JPH05503849A - Ｔｓｈのヒト受容体及びこの受容体をコードする配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＳＨのヒトｊｇ″　びこのＨをコード　る　４本発明は、ＴＳ）（のヒト受容 体及びこの受容体をコードする核酸に係る。

Ｔ　Ｓ　Ｈの受容体は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の受容体である。この受 容体は多数の甲状腺疾患、特にバセドウ病や他の甲状ＲＲ能不全のような自己免 疫疾患に関与する。

現在までに入手可能なＴＳＨ受容体に関する種々のデータでは、その構造を確実 に立証することはできない、既知の分子量は、データによると３００００〜２０ ００００である。このばらつきは、これらの分子とその生物学的及び薬理学的特 性を知るために多数の不確定要素が存在していることを示している。

さて本発明者らは、ＴＳＨの受容体をコードするヌクレオチド（核酸）配列をク ローニング及び単離した６本発明者らは更に、この受容体をコードする遺伝子の 位１を決定した。

従って本発明は、ＴＳＨのヒト受容体又はこの受容体の一部をコードする核酸に 係る。

本発明は更に、受容体特性を有しており且つ該核酸にょリコードされるタンパク 質にも係る。本発明は更に、ヒトＴＳＨの受容体をコードする核酸を外来配列と して含む組換ベクターにも係る。本発明は更に、ヒｌ−Ｔ　Ｓ　Ｈの受容体を発 現することが可能な形質転換細胞宿主にも係る。

本発明は更に、例えばバセドウ病のような所定の甲状腺疾患の診断又は検査、更 には治療用手段も提供し、これらの手段は特に、種々の甲状腺疾患、特にバセド ウ病に存在するこの受容体に対する抗体を検出し、場合により測定するために、 原核細胞系又は真核細胞系での発現により受容体を産生させるものであり、更に 、ＴＳＨの受容体の遺伝子の遺伝的異常を検出するため又は所定の癌の場合に受 容体の異常を検出するためのヌクレオチドプローブから構成され、これらの手段 は更に、ＴＳＨのヒト受容体に対する抗体から構成され、これらの抗体は場合に より毒性を獲得するように修飾され得る。本発明の他の手段は、Ｔ　Ｓ　Ｈのヒ ト受容体に対する抗体、即ち所定の甲状腺疾患、特にバセドウ病の過程で形成さ れる抗体に固定することが可能であり、従って、自然抗体が受容体に固定して受 容体と活性化又は阻害するのを阻止することが可能なペプチドである。

本発明の核酸はｕＴのヌクレオチド配列Ｉに合致することを特徴とする核酸、 ：　；　二　：　：：　：　：　ズ　：　ｇ　ｇ　＝；＾　内　ｌ！　−−ψ　 Ｐ　暢　−Ｏｍ　４　ｐ４　＾ｄ　ｄ　−ｎ　−ｄ　ｍ　ｎ　＋＋　Ｎ　Ｎ　Ｎ 　１ｍ　Ｎ： 鏝 瀝 区 ツ ！ く 鳳 ！ ま た ニ ド　ヒ　述　ン　ｚｔｉｙ　ジ　３　ミ　ｌ　１　膏又はこの核酸の変異体もし くはこの核酸のフラグメントであって、ＴＳＨのヒト受容体の構造特性及び／又 は機能特性及び／又は抗原特性を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコー ドする変異体もしくはフラグメントである。

従って、形成されるコード化タンパク質が以下の条件の少なくとも１以上を満た すとき、配列■に合致する核酸の変異体又はこの核酸の部分も本発明の範囲に含 まれる。

＊コード化タンパク質又はポリペプチドは、配列Ｉの核酸から誘導されるアミノ 酸配列に含まれ且つこのフラグメントが細胞の表面に暴露されたときにヒトＴＳ Ｈ受容体として挙動する（ＴＳＨを特にアデニル酸シクラーゼ又は別の形質導入 系の活性化に結び付ける）ことができるためにその存在を必要とする部位を含む 。

