CN1585900A - 检测与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体 - Google Patents
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Abstract
一种筛选动物受试体体液样本中的分析物自身抗体的方法,该自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及所述方法中使用的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及检测与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体的方法和试剂盒,例如用来检测表征胰岛素依赖性糖尿病(IDDM,1型糖尿病)开始出现或疾病存在的自身抗体的方法和试剂盒。
背景技术
1型糖尿病是流行的自身免疫性疾病中的一种,在欧洲和北美,有超过2百万的患者(M A Atkinson,G S Eisenbarth.Type 1 diabetes:new perspectives ondisease pathogenesis and treatment.The Lancet,2001 358:221-229)。而且,1型糖尿病的发病率在全球范围内每年以2.5%的速率增长,预测2010年后发病率将比1998年高出40%(M A Atkinson,G S Eisenbarth.Type 1 diabetes:newperspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet,2001 358:221-229)。
胰腺β细胞抗原的自身抗体是1型糖尿病的易识别血清标记物,其包括:在免疫荧光测试(ICA)中与胰岛细胞反应的自身抗体,谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是其65kDa异构体GAD65)的自身抗体,蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(指IA-2或ICA512)自身抗体和胰岛素的自身抗体。GAD65自身抗体和IA-2自身抗体是ICA反应性成分(M A Atkinson,G S Eisenbarth Type 1 diabetes:new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet,2001 358:221-229)。至少在约90%的1型糖尿病患者血清诊断中存在GAD65,IA-2和胰岛素这三种类型的自身抗体中的一种(M A Atkinson,G S Eisenbarth.Type 1diabetes:new perspectives on disease pathogenesis and treatment.TheLancet,2001 358:221-229)。上述自身抗体作为胰腺β细胞自身免疫的血清标记物的检测也可以被用于监测糖尿病预防试验的患者(M A Atkinson,G SEisenbarth.Type 1 diabetes:Desc/Clms Page number 2 new perspectives ondisease pathogenesis and treatment.The Lancet,2001 358:221-229)。
目前,GAD65自身抗体是利用35S,3H或125I标记的GAD65放射活化,通过免疫沉淀测试法(IPA)进行检测。用35S或3H标记的GAD65已在体外转录/翻译体系中制备出(C E Grubin,T Daniels,B Toivola,M Landdin-Olsson,W AHagopian,L Li,A E Karlsen,E Boel,B Michelsen,A Lernmark.A novelradioligand binding assay to determine diagnostic accuracy ofisoform-specificglutamic acid decarboxylase antibodies in childhoodIDDM.Diabetologia,199437:344-350;J S Petersen,K R Hejnaes,A Moody,A EKarlsen,M O Marshall,MHoier-Madsen,E Boel,B K Michelsen,T Dyrberg.Detection ofGAD65antibodies in diabetes and other autoimmune diseases using a simple radioligandassay.Diabetes,1994 43:459-467;and AFalorni,EOrtqvist,B Persson,ALernmark.Radioimmunoassays for glutamic acid decarboxylase(GAD65)andGAD65 autoantibodies using 35S or 3H recombinant human ligands.Journal ofImmunological Methods,1995 186:88-89)。天然的GAD65,例如从脑组织中分离的鼠或猪GAD65(M J Rowley,I R Mackay,Q-Y Chen,W J Knowles,P ZZimmet.Antibodies to glutamic acid decarboxylase discriminate major types ofdiabetes mellitus.Diabetes,1992 41:548:551;and M Ohta,H Obayashi,KTakahashi,YKitagawa,K Nakano,S Matsuo,M Ohishi,N Itoh,K Hayashi,KOhta.A simple solid-phase radioimmunoassay for glutamic acid decarboxylase(GAD)antibodies in patients with diabetes mellitus.J Clin Biochem Nutr,199620:139-148)或重组人GAD65,例如在昆虫细胞、酵母菌或哺乳细胞中表达的重组人GAD65(F Luhder,K-P Woltanski,L Mauch,HHaubruck,K-D Kohnert,IRjasanowski,D Michaelis,M Ziegler.Detection of autoantibodies to the65-kDisoform of glutamate decarboxylase by radioimmunoassay.EuropeanJournal of Endocrinology,1994 130:575-80;M Powell,L Prentice,T Asawa,RKato,J Sawicka,H Tanaka,V Petersen,A Munkley,S Morgan,B Rees Smith,JFurmaniak.Clinica Chimica Acta,1996 256:175-188;and T Matsuba,M Yano,NoAbiru,H Takino,S Akazawa,S Nagataki,K Yasukawa.Expression ofrecombinant human glutamic acid decarboxylase(GAD)in myeloma cells andenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for autoantibodies to GAD.JBiochem,1997 121:20-24)已经用125I标记并用于IPAs中。GAD65和IA-2的重组融合蛋白也已经用于IPAs中来检测组合的自身抗体(A Zavialov,MAnkelo,AWesterlund-Karlsson,M Knip,J Illonen,A Hinkkanen.Novel fusionproteins in the analysis of diabetes associated autoantibodies to GAD65 and IA-2.Journal of Immunological Methods,2000 246:91-96;and M Rickert,J Seissler,W Dangel,H Lorenz,W Richter.Fusion proteins for combined analysis ofautoantibodies to the 65-kDaisoform of glutamic acid decarboxylase and isletantigen-2 in insulin dependent diabetes mellitus.Clinical Chemistry,2001 47(5):926-934)。
目前可获得的基于35S-GAD65的IPAs在技术上要求高,难于标准化,价格昂贵且不适合用于试剂盒中。基于人重组125I-GAD65与基于35S-GAD65的测试具有相同的灵敏性和特异性,但前者具有产率高、技术简单、成本低的优点,且易于制成试剂盒。然而,基于从鼠或猪的脑组织中分离的125I-GAD65,由于受到GAD67异构体的污染而使其检测特异性较低。
GAD65自身抗体也可用不同类型的ELISAs检测(A M Gronowski,E C CWong,T RWilhite,D L Martin,C H Smith,C A Parvin,M Landt.Detection ofglutamic acid decarboxylase autoantibodies with the varelisa ELISA.ClinicalChemistry,1995 41(10):1532-1534;and H D Mehta,B S Vold,S Minkin,EFUllman.DELISA:sensitive nonisotopic assay for GAD65 autoantibodies,a keyrisk-assessment marker for insulin-dependent diabetes mellitus.ClinicalChemistry,1996 42(2):263-269)。
然而,目前通过ELISA检测GAD65自身抗体的试验比上述IPAs的灵敏性和特异性差,且研究的成熟程度也不如IPAs(R S Schmidli,P G Colman,EBonifacio,Participating Laboratories.Disease sensitivity and specificity of 52assays for glutamic acid decarboxylase antibodies.The secondinternationalGADAb workshop.Diabetes,1995 44:636-640)。
本发明解决了上面提及的用于筛选表征1型糖尿病发病或疾病存在的自身抗体相关的方法和试剂盒的问题,并可以普遍用于与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体的测定中。本发明的方法和试剂盒尤其具有与上述现有技术相比得到改善的特异性和灵敏性。
本发明提供一种筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原分子发生反应的分析物自身抗体的方法,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体能发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接的可检测的标记方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的筛选分析物自身抗体的方法的优点尤其在于提供了高特异性和高灵敏性的自身抗体检测。
本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子、或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段或其融合分子可以选自任何胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的融合分子,尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是其谷氨酸脱羧酶65KDa和67KDa异构体,GAD65和GAD67)、蛋白质酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素,或它们的一种或多种变异体(诸如,IA-2β)、类似物、衍生物或片段,或包含两种或多种上述分子的融合分子,存在于体液样本中的分析物自身抗体能与这些分子反应。在本发明特别优选的实施例中,采用了一种或多种上述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素,尤其是上述胰腺胰岛细胞抗原分子,优选一种或多种GAD65,GAD67或IA-2。可选择的方案是,优选采用一种或多种上述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,尤其是一种或多种上述胰腺胰岛细胞抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段,优选一种或多种GAD65,GAD67或IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。本发明另一个可选择的优选实施例中,优选采用一种或多种包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子的融合分子,所述抗原分子选自上述胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
因此,可以理解本发明所述术语GAD包括所有GAD异构体,尤其包括GAD65或GAD67。在一些实施例中优选使用GAD65,而在另外一些实施例中优选使用GAD67。也可以理解,本发明包括其公开范围内的包含有GAD65或GAD67或其一种或多种片段(如其结合区域)的融合分子。例如,本发明范围内的融合分子包括GAD65与GAD67直接或间接融合,或GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子。并且,还可以理解本发明范围内的融合分子可以包括IA-2,或其一个或多个结合区域与IA-2β或IA-2β的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子。本发明还包括GAD65或GAD67、或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段与IA-2或IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段直接或间接融合的融合分子。
本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子、或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是GAD65或GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,这些分子能与存在于分析物体液样本中的自身抗体发生反应。
在本发明的一个优选方案中,上述筛选方法适用于检测下述物质的分析物自身抗体:GAD和/或IA-2,一种或多种包括GAD65或GAD67的抗原分子,或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,和/或IA-2,或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子,通过这些抗原分子与体液样本中的分析物自身抗体发生反应而得到检测。当本发明采用融合抗原分子时,适宜的融合分子可以包括GAD65或GAD67或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段直接或间接融合的融合分子;适宜的融合分子也可以包括GAD65与GAD67直接或间接融合的融合分子、或GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子;适宜的融合分子还包括IA-2或其一个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子。
