CN102967704A - 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒。该试剂盒对T₁DM、T₂DM和正常人血清中ICA、GADA、IAA、IA-2ACPH-A和ZnT8-A等6种抗体联合检测，对Ⅰ型糖尿病诊断有高度敏感性(可达98%)和特异性(可达99.6%)，为糖尿病的分型诊断提供高效、快捷的检测手段。

Description

一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒。

背景技术

糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病（血糖）一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病已经成为继心脑血管、癌症以外危害人类健康的第三大疾病。

临床上根据病因和发病机制分为1型糖尿病(T₁DM)、2型糖尿病(T₂DM)及其他类型。T₁DM又称免疫介导性糖尿病，它是由于自身免疫系统破坏胰岛细胞，使胰岛素的合成和分泌减少或完全缺乏的自身免疫性疾病；T₂DM主要是因为胰岛素抵抗伴相对性胰岛素不足而引起。LADA全称为成人隐匿性免疫性糖尿病（latent autoimmune diabetes in adult,LADA），其介于1型糖尿病和2型糖尿病之间，属于免疫介导型1型糖尿病的亚型，其患病率约占初诊2型糖尿病患者的10%-15%（患病率是1型糖尿病的2倍），其中胰岛B细胞功能衰退速度是2型糖尿病患者的3倍。由此可知，对糖尿病进行准确的分型是对其实施预防及治疗的基本前提。检测糖尿病患者自身抗体是对糖尿病进行准确分型的主要方法。目前确认的糖尿病自身抗体包括胰岛细胞抗体（ICA）、谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、胰岛素抗体（IAA）酪氨酸磷酸抗体(IA-2A)、羧基肽酶抗体（CPH-A）和锌转运蛋白8抗体（ZnT8-A）等。

目前常用免疫组化法、免疫荧光法、酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法（RIA）检测。但是上述方法检测时间长，对辅助设备的要求较高，且仅能检测单一自身抗体，单一自身抗体检测的敏感性仅为39%-68.8%。

免疫印迹(IB)法或称蛋白免疫印迹试验（Western Blot,WB）是目前国内测定可提取性核抗原（ENA）多肽抗体的主要方法，因为它结合了聚丙烯酰凝胶电泳的高分辨率和免疫标记技术的高特异性及敏感性的优点。近年来被卫生部临检中心推荐为爱滋病等传染性疾病的确认试验。但将免疫印迹法用于糖尿病自身抗体6项联检在国内尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒。本发明提供的试剂盒对T₁DM、T₂DM和正常人血清中ICA、GADA、IAA、IA-2ACPH-A和ZnT8-A等6种抗体联合检测，对Ⅰ型糖尿病诊断有高度敏感性(可达98%)和特异性(可达99.6%)，为糖尿病的分型诊断提供高效、快捷的检测手段。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，包括检测印迹膜和标准带；

检测印迹膜依次包括起始带、检测带和质控带；检测带转印有胰岛细胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脱羧酶抗原、锌转运蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰岛素自身抗原；

标准带的制备方法为：

取胰岛细胞抗体、酪氨酸磷酸酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、锌转运蛋白8抗体、羧基肽酶抗体、胰岛素自身抗体经梯度不连续电泳后转印至硝酸纤维素膜，显色后，获得标准印迹膜，根据标准印迹膜上各阳性区带分别与起始带、质控带的相对距离，获得标准带。

同一胰岛细胞蛋白抗原因电泳时的微笑效应（在电泳槽中心的抗原移动速度大于两边），使相同的胰岛细胞蛋白抗原带不能在一条直线上，与标准带比对时会造成结果误判。本发明在制备试剂盒的过程中，利用梯度不连续电泳解决了这一难题，不仅保证了结果判断的准确性，而且也是大批量生产的前提。

ICA作为一类自身抗体，发现于1974年，当时认为与胰岛的所有细胞均存在反应，T₁DM儿童中，70%-80%在明确诊断时ICA为阳性。ICA检测是临床上应用较早的指标，在多数试验室中采用免疫组化的方法来进行测定，虽然具有一定的灵敏度和特异性，但由于受检测方法学的限制，使检测结果在不同的试验室中有一定差异。