＊コード化タンパク質又はポリペプチドは、下記アミノ酸配列■を認識するか又 はＴＳＨヒト受容体の循環分泌形を認識する抗体により認識され得る。

＊コード化タンパク質又はポリペプチドは、下記アミノ酸配列■を認識し且つこ れらの抗体と共に抗体−抗原型の複合体を形成する抗体を産生し得る。

本発明の核酸は、ヒト染色体１４のｑ３１位に位置付けられる遺伝子に担持され ることに留意すべきである。

本発明の核酸は、ＴＳＨのヒト受容体の特徴を有するという点において特に有利 である。実際に、この核酸又はその発現産物を診断用途及び場合により人体での 治療用途で使用すると仮定するならば、診断的、薬理学的又は治療的目的で人体 で使用するのに適合可能な遺伝的材料を提供することが重要である。

本発明の核酸は有利には、ＴＳＨのヒト受容体に対応する成熟タンパク質をコー ドする核酸であり、この成熟タンパク質は、シグナルペプチドが遊離されている ことを特徴とする。

本発明は更に、以下の配列に対応する核酸フラグメントに係る。

一１位のアミノ酸と３９４位のアミノ酸との間に含まれるアミノ酸配列をコード するヌクレオチド配列、−３９５位のアミノ酸と６６０位のアミノ酸との間に含 まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、−６６１位のアミノ酸と７ ４３位のアミノ酸との闇に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 。

本発明は更に、以下の核酸配列に対応するヌクレオチドフラグメントに係る。

一１９位のアミノ酸と２４３位のアミノ酸との間に含まれる配列、 一２４６位のアミノ酸と５２６位のアミノ酸との間に含まれる配列、 一６０４位のアミノ酸と７６４位のアミノ酸との間に含まれる配列。

上記番号は配列■、実施例及び実施例に関する図面を引用した。

本発明の核酸は更に、以下のアミノ酸配列■に合致するタンパク質 ｆｆ４ｍｍＱｌｄ６Ｎ−・Ｏ＾φ− ＥｅＳＨＭ　ξ　ラ　璽　置　口　＝　；ミ　月　■　属　ｋ　目　真　＞　− 。

Ｍ″　−り ！　Ｃ？：　べ　！　５　ｇ　；　！’　：　！　＝　；　υｍ−２？！：′ｊ ｊゝゝ 二Ｓ　Ｍ　＜　Ｌｔ　ｅ　１３　ｈ　５　！　：　ｓ　ｄ　ｘ゛　ｃ゛ｅ　ｅ　 ｃ　！　、ａ　、旨　ｚ　Ｊ　ごｏＩＩｌ＜　に　Ｈべ　− Ｊ　萬　兵　６　コ　ド　目　■　ｚ　；！　：　ｊ　：　ｊｌ！　２　＞　− 、！　ｏ　乏　二′　：　２　ゝ ス　タ　−；　？：に、　！　２　：　：　３　！　２　！ｊ＠：Ｊ　′　ｊｊ ＠　″　′＠ｏ　（′３　ご　＃ｋｊ＆Ｉ＋　タ　二　３　；　＝　二　二ａ２ ３：１２ζご２３１　ｊ　：　；　；コ冒　；　Ｊ　目　５ｓｓａＢ’ｉｌ　Ｌ り　捻　Ｊ　；　″　り ！　己　ｅ３！！’ａ！！−−−タ　、！、５　：　；　ス　エ 、　９＃ｄｄ　＋６　６　−　ψ　噛　ト　た　ト　トー　・　＠！　＋１　＠ 　＠　″　＠＠０よ　Ｈ２４ｌ　３　３　：　：　ｉ：！ｒ　！ｊ　！占　３　 目　Ａ　３　；　ａ　Ａ　５　Ａ　Ａ　５′　＠　１　２　３４３５３　′　二 コ　＝？：　ご　４＆、！　、＋４！　ゎ　５　ヨ又は、配列■の構造的もしく は機能的もしくは抗原的特性を有するかもしくはそれらの特性を併有するこのタ ンパク質の変異体もしくは一部をコードすることを特徴とする。