本发明优选的方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,然后提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其根据步骤(f)提供的标记方法被标记。
本发明更优选的方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如,与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子包括GAD65、GAD67、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段直接或间接融合的融合分子),该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子,其包括GAD65、GAD67、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段直接或间接融合的融合分子),其被步骤(f)提供的标记物所标记。本发明的优选方法包括检测GAD的自身抗体方法,该方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要是由GAD抗原分子组成的第一抗原分子,其中GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子包括:GAD65与GAD67直接或间接融合,或GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子),该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要由GAD组成的抗原分子,其选自GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子包括:GAD65与GAD67直接或间接融合,或GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子),其被步骤(f)提供的标记方法所标记。本发明的优选方法还有检测IA-2自身抗体的方法,该方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要由IA-2抗原分子组成的第一抗原分子,该抗原分子选自IA-2、或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子,包括IA-2或其一个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子),该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,以及提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的基本由IA-2抗原分子组成的第二抗原分子,该抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合分子,包括IA-2或其一个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子),其被步骤(f)提供的标记方法标记。本发明的方法还可以是用于检测GAD和IA-2二者的自身抗体的方法,该方法包括提供(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD第一和第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括GAD65、GAD67,所述GAD第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,且所述GAD第二抗原分子被步骤(f)提供的标记方法所标记;以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2、它的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上,且所述IA-2第二抗原分子被步骤(f)提供的标记方法所标记。
因此,本发明的一个优选实施例包括一种筛选动物受试体体液样本中能与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的方法,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供与存在于体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)提供与存在于体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域存在于一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后,给予直接或间接的可检测标记方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物,以得到所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中只与GAD或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由GAD抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子根据步骤(d)被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子被步骤(e)提供的标记方法所标记;
(c)将步骤(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二抗原分子];
(d)在步骤(c)之前或之中或之后进行固定,由此步骤(c)形成的复合物中的GAD第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(e)在步骤(c)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记方法,由此步骤(c)形成的复合物中的GAD第二抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记;
(f)检测是否存在步骤(d)中所固定的、在步骤(c)中形成的复合物,以得到所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由IA-2抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中,抗原分子选自IA-2和所述一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子根据步骤(d)被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子根据步骤(e)的标记方法被标记;
(c)将步骤(b)提供的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述IA-2抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(d)在步骤(c)之前或之中或之后进行固定,由此步骤(c)形成的复合物中的IA-2第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(e)在步骤(c)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记方法,由此步骤(c)形成的复合物中的IA-2第二抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记;
(f)检测是否存在步骤(d)所固定的、步骤(c)所形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中分别与GAD和IA-2反应、或与它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的第一和第二分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原分子,GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子根据步骤(e)被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子被步骤(f)的标记方法所标记;
(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子根据步骤(e)被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子被步骤(f)提供的标记物方法标记;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记方法,由此步骤(d)形成的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中固定的、步骤(d)中形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明方法可以优选为上述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子都包括一种或多种共同的抗原分子。例如,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子可以包括GAD65或GAD67;或者可以包括IA-2。
与所述体液样本中自身抗体反应的、存在于一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子包括选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分子,而存在于一种或多种复合物中的其它抗原分子,包括上述抗原分子的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。例如,与所述体液样本中自身抗体反应的一种或多种复合物中的第一或第二抗原包括GAD65或GAD67,而存在于一种或多种复合物中的其它抗原分子包括GAD65或GAD67的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。再例如,与所述体液样本中自身抗体反应的一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子包括IA-2,而存在于一种或多种复合物中的另一种抗原分子,包括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
本发明的再一实施例是,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子均包括能与所述体液样本中自身抗体反应的同一抗原分子的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。例如,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子均包括与所述体液样本中自身抗体反应的GAD65或GAD67的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。再例如,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子均包括与所述体液样本中自身抗体反应的IA-2的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。从上述可以理解,复合物中的两种抗原分子包括衍生于同一抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段,这些变异体、类似物、衍生物或片段可以相同或不同(例如变异体1和变异体2,其中,变异体1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同变异体,或片段1和片段2,其中,片段1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同片段,诸如,完全不同或部分重叠的GAD65或GAD67的表位)。
在本发明所述采用融合分子的情况下,可以理解该融合分子包括独特的抗原分子(例如GAD65和IA-2),但本发明所形成的复合物中的融合分子,其分别由第一和第二抗原提供的与分析物自身抗体相结合的区域存在于一种同一抗原分子中,或由该同一抗原分子衍生而得。利用一种或多种融合分子所形成的复合物的实例包括(i)[GAD-IA-2固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2标记],其中自身抗体包括GAD自身抗体,该自身抗体与[GAD-IA-2固定]和[GAD-IA-2标记]中的GAD的结合区域发生反应,或复合物的自身抗体包括IA-2自身抗体,该自身抗体与[GAD-IA-2固定]和[GAD-IA-2标记]中的IA-2的结合区域发生反应,或(ii)[GAD-(片段)固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2标记],其中,GAD分析物自身抗体与[GAD-(片段)固定]和[GAD-IA-2标记]中的GAD的结合区域发生反应,或(iii)[IA-2(片段)固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2标记],其中,IA-2分析物自身抗体与[IA-2(片段)固定]和[GAD-IA-2标记]中的IA-2结合区域发生反应,其中GAD可以为GAD65或GAD67。
适宜的可检测标记物选自酶标记物、同位素标记物、化学发光标记物、荧光标记物、颜料及类似物,典型的标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、生物素或类似物,尤其包括生物素。这些可检测标记物(当与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段或其一种或多种融合分子相结合)与一种或多种被标记的底物(诸如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合物,例如抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶结合物或类似结合物)发生反应,由此得到的结合物可以通过测试光密度或类似方法而得到检测。
可检测标记物可以直接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子结合。可检测标记物也可以间接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子结合,尤其是可检测标记物与一种或多种抗体或其它结合试剂相结合,所述抗体或试剂能够与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子相结合。
本发明的筛选自身抗体的方法尤其包括通过本领域熟知的非竞争性夹心测试法,直接监测本发明所提供的(i)待检受试体体液样本中的自身抗体与(ii)上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子的反应。
