JPH07507441A - １型真性糖尿病に関連する抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ここで自己抗体、例えば、細胞質ランゲルハンス島細胞抗体（ＩＯＡ）、抗グル タミン酸デカルボキンラーゼ（ＣＡＤ）自己抗体および抗インスリン自己抗体の 存在はその疾患の臨床的発症の数年前に見いだされるという証拠が存在する（Ｅ ｉｓｅｎｂａｒｔｈＳＧ、Ｓ、（１９８６）Ｎ。

Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　、旦１迭：　１３６０−１３６８）。夏型糖尿病およ び他の自己免疫疾患の共通の特徴は、細胞のタンパク質に対する自己抗体の出現 により発現されうる体液性免疫応答である（Ｔａｎ、Ｅ。

Ｍ、（１９９１）Ｃｅ　ｌ　Ｉ、６ヱ：　８４１−８４２）、今日まで、■型具 性糖尿病に関連したわずかの自己抗原、すなわち、インスリン（ＰａＩｍｅｒ、 　Ｊ、　Ｐ、ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２：１３３７−１３３９）　 、ＣＡＤ（ＢａｅｋｋｅｓｋｏｖＳＳ、ら（１９９０）最近、カルボキシペプチ ダーゼＨ１すなわち、顆粒関連酵素の断片をエンコードするｃＤＮＡは、糖尿病 前症の患者からの血清と反応することが報告され（Ｇｉ　ｌ　１ａｒｄ、Ｂ、に 、ら、前掲）そしてヒトのランゲルハンス島ライブラリーからのλｇｔｌｌファ ージで発現された他のタンパク質はＩＤＤＭ血清により認識されるように思われ る（Ｒａ配列を有する細胞タンパク質は、また、体液性および／または細胞性免 疫応答により認識されると報告された。夏型糖尿病のほとんどすべての患者は、 増大したレベルのＩｇＧ抗ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体を有し、この抗体 が牛乳誘発ランゲルハンス島自己免疫性のための標的抗原を表すことができる分 子量６９，０００のランゲルハンス島タンパク質を沈澱させることは興味深いこ とである（Ｍａ　ｔ　ｒ　ｉ　ｎ、前掲：お原の同定は、この疾患の発症の危険 性を評価する臨床医の能力を改良することができるであろう。

発明の要約 本発明は、Ｉ型具性糖尿病に関連する神経内分泌タンパク質、このタンパク質を エンコードする核酸およびこのタンパク質に対する抗体を検出しそして真性糖尿 病の発症する危険性のある個体を同定するための方法および試薬に関する。ＰＭ −１と表示するタンパク質は、ヒトのランゲルハンス島細胞により発現される６ ９ｋＤ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）により測定して）の抗原である。ＰＭ−１タンパク質をエンコード するｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびこのタンパク質の推定されたアミノ酸配 列が決定され、そして配列表に示されている。ＰＭ−１タンパク質は、このタン パク質を発現する細胞、例えば、ランゲルハンス島細胞またはそれから誘導され る細胞からタンパク質を単離するか、あるいはこのタンパク質を化学的的に合成 するか、あるいは組み換えＤＮＡ技術により生産することができる。

ＰＭ−１タンパク質に対する自己抗体は、ある糖尿病前症の個体（この個体は後 に明白な糖尿病を発症した）の血清の中に見いだされたが、非糖尿病の患者の血 清の中に見いだされなかった。従って、抗ＰＭ−１自己抗体は糖尿病の発症に関 連づけられる。ＰＭ−１タンパク質の免疫反応性型をイムノアッセイにおいて使 用して、生物学的流体の中のこのような自己抗体の存在を検出し、これにより糖 尿病の発症する危険性のある個体を同定することができる。ＰＭ−１タンパク質 、またはその抗原性断片は、■型糖尿病の発症を処置または予防する方法におい て有用である。ＰＭ−１タンパク質または抗原性断片を含有する治療用組成物を 糖尿病の、轡者または糖尿病の発症する危険性のある糖尿病前症の患者に投与し て、ＰＭ−１タンパク質に対して個体を耐性とするか、あるいはＰＭ−１タンパ ク質に対する個体の免疫反応性をブロックすることができる。

図面の簡単な説明 第１図は、糖尿病前症の患者からの血清と精製したＰＭ−１クローンとの反応性 を示す。このクローンは対照の血清と反応性しなかった。

第２Ａ図〜第２Ｅ図は、ＰＭ−１タンパク質のヌクレオチド配列および推定され たアミノ酸配列である。下線は次の通りである：　（ａ）ヌクレオチド−７２に おけるフレーム終止コドン（ＴＡＡ）における第１の上流：および（ｂ）ポリ（ Ａ）テイルの２３ｂｐ上流のポリアデニル化シグナル。ウシ血清アルブミン（Ｂ 　Ｓ　Ａ）との相同的サブユニットはボックスの中である。潜在的Ｎ結合グリコ ジル化部位は星印により示されている。潜在的リン酸化部位は次の通りである： ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）；ＣＫ２（カゼインキナーゼＩＩ）およびＡＭ Ｐ　（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性キナーゼ）。アミド化部位はＡＭＤとして示さ れている。

第３図は、ＰＭ−１タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを配列決定するために 使用する方法の概略的表示である。合成オリゴヌクレオチドのプライマーを使用 する配列決定の方向は矢印により示されている。制限部位は次の通りである：Ａ ：ＡｃｃＩＩ、Ｂ：Ｂｇｌ　Ｉ　Ｌ　Ｈ：Ｈｇ１ＡＩ、Ｍ：Ｍａｅ　Ｉ　Ｉ、お よびＮ：ＮｄｅＴ０第４図は、ＰＭ−１タンパク質とＢＳＡとの間の類似性をも つ領域を示す。

第５図は、ＰＭ−１タンパク質の推定されたアミノ酸配列を使用して発生したカ イト・アンド・ドーリトル（Ｋｙｔｅ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）疎水性プロッ トである。

第６図は、ある細胞系および種々の組織からの総量ＲＮＡの、ＰＭ−１ｃＤＮＡ プローブを使用したノザンプロット分析の結果を示す。このプローブは、ラット の膵臓、脳、大脳（後者において２つの組織は追加の５Ｋｂのバンドをもつ）か らの総ＲＮＡの中の２ＫｂのｍＲＮＡとハイブリダイゼーションした。２Ｋｂの 総ＲＮＡバンドとのハイブリダイゼーションは、また、薩歯類ランゲルハンス島 細胞（ＲＩＮ　１０４６−３８）を使用しても検出された。

第７図は、種々の細胞系からの総ＲＮＡのＰＭ−１ｃＤＮＡプローブを使用する ノザンプロット分析の結果を示す。このプローブはヒトのランゲルハンス島カル シノイド細胞系（ＢＯＮ−１）および３つの薩歯類ランゲルハンス島細胞系（Ｒ ＩＮ　１０４６−３８、ベータＴＣ−１およびアルファＴＣ−６）とハイブリダ イゼーションしたが、非ランゲルハンス島細胞系（ＩＩｅｐＧ２−へバトーマ、 ＨｅＬａ−線維芽、ＪＥＧ−絨毛症）とハイブリダイゼーションしなかった。

第８図は、３つの細胞系のホモジネートのウェスタンプロット分析の結果を示す 。ＰＭ−１タンパク質のＣ末端に対して発生した免疫後の抗体は、ＲＩＮ　１０ ４６−３８の中の６９ｋＤにおけるバンドを認識するように思われる。

発明の詳細な記述 ＰＭ−１タンパク質は、約６９ｋＤ　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して）の分 子量を有する神経内分泌タンパク質である。ＰＭ−１タンパク質はヒトの膵臓β −ランゲルハンス島細胞およびヒトのインスリノーマにより発現される。ＰＭ− １タンパク質のアミノ酸配列およびこのタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの ヌクレオチド配列を、後衛する配列表に記載する。クローンＰＭ−１の部分的ｃ ＤＮＡインサートを含有するベクターで形質転換された宿主細胞は、アメリカン ・タイプ・カルチャー４コレクンａン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ寄託Ｎｏ、６９１０８で寄託された。

ＰＭ−１ｃＤＮＡは１７８５ｂｐのヌクレオチド配列を含んでなり、このヌクレ オチド配列は１４４０ｂｐのオープンリーディングフレームの５’１７８非コー ディング配列および３’１５５ｂｐの非コーディング配列を含む。それぞれ、２ Ｋｂおよび５Ｋｂの２つのｍＲＮＡ種から翻訳することができるｃＤＮＡのオー プンリーディングフレームは、潜在的Ｎ結合グリコジル化部位をもつ、４８３ア ミノ酸のタンパク質を予測させる。規定ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡは 、ポリ（Ａ）テイルの２３ｂｐ上流に存在する。天然のＰＭ−１分子は、内部お よびＣ末端のポリペプチドに対して発生した特定の抗体で検出すると、５ＤＳ− ＰＡＧＥにおいて６９ｋＤに移動する。

ＰＭ−１タンパク質は、抗原を発現する細胞、例えば、β−ランゲルハンス島細 胞から誘導された細胞系から単離することにより、天然の形態で得ることができ る。あるいは、このタンパク質は化学的に、例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）の固相法により合成することができる。