本発明は更に、こうして形成されたタンパク質がＴＳＨのヒト受容体の構造的及 び／又は機能的及び／又は抗原的特性を有するかもしくはこれらの特性を併有す るという条件下で、上記アミノ酸配列■の全部又は一部に合致することを特徴と するタンパク質にも係る。

本発明の有利な実施態様によると、このタンパク質はＴＳＨのヒト受容体に対応 する。本発明のタンパク質は本発明の別の実施態様によると、ＴＳＨのヒト受容 体の固定部位を欠失し得る。

上記定義によると、本発明は特にＴＳ）（のヒト受容体に対応するタンパク質に 係り、このタンパク質はシグナルペプチドを欠失する。

従って、本発明はグリコジル化又は非グリコジル化形態のＴＳＨヒト受容体のタ ンパク質又はこのタンパク質のポリペプチドもしくはペプチドフラグメントにも 係る。

ペプチドフラグメントは有利には慣用方法、場合によりタンパク質を適切な酵素 で切断することにより得られる。

ＴＳＨのヒト受容体に対応するタンパク質の最も親水性の領域の内側でこれらの タンパク質を選択すると有利である。

特に有利なポリペプチドは、１９位〜２４３位、２４６位〜５２６位、６０４位 〜７６４位の開のアミノ酸鎖により構成される。他の有利なポリペプチド又はペ プチドは、これらの鎖の抗原特性を維持するという条件下で上記類を含むか又は 上記類に含まれるポリペプチド又はペプチドである。

これらのペプチドは例えば、慣用のモノクローナル抗体製造方法によりポリクロ ーナル抗体又はモノクローナル抗体を製造するために使用され得る。

ＴＳＨのヒト受容体タンパク質のアミノ酸配列が解明され、ＴＳＨの受容体のｃ ＤＮＡ又は遺伝子を発現させることができるならば、ＴＳＨに類似し且つより活 性な分子、又はＴＳＨのアンタゴニストをめるための手段を提供できる。

この仮説によると、ＴＳＨの点修飾を利用することができる。

本発明は更に、ベクターの複製に非必須の部位に挿入された上記核酸の１種を外 来核酸として含むことｆ！：特徴とする組換ベクターにも係る。

好適ベクターは、 −例えばβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を含む組換核酸並びにアミノ酸配列１９ 〜２４３，２４６〜５２６及び６０４〜７６４の１種をコードするヌクレオチド フラグメントにより修飾されたベクターｐＵＲ２９２、−ヒトユビキチン（７６ アミノ酸）をコードするＤＮＡを上記フラグメントの各々で組換えることにより 修飾されたＭｏｎ１ａ他（Ｊ　Ｂｊｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４．　Ｐ４Ｏ１０−４ １０３，１９８９＞に記載のベクタ・ｐ　ＮＭＨＵＢである。

これらの組換ベクターは好ましくは、外来核酸の発現及びクローニング用ベクタ ーである。

好適組換ベクターは例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウィルス誘導体 （例えばバキュロウィルス）である。

本発明の実施に特に有利な組換ベクターは、外来核酸を所定の細胞宿主中で発現 させることが可能な調節エレメントの制御下に該核酸が配置されたベクターであ る。このような調節エレメントは、選択された細胞宿主の酵素系により認識され る能力により選択される。本発明の核酸配列及びその誘導体、特に組換ベクター は、細菌（特に大腸菌）のような原核細胞系、又は特に酵母、動物細胞（例えば 昆虫細胞、特にショウジヨウバエ細胞又は哺乳動物細胞）のような真核細胞系で 利用され得る。