根据本发明一个优选实施例,上述一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子被固定在固体支持物上,上述一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子与可检测标记物结合,其中优选的第二抗原分子存在于液相中,这是熟知的ELISA技术的惯例做法。
本发明的一种优选方法是将与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子,在与待检体液样本接触之前,固定到固体支持物上。与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的该固定的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或它们的一种或多种融合分子,在与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子与体液样本接触的同时或者随后,与体液样本接触。尤其优选被固定的能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或所述物质的一种或多种融合分子与待检体液样本接触以形成中间复合物,其包括[抗原分子]-[分析物自身抗体],其中抗原分子被固定到固体支持物上,然后将形成的中间复合物与液相中的、并能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或它们的一种或多种融合分子接触,从而形成复合物,其包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],该复合物是通过第一抗原分子被固定到固体支持物上。
因此,本发明提供了一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的方法,该抗体与一种或多种抗原分子反应,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述受试体体液样本;
(b)提供一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段;
(c)提供与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,该第二抗原分子存在于液相中;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种被固定的复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或是从该共同抗原分子衍生而得,或者其中与分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结合区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接检测的标记物,由此,步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(f)检测是否存在步骤(d)形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明所需的能与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的融合分子可以选自任何胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的融合分子,尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是其65KDa和67KDa异构体GAD65和GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素,或它们的一种或多种变异体(诸如,IA-2β)、类似物、衍生物或片段,或包含两种或多种上述物质的融合分子。本发明尤其所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是GAD65和GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)、或所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
本发明还包括其它接触技术,例如在上述接触步骤之前并不预先固定一种或多种第一抗原分子或其变异体、类似物、衍生物、或片段,或这些物质的一种或多种融合分子,而是先将固体支持物与用来结合一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或一种或多种这些物质的融合分子的结合剂相接触,然后将一种或多种上述第一和第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或一种或多种这些物质的融合分子以及待检体液样本与处理后的固体支持物接触。
关于本发明所采用的固体支持物和条件,它与已知免疫测试技术中所惯用的固体支持物和使用条件并没有根本的区别。本发明所采用的固体支持物包括已知ELISA技术中常用的ELISA板,或其它适宜支持物,诸如管、颗粒、磁珠、硝酸纤维或类似物。
本发明还提供了一种用于筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原分子发生反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域存在于一种共同的抗原分子中或由该共同的抗原分子衍生而得;
(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所形成的复合物,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明用于筛选分析物自身抗体的试剂盒的优点尤其在于,它能够高特异性和高灵敏性地检测这种自身抗体。
本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,或这些物质的融合分子可以选自任何胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素、和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的融合分子,尤其适于从谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是其65KDa和67KDa的谷氨酸脱羧酶异构体GAD65和GAD67)、蛋白质酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素,或它们的一种或多种变异体(诸如,IA-2β)、类似物、衍生物或片段,或包含两种或多种上述物质的融合分子。尤其是,本发明所需的能与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD,尤其是其65KDa和67KDa异构体GAD65和GAD67)、蛋白质酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素,或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
在本发明的一个优选方案中,上述筛选试剂盒是用于检测分析物自身抗体的,该抗体是下述抗原的抗体:GAD65或GAD67和/或IA-2、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及包括GAD65或GAD67或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子,和/或IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子。对于本发明使用融合分子的试剂盒情况下,合适的融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,如前述方法部分的大量描述。
本发明优选的试剂盒包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,这些物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,所述融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,该第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,以及与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,所述融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其如(e)中所定义被标记物所标记。
本发明更优选的试剂盒包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2、上述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,所述融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,该第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,以及与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子,其选自GAD65、GAD67、IA-2,上述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,所述融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其如(e)中所定义被标记物所标记。本发明的优选试剂盒还包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要是由GAD抗原分子组成的第一抗原分子,其中GAD选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,该第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,以及与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要由GAD组成的第二抗原分子,其选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其如(e)中所定义被标记物所标记。本发明的优选试剂盒还包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的基本由IA-2抗原分子组成的第一抗原分子,该抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,该第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,以及与体液样本中的分析物自身抗体反应的基本由IA-2抗原分子组成的第二抗原分子,该抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其如(e)中所定义被标记物所标记。本发明的另一种试剂盒包括(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD第一和第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括GAD65、GAD67或所述物质的一种多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,且所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义被标记物标记;以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上,且所述IA-2第二抗原分子如(e)中所定义被标记物所标记。
因此,本发明的一个优选实施例包括一种筛选动物受试体体液样本中能与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或是由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体相结合的区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得;
(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与GAD或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的基本由GAD抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记;
(b)将(a)中抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述GAD第二抗原分子];
(c)所述(b)定义的复合物中的GAD第一抗原分子在GAD第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(d)在GAD第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为(b)所定义的复合物中的GAD第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(e)检测是否存在(c)中所固定的(b)中所定义的复合物,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由IA-2抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记;
(b)将步骤(a)的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子IA-2发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述IA-2第二抗原分子];
(c)所述(b)定义的复合物中的IA-2第一抗原分子在IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(d)在IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为(b)定义的复合物中的IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(e)检测是否存在(c)中所固定的(b)中所定义的复合物,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的优选实施例还包括用于筛选动物受试体体液样本中第一和第二分析物自身抗体的试剂盒,该抗体能分别与GAD和IA-2,或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原分子,GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中,抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子如(f)中所定义的被标记物所标记;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(d)所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在GAD或IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,被固定到固体支持物上的方法;