Palmer等在1983年最先检出IAA后，指出T₁DM自身免疫过程并非仅限于胰岛细胞膜和胞浆抗原，胰岛素分子作为抗原也参与T₁DM的自身免疫过程。

胰腺内的GAD₆₅被证实是T₁DM、Stiff-man综合征及多发性自身免疫性内分泌综合征等疾病的一种自身抗原，上述疾病的部分患者体内存在GAD₆₅抗体，其中T₁DM中的阳性率最高。

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)样跨膜蛋白(1994年发现)，目前称为ICA512或IA-2抗体，它是胰岛细胞瘤相关蛋白，是ICA的主要的成分之一，结构上分为4部分，信号肽、胞外结构、单一跨膜结构域及胞内结构域，其分子量为120KD。IA-2识别的表位局限于胞内结构域。

羧基肽酶-H自身抗体(CPH-Ab)，位于胰岛细胞胞浆中羧基肽酶-H自身抗体(CPH-Ab)。2003年在成人迟发自身免疫性糖尿病(LADA)患者中发现。经典Ⅰ型糖尿病中的检出率不到13%，CPH-A阳性糖尿病患者具有LADA患者的临床特征，CPH-A是提高LADA诊断效率的一项新指标，与GADA联合检测可提高LADA诊断的敏感性。

锌转运蛋白8抗体（2004年Chimienti发现）定位于胰岛素分泌细胞的分泌颗粒中。是一种新的锌转运蛋白，主要是负责将Zn转运至细胞外基质。其定位于胰岛素分泌颗粒中，参与胰岛素分泌功能。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，标准带与标准印迹膜中相应阳性区带的误差小于0.5mm。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中还包括浓缩洗涤液、工作液、酶联试剂和显色液。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，还包括与检测印迹膜相配合的反应槽，反应槽与检测印迹膜可拆卸连接。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，检测印迹膜的制备方法为取胰岛细胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脱羧酶抗原、锌转运蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰岛素自身抗原经梯度不连续电泳后转印至硝酸纤维素膜，即得。

在本发明的一些实施例中，制备获得胰岛细胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脱羧酶抗原、锌转运蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰岛素自身抗原的方法具体为将胰腺组织用超声波细胞破碎仪破碎，置高速冷冻离心机，收集上清液，置透析袋透析后置聚乙二醇中浓缩，用紫外分光光度仪测定DM蛋白抗原含量。其主要解决的关键问题是在于：提取和纯化DM抗原过程中，其抗原成份会降解丢失。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，酶联试剂的制备方法为取磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫柳汞与水混合溶解，与小牛血清、酶标记物混合后，加水稀释，调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得；

酶标记物为辣根过氧化物酶标记抗人IgG（效价1:100）；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫柳汞的质量比为20:1:1；

以g/mL/mL/mL计，磷酸二氢钾与小牛血清、酶标记物、酶联试剂的质量体积比为1:70:47:140。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，显色液的制备方法为取3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与0.02mol/L的pH值为5.0的磷酸盐/柠檬酸缓冲液混合，与H₂O₂混合后，调节pH值为4.8～5.2，混匀，即得；

以g/mL/mL/计，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与磷酸盐/柠檬酸缓冲液、H₂O₂的质量体积比为0.5:1000:0.1。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，浓缩洗涤液的制备方法为取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于水后，与吐温-20混合，加水后调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得；

氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾的质量比为30:20:1；

以g/mL/mL/计，氯化钠与吐温-20、浓缩洗涤液的质量体积比为9:5:70。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中，工作液的制备方法为取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于水后，与小牛血清白蛋白混合，加水后调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得；

氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、小牛血清白蛋白的质量比为90:60:3:10；

以g/mL计，氯化钠与工作液的体积比为9:1000。

本发明还提供了一种以非疾病诊断为目的的糖尿病自身抗体6项联检方法，包括如下步骤：

制备获得标准带；

制备获得检测印迹膜；

取浓缩洗涤液配制获得洗涤应用液；

取检测印迹膜与洗涤应用液、待检血清混合、孵育，弃去反应液、拍干、洗涤，重复上述操作后，加入洗涤应用液和酶联试剂混合、孵育，弃去酶联反应液、拍干、洗涤，重复上述操作后，加入显色剂显色；