有利な哺乳動物細胞は例えばＣＨ○細胞である。

本発明は更に、ベクターに挿入された外来核酸を発現させることができるような 条件下で上記ベクターから選択されるベクターにより形質転換されていることを 特徴とする細胞宿主に係る。

本発明の実施に好適な細胞宿主は、原核細胞系（特に大腸菌のような細菌）、又 は真核細胞系（特に酵母、又は昆虫細胞、特にショウジヨウバエ細胞、又は動物 細胞、特にＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞）である。

特に好適な細胞宿主は、それ自体本発明の核酸により修飾されたバキュロウィル ス型のベクターにより形質転換されたショウジヨウバエ細胞により構成される。

ＴＳＨの受容体の発現は非野生形で得られる。Ｔ　Ｓ　Ｈのヒト受容体を発現さ せるために選択される細胞宿主は更に、野生コンホメーションにおけるヒトＴＳ Ｈ受容体又はこの受容体の一部を発現させることが可能な宿主であり得る。

こうして産生されたＴＳＨの受容体又はこの受容体の一部は従って、該受容体が １ｎｓｉｔｕで有すると類似の三次元コンホメーションを有する。

本発明の別の好適実施態様によると、細胞宿主は該宿主により発現され得るＴＳ Ｈのヒト受容体がｉｎ　５ｉｔｕで天然に行われる翻訳後修飾を受けていること を特徴とする。

本発明は更に、上述の組換ベクターにより形質転換された細胞宿主により発現さ れるようなＴＳＨ受容体又はこの受容体のフラグメントにも係る。

本発明は更に、上記ＴＳＨのヒト受容体を特異的に認識する能力を有することと 特徴とするポリクローナル又はモノクローナル抗体にも係る。

モノクローナル抗体は特に、本発明のタンパク質で予め免疫した動物く例えばマ ウス）の牌細胞をミエローマ細胞と融合させ、こうして形成されたハイブリドー マを回収する段階と、ハイブリトーマを培養し、前記タンパク質に対するモノク ローナル抗体と産生することが可能なハイブリドーマを選択する段階とに従って 操作することにより、慣用方法により得られる。

有利な抗体は、ＴＳＨのヒト受容体の細胞外ドメインに特異的な抗体である。

これらの抗体は更に、ＴＳＨのヒト受容体に由来し且つ場合により高分子に結合 されたペプチドで予め免疫したマウスの牌細胞をミエローマ細胞と融合させるこ とにより形成されるハイブリドーマがらも得られる。使用されるペプチドはＴＳ Ｈの受容体に由来するペプチドでもよいし、慣用方法に従って化学的合成により 得られるペプチドでもよい。

本発明の別のモノクローナル抗体は、ＴＳＨ受容体の特徴を有するアミノ酸鎖及 びβ−ガラクトシダーゼ又はヒトユビキチンのような担体タンパク質を含む組換 タンパク質で免疫した動物（例えばマウス）のＪ！！！細胞をミエローマ細胞と 融合させることにより形成されるハイブリドーマからも得られる。

ＴＳＨ受容本の配列Ｈのアミノ酸Ｗ１９〜２４３．２４６〜５２６及び６０４〜 ７６４に特異的なＭａｂもこの類に含まれる。

本発明は更に、実施例に記載するようなこれらのＭａｂを産生するハイブリドー マにも係る。

他のモノクローナル抗体は、上記鎖の抗原特性、及び場合により免疫原特性を有 するという条件下でこれらの鎖に含まれるか又はこれらの鎖を含むフラグメンＩ 〜を特異的に認識する抗体である。抗原特性を有することが可能であり、担体タ ンパク質に結合している場合には免疫原性を有することが可能な本発明の好適フ ラグメントは、１０個以上、好ましくは２１個以上のアミノ酸を有するフラグメ ントである。抗体の製造に使用されるフラグメントは、ＴＳＨ受容体の配列の全 体を含んでもよいが、有利には２５０個未溝のアミノ酸を含む。