ＰＭ−１タンパク質は、また、組換えタンパク質として生産することができる。

ＰＭ−１タンパク質をエンコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、発現ベク ター、例えば、プラスミドまたはウィルスの核酸の中に、適当な遺伝子調節要素 と組み合わせて挿入する。ＰＭ−１タンパク質をエンコードする核酸を、例えば 、後述するｃＤＮＡクローニング手順によりあらたに生産することができるか、 あるいはそれは入手可能なりローンから得ることができる。あるいは、ＰＭ−１ タンパク質をエンコードするＤＮＡは、配列表に記載するヌクレオチド配列（ま たはその機能的同等体）に従い化学的合成することができる。次いで、組換えベ クターをベクター適合性宿主細胞の中に導入する。宿主細胞を適当な培地の中で 、タンパク質の発現および、適当ならば、その分泌を可能とする条件下に培養す る。細胞または細胞培地からの組換えＰＭ−１タンパク質の分離は、標準的手順 、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外 濾過、電気泳動またはそのタンパク質に対して特異的な抗体を使用する免疫精製 により達成することができる。ＰＭ−１タンパク質は、このタンパク質が、組み 換えＤＮＡ技術により生産するとき、細胞物質または培地を実質的に含有しない ように、あるいは化学的に合成するとき、化学的前駆体または他の化学物質を実 質的に含有しないように、分離される。

ＰＭ−１タンパク質から誘導された抗原性断片またはペプチドは、本発明の範囲 内である。本発明の範囲内の断片は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて免疫応 答、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の生産を誘発するか、あるいはＴ細胞の応 答、例えば、Ｔ細胞の増殖および／またはリンホカインの分泌および／またはＴ 細胞のアネルギーの誘発を引き出すものを包含する。ＰＭ−１タンパク質をコー ドする核酸配列の断片は、また、本発明の範囲内である。本明細書において使用 するとき、ＰＭ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片は、ＰＭ− １タンパク質の全体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ない塩 基を有するヌクレオチド配列を意味する。本発明の任意の態様において使用する 核酸配列は、ここに記載するｃＤＮＡであることができるか、あるいはここにお いて表す配列のすべてまたは一部分を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド 配列、またはそれらの機能的同等体であることができる。このようなオリゴデオ キシヌクレオチド配列は、既知の技術を使用して化学的または機械的に生産する ことができる。オリゴデオキシヌクレオチド配列の機能的同等体は、配列のリス トに示す配列またはまたはその断片がハイブリダイゼーションする相補的オリゴ ヌクレオチドに対して、あるいは配列表に示す配列に対して相補的な配列に対し てハイブリダイゼーションすることができるものである。

ＰＭ−１タンパク質の核酸配列および推定されたアミノ酸配列が与えられると、 Ｔ細胞またはＢ細胞のエピトープを含有するペプチドを同定することができる。

エピトープはレセプターによる認識の基本的要素または最小の単位であり、ここ でエピトープはレセプターの認識のために必須のアミノ酸残基からなる。例えば 、ヘルパーＴ細胞上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）との相互作用に関連するＴ細 胞エピトープを含有するペプチドを同定することができる。これらのＴ細胞エピ トープは通常鎖長が少な（とも７アミノ酸残基でありそして、抗原提示細胞の表 面に存在するＭＨＣＩＩ糖タンパク質と一緒になって、ＴＣＲと相互作用する複 合体を形成する。ＰＭ−１タンパク質の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含 んでなる関係するペプチドは、ＰＭ−１タンパク質を所望の長さのオーバーラツ プまたは非オーバーラツプのペプチドに分割することによって同定することがで き、それらのペプチドは組換え的または合成的に生産することができる。標準的 Ｔ細胞増殖ア・ソセイに際し、ペプチドを抗原提示細胞の存在下に培養して、例 えば、標識化チミジンの細胞の取り込みより示される、Ｔ細胞の増殖を刺激する 前記ペプチドの能力を測定することができる。変更された構造をもつＰＭ−１タ ンノくり質由来のペプチドをデザインすることができ、このようなペプチドはＭ ｉ（Ｃ１ｌ糖タンパク質と複合化する能力を保持するが、このア・ソセイにおい て既知のアクチベーターの存在下にＴ細胞の増殖を阻害するこれらのペプチドの 能力を評価すると、ＴＣＲと反応することができない。

溶解度を増加し、治療的または予防的効能、または安定性（例えば、ｅｘ　ｖｉ ｖｏの貯蔵寿命、およびｉｎ　ｖｉｖｏのタンパク質分解的崩壊に対する抵抗） を増強するような目的で、ＰＭ−１タンパク質またはそれらのペプチドの構造を 修飾することができる。アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸の置換、欠失、また は付加により変更され、免疫原性が変更されおよび／または治療的有効性が増加 されたか、あるいは同一目的である成分が付加された、修飾されたＰＭ−１タン ノくり質または修飾されたペプチドを生産することができる。例えば、ＰＭ−１ 配列まｔこは他の配列から誘導された追加のアミノ酸残基を、ＰＭ−１タンノ（ り質のアミン末端、カルボキシ末端、またはアミン末端およびプＪルポキン末端 の両者に取り付けることができる。非ＰＭ−１誘導配列（ま、溶解度を増加する か、あるいは精製を促進することができる残基、例えば、組換え技術により生産 されたタンパク質の精製を促進するためにＰＭ−１タンパク質に取り付けられた 配列を包含する。ＰＭ−１タンノ（り質また１まそのペプチドをエンコードする ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を使用して、ＰＭ−１タンパク質またはペプチ ドの構造を修飾すること力（できる。このような方法は、ＰＣＲ（Ｈｏら、Ｇｅ ｎｅ、７７：５１　５９（１９８９））または突然変異した遺伝子の全合成（Ｈ ｏ　ｓ　ｔ　ｏｍｓ　ｋ１６１　：１０５６−１０６３　（１９８９）’）を必 要とするかも知れない。

ＰＭ−１タンパク質は、個体における自己免疫疾患を処置する新規な治療法にお いて使用することができる。ＰＭ−１タンノ（り質、またはその抗原性断片を、 糖尿病または糖尿病前症の患者に投与して、個体におけるＩ型糖尿病の亢進また は発症を予防することができる。ＰＭ−１タンパク質、または少なくとも１つの 抗原性断片を、治療用組成物の形態で、個体における糖尿病の亢進または発症を 予防するために有効な量で、個体に同時にまたは順次に投与する。さらに、治療 用組成物は非免疫原性条件下に投与して、免疫応答を引き出すよりむしろ、ＰＭ −１タンＩくり質に対して個体を耐性とすることができる。本明細書において使 用するとき、耐性とするは、ＰＭ−１タンパク質に対して暴露したときにおける 非応答性または症状の減少と定義される。抗原の耐性とする投与量を投与する技 術は、この分野において知られており、アジュノ〈ントの不存在下のおよび／ま たは可溶性の形態の、ＰＭ−１タンノくり質、まｔこ１よその断片の投与を包含 する。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなるＰＭ−１タンパク質由来 のペプチドの投与は、適当なＴ細胞の下位集団がＰＭ−１タンパク質に対して非 応答性となるように、それらを耐性とすることができる。ＭＨＣＩＩ糖タンノく り質に結合する力（、ＴＣＲと相互作用性でない複合体を生ずるＰＭ−１タノバ ク質のアンタゴニストのペプチドを利用する治療的方法を、また、使用すること ができる。

ＰＭ−１タンパク質またはそのペプチドは、単独で、あるい１ま抗ＣＤ４抗体ま たは他のＣＤ４ブロッカ−と組み合わせて投与すること力（できる。このアプロ ーチは、米国特許第４．６８１，７６０号および米国特許第４，９０４，４８１ 号に開示されている。このアプローチにおいて、抗原および抗ＣＤ４抗体または 免疫反応性断片は同時に投与される。「同時の」投与は、抗ＣＤ４成分が抗原に 対するヘルパーＴ細胞の応答をブロックすることができる時間のフレーム内を意 味する。この意味における「同時」の性質は、前述の米国特許（引用することに よって本明細書の内容となる）に記載されている。

ＰＭ−１タンパク質またはその断片を、製剤学的に許容されうる担体または希釈 剤と組み合わせて治療用組成物を形成する。製剤学的に許容されうる担体は、ポ リエチレングリコール（Ｖｉｅら、Ｉ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒ ｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙＳ６４：８４−９９（１９８１））およびリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏ　ｉｍｍｎｏ　Ｉ　ｏｇｙ、ユニ　２７ 　（１９８４）’）を包含する。製剤学的に許容されつる希釈剤は、生理的食塩 水および水性緩衝剤溶液を包含する。このような組成物は、一般に、皮下注射、 静脈内または腹腔内、経口的投与（例えば、カプセル剤の形態で）、吸入、経皮 的適用または経直腸的投与により投与される。