质控带和各阳性区带显色清晰后，弃去显色液，流水冲洗终止反应，取检测印迹膜、干燥后与标准带对照，获得结果；

取检测印迹膜的起始线与标准带的起始线对齐，如果标准带上的阳性区带对应的检测印迹膜上的相应位置有显色区带，则待检血清中含有相应的抗体。

本发明利用免疫印迹技术将胰腺细胞提取的混合蛋白抗原（包含有IA、GAD、IA-2、CPH、ZnT8和ICA等6种细胞蛋白成份）用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（PAGE），按分子量大小依次分开，再通过印迹技术转移至印迹膜上，其印迹膜条上即含有按分子量大小不同排列的各种胰岛细胞自身抗原成份。将其放入反应槽与待测血清反应，如待测血清含有自身抗体，将会分别与相应抗原结合，再加入酶联免疫显色试剂，就会在抗原、抗体结合位置出现显色区带，与标准带对照即可判断待测血清中含有何种抗体。其抗体的有无及抗体的种类和数量，对糖尿病分型诊断、预测和防治均有重要的临床意义。

本发明提供的试剂盒对T₁DM、T₂DM和正常人血清中ICA、GADA、IAA、IA-2A、CPH-A和ZnT8-A等6种抗体联合检测，其T₁DM阳性率为98.0％，T₂DM阳性率为28.81％，而正常人阳性率仅为3.33％，经统计学分析其差别具有显著性意义（P<0.01）。本发明提供的试剂盒对糖尿病的诊断和分型均有重要的临床意义，一次能对6种胰岛细胞自身抗体（ICA、GADA、IAA、IA-2A CPH-A和ZnT8-A）联合检测，能够在分子水平检测技术根据显色区带位置可判断自身抗原的分子量。与传统试剂只能检测一种自身抗体相比，使检测效率提高了6倍，其敏感性高（98.0%）特异性强（99.6%），具有确认价值，且操作简单、快速，多种自身抗体检测一次完成只需2小时就可获得检验结果。同时该试剂盒操作简单，为糖尿病的分型诊断提供一个高效、快捷的检测手段，不需特殊设备辅助，适宜在基层医院推广应用。

具体实施方式

本发明公开了一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒中所用抗原、抗体及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1试剂盒的制备

IA、GAD、IA-2、CPH、ZnT8和ICA等6种胰岛细胞蛋白抗原的提取和纯化：

筛选猪、牛、大鼠和人胰腺组织，选出含6种胰岛细胞蛋白抗原的胰腺组织；

抽提6种胰岛细胞蛋白抗原：将胰腺组织用超声波细胞破碎仪破碎，置高速冷冻离心机，收集上清液，置透析袋透析后置聚乙二醇中浓缩，用紫外分光光度仪测定DM蛋白抗原含量。其主要解决的关键问题是在提取和纯化DM抗原过程中，其抗原成份会降解丢失。

电泳：将胰岛细胞6种抗原用样品缓冲液适当稀释，采用SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳，将各种蛋白组分按分子量大小分开。

电转移：将电泳后的凝胶置电转移仪，将胰岛细胞蛋白混合抗原各种蛋白组分由凝胶层中转移到硝酸纤维膜上，制备获得检测印迹膜。

酶标试剂配制：（每1000人份用量）：称取磷酸氢二钠0.2g、磷酸二氢钾0.01g、硫柳汞0.01g，并用纯化水溶解于一洁净容器中，用量筒量取灭活小牛血清0.7mL倾入容器中，量取酶标记物（酶标记物为辣根过氧化物酶标记抗人IgG，效价1:100）0.47mL加入容器中，用纯化水加到体积14mL。用精密pH试纸测定溶液pH值，pH=7.2±0.2。盖紧瓶盖，充分摇晃，使溶液混匀。在容器上贴上半成品标签，注上品名、批号、批量及分装期限。

显色剂配制：（每1000人份用量）：称取0.5g3,3`,5,5`-四甲基联苯胺，溶解于1000mL、0.02M PH5.0磷酸盐/柠檬酸缓冲液中，倒入显色剂专用棕色瓶中,加入1mL H₂O₂，盖紧瓶盖，充分摇晃15分钟，使溶液混匀。用精密PH试纸测定溶液PH值，PH＝5.0±0.2，在容器上贴上半成品标签，注上品名、批号、批量及分装期限。