本発明の範囲で有用なモノクローナル又はポリクローナル抗体は更に、毒性分子 、例えばジフテリア毒素又は放射性物質で抗体ご修飾することにより得られる抗 毒素の形態でもよい。これらの抗毒素はこの場合、所定の甲状腺疾患、特に所定 の甲状腺癌の治療に使用可能な治療薬を形成することができる。

本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は、甲状腺組織の受容体の免疫細胞化学 的分析、例えば免疫蛍光、金標識、免疫ペルオキシダーゼによる分析にも使用す ることができる。

本発明の抗体は更に甲状腺起源の転移の識別にも使用することができる。

これらの抗体の別の用途は例えば、バセドウ病く又はグレイゲス病）又はアシモ ト病のような甲状腺の自己免疫疾患における自己抗体の検出のための使用である 。

この場合、自己抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出のために「サンドイッチ」試験を実 施することができる。本発明のモノクローナル抗体は、上記ポリペプチド又はペ プチドの１種に対応し、ヒト甲状腺から抽出されるか又は修飾細胞により産生さ れる抗原を固定するために使用される。こうして本発明の抗体に固定された抗原 は、疾患の血清中で自己抗体を検出するために使用される。抗原−抗体結合はこ の型の複合体に一般的な結合又は共有架橋結合である。

Ｍａｂの別の用途は、例えば組換細胞により産生される抗原の免疫精製である。

本発明の抗体、特にモノクローナル抗体は更にバセドウ病、アシモト病のような 甲状腺疾患の監視にも適切である。

ＴＳＨの受容体の特異抗原に結合した本発明のＭａｂを使用することにより、患 者の血液中に存在する自己抗体の割合を決定すると、これらの患者の治療を調節 することができる。

更に、所定の集団を本発明のＭａｂで免疫することもでき、これらのＭａｂはＴ ＳＨの受容体の工と１・−ブを認識する。この場合、得られる新規抗体は循環自 己抗体に対するトラップとして機能し得る。この場合、イディオタイプ−抗イデ イオタイプ網を形成することが問題となる。本発明のＭａｂの注入により形成さ れる抗体はＴＳＨ受容体の相補的領域を有しており、ＴＳＨ受容体で循環自己抗 体を固定できると証明され得る。

本発明は更に、ＴＳＨのヒト受容体の製造方法にも係り、該方法は、調節エレメ ント、特に細胞宿主のポリメラーゼにより認識され且つこの宿主中で該核酸と発 現させることが可能なプロモーターの存在下で、本発明の外来核酸を含む上記の ような組換ベクターでコンピテント細胞宿主を形質転換させる段階と、該核酸を 発現させることが可能な条件下で形質転換細胞宿主を培養し、場合により、発現 されたタンパク質を膜に向かって輸送する段階とを含むことを特徴とする。

本発明は更に、ＴＳ）（のヒト受容体に対する抗体の存在を生物学的サンプルで ｔｎ　ｖｉｔｒｏ３断するための方法にも係り、該方法は、生物学的サンプル、 特に血漿を、ＴＳＨのしＩ〜受容体又はこの受容体の一部に対応し、支持体に予 め固定され、場合により本発明のＭａｂに結合された本発明のタンパク質に接触 させる段階と、場合により形成された抗体−タンパク質複合体を検出する段階と を含むことを特徴とする。

本発明は更に、ＴＳＨのヒト受容体に対する抗体の存在を生物学的サンプルでｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ診断するためのキラｌ〜にも係り、該キットは、本発明のＭａｂ により構成され得る支持体に固定された本発明のタンパク質又はこのタンパク質 の一部と、タンパク質−抗体複合体の形成の検出手段とを含む。