(e)在GAD或IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的试剂盒可以优选为第一和第二抗原分子包括一种或多种共同的抗原分子。例如,第一和第二抗原分子可以包括GAD65或GAD67;或者都包括IA-2。
也可以优选,与所述体液样本中自身抗体反应的第一或第二抗原分子中的一种包括选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分子,而另一种抗原分子则包括上述第一或第二抗原分子的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。例如,与所述体液样本中自身抗体反应的第一或第二抗原分子中的一种包括GAD65或GAD67,而另一种抗原分子则包括GAD65或GAD67的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。再例如,与所述体液样本中自身抗体反应的第一或第二抗原分子中的一种包括IA-2,而另一种抗原分子包括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
本发明的再一实施例是第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自身抗体反应的同一抗原分子的可相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或片段。例如,第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自身抗体反应的GAD65或GAD67的可相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或片段。再例如,第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自身抗体反应的IA-2的可相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或片段。可以理解为,第一和第二抗原分子包括衍生于一同一抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段,这些变异体、类似物、衍生物或片段可以相同或不同(例如,第一抗原分子的变异体1和第二抗原分子的变异体2,其中,变异体1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同变异体,或第一抗原分子的片段1和第二抗原分子的片段2,其中,片段1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同片段,诸如,完全不同或部分重叠的GAD65或GAD67的表位)。
适宜的可检测标记物选自酶标记物、同位素标记物、化学发光标记物、荧光标记物、颜料及类似物,典型的标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、生物素或类似物,尤其包括生物素。这些可检测标记物(当与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子相结合)与一种或多种其标记的底物(诸如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合物,例如抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶结合物或类似结合物)发生反应,由此得到的结合物可以通过测试光密度或类似方法而得到检测。
可检测标记物可以直接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子结合。可检测标记物也可以间接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子结合,尤其是可检测标记物与一种或多种抗体或其它结合试剂相结合,所述抗体或试剂能够与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子相结合。
本发明筛选自身抗体的试剂盒进一步包括直接监测本发明所提供的(i)待检受试体体液样本中的自身抗体与(ii)上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子相互反应的方法,尤其是利用本领域熟知的非竞争性夹心测试法。
根据本发明一个优选实施例,上述一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子被固定在固体支持物上,上述一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子与可检测标记物结合,其中优选的第二抗原分子存在于液相中,这是熟知的ELISA技术的常规做法。
本发明的一种优选试剂盒包括与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子,在与待检体液样本接触之前,被固定到固体支持物上的方法。本发明适宜的试剂盒包括与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的被固定的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子,在与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子与体液样本接触的同时或者随后,与体液样本接触的方法。尤其优选的接触方法是被固定的与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或这些物质的一种或多种融合分子在与待检体液样本接触而形成了中间复合物,其包括[抗原分子]-[分析物自身抗体],其中抗原分子被固定到固体支持物上,且该被固定的中间复合物随后与液相中的与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或所述物质的一种或多种融合分子接触,从而形成复合物,其包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],该复合物通过第一抗原分子被固定到固体支持物上。
因此,本发明提供了一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的试剂盒,该抗体与一种或多种抗原分子反应,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,其中,所述第一抗原分子被固定在固体支持物上;
(b)与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,该第二抗原分子存在于液相中,并如(d)中所定义被标记物所标记;
(c)(a)和(b)所提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种被固定的复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或是从该共同抗原分子衍生而得,或者其中与分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结合区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得,该被固定的复合物是通过复合物中的第一抗原分子被固定在固体支撑上的;
(d)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(c)中所定义的复合物,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
本发明的试剂盒中的其它接触方法还可以是,例如在上述接触步骤之前并不先提供固定一种或多种第一抗原分子或其变异体、类似物、衍生物、或片段,或这些物质的一种或多种融合分子的方法,而是先提供固体支持物与用于结合一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或一种或多种这些物质的融合分子的结合剂相接触的方法,对于这种试剂盒,其还包括随后将处理后的固体支持物与所述一种或多种第一和第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,或一种或多种这些物质的融合分子以及待检体液样本接触的方法。
关于本发明的试剂盒采用的固体支持物和条件,与已知免疫测试技术中所惯用的固体支持物和条件并没有根本的区别。本发明所采用的固体支持物包括已知ELISA技术中常用的ELISA板,或其它适宜支持物,诸如管、颗粒、磁珠、硝酸纤维或类似物。
本发明所提供的与选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的一种或多种抗原分子发生反应的分析物自身抗体的检测方法,或利用本发明的试剂盒,可以用来诊断与该分析物自身抗体有关的一些疾病。尤其是,本发明能够用来筛选动物受试体的体液样本,所述动物疑似患有或已经患有下述疾病:1型糖尿病和/或僵人综合征、2型糖尿病、一种或多种自身免疫性甲状腺疾病、乳糜泄、一种或多种结缔组织疾病、肾上腺自身免疫性疾病、或两种或多种不同自身免疫性疾病并存,本发明进一步提供了诊断动物受试体中上述任一疾病的方法。
从上述内容可以获知本发明提供了用于检测动物受试体的体液样本中的分析物自身抗体的测试方法和检测用试剂盒,该自身抗体与一种或多种抗原分子发生反应,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,并能够提供患有上述疾病或该疾病征兆的指示。通过检测体液样本中的这种自身抗体(或至少样本中该自身抗体的水平)而得到受试体很有可能患有所述疾病的指示,从而使这些疾病或其初始征兆能够得到诊断。
本发明进一步提供一种诊断动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗体有关的疾病或该疾病初始征兆的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,该方法包括检测与一种或多种抗原分子反应的自身抗体,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,并能够提供上述受试体体液样本中具有所述疾病或疾病初始征兆的指示,据此,检测出的自身抗体能够提供是否患有所述疾病或该疾病初始征兆的指示。
本发明还进一步提供了一种延迟或预防动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗体有关的疾病或该疾病初始征兆的方法,或治疗或治愈患有这种疾病的动物(尤其是人类)患者的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,该方法包括先检测所述受试体体液样本中的所述自身抗体,并给予所述疾病或疾病初始征兆的指示,因此得以诊断受试体是否患有所述疾病或具有该疾病的初始征兆,并给予至少受试体一种治疗有效量的治疗剂,该治疗剂的作用是延迟疾病初始征兆的出现、排除、预防和/或治疗这些疾病。
本发明进一步提供了一种评定延迟或预防动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗体有关的疾病出现的有效性的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,或评定治疗或治愈动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗体有关的疾病的有效性的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,该方法包括至少给予受试体一种治疗有效量的治疗剂,该治疗剂的作用是延迟疾病出现、排除、预防和/或治疗这种疾病,并检测受试体体液样本中的所述自身抗体,并给予患有疾病或疾病出现的指示,因此提供了治疗、延迟或预防这种疾病出现的有效性的指示。
本发明进一步提供了一种如上所述的试剂盒以及至少一种治疗有效量的治疗剂,该治疗剂的作用是治疗与一种或多种抗原分子反应的自身抗体有关的疾病,所述抗原选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素。
本发明中用于筛选的体液样本一般地包括血样或其它液体血组成,如血清样或血浆样,而样本也可以是其它的生物液体,诸如唾液或尿液或被溶解的组织提取液。
本发明所使用的术语“抗原”或“抗原分子”表示与本发明所述抗体发生反应的化合物,且该抗原能够与抗体结合而形成特定的抗体-抗原复合物。抗原或抗原分子可以是天然的或合成的,其修饰物优选为不损害它与特异性抗体相结合的性质。
如上所述,本发明还使用了抗原分子的“变异体”、“类似物”、“衍生物”和“片段”,术语“变异体”、“类似物”、“衍生物”和“片段”表示主要保留了天然抗原分子相同生物功能或活性,尤其是其与特异性抗体结合性质的多肽。本发明所述变异体、类似物、衍生物和片段以及片段的变异体、类似物、衍生物具有一个一级结构的氨基酸,其中天然抗原分子中的几个(如5至10、1至5或1至3)氨基酸残基被取代、删除或添加或以这些方式的任意组合而进行修饰。尤其优选的是沉默取代、添加和删除,这样的修饰不改变或者不显著改变天然抗原分子的生物活性或功能。保守型取代是下面大篇幅所述的优选取代方式。
更具体而言,本发明适宜的抗原分子的变异体、类似物或衍生物可以是其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)所取代的抗原分子,或其中一个或多个氨基酸残基包括取代基或类似物的抗原分子。
最典型的变异体、类似物或衍生物是通过保守性氨基酸取代而与参照物(如本发明所述的天然抗原分子)不同的分子。这种取代是用具有类似性质的其它氨基酸取代多肽中的特定氨基酸。典型的保守型取代是脂肪氨基酸A、V、L和I、羟基残基S和T、酸性残基D和E、氨基残基N和Q、碱性残基K和R、芳香残基F和Y之间的相互替代。
更具体而言,本发明所用术语“片段”表示氨基酸序列与天然氨基酸中的部分而不是全部氨基酸相同的多肽,其变异体或衍生物和该片段可以是“独立”的,即不是部分存在或被融合至其它氨基酸或多肽中,或可以存在于更大的多肽中,由其自身构成一部分或一区域。本发明优选的片段可以是一个或多个所述抗原分子的表位,且该表位片段可以“独立”形式使用或存在于更大多肽如骨架多肽中,其中这些片段自身构成一部分或一区域。与使用全长抗原相比,这些表位片段以分离或独立形式使用更能增强稳定性和/或提高特异性。
本发明将通过下述实施例进一步给予举例说明,但并不意于限制本发明的保护范围。
实施例
GAD包被的ELISA板的制备
由SDS-PAGE测定的纯度>95%的人重组GAD65(M Powell,L Prentice,TAsawa,R Kato,J Sawicka,H Tanaka,V Petersen,A Munkley,S Morgan,B ReesSmith,JFurmaniak.Clinica Chimica Acta,1996 256:175-188)在包被缓冲液中被稀释至150μg/L,该缓冲液包括1.59g/L Na2CO3、2.94g/L NaHCO3、0.1g/LNaN3、0.01g/L酚红和5mg/L BSA(pH9.2),将150μL的稀释溶液加入96孔ELISA板(商品名为Nunc F8 MaxiSorp)中。然后在4℃下,包被该板过夜,吸出孔中物质,用高盐缓冲液(HSB)清洗三次,该缓冲液包括10g/L BSA,1g/LNaN3,11.69g/L NaCl,18.17g/L Tris,和10mL/L聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(商品名为Tween 20(pH8.3))。将后包被缓冲液加入到孔中(每孔250μL),该缓冲液包括3g/L BSA、9g/LNaCl、20g/L蔗糖和0.2g/L NaN3,室温下培养30分钟。然后吸出后包被缓冲液,真空干燥,4℃下,在用硅胶的密封袋中储存备用。
用生物素标记GAD65