浓缩洗涤液配制（每1000人份用量）：量取吐温-2050mL倾入一洁净容器中。称取氯化钠90g、磷酸氢二钠60g、磷酸二氢钾3g并用纯化水溶解于一洁净容器中充分溶解。用纯化水将溶液加至批量体积700mL。用PH试纸测定溶液PH值，PH＝7.2±0.2。盖紧桶盖，充分摇晃15分钟，使溶液混匀。在容器上贴上半成品标签，注上品名、批号、批量及分装期限。

工作液配制（每1000人份用量）：称量小牛血清白蛋白10克倾入一洁净容器中。称取氯化钠9g、磷酸氢二钠6g、磷酸二氢钾0.3g并用纯化水溶解于一洁净容器中充分溶解。用纯化水将溶液加至批量体积1000mL。用PH试纸测定溶液PH值，PH＝7.2±0.2。

标准带的制备：

获得胰岛细胞6种自身抗体；

电泳：将胰岛细胞6种自身抗体用样品缓冲液适当稀释，采用SDS-聚丙稀酰胺凝胶梯度不连续电泳，将各种蛋白组分按分子量大小分开。

电转移：将电泳后的凝胶置电转移仪，将胰岛细胞蛋白自身抗体由凝胶层中转移到硝酸纤维膜上，制备获得标准印迹膜。

根据各阳性区带、质控带距起始线的距离用电脑模拟出标准带。用A6铜版纸彩色打印或印刷。用标准印迹膜阳性区带与电脑模拟的标准带对比使两种区带误差小于0.5mm。

实施例2基于本发明提供的试剂盒的检测方法

待测血清或全血10μl，待测标本宜用新鲜血清或全血，血清一般可用静脉取血，待凝固后离心取得。即时检测可手指采血，用全血检测。采得的血清或全血如当天不检测，应置4℃保存；超过七天以上，需置－20℃以下保存。

洗涤应用液的配制：在2-8℃贮存的浓缩洗涤液会有结晶析出，将整瓶（25mL）浓缩洗涤液用蒸馏水或纯净水稀释至250mL，放入试剂瓶中，标签上注明配制时间，保存于2-8℃，有效期3个月，如有絮状物或霉变应废弃；

使用镊子将所需数量的印迹膜放到反应槽中，加入洗涤应用液1mL和待检血清10μL；

置摇床上室温（20~37℃）摇动30min或置37℃温箱30min；

弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；

在反应槽中加入洗涤应用液0.5mL和酶联试剂10μL；

置摇床上室温（20~37℃）摇动30min或置37℃温箱30min；

弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1mL，洗涤1min弃去反应槽液体，反复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干液体；

在反应槽中加入显色剂0.5mL，在摇床上摇动5±2min，显色；

待质控带和阳性区带显色清晰后，倒掉槽中液体，用流水（自来水或蒸馏水）冲洗3次以终止反应，取出印迹膜条，置吸水纸上，待干后与标准带对照判断结果。

将印迹膜上起始线与标准带起始线对齐，观察阳性显色区带与对应的标准带位置即可判断是否有DM自身抗体。

实施例3几种检测方法的比较

45例T1DM患者来自分泌科和儿科的初诊患者，均符合世界卫生组织（WHO）1999年诊断标准。年龄5-48岁，平均年龄（25±12岁），其中男27例，女18例，健康对照组为50例来我院体检者，年龄15-41岁，平均年龄（24±5岁），其中男24例，女26例，所有对照者空腹血糖均正常，无糖尿病家族史和自身免疫病史。

所有被检标本均是空腹静脉采血，分离血清，分装后置-20℃保存待检。IAA放射免疫检测试剂盒购自北京生物技术研究所，SN-697全自动双探头放射免疫r-计数仪由上海原子能研究所日环仪器一厂生产；IAA酶联免疫检测试剂盒是美国Biomerica公司产品，按试剂盒使用说明书操作，IAA阳性判断标准为测定值大于阴性对照值的2.5倍；本发明提供的糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，按试剂使用说明书操作，IAA阳性判断标准为在5.8KD区带位置出现清晰的显色区带。