このような診断用キットは、例えばバセドウ病、アシモト病又は別の甲状腺疾患 に起因する疾患の場合に産生される抗ＴＳＨ受容体抗体を検出するために使用さ れ得る。

本発明は更に、本発明の核酸又はその相補的配列もしくは対応するＲＮＡとハイ ブリダイズすることを特徴とする合成又は非合成ヌクレオチドプローブにも係る 。

このようなプローブは、ＴＳＨのヒト受容体の遺伝的異常の於断操作又は所定の 癌の場合に受容体のレベルに存在する異常の検出に使用され得る。

更に、本発明のベクターでトランスフェクトした細胞における抗体の検出システ ムも製造することができる。トランスフェクトした細胞を例えば患者の血液と接 触させる。

次に放射性ＴＨ３の固定が阻害されているか又はアデニル酸シクラーゼもしくは 他の任意の形質導入システムが活性化されているか登検出する。

このために本発明は、抗体の存在の機能的試験のためにＴＳＨ受容体のｃＤＮＡ 又は遺伝子の発現を使用する全システムに係る。

本発明のその他の特徴及び利点は、実施例及び以下の図面に明示される。

ｌユ・ヒトＴＳＨ受容体の構造の説明図。

Ａ：親疎水性分布図（Ｈｏｏｐ　Ｍ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ。

１９８１、ＰＮＡＳ　−ＵＳＡ　７８．　３８２４−３８２８）。疎水性領域は 負の値に対応する。Ｉ〜■は予想されるトランスメンブランセグメントに対応す る。

Ｂ　：　ｈＴＳＨ受容体（ＴＳＨのヒト受容体）とＬｏｏｆｅｌｔｈ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ　２主５．　５２５−５２８）に記載のｐＬＨ ／ｈＣＧ受容体の比較。

陰影領域は予想されるシグナルペプチドと７個の層領域を表す。Ｅ１〜５は予想 される細胞外ドメインであり、工１．２は細胞内ドメインである。アミノ酸番号 を図面の上下に示した。

Ｃ：配列決定に使用されるｃＤＮＡのクローンの地図。λｈＴＳＨＲは＾ｇｔｌ Ｏのクローンである。オーブンリーディングフレームを四角で囲んだ。

区ユニ　Ｔ　Ｓ　Ｈのヒト受容体（ｈＴＳＨＲ）及び推定タンパク質の配列。

＋１位は開始コドンの第１番目のヌクレオチドの位置である。ヌクレオチド番号 （上段）及びアミノ酸番号（下段）を示した。細胞外ドメインの窒素に結合した グリコジル化部位を下線で示し、キナーゼＣによる予想リン酸化部位を点線で示 した。いくつかのクローンでは変化が見られる。

その変化は配列の上部に示す。アミノ酸の変化は、Ｌｅｕ→Ｐ　ｒ　ｏ　１．３ 、Ｌｅｕ→Ｐｒｏ２６０、Ｔｙｒ　→Ｈｉｓ４１４、Ｐ　ｈ　ｅ−ＩＬ　ｅ　ｕ 　５００、Ｐｈｅ−＋Ｌｅｕ６３４．ＧＩｕ−Ａｓｐ７２７、Ｌｙｓ−＊Ａｓｎ ７４４である。

１ｉ　：　Ｔ　Ｓ　Ｈ受容体のｍ、　ＲＮ　ＡのＲＮＡプロットの分析。

ヒト甲状ＷＡ（レーン１）、精巣（レーン２）、卵巣（レーン３）、肝臓（レー ン４）及び肝臓（レーン５）のポリアデニル化ＲＮＡ　（２０μｇ）を分析した 。ＤＮＡマーカーのサイズをＫｂ（キロベース）で示す。

［：　ＣＯＳ　７細胞におけるＴＳＨ受容体のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの発現、ＴＳＨ受 容体をコードするベクターでＣＯ３７細胞をトランスフェクトした。非振ｍｂＴ ｓＨ（・）、ｐＬＦ（（○〉及びｂＦｓＨ（△）の４度を増加させながら「方法 ｊの項に記載するように”５Ｉ−ｂＴＳ）（の固定を検討した。