PBS(1.15g/L Na2HPO4,0.2g/L KH2PO4,0.2g/L KCl,8g/L NaCl)中的人重组GAD65与商用生物素化试剂(sulfo-NHS-LC-LC-生物素,商品名为EZ-Link,Perbio Science制造)反应,摩尔比为1份的GAD65比24份的生物化试剂,室温下反应30分钟。4℃下对PBS透析使反应停止,在-70℃下,将得到的物质分为小等份进行储藏。
将利用上述技术获得的生物素标记GAD65(GAD65-Bi)在20g/L BSA中被稀释至3mg/L,通过0.22μm过滤器过滤,以每小瓶1mL等分,冷冻干燥,然后在-20℃下储藏。使用时,每小瓶加入7.5mL的HSB,使GAD65-Bi的浓度为400μg/L。
制备GAD65自身抗体测试的校准品
将GAD65的三种人单克隆抗体的IgG制备液(M J Powell,N Hayakawa,MMasuda,J Sanders,M Evans,LDKE Premawardhana,J Furmaniak,B Rees Smith.Isolation and characterization of three human monoclonal antibodies to glutamicacid decarboxylase(GAD65)from a patient without clinical diabetes.Diabetes/Metabolism Research and Reviews,2001 17(S1):021)在HSB中稀释,使450nm时的光密度为4.0至0.1。这些单克隆抗体是已知的1型糖尿病患者血清中GAD65的代表性自身抗体(M J Powell,N Hayakawa,M Masuda,JSanders,M Evans,LDKE Premawardhana,JFurmaniak,B Rees Smith.Isolationand characterization of three human monoclonal antibodies to glutamic aciddecarboxylase(GAD65)from a patient without clinical diabetes.Diabetes/Metabolism Research and Reviews,2001 17(S1):021)。
GAD65自身抗体检测
根据上述技术制备的包被有GAD65的板置于室温中,将25μL待测供体的未稀释血清样本或校准品加到板上的孔中,一式两份,在室温下培养1个小时并以200rpm进行振荡。然后吸出样品,用缓冲液(8.7g/L NaCl,2.4g/L Tris,0.5mL/L Tween 20,pH7.6)清洗孔三次,随后加入100μL的GAD65-Bi,该GAD65-Bi根据上述方法在HSB(400μg/L)中稀释制得,将板在室温下培养1个小时,同时200rpm振荡。吸出孔中的培养物,用缓冲液(8.7g/L NaCl,2.4g/LTris,0.5mL/L Tween20,pH7.6)清洗孔三次。然后,加入100μL稀释浓度为1μg/mL的抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶结合物,在室温下培养20分钟,200rpm振荡。吸出培养物后,用缓冲液(8.7g/L NaCl,2.4g/L Tris,0.5mL/LTween20,pH7.6)清洗孔三次,用水洗一次。然后加入100μL四甲基联苯胺(TMB),在暗处培养20分钟,随后加入50μL的0.5mol/L H2SO4。然后在ELISA板读数器中测定450nm时孔的吸收度或者在样本450nm的OD>4.0时,测量405nm时的吸收度。
将上述步骤应用到IA-2自身抗体以及GAD65与IA-2自身抗体的联合检测中(尤其是涉及制备生物素标记的IA-2,IA-2-Bi)。用于绘制校准曲线的IA-2自身抗体的参照制备液是由多克隆IA-2自身抗体制备得到。
结果
450nm时GAD65的OD值校准曲线如图1a所示。该曲线的测定对象包括7个任意分配的GAD65自身抗体校准品,ELISA单位从0ELISA单位/mL至512ELISA单位/mL。对于校准品0,1.0,2.0,8.0,32,128和512,450nm时的OD值分别为0.033,0.168,0.310,1.020,3.187,>4.0和>4.0。图1b显示了校准品1.0,2.0,8.0,32,128和512,405nm时的OD值分别为0.008,0.048,0.090,0.290,0.929,1.385和1.620。随后,450nm时的OD值>4.0的样本可以在如图1b所示的OD405nm的校准曲线内测量。对于n=25的健康献血者血清而言,450nm时的平均±SD吸收度为0.04±0.015。
本发明的GAD65自身抗体的结果如表1和2所示。表1列出了n=18的1型糖尿病患者和n=14的甲状腺机能亢进患者(Graves′disease)血清中的GAD65自身抗体结果。当采用ELISA技术,所有18例糖尿病患者血清的GAD65自身抗体检测都为阳性(水平>1.0ELISA单位/mL),然而采用放射免疫测试法(RIA)时,只有13名患者为阳性。RIA检测中显阴性的5例样本在ELISA检测中显示了低水平的GAD65自身抗体,其450nm时的OD值在0.117至0.980之间(1.3至10.7ELISA单位/mL)。RIA检测中的低水平样本(1.0至7.5RIA单位/mL),ELISA检测时450nm的OD值在0.290和1.060之间(12.0至105.8ELISA单位/mL)。RIA检测的较高水平的GAD65自身抗体(26.8至118.8RIA单位/mL),利用ELISA技术检测的450nm时的OD值都非常高,>4.0(>128ELISA单位/mL),因此,样本中的GAD65自身抗体水平和校准曲线的关系在测量405nm的吸收度后再计算。在进行ELISA测试之前,将待测血清与未标记的GAD65(最终浓度为0.0005至0.01ug/mL)进行预培养会导致450nm时的OD值产生剂量依赖性的降低。这些实验确证了本发明的ELISA技术检测中GAD65自身抗体的特异性。
对于n=14的甲状腺机能亢进患者,所有样本的450nm时的OD值都低于0.05(<1ELISA单位/mL,采用本发明的ELISA技术检测);用RIA检测GAD65自身抗体时,所有样本都显阴性(<1RIA单位/mL)。
ELISA和RIA检测GAD65自身抗体的最低检测限值如表2所示。RIA检测时,胰岛细胞自身抗体的WHO参照制备液[NIBSC 97/550]的稀释度为250至31.25WHO单位/mL,可检测到GAD65水平。而利用本发明的ELISA技术时,可检测到GAD65自身抗体的WHO标准稀释浓度为250至3.91WHO单位/mL。血清样本Z(来自具高水平GAD65自身抗体的患者)的稀释特征的实施例如表2所示。RIA可检测到GAD65自身抗体的样本Z的稀释度范围为1/8至1/8192。ELISA技术检测到GAD65自身抗体的样本Z的稀释度范围为1/8至1/32768。通过对WHO标准品和患者血清的终点稀释度分析,显示采用ELISA技术可检测到自身抗体的稀释度高于RIA检测的4至8倍。
采用ELISA技术检测的IA-2自身抗体的结果实例如表3所示。450nm时IA-2自身抗体OD校准值(0,1.0,2.0,4.0,8.0,16,32,64,128ELISA单位/mL)为0.054至>4.0,OD405nm值为0.008至1.874。在RIA测试中,IA-2自身抗体水平为2.0至38.9RIA单位/mL的n=10的1型糖尿病患者的血清在ELISA测试中都显阳性。这些样本450nm的OD值在0.209至>4.0(2.6至>32ELISA单位/mL)之间。在250WHO单位/mL和125WHO单位/mL的IA-2自身抗体RIA中,可检测到WHO标准品,而利用ELISA技术可检测到该WHO标准品的进一步稀释液(62.5WHO单位/mL和31.25WHO单位/mL)中的抗体。n=10的健康献血者血清(RIA检测IA-2自身抗体时,都显阴性)450nm的OD值为0.030和0.071(<1ELISA单位/mL)之间。
表4和5显示了联合检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的结果。表4显示了利用ELISA技术联合检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的结果,检测中采用了IA-2-Bi或GAD65-Bi或IA-2-Bi+GAD65-Bi。在IA-2自身抗体校准品中,使用GAD65-Bi时,ELISA检测中没有任何吸收信号,而当使用IA-2-Bi或IA-2-Bi+GAD65-Bi时,观察到450nm的OD值的剂量依赖性增加。单独的IA-2-Bi与IA-2-Bi+GAD65-Bi的450nm OD值基本相同。在检测中使用IA-2-Bi时,GAD65自身抗体校准品中没有检测到任何吸收信号,而使用GAD65-Bi和IA-2-Bi+GAD65-Bi时,观察到450nm的OD值剂量依赖性反应。比较单独的GAD65-Bi与IA-2-Bi+GAD65-Bi+GAD65-Bi 450nm时的OD值。检测血清样本Z的不同稀释浓度中的两种抗体,显示了与单独检测IA-2自身抗体或GAD65自身抗体的结果相吻合。来自健康献血者血清或健康献血者血清池的血清的450nmOD值非常低,为从0.006至0.046,与使用的生物素标记抗原种类无关。该实验显示了联合检测IA-2自身抗体和GAD65自身抗体时,结果是确定的,说明测试样本中存在两种自身抗体。
表5显示了联合检测IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的更为详细的结果。测定了1型糖尿病患者的血清。利用RIA测定了这些血清的IA-2自身抗体和GAD65自身抗体;血清1-3中IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的检测都为阳性,血清4-6中GAD65自身抗体检测为阴性,而IA-2自身抗体为阳性,血清7-9中GAD65自身抗体检测为阳性,IA-2自身抗体为阴性,血清10-12中IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的检测都为阴性。如表5所示,在联合检测中,血清样本中检测到一种或另一种或两种自身抗体。RIA检测的血清6中的IA-2自身抗体处于边界水平(0.9RIA单位/mL),联合ELISA技术检测中的吸收信号明显为阳性。
表6、7和8分别显示ELISA检测不同患者亚组中GAD65自身抗体、IA-2自身抗体以及GAD65和IA-2自身抗体混合结果的其它实例。
结论
上述结果显示了本发明的非放射技术可以用来检测待测样本中的GAD65自身抗体。非放射技术也可以用来分别或同时地检测IA-2自身抗体,其测试结果确定,且与已建立的放射参照方法结果吻合(M Powell,L Prentice,TAsawa,R Kato,J Sawicka,H Tanaka,V Petersen,A Munkley,S Morgan,B ReesSmith,JFurmaniak.Clinica Chimica Acta,1996 256:175-188;and M Masuda,MPowell,S Chen,C Beer,P Fichna,B Rees Smith,JFurmaniak.AutoantibodiestoIA-2 in insulin-dependent diabetes mellitus.Measurements with a newimmunoprecipitation assay.Clinica Chimica Acta,2000 291:53-66)。而且,利用本发明的非放射技术检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的灵敏度至少与RIA检测相同(表1,2和3)。
本发明技术提供了非放射测试法来检测GAD65自身抗体或IA-2自身抗体,该方法灵敏度高,可方便地用于诊断和筛选中。本发明对于GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的联合检测法在多人群筛选中尤其有利。
表1
本发明ELISA检测患者血清中的GAD65自身抗体和放射免疫检测法(RIA)基于125I-标记的GAD65检测GAD65自身抗体
样本 | ELISAELISA单位/ml | OD450nm | OD450nm | RIARIA单位/ml |
1型DM血清样本 | ||||
1 | 10.7 | 0.980 | 0.254 | <1.0 |
2 | 8.1 | 0.660 | 0.158 | <1.0 |
3 | 2.1 | 0.183 | 0.024 | <1.0 |
4 | 1.3 | 0.117 | 0.001 | <1.0 |
5 | 4.4 | 0.432 | 0.091 | <1.0 |
6 | >128 | >4.0 | 2.100 | 74.3 |
7 | >128 | >4.0 | 2.283 | 118.8 |
8 | >128 | >4.0 | 2.155 | 83.2 |
9 | >128 | >4.0 | 2.230 | 87.4 |
10 | >128 | >4.0 | 2.023 | 83.0 |
11 | >128 | >4.0 | 1.774 | 41.9 |
12 | >128 | >4.0 | 1.554 | 26.8 |
13 | 105.8 | 3.596 | 1.060 | 7.5 |
14 | 21.9 | 1.830 | 0.485 | 3.6 |
15 | 20.2 | 1.735 | 0.466 | 3.1 |
16 | 12.0 | 1.116 | 0.290 | 1.5 |
17 | 43.4 | 2.615 | 0.732 | 4.7 |
18 | 20.8 | 1.771 | 0.473 | 2.2 |
甲状腺机能亢进患者血清样本 | ||||
1 | <1.0 | 0.015 | <1.0 |
2 | <1.0 | 0.019 | <1.0 | |
3 | <1.0 | 0.049 | <1.0 | |
4 | <1.0 | 0.048 | <1.0 | |
5 | <1.0 | 0.008 | <1.0 | |
6 | <1.0 | 0.031 | <1.0 | |
7 | <1.0 | 0.036 | <1.0 | |
8 | <1.0 | 0.033 | <1.0 | |
9 | <1.0 | 0.029 | <1.0 | |
10 | <1.0 | 0.037 | <1.0 | |
11 | <1.0 | 0.036 | <1.0 | |
12 | <1.0 | 0.042 | <1.0 | |
13 | <1.0 | 0.041 | <1.0 | |
14 | <1.0 | 0.047 | <1.0 |
注:高于1RIA单位/mL的GADAb水平为RIA测试阳性。1型DM=1型糖尿病。
表2
ELISA和RIA测试GAD65Ab的灵敏度比较
样本 | ELISAELISA单位/ml | OD405nm | OD405nm | RIARIA单位/ml |
WHO标准品(97/550) | ||||
250 | >128 | >4.0 | 1.234 | 6.4 |
125 | 45.5 | 2.670 | 0.742 | 3.6 |
62.5 | 17.4 | 1.557 | 0.422 | 2.5 |
31.25 | 10.0 | 0.894 | 0.225 | 1.1 |
15.63 | 4.4 | 0.431 | 0.095 | <1.0 |
7.81 | 2.2 | 0.202 | 0.023 | <1.0 |
3.91 | 1.2 | 0.100 | 0.00 | <1.0 |
1.95 | <1.0 | 0.058 | 0.00 | <1.0 |
0.98 | <1.0 | 0.031 | 0.00 | <1.0 |
样本Z | ||||
1/8 | >128 | >4.0 | 2.048 | 91 |
1/32 | >128 | >4.0 | 1.868 | 76 |
1/128 | >128 | >4.0 | 1.769 | 38 |
1/512 | >128 | >4.0 | 1.591 | 13 |
1/1024 | 90 | 3.714 | 1.120 | 5.6 |
1/2048 | 29.4 | 2.542 | 3.1 | |