ＰＭ−１タンパク質の配列分析は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との類似性を もつ２つの領域を明らかにした（第４図）。類似性をもつそれらの領域は、ＰＭ −１タンパク質およびＢＳＡが共有するエピトープを含有することができる。多 数のｌ型糖尿病の患者は増加したレベルの抗１ｇＧ抗ＢＳＡ抗体を有することが 示された。こうして、ＢＳＡは牛乳誘発ランゲルハンス島自己免疫性のための標 的抗原を表すことができる（Ｍａ　ｒ　ｔ　ｉ　ｎ、　Ｊ、　Ｍ、ら、前掲）。

ＰＭ−１タンパク質およびＢＳＡが共有するアミノ酸残基を含んでなるペプチド は、治療用組成物の形態で、個体における自己免疫疾患、例えば、ｌ型糖尿病を 処置するために有用であることが発見された。製剤学的に許容されうる担体また は希釈剤および下記のペプチドの一方または両者からなる治療用組成物を投与す ることができる：Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘａａ、−Ｘａａ ２−Ｖａ　Ｉ　；およびＸａ　ａ３−Ｘａ　ａ４−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｃ ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘａａ、−Ｐｒｏ、式中Ｘａａ、はＭｅｔまたはＨｉＳであり、 Ｘ　ａ　ａ　、、はＡｓｐまたはＬｅｕであり、Ｘａａ３はＧｌｕまたはＡｓｐ であり、Ｘａａ４はＧｌｕまたはＬｙｓであり、そしてＸａａｌはＧｌｕまたは Ｌｅｕである。このような組成物は、自己免疫疾患を処置するために有効な量で 個体に投与される。ＰＭ−１タンパク質またはＢＳＡから誘導された追加のアミ ノ酸残基を、これらのペプチドのアミノ末端、カルボキン末端またはアミノ末端 およびカルボキシ末端の両者に取り付けることができる。

ＰＭ−１タンパク質と反応性の抗体は標準技術により生産することができる。動 物、例えば、マウスまたはウサギを免疫原性の形態のＰＭ−１タンパク質（例え ば、抗体の応答を引き出すことができるＰＭ−１タンパク質のすべてまたは部分 ）で免疫化する。免疫原性をタンパク質またはペプチドのサブユニットに付与す る技術は、担体への結合またはこの分野においてよく知られている他の技術を包 含する。ＰＭ−１タンパク質または免疫原性ペプチドは、アジュバントの存在下 に投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体の力価を検 出することによってモニターすることができ、標準的ＥＬＩＳＡあるいは他のイ ムノアッセイが抗原として免疫原を使用して抗体のレベルを評価することができ る。

免疫化後、抗ＰＭ−１抗血清が得られそして、必要に応じて、ポリクローナル抗 ＰＭ−１抗体をこの血清から単離する。モノクローナル抗体を生産するために、 抗体生産細胞（リンパ球）を免疫化した動物から収獲し、そして標準の体細胞融 合手順により免疫化細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を 生成する。ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にＰＭ−１タンパク質と反応性の抗 体の生産についてスクリーニングすることができる。

ＰＭ−１タンパク質に対して自己抗体は、数人のＩＯＡ陽性糖尿病前症の個体（ 後に明らかな糖尿病を発生した）の血清の中に見いだされた。

これらの自己抗体は、糖尿病でない個体において見いだされなかった。

抗ＰＭ−１自己抗体は糖尿病の発症に関連づけられ、そして個体におけるこれら の抗体の検出は個体の糖尿病の発生する危険性の指標を提供する。

ＰＭ−１タンパク質は、免疫化学的アッセイにおいて、生物学的流体の中の抗原 に対する自己抗体の存在を検出しかつ糖尿病の発生する危険性のある個体を同定 するために使用できる。ＰＭ−１タンパク質を、試験すべき生物学的流体と、抗 原を生物学的流体の中の抗体と複合化させる条件下に接触させる。ＰＭ−１タン パク質またはペプチドと抗体との間で形成した複合体の検出は、生物学的流体の 中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体の存在の指標である。

好ましいアッセイのタイプは同相免疫測定アッセイである。このタイプのアッセ イにおいて、精製したＰＭ−１タンパク質を固相の支持体上で固定化する。この 支持体を試験すべき生物学的流体の試料とインキュベーションする。このインキ ュベーションは、固定化されたＰＭ−１タンパク質とこのタンパク質に対する抗 体との間の複合化を可能とする条件下に実施する。次いで、固相の支持体を試料 から分離し、そして標識化抗（ヒトＩｇＧ）抗体を使用して支持体に結合したヒ ト抗ＰＭ−１抗体を検出する。支持体と結合した標識の量を、陽性および陰性の 対照と比較して、抗ＰＭ−１抗体の存在または不存在を評価する。

これらのアッセイにおいて、免疫反応性の形態のＰＭ−１タンパク質またはその ペプチドを使用する。全分子、ＰＭ−１に対する抗体と免疫反応性の部分の天然 、合成または組換え精製した形態を使用することができる。さらに、ＰＭ−１に 対する自己抗体と免疫反応性であるように十分にＰＭ−１アミノ酸配列を十分に 複製したアミノ酸配列を有し、そして適当な感受性および信頼性のアッセイを提 供する修飾されたＰＭ−１タンパク質を使用することができる。

固相の免疫測定アッセイにおいて、精製したＰＭ−１抗原を固相の支持体に吸着 または化学的に結合させることができる。種々の固相の支持体、例えば、ガラス 、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストランまたは他の物質から形成された ビーズを使用することができる。他の適当な固相の支持体は、これらの物質から 形成されるか、あるいはそれらで被覆された管またはプレートを包含する。

ＰＭ−１タンパク質を、アミドまたはエステル結合を介する共有結合あるいは吸 着のような技術により、固相の支持体に共有結合的または非共有結合的に結合す ることができる。ＰＭ−１タンパク質を固相に添付した後、固相の支持体を動物 のタンパク質で後被覆して、支持体表面へのタンパク質の非特異的吸着を減少す ることができる。

ＰＭ−１タンパク質を含有する支持体は、試験する液体試料の中で抗体を選択的 に不溶化する機能をする。抗ＰＭ−１抗体についての血液の試験において、支持 体を血液の血漿または血清とインキュベーションする。インキュベーションの前 に、血漿または血清を通常の動物の血漿または血清で希釈することができる。希 釈剤の血漿または血清は、抗（ヒト１ｇＧ）抗体源である同一の動物種から誘導 される。好ましい抗（ヒト１ｇＧ）抗体はヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体である。こ うして、好ましいフォーマットにおいて、希釈剤はヤギの血清または血漿である 。

インキュベーションの条件、例えば、ｐＨおよび温度、およびインキュベーショ ンの期間は臨界的でない。これらのパラメーターは日常的実験により最適化する ことができる。一般に、インキュベーションは約４５℃においてｐＨ７〜８の緩 衝液中で１〜２時間実施する。

インキュベーンコン後、固相の支持体および試料を任意の普通の技術、例えば、 沈降または遠心により分離する。次いで、固相の支持体を洗浄して試料を除去し て妨害物質を排除することができる。

固相の支持体に結合したヒト抗体を評価するために、標識化抗（ヒトＴｇＧ）抗 体（トレーサー）を使用する。一般に、固相の支持体を標識化抗（ヒトＩ　ｇＧ ）抗体の溶液とインキュベーションし、この溶液は抗（ヒトＩｇＧ）抗体源とし て働く少量の（約１％）の動物種の血清または血漿を含有する。抗（ヒトＩ　ｇ Ｇ）抗体は任意の動物種から得ることができる。しかしながら、ヤギ抗（ヒト■ ｇＧ）抗体は好ましい。抗（ヒト！ｇＧ）抗体はヒトＩｇＧのＦ、断片に対する 抗体、例えば、ヤギ抗（ヒトＩｇＧ）Ｆ、抗体させることができる。

抗（ヒｈ　Ｉ　ｇＧ）抗体を放射性物質、例えば、＋５ヨウ素、光学的標識、例 えば、蛍光性物質、または酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標 識化することができる。抗ヒト抗体を、また、ビオチニル化し、そして標識化ア ビジンを使用して固相の支持体へのその結合を検出することができる。

標識化抗体とのインキュベーション後、固相の支持体を溶液から分離し、そして 支持体に結合した標識の量を評価する。標識が放射性ガンマ線放射体である場合 、ガンマカウンターにより検出することができるか、あるいは標識が蛍光性であ る場合、蛍光測定装置により検出することができる。酵素の場合において、標識 は酵素のための基質を使用して比色的に検出することができる。

支持体に結合した標識の量を陽性または陰性の対照と比較して、抗ＰＭ−１抗体 の存在を決定する。一般に、対照は試験すべき試料と同時に実験する。陽性の対 照はＰＭ−１タンパク質に対する抗体を含有する血清である：陰性の対照は、Ｐ Ｍ−１タンパク質に対する抗体を含有しない個体（例えば、非糖尿病前症の患者 ）からの血清である。