用SPSS8.0统计软件分析，各组间阳性率比较采用卡方检验。

ELISA、RIA和IB法检测45例T1DM患者IAA阳性率分别为35.56%、37.78%和24.44%；检测50例健康对照者假阳性率分别为10.00%，8.00%和0。三种检测方法检测IAA对T1DM的敏感性依次为RIA(37.78%)>ELISA(35.56%)>IB(24.44%),其特异性为IB(100%)>RIA(92%)>ELISA(90%),经统计学分析,ELISA和RIA法检测IAA的特异性和敏感性均无明显差异(P>0.05);IB法检测IAA的敏感性明显低于ELISA或RIA法(P<0.05),其特异性明显高于后两种方法(P<0.05)，见表1。

表1ELISA、RIA和本发明提供的试剂盒的检测方法检测T1DM患者IAA的结果比较(n,%)

组别	例数(n)	ELISA(%)	RIA(%)	IB(%)
					T1DM组阳性率	45	35.56	37.78	24.44
对照组假阳性率	50	10.00	8.00	0
					敏感性		35.56△	37.78	24.44*
特异性		90.00△	92.00	100*

注:^△ELISA和RIA比较P>0.05，^*IB与ELISA或RIA比较P<0.05。

上述试验利用ELISA、RIA和本发明提供的试剂盒的检测方法分别检测45例T1DM患者和50例健康对照者血清IAA结果显示:ELISA和RIA的敏感性和特异性均无明显差异(P>0.05),两者的敏感性均显著高于本发明提供的试剂盒的检测方法(P<0.05),而两者的特异性均明显低于本发明提供的试剂盒的检测方法(P<0.05),本发明提供的试剂盒的检测方法法的特异性可达100%,可以作为IAA检测的确认试验。

实施例4基于本发明提供的试剂盒的临床检测

糖尿病患者均来新近确诊的病人，符合1999年WHO糖尿病诊断标准，其中T1DM患者46例，其中男性26例，女性20例。年龄2－48岁，平均年龄（23±11）岁；T1DM患者118例，其中男性63例，女性55例。年龄30－77岁，平均年龄（45±10）岁。正常人60例均来自健康体检者，均无糖尿病家族史，空腹血糖正常，其中，男性32例，女性28例。年龄18－60岁，平均年龄（36±12）岁。

抽取被检者空腹静脉血3mL，分离血清，分装后置-20℃贮存，待检。

ICA、GADA、IAA、IA-2A、CPH-A和ZnT8-A采用本发明实施例1制备的糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒测定。其基本原理是将胰岛素、谷氨脱羧酶和胰岛细胞的多种蛋白抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小不同依次分开，再电转移至印迹膜上，与待检血清反应，如果被检血清中含有相应抗体，抗原和抗体就会结合，再加入酶联第二抗体和显色剂，相应抗原位置即会出现显色区带，与试剂盒中糖尿病自身抗体标准区带比较，即可判断是何种自身抗体：120KD区带阳性为IA-2A；65KD区带阳性为GADA；64KD区带阳性或同时阳性为ICA；54KD区带阳性为CPH-A；40KD区带阳性为ZnT8-A；5.8KD区带阳性为IAA。

实验结果以Ｘ²检验进行处理。

在46例T1DM中总ICA阳性者10例，阳性率（10/46）为21.7％；GADA阳性者32例，阳性率（32/46）为69.56％；IAA阳性者7例，阳性率为（7/46）为15.21％；IA-2A阳性者4例，阳性率4/46）为8.7％；CPH-A阳性者2例，阳性率（2/46）为4.3％；ZnT8-A阳性者6例，阳性率（6/46）为13.0％；其中1例患者6种抗体均为阳性，2例患者5种抗体均为阳性，4例患者4种抗体均为阳性，6例患者3种抗体均为阳性，11例患者二种抗体同时阳性，至少有一种抗体阳性者44例，总阳性率为（44/46）95.65％。