1/4096 | 12.0 | 1.375 | 1.4 | |
1/8192 | 6.9 | 0.784 | 1.0 | |
1/16384 | 2.8 | 0.385 | <1.0 | |
1/32768 | 1.6 | 0.210 | <1.0 | |
1/65536 | <1.0 | 0.132 | <1.0 | |
1/131072 | <1.0 | 0.092 | <1.0 | |
1/262144 | <1.0 | 0.055 | <1.0 |
注:高于1RIA单位/mL的GADAb水平为RIA测试阳性。*WHO单位/mL。
表3
用ELISA和基于125I-标记的IA-2/ICA512的RIA方法检测IA-2/ICA512自身抗体
样本 | ELISAELISA单位/ml | OD405nm | OD405nm | RIARIA单位/ml |
IA-2Ab校准品 | ||||
0 | 0.054 | 0.008 | ||
1 | 0.114 | 0.021 | ||
2 | 0.183 | 0.040 | ||
4 | 0.313 | 0.073 | ||
8 | 0.614 | 0.166 | ||
16 | 1.219 | 0.340 | ||
32 | 2.506 | 0.719 | ||
64 | >4 | 1.371 | ||
128 | >4 | 1.874 | ||
1型DM血清样本 | ||||
1 | >32 | >4 | 1.420 | 14.8 |
2 | >32 | >4 | 1.594 | 38.9 |
3 | 11.2 | 0.859 | 0.228 | 2.8 |
4 | >32 | >4 | 2.096 | 22.7 |
5 | >32 | >4 | 2.348 | 33.9 |
6 | 6.5 | 0.516 | 0.140 | 6.3 |
7 | >32 | >4 | 2.354 | 15.8 |
8 | 4.1 | 0.265 | 0.067 | 2.9 |
9 | 2.6 | 0.209 | 0.055 | 2.3 |
10 | 8.4 | 0.664 | 0.179 | 2.0 |
WHO标准品 | ||||
(97/550)* |
250 | 18.8 | 1.503 | 2.0 | |
125 | 9.2 | 0.721 | 1.2 | |
62.5 | 4.0 | 0.337 | <1.0 | |
31.25 | 2.0 | 0.191 | <1.0 | |
15.63 | <1.0 | 0.116 | <1.0 | |
7.81 | <1.0 | 0.093 | <1.0 | |
健康献血者血液 | ||||
1 | <1.0 | 0.030 | <1.0 | |
2 | <1.0 | 0.036 | <1.0 | |
3 | <1.0 | 0.043 | <1.0 | |
4 | <1.0 | 0.045 | <1.0 | |
5 | <1.0 | 0.070 | <1.0 | |
6 | <1.0 | 0.045 | <1.0 | |
7 | <1.0 | 0.063 | <1.0 | |
8 | <1.0 | 0.037 | <1.0 | |
9 | <1.0 | 0.071 | <1.0 | |
10 | <1.0 | 0.069 | <1.0 |
注:高于1RIA单位/mL的IA-2/ICA512Ab水平为RIA测试阳性。1型DM=1型糖尿病。*WHO单位/mL。
表4
ELISA检测GAD65Ab和IA-2/ICA512Ab混合物
样本ELISA单位/mL | IA-2-BiOD450nm | GAD65-BiOD450nm | GAD65-Bi+IA-2-BiOD450nm |
IA-2Ab校准品 | |||
8 | 1.314 | 0.022 | 1.252 |
16 | 2.730 | 0.033 | 2.574 |
32 | 3.888 | 0.031 | 3.824 |
GAD65Ab校准品 | |||
4 | 0.053 | 0.460 | 0.458 |
16 | 0.045 | 1.518 | 1.400 |
32 | 0.043 | 2.033 | 2.160 |
血清样本Z | |||
稀释1/2 | 3.069 | >4 | >4 |
1/4 | 2.328 | >4 | >4 |
1/8 | 0.905 | >4 | >4 |
1/16 | 0.401 | 3.936 | 3.875 |
1/32 | 0.197 | 3.379 | 3.626 |
1/64 | 0.143 | 2.209 | 2.512 |
1/128 | 0.069 | 1.718 | 1.571 |
健康献血者血清 | 0.019 | 0.006 | 0.023 |
健康献血者血清池 | 0.022 | 0.015 | 0.046 |
表5
ELISA检测GAD65Ab和IA-2/ICA512Ab混合物
样本ELISA单位/mL | OD450nm | OD450nm | GAD65Ab RIARIA单位/mL | IA-2/ICA512Ab RIARIA单位/mL |
GAD65Ab校准品 | ||||
0 | 0.080 | 0.028 | ||
2 | 0.231 | 0.070 | ||
8 | 0.737 | 0.219 | ||
16 | 1.476 | 0.436 | ||
32 | 2.117 | 0.613 | ||
64 | 2.648 | 0.755 | ||
128 | 3.607 | 1.083 | ||
IA-2Ab校准品 | ||||
0 | 0.065 | 0.025 | ||
2 | 0.205 | 0.054 | ||
4 | 0.308 | 0.081 | ||
8 | 0.552 | 0.154 | ||
16 | 1.116 | 0.327 | ||
32 | 2.031 | 0.590 | ||
64 | 3.596 | 1.079 | ||
128 | >4 | 1.777 | ||
1型DM血清样本 | ||||
1 | >4 | 1.646 | 10.8 | 14.8 |
2 | >4 | 1.964 | 50.2 | 39.0 |
3 | 1.640 | 0.481 | 3.1 | 2.8 |
4 | >4 | 1.927 | 阴性 | 22.7 |
5 | >4 | 2.428 | 阴性 | 39.9 |
6 | 0.298 | 0.100 | 阴性 | 0.9 |
7 | 3.594 | 1.063 | 26.8 | 阴性 |
8 | >4 | 2.092 | 253.0 | 阴性 |
9 | 1.874 | 0.554 | 2.2 | 阴性 |
10 | 0.068 | 0.040 | 阴性 | 阴性 |
11 | 0.074 | 0.029 | 阴性 | 阴性 |
12 | 0.066 | 0.021 | 阴性 | 阴性 |
健康献血者血清池 | 0.073 | 0.020 | 阴性 | 阴性 |
注:高于1RIA单位/mL的GAD65Ab水平为RIA测试阳性。高于1RIA单位/mL的IA-2/ICA512Ab水平为RIA测试阳性。1型DM=1型糖尿病。
表6
ELISA或放射免疫测试法(RIA)根据125I-标记的GAD65检测不同患者组的GAD65Ab
ELISA显阳性数(%)(5单位/mL或更高=阳性) | RIA显阳性数(%)(25单位/mL或更高=阳性) | |
健康献血者血液n=300 | 2/300(0.7%)1 | 3/300(1%)2 |
1型DMn=39 | 39/39(100%)3 | 32/39(82%)4 |
2型DMn=62 | 1/62(1.6%)5 | 0/62(0%) |
甲状腺机能亢进n=88 | 2/88(2.3%)6 | 3/88(3.4%)7 |
桥本甲状腺炎n=11 | 1/11(9%)8 | 0/11 |
类风湿关节炎n=10 | 0/10 | 0/10 |
系统性红斑狼疮n=10 | 1/10(10%)9 | 1/10(10%)9 |
1ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品,数值为11单位/mL和>500单位/mL(所有单位/mL都是WHO 97/550)。吸收实验表明存在特异性GAD65Ab。用RIA分别检测相同样本,显示阴性以及2500单位/mL。
2RIA检测GAD65Ab显阳性的样本,数值为33、100、2500单位/mL。用ELISA分别检测相同样本,显示阴性、阴性以及>500单位/mL。
3数值范围:5.2至>500单位/mL。
4数值范围:阴性至3800单位/mL。
5ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品,数值为40单位/mL。用RIA检测相同样本,显阴性。
6ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品,数值为306和500单位/mL。用RIA分别检测相同样本,数值为354和1700单位/mL。
7RIA检测GAD65Ab显阳性的样品,数值为78、354和1700单位/mL。用ELISA分别检测相同样本,分别为阴性、306和500单位/mL。
8ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品数值为24单位/mL。用RIA检测该样本显阴性。
9ELISA和RIA检测GAD65Ab显阳性的相同样品,数值分别为15单位/mL和30单位/mL。
表7
ELISA或基于125I-标记IA-2的放射免疫测试法(RIA)测定不同患者组的IA-2Ab
ELISA显阳性数(%)(30单位/mL或更高=阳性) | RIA显阳性数(%)(125单位/mL或更高=阳性) | |
健康献血者血液n=210 | 2/210(1%)1 | 2/210(1%)2 |
1型DMn=30 | 12/30(40%)3 | 12/30(40%)4 |
2型DMn=62 | 1/62(1.6%)5 | 0/62 |
甲状腺机能亢进n=102 | 0/102 | 0/102 |
类风湿关节炎n=10 | 0/10 | 0/10 |
系统性红斑狼疮n=10 | 1/10 | 1/10 |
1ELISA检测IA-2显阳性的样品,数值为44单位/mL和179单位/mL(所有单位/mL都是WHO 97/550)。吸收实验表明样本中存在特异性IA-2Ab。用RIA检测相同样本,显阴性。
2RIA检测IA-2Ab显阳性的样本,数值为150和288单位/mL。ELISA检测相同样本,显阴性。
3数值范围:132至>4000单位/mL。
4数值范围:178至4508单位/mL。
5IA-2Ab显阳性的样品为101单位/mL。用RIA检测相同样本,显阴性。
表8
不同患者组中的GAD65Ab ELISA、IA-2Ab ELISA和GAD65Ab+IA-2Ab ELISA的检测结果
显阳性数(%) | |||
GAD65AbELISA | IA-2AbELISA | GAD65Ab+IA-2Ab ELISA | |
1型DMn=35 | 28/351(80%) | 14/352(40%) | 33/353(94.3%) |
2型DMn=44 | 1/444(2.3%) | 1/445(2.3%) | 2/446(4.5%) |
健康献血者血液n=73 | 2/737(2.7%) | 0/73(0%) | 2/738(2.7%) |
甲状腺机能亢进n=20 | 0/20(0%) | 0/20(0%) | 0/20(0%) |
类风湿关节炎n=10 | 0/10(0%) | 0/10(0%) | 0/10(0%) |
系统性红斑狼疮n=10 | 1/109(10%) | 0/10(0%) | 1/1010(10%) |
1ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品,数值范围为7.3至>500单位/mL(单位/mL为WHO 97/550)。
2ELISA检测IA-2显阳性的样品,数值范围为34至3613单位/mL和179单位/mL(单位/mL为WHO 97/550)。
3所有组合的ELISA检测结果按照如下计算表示:
样本的OD450nm值
健康献血者血清池的OD450nm值;
数值为2.0或更高为阳性
18例血清对于GAD65Ab的检测为阳性,对于IA-2Ab的检测为阴性;所有18例血清在ELISA联合检测中为阳性。
4例血清对于GAD65Ab的检测为阳性,对于IA-2Ab的检测为阴性;所有4例血清在ELISA联合检测中为阳性。
10例血清对于GAD65Ab和IA-2Ab的检测都为阳性;所有10例血清在ELISA联合检测中为阳性。
1例血清对于GAD65Ab和IA-2Ab的检测都为阴性,但在ELISA联合检测中为阳性。
2例血清在所有3种检测中都显阴性。
4在一个阳性样本中,GAD65Ab的检测水平为10单位/mL,而对于IA-2Ab的检测显阴性。
5在一个阳性样本中,对于GAD65Ab的检测显阴性,而IA-2 Ab的检测水平为76单位/mL。
6阳性样本与4和5中的样本相同(给定值分别为7.8和4.8)。
ELISA检测不同患者组中GAD65Ab、IA-2Ab和GAD65Ab+IA-2Ab的结果。
7在两个阳性样本中,GAD65Ab水平为9和>500单位/mL,而对于IA-2Ab的检测显阴性。
8阳性样本与7中的样本相同。这些样本的给定值分别为3.6和55.0。
9GAD65Ab水平为15单位/mL,而IA-2Ab的检测显阴性。
10阳性样本与9中的样本相同。给定值为6.0。
Claims (55)
1.一种筛选动物受试体体液样本中能与一种或多种抗原分子发生反应的分析物自身抗体的方法,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述受试体体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素,以及它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子、或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与分析物自身抗体结合的区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接的可检测标记物,由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
2.根据权利要求1的方法,其中能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,和GAD65、GAD67、IA-2或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
3.根据权利要求2的方法,其中能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
4.根据权利要求3的方法,其包括提供能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、且主要由GAD组成的第一抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,根据步骤(e)被固定在固体支持物上;还提供与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、主要由GAD组成的第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,它们被步骤(f)提供的标记物所标记。
5.根据权利要求3的方法,其包括提供能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由IA-2组成的第一抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自LA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,根据步骤(e)被固定在固体支持物上;还提供能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由IA-2组成的第二抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,它们被步骤(f)提供的标记物所标记。