便宜上および標準化のために、固相アッセイの実施のための試薬をアッセイキッ トに組み立てる。例えば、血液をスクリーニングするためのキットは、別々の容 器の中に、下記の成分を含むことができる：（ａ）ＰＭ−１タンパク質で被覆し た固相の支持体、（ｂ）　血清または血漿のための希釈剤、例えば、正常のヤギ の血清または血漿、 （ｃ）　約１％のヤギの血清または血漿を含有する緩衝化水溶液中の標識化抗（ ヒト■ｇＧ）抗体、例えば、ヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体、 （ｄ）　必要に応じて、陽性の対照、すなわち、ＰＭ−１タンパク質に対する抗 体を含有する血清、および （ｅ）　必要に応じて、しかし好ましくは、陰性の対照、例えば、ＰＭ−１タン パク質に対する抗体を含有しない血清。

標識が酵素である場合、キットの追加の成分は酵素のための基質であることがで きる。

他のアッセイのフォーマントを使用して、ＰＭ−１タンパク質に対する抗体につ いて試験することができる。１つの型は抗原サンドイッチアッセイである。この アッセイにおいて、標識化ＰＭ−１タンパク質を抗（ヒトＩｇＧ）抗体の代わり に使用して、固相の支持体に結合した抗ＰＭ−１抗体を検出する。このアッセイ は原理的には抗体分子の２価に基づく。抗体の１つの結合部位は固相の支持体に 固定された抗原に結合する；第２は標識化抗原の結合に利用可能である。このア ッセイの手順は免疫測定アッセイについて記載した手順と本質的に同一であるが 、ただし試料とのインキュベーンコン後、支持体を標識化ＰＭ−１タンパク質の 溶液とインキュベーションする。ＰＭ−１タンパク質は放射性同位元素、酵素な どでこの型のアッセイのために標識化することができる。

以下の実施例は、糖尿病前症の徂者の血清を使用して、ヒトのランゲルハンス島 のλｇｔ１１発現ライブラリーからのｃＤＮＡクローンの単離を説明する。ＰＭ −１クローンの最長のオーブンリーディングフレームによりコードされる推定上 のポリペプチドは、５４．６００の分子量を有する。ウェスタンブロンド上で、 免疫反応性ＰＭ−１は６９ｋＤの分子量を宵し、グリコジル化または５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥの異常な移動を示唆する。

実施例１・λｇｔ１１発現ライブラリーからのＰＭ−１をエンコードするｃＤＮ Ａクローンの単離 ２つのライブラリー、すなわち、ヒトのランゲルハンス島ライブラリーおよびヒ トのインスリノーマのライブラリーを使用して、ＰＭ−１をエンコードするｃＤ ＮＡクローンを同定しかつ単離した。ヒトのランゲルハンス島のポリ（Ａ＋）Ｒ ＮＡからクロンチク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州バロアルト）によ り、λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを構築した。はぼ１×１０６プラークが得 られ、８０％が組換え体であった。ヒトのインスリノーマのポリ（Ａ＋）ＲＮＡ を単離し、次いでｃＤＮＡを生産しそしてλｇｔｌｌファージの中にパッケージ ングした（Ｈｕｙｎｈ、Ｊ、Ｖ、ら（１９８５）Ｇｌｏｖｅｒ　ＤＭ（編）ＤＮ Ａのクローニング技術（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、ＩＲ Ｌ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード　ｐｐ、４９−７８）。

明らかな疾患に進行しそして高い力価のランゲルハンス島細胞抗体（〉８０シユ ベニル・ダイアベテス・ファンデーション・ユニッツ［Ｊｕｖｅｎｉｌｅ　Ｄｉ ａｂｅｔｅｓ　Ｆｏｎｄａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔｓ］）を発現するＩ型糖尿病患者 の第１親等の親類から得られた血清を使用して、ライブラリーをスクリーニング した。血清を反復して野生型λｇｔｌｌ感染大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ）（Ｙ１０９０）のタンパク質すゼイト（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら（ １９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａ　Ｉ、１２−２５−１２．２８、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバ−、 ニューヨーク州）で吸収させて、抗大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）抗体を除去した。許 容されえないほどに高いレベルの宿主細胞に対する反応性を与え続けた、吸収さ せた血清、対照または親類の血清は利用しなかった。吸収させた抗体は、免疫学 的アニーリングのために使用するまで、−２０℃において０．０５％のアジ化ナ トリウムの存在下に貯蔵した。本来、３つの血清のプールを使用して陽性のクロ ーンを同定し、そして引き続いて３つの他の親類の血清を研究した。１０の正常 の個体の血清を、また、陽性のクローンとの反応性について試験した。

ファージのヒトのランゲルハンス島λｇｔ１１発現ライブラリーを、前述したよ うにして得られた糖尿病前症の親類からの血清でスクリーニングした（Ｙｏｕｎ ｇ、Ｒ，Ａ、およびＲ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２ 　：　７７８−７８２）、分離した組換えファージを、はぼｌＸｌ０’プラ一ク 形成単位／プレートで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）（Ｙ１０９ ０）を有するルリアーベルタニ（Ｌｕ　ｒ　ｉ　ａ−Ｂｅ　ｒ　ｔ　ａｎ　ｉ） 寒天プレート（直径１５０ｍｍ）上にプレートした。４２℃において３時間イン キュベーションした後、１０ｍＭ　イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ シドで飽和させたニトロセルロースのフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　 ５ｃｈｕｅ１１）を３７℃において寒天上に一夜オーバーレイして、β−ガラク トンダーゼ融合タンパク質の発現を誘発した。１ｘＴｒｉｓ−緩衝剤生理的食塩 水０．０５％ツイーン中の１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でブロック（ 室温において２時間インキュベーション）した後、プレートを１１５００希釈血 清と４℃において一夜インキユベーションした。

１ｘＴｒｉｓ−緩衝剤生理的食塩水００５％ツイーンで数回洗浄した後、抗ヒト ＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ１／１００希釈とのインキュベーションにより 、結合した抗体を検出した（室温において２時間）（Ｃａｐｐｌｅ、ノースカロ ライナ州ダーハム）。

最初に、３つの糖尿病前症からの血清のプールで、ファージλｇｔ１１ライブラ リーをスクリーニングした。プラークのすべての子孫が血清により認識されるま で、順次に反復することによりて、もとの陽性のプラークを再プレートしかつ再 スクリーニングした。次いで、個々の血清を陽性のクローンとい（つかの陰性の クローンとの混合物とインキュベーションして、誤った陽性の可能性を減少し、 そして個々の血清の反応性の得点をつけた。

ヒトのランゲルハンス島λｇｔｌ１発現ライブラリーから、はぼ０．４Ｘ１０＠ プラークをスクリーニングし、そしてＰＭ−１分子を同定した。このクローンは 、その融合タンパク質をイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によ り誘発したとき、６つのＩＯＡ陽性糖尿病前症の被検体の血清のうちの３つによ り認識された（血清の１：５００の希釈において）が、このクローンは１０の対 照の個々の血清と反応しなかった（第１図）。ＰＭ−１と表示するクローンは領 ９５ｋＤであった。ＰＭ−１クローンから誘導された標識化ｃＤＮＡプローブを 使用して、ヒトλｇｔ１１ランゲルハンス島ライブラリーおよびヒトインスリノ ーマλｇｔｌｌライブラリーの両者をプラークのハイブリダイゼーションにより スクリーニングして、全長の分子を得た（Ｆｅｉｎｂｅジョンおよびオーバーラ ツプのクローンを、はぼ３．５Ｘ１０’プラークのスクリーニング後、ヒトラン ゲルハンス島λｇｔｌ１発現ライブラリーから得た。最大のクローンは内部のＥ ｃｏＲＩ部位をもつ１．７８Ｋｂのインサートを含有した。このプローブを（ア ルファ”Ｐ）ｄＣＴＰでランダムブライミング（Ｗａ　Ｉ　１ａｃｅ、Ｒ，Ｂ、 ら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：８７９　８９４） によりクレノー断片（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）を使用して標識化し、そ してライブラリーのスクリーニングに使用した。ＤＮＡ配列の分析（下を参［） において、クローンは同一遺伝子の断片を含有することが確証された。

実施例２・λｇｔｌｌｃＤＮＡインサートの増幅およびＰＭ−１タンパク質のク ローニング 陽性のクローンからのλｇｔｌｌｃＤＮＡインサートをポリメラーゼ連鎖反応（ Ｆ　ｒ　ｉ　ｅｄｍａｎ、　Ｋ、　Ｄ、　ら（１９８８）Ｎｕｃ　ｌ　ｅ　１ｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　、１６：８７１８：およびＩｎｎ１５５Ｍ、ら、方法およ び応用への案内［Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ］、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク）により、λｇｔｌｌ鋳型のβ−ガラクトンダーゼ部分に対する相 補性のλｇｔｌｌプライマーを使用して増幅した（プライマーｎ、１２１８　： 　５’ＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ３′；およびプライ ７−ｎ、１２２２：５’ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡ丁Ｇ３ ’、ニュー・イングランド・バイオラプス）。ＰＣＲのための反応混合物（０， １ｍ１）は、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび００１％のゼラチンを含有する１ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭ　Ｍｇ ＣＬの中にｃ　ＤＮＡ鋳型、１００１００ｐの各プライマーおよび２．５単位の Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー／セツス）を含有した。反応 はパーキン−エルマー／セツス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）熱的 サイクラ−の中で３０サイクルの変性（９２℃、１．５分）、アニーリング（５ ５℃、１．５分）、および延長（７２℃、１分）について実施した。ＥｃｏＲＩ の消化および１％のアガロースゲル上の分画後、臭化エチジウムで染色して生産 物を可視化し、問題のＰＣＲ生産物を切り出し、精製しモしてｐブルースクリプ ト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＩＩベクター（ストラタジーン、ラジョラ、カリ フォルニア州）の中にサブクローニングした。ＰＣＲのための試料をファージの 懸濁から得た。

Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、ら（１９７７）Ｐ ｒｏｃ、Ｎａ’ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ヱま：５４６３−５４６７ ）により、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（セクエナーゼ［５ｅｑｕｅｎａｓｅ］　： ユナテツド・スティン・バイオケミカル、オハイオ州りレブランド）を使用して 、ヌクレオチド配列を決定した。Ｇ＋Ｃ富んだ配列の中の圧縮を回避するために 、いくつかの配列決定反応をｄＧＴＰで交互するｄｌＴＰを使用して実施した（ Ｔａｂｏｒ、Ｓ。

ＰＣＲ増幅およびｐブルースクリプト（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ）サブクローニ ング後、部分的配列は、０．６ｋＤのサイズの最小のオーツ（−ラップのクロー ンがもとの配列決定したＰＭ−１インサート内に完全に含有される配列を明らか にすることを示した（第２Ａ図〜第２Ｅ図）。

１．７８ｋＤのサイズの最大のクローンの両者のｃＤＮＡ鎖の配列決定の結果は 、ＰＭ−１および第２クローンとオーバーラツプする分子の領域における完全な 同一性、および前のクローン内に含有されない配列を示す。ヌクレオチド配列の 分析は、４８３アミノ酸をコードしそしてポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ Ａ）の２３塩基下流のポリ（Ａ）テイルで終わる１４４９塩基のオーブンリーデ ィングフレームをもつ、１７８５の鎖長さを明らかにする。ＰＭ−１分子の翻訳 は、Ｋｏｚａｋにより規定された基準に従い第１のインフレームＡＴＧから推定 的に開始する（Ｋｏｚａｋ、Ｍ、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅ ｓ、　、１５　（２０）：８１２５　８１３２）。第１ＡＴＧから上流に、−７ ２ｂｐにインフレーム終止コドン（ＴＡＡ）が存在する。推定されたＡＴＧ開始 コドンからの予測されたオーブンリーディングフレームは、推定された線状分子 量５４，０００をもつタンパク質をコードし、これは１つの潜在的Ｎ連鎖グリコ ジル化部位を含有する（第２Ａ図〜第２Ｅ図）。

ＥＵＧＥＮＥ、ＳＡＭＳＰＩＭＡ、ＳＨおよびＰＲＯ３ＩＴＥプログラムを使用 して配列を整列させそして分析した。遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（ＤＮＡ およびアミノ酸のデータバンクを相同性についてサーチし、そして相同性タンパ ク質のファミリーの配列から誘導されたタンパク質配列のパターンについてＰＬ ＳＥＡＲＣＨプログラムを分析した（分子生物学計算研究源［Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＣｏｍｐｕｔｉｎｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ ］、Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ａｎｄ　Ｈ ａｒｖｅｒｄ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ）、ウノ血清 アルブミン（ＢＳＡ）を除外して、有意なアミノ酸または核酸の類似性は発見さ れなかった。ＢＳへの２つの領域はＰＭ−１タンパク質との類似性を有するよう に思われ、ＰＭ−１タンパク質がＢＳＡと潜在的免疫原性エピトープを共有する ことがあることを示唆する。塩基に対する抗体は、ＲＩＮ腫瘍細胞系の中でイン ターフェロンにより誘発されうる、分子量６９，０００のランゲルハンス島タン パク質と交差反応することは知られている（Ｍａ　ｒ　ｔ　ｉ　ｎ、　Ｊ、　Ｍ 、　ら（１９９１）Ａｎｎ。

Ｍｅｄ、　、２３：４４７−４５２：およびＤｏｓｈＳＨ９Ｍ、ら（１９９１） Ｐｅｄｉａｔｒ、Ａｄｏｌｅｓｃ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、２１）。ウェスタ ンプロットのフォーマット上で１つの短いＢＳＡ独特ペプチド領域（アミノ酸残 基１５４−１６９）に対して産生された抗体は、新しく診断されたＩＤＤＭ患者 からの血清より、ＲＩＮならびに同様な移動度をもつランゲルハンス島タンパク 質（６０〜７０ｋＤ）と反応することが報告された。これらのランゲルハンス島 およびＲＩＮ腫瘍ＢＳＡ交差反応性タンパク質の同一性は、まだ、分類されてき ていない。

ＰＭ−１の推定されたアミノ酸配列から発生させた疎水性プロットｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　（１９８５）８１５：４６８−４７６）により規定 された基準に従い、いくつかの非常に疎水性のセグメント交互する、ある数のわ ずかに疎水性の領域を明らかにし、その分子がドメインにまたがる膜を含有しな いことを示唆する。疎水性のセグメントは、潜在的トランスメンブレンースバニ ング領域であるために十分に長いと思われない。この分子は極めて親水性であり 、そのアミノ酸残基のほぼ１／３が帯電している。

実施例３：ＰＭ−１から誘導された合成ペプチドからの抗ＰＭ−１抗体の生産 ペプチドをＰＭ−１の推定されたアミノ酸配列から合成し、そしてウサギを免疫 化して特定のドメインに対する抗体を発生させるために使用した（Ｖａｎ　Ｒｅ ｇｅｎｍｏｒｔｅｌ、Ｍ、Ｈ，Ｖ、ら（１９８８）生化学および分子生物学にお ける実験室の技術［ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ］　（Ｒ，Ｈ ，ＢｕｒｄｅｎｏｙＰ、　Ｈ，ｖｏｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、ＩＩ）　Ｅｌ ｓｃｖｉｅｒ、ニューヨークおよびアムステルダム）。分子の２つの領域、すな わち、１つはＣ末端に相当する、残基４７１−４８３　：ＧＫＴＤＫＥＨＥＬＬ ＮＡ、および１つはＣ末端付近の内部のポリペプチドに相当する、残基４５８− ４７０　：ＡＤＬＤＰＬＳＮＰＤＡＶ、　を利用し、ソシテ天然ＰＭ−１分子を 免疫沈澱させる抗血清を生成することが発見された。合成ポリペプチドを担体の タンパク質である臭化ブロモアセチルに結合したキーホールリンベットヘモシア ニン（ＫＬＨ）にカップリングさせた。

４羽の雌のニューシーラント白ウサギを、１ｍｌの完全フロインドアジュバント の中に懸濁させた１ｍｇのＫＬＨ−ペプチド接合体で免疫化した。ウサギをさら に不完全フロインドアジュバント中の１ｍｇの特定のポリペプチドで３０日の間 隔で促進し、そして血清の試料を集め、そしてアリコートで一２０℃において貯 蔵した。

間接的ＥＬＴＳＡアッセイを実施して、ＰＭ−１ポリペプチドに対する特定の抗 体を検出した（Ｈａ　ｒ　Ｉ　ｏｗ、　Ｅ　およびり、Ｌａｎｅ（１９８８Ｌ抗 体・実験室の７　ニュアル（Ａｎ　ｔ　ｉ　ｂｏｄｙ　：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａ＋）、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）。１μｇの特定のポリ ペプチドをを使用してイムロン（Ｉ　ｍｍｕ　１　ｏ　ｎ）マイクロタイタープ レートの各ウェルを被覆し、そしてプレートの残留結合を１％ＢＳＡ　ＰＢＳ溶 液で２時間ブロックした後、ウサギの免疫前および免疫後の血清の適当な希釈物 を各ウェルに添加しくに１００〜１：３２，０００）そして−夜インキユベーシ ョンした。すべての点を３回反復実験した。結合しない抗体を洗浄除去した後、 抗ウサギＩｇＧ（全分子）ペルオキシダーゼ接合体（シグマ）を含有する溶液を 展開試薬としてウェルに添加した。２時間インキュベーションした後、結合しな い接合体を洗浄除去し、そして基質溶液（Ｏ−フェニレンジアミンニ塩酸塩、Ｏ ＰＤ、シグマ）を添加した。ウェルの中の溶液の光学密度を分光光度計で評価し た。

実施例４・種々の細胞系および組織からのＲＮＡのＰＭ−１プローブによるノザ ン分析 いくつかのＰＭ−１クローンから誘導されたカルシノイドを使用して、ヒトおよ び動物の組織およびいくつかの細胞系においてノザンブロツティングにより転写 体についてブロービングした。種々の組織および細胞系からの全体のＲＮＡおよ びポリ（Ａ十）ＲＮＡをグアニジニウム法により調製し、ポリアデニル化（ポリ −Ａ）画分についてオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムで濃縮し、そして標準的 手順に従いノザンプロットで分析した（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ、Ｓ、（１９８０）Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）。ハイブリダイゼーションを、４２℃において、ア ルファ３２Ｐ　ｄＣＴＰ標識化ｃＤＮＡ精製プローブを含有するプレハイブリダ イゼーション緩衝液（５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ　（ＩＸＳＳＰＥは １５０ｍＭ　ＮａＣ＋、１０ｍＭ　リン酸ナトリウムおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，４から成る）、５×デンハルト溶液、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子Ｄ ＮＡ、および０．１％５ＤＳ）の中で１８時間実施した（ＳａｍｂｒｏｏｋＳＪ 、ら（１９８９）Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、 １２−２５−１２．２９、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）。