在118例T2MD患者，ICA阳性者2例，阳性率（2/118）为1.7％；GADA阳性者29例，阳性率（29/118）24.57％；IAA阳性者1例，阳性率（1/118）0.84％，IA-2A阳性者3例，阳性率（3/118）为2.5％；CPH-A阳性者2例，阳性率（2/118）为1.7％；ZnT8-A阳性者0例，阳性率（0/118）为0％；其中0例患者6种抗体同时阳性，0例患者5种抗体均为阳性，0例患者4种抗体均为阳性，0例患者3种抗体均为阳性，2例患者2种抗体均为阳性，至少有一种抗体阳性者34例，总阳性率（34/118）28.81%。60例正常人中，ICA阳性者1例阳性率（1/60）1.66％；GADA阳性者1例，阳性率1/60）1.66％；IAA无1例阳性，总阳性率为（2/60）3.33％；IA-2A阳性者0例阳性率（0/60）0％；CPH-A阳性者0例阳性率（0/60）0％；ZnT8-A阳性者0例阳性率（0/60）0％；可见T1DM组ICA、GADA、IAA、IA-2A、CPH-A和ZnT8-A的总阳性率明显高于T2DM组及正常对照组。经统计学分析，差异具有显著性（P<0.01），见表2。

表2糖尿病自身抗体免疫印迹检测结果（n,%）

本发明利用实施例1制备的糖尿病自身抗体免疫印迹试验盒对T₁DM、T₂DM和正常人血清中ICA、GADA和IAA联合检测，其在T₁DM阳性率为95.65％，T₂DM阳性率为28.81％，而正常人阳性率仅为3.33％，经统计学分析其差别具有显著性意义（P<0.01）。所以该方法对糖尿病的诊断和分型均有重要的临床意义，同时该试剂盒操作简单，不需特殊设备辅助，适宜在基层医院推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，包括检测印迹膜和标准带； 

所述检测印迹膜依次包括起始带、检测带和质控带；所述检测带转印有胰岛细胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脱羧酶抗原、锌转运蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰岛素自身抗原； 

所述标准带的制备方法为：取胰岛细胞抗体、酪氨酸磷酸酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、锌转运蛋白8抗体、羧基肽酶抗体、胰岛素自身抗体经梯度不连续电泳后转印至硝酸纤维素膜，显色后，获得标准印迹膜，根据所述标准印迹膜上各阳性区带分别与起始带、质控带的相对距离，获得所述标准带。 

2.根据权利要求1所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述标准带与所述标准印迹膜中相应阳性区带的误差小于0.5mm。 

3.根据权利要求2所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，还包括浓缩洗涤液、工作液、酶联试剂和显色液。 

4.根据权利要求3所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，还包括与所述检测印迹膜相配合的反应槽，所述反应槽与所述检测印迹膜可拆卸连接。 

5.根据权利要求4所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述检测印迹膜的制备方法为取胰岛细胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脱羧酶抗原、锌转运蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰岛素自身抗原经梯度不连续电泳后转印至硝酸纤维素膜，即得。 

6.根据权利要求3所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述酶联试剂的制备方法为取磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫柳汞与水混合溶解，与小牛血清、酶标记物混合后，加水稀释，调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得； 

所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记抗人IgG（效价1:100）； 

所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫柳汞的质量比为20:1:1； 

以g/mL/mL/mL计，所述磷酸二氢钾与所述小牛血清、所述酶标记物、所述酶联试剂的质量体积比为1:70:47:140 。

7.根据权利要求3所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述显色液的制备方法为取3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与0.02mol/L的pH值为5.0的磷酸盐/柠檬酸缓冲液混合，与H₂O₂混合后，调节pH值为4.8～5.2，混匀，即得； 

以g/mL/mL/计，所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与磷酸盐/柠檬酸缓冲液、H₂O₂的质量体积比为0.5:1000:0.1。 

8.根据权利要求3所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的制备方法为取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于水后，与吐温-20混合，加水后调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得； 

所述氯化钠、所述磷酸氢二钠、所述磷酸二氢钾的质量比为30:20:1； 

以g/mL/mL/计，所述氯化钠与所述吐温-20、所述浓缩洗涤液的质量体积比为9:5:70。 

9.根据权利要求3所述的用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒，其特征在于，所述工作液的制备方法为取氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶于水后，与小牛血清白蛋白混合，加水后调节pH值为7.0～7.4，混匀，即得； 

所述氯化钠、所述磷酸氢二钠、所述磷酸二氢钾、所述小牛血清白蛋白的质量比为90:60:3:10； 

以g/mL计，所述氯化钠与所述工作液的体积比为9:1000。