6.根据权利要求3的方法,其包括提供(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD第一和第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子按照步骤(e)被固定到固体支持物上,且所述GAD第二抗原分子被步骤(f)提供的标记物所标记;以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中至少一种融合分子中的抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子按照步骤(e)被固定到固体支持物上,且所述IA-2第二抗原分子被步骤(f)提供的标记物所标记。
7.一种筛选动物受试体体液样本中能与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的方法,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述的受试体体液样本;
(b)提供能与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)提供能与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子、或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域位于一种共同的抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后给予固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后,给予直接或间接的可检测标记物,由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
8.一种筛选动物受试体体液样本中能与GAD或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、且主要由GAD抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子根据步骤(d)被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子被步骤(e)提供的标记物所标记;
(c)将步骤(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述GAD第二抗原分子];
(d)在步骤(c)之前或之中或之后给予固定方法,由此步骤(c)形成的复合物中的GAD第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(e)在步骤(c)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记物,由此步骤(c)形成的复合物中的GAD第二抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(f)检测是否存在步骤(d)中所固定的、在步骤(c)中形成的复合物,以得到所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
9.一种筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述受试体的所述体液样本;
(b)提供能与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、且主要由IA-2抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中,抗原分子选自IA-2和它的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子根据步骤(d)被固定到固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子根据步骤(e)的标记方法被标记;
(c)将步骤(b)提供的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述IA-2抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(d)在步骤(c)之前或之中或之后给予固定方法,由此步骤(c)形成的复合物中的IA-2第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(e)在步骤(c)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记物,由此步骤(c)形成的复合物中的IA-2第二抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(f)检测是否存在步骤(d)所固定的、步骤(c)所形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
10.一种筛选动物受试体体液样本中能分别与GAD和IA-2,或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的第一和第二分析物自身抗体的方法,所述方法包括:
(a)提供所述的受试体体液样本;
(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原分子,GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子根据步骤(e)被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子被步骤(f)的标记物所标记;
(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子根据步骤(e)被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子被步骤(f)提供的标记物所标记;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法,由此步骤(d)形成的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持物上;
(f)在步骤(d)之前或之中或之后,提供直接或间接的可检测标记物,由此步骤(d)形成的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;
(g)检测是否存在步骤(e)中固定的、步骤(d)中形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
11.根据权利要求1至10任意一项的方法,其中,所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种或多种共同的抗原分子。
12.根据权利要求11,即从属于权利要求1至4、6至8或10中任意一项的方法,其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括GAD65或GAD67。
13.根据权利要求11,即从属于权利要求1至3、5至7、9或10中任意一项的方法,其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括IA-2。
14.根据权利要求1至10任意一项的方法,其中,一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子之一选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,而另一存在于一种或多种复合物中的抗原分子包含上述抗原分子的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段,它们能与所述体液样本中的自身抗体发生反应。
15.根据权利要求14,即从属于权利要求1至4、6至8或10中任意一项的方法,其中,与所述体液样本中自身抗体反应的一种或多种复合物中的第一或第二抗原中的一种包括GAD65或GAD67,而另一种存在于一种或多种复合物中的抗原分子包括GAD65或GAD67的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。
16.根据权利要求14,即从属于权利要求1至3、5至7、9或10中任意一项的方法,其中,一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子中的一种包括IA-2,而另一存在于一种或多种复合物中的抗原分子包含IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,它们能与所述体液样本中的自身抗体发生反应。
17.根据权利要求1至11任意一项的方法,其中,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子都包括同一抗原分子的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段,它们能与所述体液样本中自身抗体反应。
18.根据权利要求17,即从属于权利要求1至4、6至8或10中任意一项的方法,其中,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子都包括GAD65或GAD67的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段,它们能与所述体液样本中的自身抗体反应。
19.根据权利要求17,即从属于权利要求1至3、5至7、9或10中任意一项的方法,其中,一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子都包括IA-2的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段,它们能与所述体液样本中的自身抗体反应。
20.根据权利要求1至19任意一项的方法,其中,所述一种或多种第一抗原在与待检体液样本接触之前被固定在固体支持物上。
21.根据权利要求20的方法,其中,在体液样本与一种或多种第二抗原分子接触的同时或者随后,所述被固定的一种或多种第一抗原分子与筛选的体液样本接触。
22.根据权利要求21的方法,其中,所述被固定的一种或多种第一抗原分子随后与待检体液样本相接触,从而形成中间复合物,其包括[抗原分子]-[分析物自身抗体],其中抗原分子被固定到固体支持物上,然后将固定的中间复合物与液相中的一种或多种第二抗原分子接触,从而形成复合物,其包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],该复合物是通过第一抗原分子被固定到固体支持物上。
23.一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的方法,该抗体与一种或多种抗原分子反应,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述方法包括:
(a)提供所述受试体体液样本;
(b)提供一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段;
(c)提供与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,该第二抗原分子存在于液相中;
(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种被固定的复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或是从该共同抗原分子衍生而得,或者其中与分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结合区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得;
(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接检测的标记物,由此,步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记物所标记;和
(f)检测是否存在步骤(d)形成的复合物,以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
24.根据权利要求23的方法,其中所述第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,和GAD65、GAD67、IA-2或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
25.根据权利要求24的方法,其中所述的能与体液样本中分析物自身抗体反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
26.一种用于筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原分子发生反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素、或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、和所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二抗原分子],其中位于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包含一种共同的抗原分子、或由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体结合的区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得;
(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
27.根据权利要求26的试剂盒,其中所述第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,和GAD65、GAD67、IA-2或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
28.根据权利要求27的试剂盒,其中所述与体液样本中分析物自身抗体反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
29.根据权利要求28的试剂盒,其包括提供能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由GAD组成的第一抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67,它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,如(d)中所定义被固定在固体支持物上,和与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由GAD组成的第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,如(e)中所定义被标记物所标记。
30.根据权利要求28的试剂盒,其包括提供能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由IA-2组成的第一抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,如(d)所定义被固定到固体支持物上;以及与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由IA-2组成的第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,如(e)所定义被标记物所标记。