使用したプローブは同定されたもとのＰＭ−１陽性クローンから誘導された０、 ６５ｋＤおよびオーバーラツプのクローンから誘導された１、７８Ｋｂであった 。ニトロセルロースのフィルターを３回交換の２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ で各回室温において洗浄した。最後の２回の洗浄を、０．２５ＳＳＣおよび０． １％ＳＤＳの中で、各実験のために要求されるストリンジエンシーに依存して室 温から６５″において実施した。フィルターをコダック（Ｋｏ　ｄ　ａ　ｋ）フ ィルムに一７０℃において増感スクリーンを使用して露出した。リポソームの結 合をサイズのマーカーとして使用した（１−（ａ　ｓ　ｓ　ｏ　ｉ　ｎ　ａＳＮ 。

両者の０．９５Ｋｂおよび１．７８ＫｂのｃＤＮＡプローブはランゲルハンス島 誘導細胞からの２ＫｂのｍＲＮＡバンドとハイブリダイゼーションし、そしてい くつかの組織において、５Ｋｂのバンドとハイブリダイゼーションした。標識化 ｃＤＮＡＰＭ−１インサートは、ラットの膵臓、脳、大脳（後者の２つの場合に おいて、また、５Ｋｂのバンドと）（第６図）、および肺および腎臓（５Ｋｂの バンド）からの全体のＲＮＡの中の２ＫｂのｍＲＮＡとハイブリダイゼーション するが、全体のｍＲＮＡはラットの心臓、胸腺、肝臓、腸、リンパ節およびだ液 腺において検出することができなかった。単一の２．５Ｋｂのポリ（Ａ十）ｍＲ ＮＡはヒトの甲状腺および肺において検出されたが、卵巣、胎盤および膵臓にお いて検出されなかった。組織の間のｍＲＮＡのサイズの不均質性は、ＰＭ−１遺 伝子の交互するスプライシングのためであろう。

２Ｋｂの全体のＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ヒトのインスリノーマ、 ヒトのランゲルハンス島カルシノイド細胞系（ＢＯＮ−１）、ハムスターのイン スリン生産細胞系（ＨＩＴ）、および３つの鰯歯類ランゲルハンス島細胞系、す なわち、ＲＩＮ　１０４６−３８、βＴＣ−１（これはより長い露出後に可視で ある）、αＴＣ−６において検出された。２つのヒトのランゲルハンス島以外の 細胞系、すなわち、ＨｅｐＧ２−へバトーム、ＨｅＬａ−線維芽、ＪＥＧ−絨毛 症において検出された（第７図）。

評価した正常の組織および細胞系におけるＰＭ−１転写体のノザン分析は、ＰＭ −１タンパク質が神経内分泌系に関係しうろことを示唆する。

主として神経組織におけるｍＲＮＡの検出、ランゲルハンス島誘導細胞系、すな わち、ＲＩＮ、ＢＯＮ−１、ＨＩＴ、βＴＣ−１、αＴＣ−６、およびインスリ ノーマ組織におけるＰＭ−１転写体の存在は、非神経内分泌の細胞系、例えば、 ＨｅＬａ線維芽、ＪＥＧ−絨毛症およびＨｅｐＧ２−ヘパトーマと対照的に、ラ ンゲルハンス島とニューロンとの間の多数の分子の共有を反映する。ヒトの肺お よび甲状腺におけるＰＭ−１ｍＲＮＡの低いレベルおよび腎臓におけるより高い レベルは、神経内分泌由来の細胞の小さい下位集団におけるＰＭ−１転写体の発 現のためであろう。ランゲルハンス島およびニューロンの細胞は、大きい稠密な コアの顆粒（例えば、インスリンまたはカルボキシペプチダーゼＨを含有する） に似た分泌顆粒の分子の大きい族ならびにシナプスの微小小胞構造（例えば、グ ルタミン酸デカルボキシラーゼおよびシナブトフィシンの細胞質内の局在化）を 共有する。これらの共有された構造の両者をもつ分子の多（は、■型糖尿病に関 係する自己免疫性の顕著な標的であるように思われる。

細胞系の抽出物およびラット脳組織の全体のホモジネートを、Ｌａｅｍｍｌｉに よりに記載されているように調製した（Ｌａｅｍｍｌｉ、■。

Ｋ、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５）。

細胞系の抽出物および全体のホモジネートのタンパク質を、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、そしてゲルからニ トロセルロース上に１８０■の一定電圧を使用して４時間の間移した。ニトロセ ルロースをストリップに切断し、そして３７℃においてＰＢＳ中で希釈した無脂 肪ミルクの中で２時間インキュベーションして非特異的結合部位をブロックした 。次いで、ニトロセルロースのストリップをＰＭ−１分子のＣ末端に対して向け られたウサギ抗血清の１　：　１００希釈物とインキュベーションし、次いで０ ．０１％のツイーン２０を含むＰＢＳ中で希釈した５％の無脂肪ミルクの中で洗 浄した。１２５Ｉ−プロティンＡ（アマーンヤム）を使用して、結合したウサギ 抗ＰＭ−１抗体を検出した。個々に着色したおよび精製したタンパク質の混合物 をタンパク質の標準として使用した（レインボウ［Ｒａ　ｉ　ｎｂｏｗ’］タン パク質分子量マーカー、アマ−ジャム）：ミオシン、分子量２００，０００、青 色；ホスホリラーゼｂ、分子量９７゜４００、褐色；ラン血清アルブミン、分子 量６９，０００、赤色；オボアルブミン、分子量、４６，０００、黄色−カルボ ニックアンヒドラーゼ、分子量３０，０００、オレンジ色；トリプシンインヒビ ター、分子量２１，０００、緑色：およびリゾチーム、分子量１４，３００、マ ゼンタ。

脳組織のホモジネートおよび細胞系抽出物（ＲＩＮ　１０４６−３８）のウェス タンプロットは、ＰＭ−１タンパク質のＣ末端および内部のポリペプチドに対し て産生されたウサギ抗体とのインキュベーション後、６９ｋＤの特定のバンドを 明らかにした。第８図が示すように、抗Ｃ末端ＰＭ−１血清はＲＩＮおよびＢＯ Ｎ−１（より長い露出後に可視である）細胞の全体のホモジネートの中の６９ｋ Ｄのタンパク質と特異的に反応したが、ＨｅＬａ細胞系のホモジネートと反応し なかった。さらに、特定の抗体を生産したポリペプチドとの吸収後、特定の６９ ｋＤのバンドは消失する。同一の特定の６９ｋＤの反応性は、また、内部のポリ ペプチドに対する高度免疫血清およびラット脳の全体のホモジネートを使用して 検出可能である。ＰＭ−１タンパク質の推定されたアミノ酸配列は、推定された ５４．０００の分子量をもつ４８３残基である。５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分画 されたタンパク質のウェスタンプロットのサイズと推定されたアミノ酸配列に基 づいて推定されたサイズとの間の差は、この分子のグリコリル化のためであるよ うに思われる（ＭｉｌｅｔｉＣ１−３３６）。あるいは、ウェスタンプロットの 結果は、他のタンパク質について従来観察されたように、洗浄剤を含有する緩衝 液の中の可溶化の結果として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＲＩＮおよび脳のタン パク質の移動が異常になったためであろう（Ｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｎ、ら（１９９１ ）Ｎａｔｕｒｅ、３５４　：　７０−７３　；およびＫｕｍａｒ，Ｋ．Ｎ．ら（ １９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２６６）２３：１４９４７当業者は、日 常的実験を越えない実験を使用して、ここに記載する特定の手順に対する多数の 同等の態様を認識するか、あるいは確認することができるであろう。このような 同等の態様は本発明の範囲内であると考慮され、そして下記の請求の範囲内に包 含される。

配　列　表 （１）一般的情報 （ｉ）出願人：ビエト口パオ口、マッシモ、エイセンバース、ジョージ、Ｓ． （ｉ　ｉ）発明の名称＝Ｉ型真性糖尿病に関連する抗原（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数 ；１ （ｉｖ）通人の住所： （Ａ）住所；ラヒブ・アンド・コックフィールド（Ｂ）街路：スティトストリー ト６ｏ （Ｃ）市・ボストン （Ｄ）州：マサチュセッッ州 （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０２１０９ （Ｖ）コンピューター読み取り可能な形態：（Ａ）媒体の型：フロッピーディス ク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ　コンバーチブル（Ｃ）操作システム：ＰＣ −Ｄｏｓ／ＭＳ−Ｄｏｓ（Ｄ）ソフトウエア：ＡＳＣＩＩ　ＴＥＸＴ（Ｖ）現在 の出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日． （ｖｉｊ）前の出願のデータ： （Ａ）出願番号＋０７／７８８．１１８（Ｂ）出願日：１９９１年１１月１日 （Ｃ）出願番号：０７／９０１．５２３（Ｂ）出願日：１９９２年６月１９日 （２）配列識別番号：１についての情報（１）配列の特性・ （Ａ）長さ：１７８５ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー．線状 （ｉ　ｉ）分子の型　ｃＤＮＡ （ｖｉ）直接の源． （Ｂ）クローン：ＰＭ−１ （ｉｘ）特徴・ＰＭ−１抗原 （ｘｉ）配列の記載．配列識別番号：１：ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧ　＆ｒ入ＣＣＣ ＣＡＧＧ　ＡＧＡＴＧＧ（；ＧＧ’ｒ　ｅｌｌ；ＡＧＧＡＧλＧＡ　ＣＣＣＣＧ ＧＧＧＩＧ　ＴＡＧ，求i；Ｊ．Ｇ＆ＧＡ　６０ ＧｍＣＴＣＡＣＴ　ＣＣＣＣＧＡＧＴＣＣ　ＣＣ（；ＡＣＣＣＴＣＣ　ＣＣＡＡ ＧＣＡＪｉＧＧ　Ｔ丁ＡＴＪＪ．ＴＪ．ＴＡ　ＡＣＴＴＡＴbＣＴＣ　１２０ ＴＣＡＴＧＣＴｒｒＴ　ＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣ　ＴＴＣＴＣＣＣＣ入入　入τＣ 入ＴＣ入λＣ入　ＡＴＡＧｕＧ入入Ｇ　ＡＡＧ入入入λＣ　P７８ λＴＧ　ＴＣＡ　ＧＧλ　ＣＡＣ　入入λ　丁（，Ｃ　ＡＧＴ　τ入Ｔ　ＣＣＣ 　ＴＧＧ　Ｇ入Ｃ　τ丁λ　ＣＡＧ　ＧＥＴ　ＣＧＡ　Ｔλ噤@２２６ ＋ｎｅｔ　ｓｅｒ　ｇｌｙ　ｈｉｓ　１ｙｓ　Ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｔｙｒ　ｐｒｏ 　ｔｒｐ　ａｓｐ　ｌｅｕ　ｇｌ＋＞　ａｓｐ　ａｒｇセｙy ＧＣＴ　ＣｈＡ　ＧｋＴ　ｋｋＧ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＪＵＴ　＆λＧ　 ｋＴＧ　Ｃκ入　ＣＬＧ　ＬＧＬ　ＴＬＴ　ＴＧＧ　ＧＬＧ@２７４ ａｌａ　ｑｌｎａｓｐ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｖａｌ　ｖａｌａｓ＋１＋１ｙｓ　ｍ ｅｔ　ｇｉｎ　ｇｌ＋ｚ　ａｒｇ　セｙｒ　ｔｒｐ　ｇｌｕλＣＧ　入入Ｇ　Ｃ ＡＧ　（；ＣＣ　τττ　λＴτ　入入λ　ＧＣＣ　ＡＣＡ　ＣＣＧ　入入Ｇ　 入入ＧＧ入入　Ｇ入τ　Ｇ入入　Ｃ入τ@３２２ ｔｊ′Ｉｒ　ｌｙｓ　ｇｉｎ　ａｌａ　ｐｈｅ　ｉｌｅ　ｌｙｓ　ａｌａ　ｔｈ ｒ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｌｙｓ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｑ１ｕ　ｈ奄■ ＧＴＴ　ＧＴｒ　ＧＣＣ　ＴＣＴ　Ｇｊ．Ｃ　ＧＣＧ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　Ｇλτ 　ＧＣＣ　入λＣＣτＡ　Ｇ入Ｇ　ＣＴＧ　ｍ　Ｃ入τ　３V０ ｖａｌ　ｖａｌ　ａｌａ　ｓｅｒ　ａｓｐ　ａｌａ　ａｓｐ　ｌｅｕ　ａｓｐ　 ａｌａ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｇｌｕ　ｌｅｕ　ｐｈｅ　ｈｉｓｒｃＪ．ｋＴｒ　Ｃ 入Ｃ　入Ｇ入　入（（　ＴＧＴ　ＣτＧＧ入ＣＴＴム　ＴＣＧ　入入λ　ＧＣλ 　λＴｒ　ＧＴ入　ＣＴＣ　Ｔ入τ　４P８ ｓｅｒ　ｉｌｅ　ｇｉｎ　ａｒｇ　ｔｍｒ　ａｙｓ　ｌｅｕ　ａｓｐ　ｌｅｕ　 ｓｅｒ　ｌｙｓ　ａｌａ　ｉｌｅ　ｖａｌ　ｌｅｕ　ｔｙｒ（ＡＡ　（ＡＧ　ｋ ＧＧ　Ａτ入　ＴＧＴ　ττＣ　ＴＴＧ　ＴＣＴ　Ｃ入Ａ　ＧＡＡ　ＧＡＪＩ　 入入ＣＧ入入　ＣτＧＧＧ＾　λλ入　S６６ ｇｉｎ　１ｙｓ　ａｒｇ　ｉｌｅ　ｃｙｓ　ｐｈｅ　ｌｅｕ　ｓｅｒ　９１１１ 　ｇｌｕ　ｑｌｕ　ａｓｎ　ｇｌｕ　ｌｅｕ　ｇｌｙ　ｌｙ■ τττ　ＣＴＴ　Ｃ（；Ａ　ＴＣＣ　ＣＡＡ　Ｇ（：Ｔ　ＴＴＣ　ＣＡＡ　ＧＪ ．Ｔ　ＪＩＪｕ　ＡＣＣ　＾ＧＡ　ＧＣλ　ＧＧ入　五入Ｇ@八τＧ　５１９ ｐｈｅ　ｌｅｕ　ａｒｇ　ｓｅｒ　９１１１１　ｇｌｙ　ｐｈｅ　ｇｉｎ　ａｓ ｐ　ｌｙｓ　ｔｈｒ　ａｒｇ　ａｌａ　ｇｕｙ　ｌｙｓ　ｍ■■ λτＧＣλ入　ＧＣＣ　λＣ入　ＧＣＡ　入ＡＣ　（；ＣＣ　（ＴＣ　τＧＣ　 τ丁Ｔ　τＣτ　τＣＣ　ＣλＧＣ入Ａ　＾ＧＧ　丁τＧ　T６２ ｍｅｔ　ｇｉｎ♂ｌａ　ｔｈｒ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ａｌａ　ｌｅｕ　Ｃｙｓ　ｐ ｈｅ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｇｉｎ　ｇｉｎ　ａｒｑ　ｌｅｕＧＣＣ　ＴＴｋ　ＣＧ Ａ　ＡＪ．Ｔ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　Ｃ（；Ａ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　Ｃｊｕ　 ＧＡＡ　（；ＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　sＴＴ　６１０ ａユａ　ｌｅｕ　ａｒｇ　ａｓｎ　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ｅｙｓ　ａｒｑ　ｐｈｅ　 ｈｉｓ　ｇｉｎ　ｑｌｕ　ｖａｌ　ｑｌｕ　ｔｈｒ　ｐｈｅｃｃｃ　ｃλτ　Ｃ （；Ｇ　ＧＣＣ　入τ（　ＴＣＡ　Ｇ入ＴＡＣτ　τＣＣＣτＧ　λＣＣ　Ｃτ Ｇ　入入Ｃ　ＣＧＣ　λ丁ＧＧλＡ　６T３ ａｒｇ　ｈｉｓ　ａｒｇ　ａｌａ　ｉｌｅ　ｓｅｒ　ａｓｐ　ｔｈｒ　ｔｒｐ　 ｌｅｕ　セｈｒ　ｖａｌ　ａｓ＋ｘ　ａｒｑ　ｍｅｅ　ｑｌ■ Ｃ入Ｇ　ＴにＣＡ（、Ｇ　ｋｃＧ　Ｇ）Ｊ、　τ入Ｔ　入Ｇ入　ＧＧ入　ＧＣｋ 　ＣＴ入　Ｔｒ人　ＴＧＧ　λτＧ　入λＧ　ＧλＣＧＩＧ@７０６ ｇ１ｎ　ａｙｓ　ａｒｇ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｔｙｒ　ａｒｇ　ｇｌｙ　ａｌａ　 ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｔｒｐ　ｍｅｔ　ｌｙｓ　ａｓｐ、ｖａｌｌｙｓ　ｖａｌ　ｇ ｉｎ　ｔｈｒ　ｇｉｎ　ｖａｌ　ａｒｇ　ｌｅｕ　ａｌａ　ｌｙｓ　ｌｙｓ　ａ ｓｎ　ｐｈａ　ａｓｐ　ｌｙｓ　１ｅｕｐｈｅ　ｔｒｐ　ｇｌｕ　ｌｙｓ　ｔｊ ｘｒ　ｓｅｒ　ｈｉｓ　セｈｒ　ｍｅｔ　ａｌａ　ａｌａ　ｉｌｅ　ｈｉｓ　ｇ ｌｕ　ｓｅｒ　ｐｈI ユｅｕ　ｑｌｕ　ｑｌｕ　ｑｌｕ　ａＳｎ　ｇｉｎ　ａｒｇ　ｌｙｓ　ｑｌｕ　 ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｐｈｅ　ｌｙｓ　ｔ−ｈｒ　ｑｌ■ ａｌａ　ｅｙｓ　ｓｅｒ　ｇｌｙ　ｐｒｏ　’ｉｌｅ　ａｓｐ　ｑｌｕ　ｌｅｕ 　ｌｅｕ　ａｓｐ　ｍｅｔ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｇｌｕ　ｇｌ■ ＧにＴ　ＧＣＴ　ＴＧＣＣＯＧ　ＧＧ入　ＣＣ入　ＧＩＧ　ＧＧ入　ＧＧ（、λ ｃｃ　ｃｃｃ　ｃλλ　ＧＣＴ　Ｃλ入　ＧＣＴ　ＧＣＴ　P２８２ ＣＣＣ＾丁ｎ丁島ＴにυよτＧ黒ＧＧＧＴＣ島ＣＧＧ　ＣＣＣＴＧτυユＡ　ん υｊλ　１７Ｓ５ＦＩＧ、　１ １．−　。：ｓ　ｌｊＬ＋　ｌ−＋ｌｌｌ　躍二　ンＡＩｊｌｊ　ｌ−４Ｌｌ　 ｌ−１）−）−−−１１Ｊｌｊ　’ｌ−Ｊ／ＣＬＩＬ＋’：’ＩｈＬ＋＜Ｄ（ｊ ＋ｊ（ＪＯ。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲＩ

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．配列表に示すアミノ酸配列、またはその抗原性断片を含んでなる単離された ＰＭ−１タンパク質。
2. ２．組み換えＤＮＡ技術により生産された、請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質 または抗原性断片。
3. ３．ＰＭ−１タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端またはアミノ末端および カルボキシ末端の両者に結合した追加のアミノ酸残基をさらに含む請求の範囲１ のＰＭ−１タンパク質。
4. ４．追加のアミノ酸残基がＰＭ−１タンパク質から誘導される請求の範囲３のＰ Ｍ−１タンパク質。
5. ５．Ｔ細胞エピトープを含む請求の範囲１の抗原性断片。
6. ６．ＭＨＣ　ＩＩ糖タンパク質と複合体を形成し、前記複合体はＴ細胞レセプタ ーと反応することができない請求の範囲１の抗原性断片。
7. ７．請求の範囲１の修飾されたＰＭ−１タンパク質または修飾された抗原性断片 。
8. ８．請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質または抗原性断片をエンコードする単離 された核酸、あるいは前記核酸の機能的同等体。
9. ９．ＤＮＡである請求の範囲８の核酸。
10. １０．請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質または抗原性断片をエンコードする核 酸、あるいは前記核酸の機能的同等体を含有する発現ベクター。
11. １１．請求の範囲１０のベクターで形質転換された宿主細胞。
12. １２．核酸がＤＮＡである請求の範囲１０の発現ベクター。
13. １３．請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質または抗原性断片と特異的に反応性の モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体あるいはそれらの免疫反応性断片 。
14. １４．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤および請求の範囲１のＰＭ−１ タンパク質または少なくとも１つの抗原性断片を含んでなる薬剤組成物。
15. １５．個体におけるＩ型糖尿病の亢進を予防するか、あるいはＩ型糖尿病の発症 する危険性のある個体におけるＩ型糖尿病の発症を予防する方法であって、個体 におけるこのような亢進または発症を予防するために有効な量の請求の範囲１４ の組成物を個体に投与することを含んでなる方法。
16. １６．個体におけるＩ型糖尿病の亢進の予防するか、あるいはＩ型糖尿病の発症 する危険性のある個体におけるＩ型糖尿病の発症を予防する方法であって、個体 に請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質または抗原性断片を、可溶性の非免疫原性 の形態で、前記個体を前記ＰＭ−１タンパク質に対して耐性とするために有効な 量で投与することを含んでなる方法。
17. １７．応答する個体のＴ細胞をＰＭ−１タンパク質に対して耐性とする請求の範 囲１６の方法。
18. １８．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤および【配列があります】 式中Ｘａａ１はＭｅｔまたはＨｉｓでありそしてＸａａ２はＡｓｐまたはＬｅｕ である、 を含んでなるアミノ酸配列を含む治療用組成物を、個体における自己免疫疾患を 処置するために有効な量で、個体に投与することを含んでなる、個体における自 己免疫疾患を処置する方法。
19. １９．自己免疫疾患がＩ型糖尿病である請求の範囲１８の方法。
20. ２０．製剤学的に許容されうる担体または希釈剤および【配列があります】 式中Ｘａａ３はＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ｘａａ４はＧｌｕまたはＬｙｓであ り、そしてＸａａ５はＧｌｕまたはＬｅｕである、を含んでなるアミノ酸配列を 含む治療用組成物を、個体における自己免疫疾患を処置するために有効な量で、 個体に投与することを含んでなる、個体における自己免疫疾患を処置する方法。
21. ２１．自己免疫疾患が１型糖尿病である請求の範囲２０方法。
22. ２２．糖尿病の発症する危険性のある個体を同定するために生物学的流体の中の ＰＭ−１タンパク質に対する抗体を検出する方法であって、ａ．配列表に示すア ミノ酸配列、またはその免疫反応性部分を含有するＰＭ−１タンパク質を、個体 の生物学的流体と、ＰＭ−１タンパク質と生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク 質に対する抗体との間の複合体の形成を可能とする条件下に、接触させ、そして ｂ．前記生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体の存在の指標とし て複合体の形成を検出し、そして糖尿病の発症する危険性のあるものとして前記 個体を同定する、ことを含んでなる方法。
23. ２３．生物学的流体がヒトの血清または血漿である請求の範囲２２の方法。
24. ２４．ＰＭ−１タンパク質が組み換えＤＮＡ技術により生産される請求の範囲２ ２の方法。
25. ２５．糖尿病の発症する危険性のある個体を同定するために生物学的流体の中の ＰＭ−１タンパク質に対する抗体を検出する方法であって、ａ．配列表に示すア ミノ酸配列、またはＰＭ−１タンパク質に対する抗体と免疫反応性の、その部分 からなるＰＭ−１タンパク質が取り付られた固相の支持体を準備し、 ｂ．前記固相の支持体を、試験すべき生物学的流体の試料と、前記固相の支持体 に取り付けられたＰＭ−１タンパク質に前記試料の中の抗体が結合できる条件下 に、インキュベーションし、ｃ．前記固相の支持体を前記試料から分離し、そし てｄ．前記生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体の存在の指標と して、前記固相の支持体に結合した抗体を測定し、そして糖尿病の発症する危険 性のあるものとして前記個体を同定する、ことを含んでなる方法。
26. ２６．前記固相の支持体に取り付けられたＰＭ−１タンパク質を組み換えＤＮＡ 技術により生産する、請求の範囲２５の方法。
27. ２７．前記生物学的流体がヒトの血清または血漿である、請求の範囲２５の方法 。
28. ２８．前記固相の支持体に結合した抗体を測定する工程が、ａ．前記生物学的流 体を誘導した種の免疫グロブリンに対する標識化抗体と、前記固相の支持体をイ ンキュベーションし、ｂ．前記固相の支持体を標識化抗体から分離し、そしてｃ ．前記生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体の指標として、前記 固相の支持体に結合する標識を検出する、ことを含んでなる、請求の範囲２５の 方法。
29. ２９．前記標識化抗体が標識化抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求の範囲２８の方法 。
30. ３０．別々の容器の中に、成分： ａ．配列表に示すアミノ酸配列、またはＰＭ−１タンパク質に対する抗体と免疫 反応性の、その部分からなるＰＭ−１タンパク質が取り付られた固相の支持体、 および ｂ．標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、 を含む、生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体を検出するための キット。
31. ３１．前記固相の支持体に取り付けられたＰＭ−１タンパク質が組み換えＤＮＡ 技術により生産される、請求の範囲３０のキット。
32. ３２．糖尿病の発症する危険性のある個体を同定するために生物学的流体の中の ＰＭ−１タンパク質に対する抗体を検出する方法であって、ａ．ＰＭ−１タンパ ク質に対する自己抗体と十分に免疫反応性であるように、配列表に示すアミノ酸 配列を十分に複製したものであるアミノ酸配列を有する修飾されたＰＭ−１タン パク質を、個体の生物学的流体と、修飾されたＰＭ−１タンパク質と生物学的流 体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体との間の複合体の形成を可能とする条 件下に、接触させ、そして ｂ．前記生物学的流体の中のＰＭ−１タンパク質に対する抗体の存在の指標とし て複合体の形成を検出し、そして糖尿病の発症する危険性のあるものとして前記 個体を同定する、ことを含んでなる方法。
33. ３３．個体に請求の範囲１のＰＭ−１タンパク質または抗原性断片を、可溶性の 非免疫原性の形態で、前記個体を前記ＰＭ−１タンパク質に対して耐性とするた めに有効な量で投与することを含んでなる、ＰＭ−１タンパク質に対して免疫応 答を示す個体を耐性とする方法。
34. ３４．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により測定 して、約６９ｋＤの分子量を有し、ヒトのランゲルハンス島、ヒトのインスリノ ーマ、および神経細胞により発現されるＰＭ−１タンパク質。