31.根据权利要求28的试剂盒,其包括提供(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD第一和第二抗原分子,所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中融合分子中的至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67,或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(d)所定义被固定到固体支持物上,且所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义被标记物所标记;以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述IA-2抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中融合分子中的至少一种抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(d)所定义被固定到固体支持物上,且所述IA-2第二抗原分子如(e)中所定义被标记物所标记。
32.一种筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子或是由该共同抗原分子衍生而得,或者其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体相结合的区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得;
(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
33.一种筛选动物受试体体液样本中与GAD或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的基本由GAD抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记;
(b)将(a)中抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述GAD第二抗原分子];
(c)所述(b)定义的复合物中的GAD第一抗原分子在GAD第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(d)在GAD第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为(b)定义的复合物中的GAD第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(e)检测是否存在(c)中所固定的、(b)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
34.一种筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、主要由IA-2抗原分子组成的第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记;
(b)将步骤(a)的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子IA-2发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[所述IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述IA-2第二抗原分子];
(c)所述(b)定义的复合物中的IA-2第一抗原分子在IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(d)在IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为(b)定义的复合物中的IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法;
(e)检测是否存在(c)中所固定的、(b)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
35.一种筛选动物受试体体液样本中分别与GAD和IA-2,或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的第一和第二分析物自身抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原分子,GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述GAD第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上,所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记;
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原分子,所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中,抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67,其中,所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,其中所述IA-2第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上,所述IA-2第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记;
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多种复合物,该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二抗原分子];
(d)所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在GAD或IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法;
(e)在GAD或IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测的标记方法;
(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
36.根据权利要求26至35中任意一项的试剂盒,其中第一和第二抗原分子包括一种或多种共同的抗原分子。
37.根据权利要求36,即从属于权利要求26至29、31至33或35中任意一项的试剂盒,其中所述第一和第二抗原分子包括GAD65或GAD67。
38.根据权利要求36,即从属于权利要求26至28、30至32、34或35中任意一项的试剂盒,其中所述第一和第二抗原分子包括IA-2。
39.根据权利要求26至35任意一项的试剂盒,其中,一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子的一种选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,而另一种包括第一或第二抗原分子的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段,它们能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应。
40.根据权利要求39,即从属于权利要求26至29、31至33或35中任意一项的试剂盒,其中,第一或第二抗原中的一种包括GAD65或GAD67,而另一种抗原分子包括GAD65或GAD67的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段,它们能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应。
41.根据权利要求39,即从属于权利要求26至28、30至32、34或35中任意一项的试剂盒,其中,第一或第二抗原分子中的一种包括IA-2,而另一种抗原分子包括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,它们能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应。
42.根据权利要求26至36任意一项的试剂盒,其中,第一和第二抗原分子都包括能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的同一抗原分子的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。
43.根据权利要求42,即从属于权利要求26至29、31至33或35中任意一项的试剂盒,其中,第一和第二抗原分子都包括能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD65或GAD67的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段
44.根据权利要求42,即从属于权利要求26至28、30至32、34或35中任意一项的试剂盒,其中,第一和第二抗原分子都包括能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。
45.根据权利要求26至44任意一项的试剂盒,其包括将所述一种或多种第一抗原在与待检体液样本接触之前被固定到固体支持物上的固定方法。
46.根据权利要求45的试剂盒,其包括在一种或多种第二抗原分子与体液样本接触的同时或者随后,将所述被固定的一种或多种第一抗原分子与体液样本接触的方法。
47.根据权利要求46的试剂盒,其中,接触方法包括被固定的一种或多种第一抗原分子与待检体液样本相接触,从而形成中间复合物,其包括[抗原分子]-[分析物自身抗体],其中抗原分子被固定到固体支持物上,然后将该中间复合物与液相中的一种或多种第二抗原分子接触,从而形成复合物,其包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],该复合物通过第一抗原分子被固定到固体支持物上。
48.一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的试剂盒,该抗体与一种或多种抗原分子反应,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,所述试剂盒包括:
(a)一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,其中,所述第一抗原分子被固定在固体支持物上;
(b)与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分子,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段,该第二抗原分子存在于液相中,并如(d)中所定义被标记物所标记;
(c)(a)和(b)所提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法,由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一种或多种被固定的复合物,该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子],其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共同的抗原分子、或是从该共同抗原分子衍生而得,或者其中与分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结合区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得,该被固定的复合物是通过复合物中的第一抗原分子被固定在固体支持物上的;
(d)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后,为所述(c)定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测的标记方法;
(e)检测是否存在(c)中所定义的复合物的方法,以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
49.根据权利要求48的试剂盒,其中所述第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素,或GAD65、GAD67、IA-2或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
50.根据权利要求49的试剂盒,其中所述与体液样本中分析物自身抗体反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段,以及融合分子,该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子,所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
51.根据权利要求1至25中任意一项的方法,或26至50中任意一项的试剂盒,其中,所述体液样本来自动物受试体,该动物疑似患有、容易患有或已经患有一种或多种以下疾病,1型糖尿病和/或僵人综合征、2型糖尿病、一种或多种自身免疫性甲状腺疾病、乳糜泄、一种或多种结缔组织疾病、肾上腺自身免疫性疾病、或两种或多种不同自身免疫性疾病并存。
52.一种在动物受试体中诊断患有一种或多种与自身抗体有关的疾病的方法,或诊断该疾病初始发生的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,该方法包括利用权利要求1至25中任意一项的方法、或权利要求26至50中任意一项的试剂盒,检测与一种或多种抗原分子反应的自身抗体,所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,检测出的自身抗体能够作为患有所述一种或多种疾病或疾病初始发生的诊断指示。
53.一种延迟或预防动物受试体中与所述自身抗体有关的疾病或疾病发生的方法,或治疗患有这种疾病的动物患者的方法,所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应,该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素,该方法包括利用权利要求1至25中任意一项的方法、或权利要求26至50任意一项的试剂盒,先检测所述受试体体液样本中能与上述抗原分子反应的自身抗体,作为患有疾病或疾病初始发生的指示,因此得以诊断受试体是否患有所述疾病或疾病的初始发生,并给予受试体至少一种治疗有效量的治疗剂,该治疗剂的作用是延迟疾病的发生、排除、预防和/或治疗这种疾病。
54.根据权利要求52或53的方法,其中一种或多种疾病选自1型糖尿病和/或僵人综合征、2型糖尿病、一种或多种自身免疫性甲状腺疾病、乳糜泄、一种或多种结缔组织疾病、肾上腺自身免疫性疾病、或两种或多种不同自身免疫性疾病并存。
55.根据权利要求26至50的任意一项试剂盒,其与治疗有效量的至少一种治疗剂组合,该治疗剂能有效治疗与自身抗体相关的一种或多种疾病,所述的自身抗体能与一种或多种选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分子发生反应。
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