非標識ホルモンの不在下の”５Ｔ−ｂＴＳＨ結合百分率として結果と表す（３試 験）。枠内はアデニル酸シクラーゼの刺激を示す。

Ｘ１１ ＴＳＨシ”　のｃＤＮＡのクロー二之ｌ友韮 任意にブライミングされる相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）をヒＩ・甲状腺のポリア デニル化ＲＮ　、Ａから作製した。ｃＤＮＡのサイズによる選択及びベクターλ ｇｔｌｏへのクローニングはＬｏｏｓｆｅｌｔ　Ｈ，ｅｔ−ａｌ、（１９８９、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２土５．　５２５−５２８＞に記載の方法に従った。全体を２ Ｐで標識したブタのＬ　Ｈ／　ｈＣＧ（ルテオトロビン／ヒトコリオゴナドトロ ピン）の受容体のｃＤＮＡ″ｃｃＤＮＡバンク（１，５Ｘ１０’クローン）をス クリーニングした。６ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０゜１５Ｍ塩化ナトリウム、０． ０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、３０％ホルムアミド、０．５％ポリビニルピロ リドン、０．５％フィコール、サケ精子ＤＮＡ　（１５０μｇ／ｍ　Ｉ　）で変 性させた０、５％ウシ血清アルブミン及び０，２％ドデシル硫酸ナトリウムを含 有するＨ１ｗｉ中で、ニトロセルロースフィルタを３７℃で３６時間、５Ｘ１０ ’ｃｐｍ／ｍ１のプローブとハイブリダイズさせた。フィルタを１５分間５０℃ で６ＸＳＳＣで２回、１５分間２５℃で２ＸＳＳＣで２回５最後に１０分間４５ ℃で２ｘｓｓｃで洗浄した。ブタＬＨ／ｈＣＧの受容体のｃＤＮＡの細胞外領域 又はｌ−ランスメンブラン領域とハイブリダイズする能力を決定するために、１ ００個の陽性クローンを試験した。８個のクローンを選択して配列決定を行った 。

【五決淀 ブルースフリア１〜ベクター（ストラテジー）て＾ＴＳＨＲクローンをサブクロ ーニング後に、Ｍｉｓｒａｋｉ　Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ ｕｎ、　１４３．　７４０−７４８）により記載されている方法に従って配列決 定と行った。

ＲＮＡプロ・ソト これらの分析は、ヒト組織にポリアデニル化ＲＮＡを使用することにより実施し た。任意にプライミングされるλＴＳＨＲ，のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサート（２， ２Ｋｂ）（６Ｘ１０’ｃｐｍ／ｎｇ、　５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍ！　）とハイブリ ダイズさせた。

クローン　ｃＤＮＡの （第１番目のコドンから数えてヌクレオチド４４〜ヌクレオチド２３９５の間に 位置する）クローンλｈＴＳＨＲ１及びλｈＴＳ）ＩＲ，を使用することにより 、ヒトＴＳＨホルモンの受容体（ｈ　Ｔ　Ｓ　ＨＲ）の完全コーディング領域を 構築した。ｃ　Ｄ　Ｎ　、ＡをベクターｐＫｓＶ１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） に挿入し、Ｇｕ　ｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅ　ＩＡ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８８ ，Ｎａｔｕｒｅ　３３６、　６９５−６９８）により記載されているようにＣ０ ８７細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクションから４ ８時間後に細胞を使用した。

ヨウ：１２Ｓ■の　−（”５Ｉ−ｂＴＳＨ）の　舌・。

精製ウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ）（４０ｉ、ｕ／ｍｇ）をＰｏｗｅ＋Ｉ−Ｊｏｎｅｓ 　Ｃ，Ｈ，Ｊ、ｅｔ　ａｌ。

（１９８０，ＪＢＣ２５５，４００１−４０１０）により記載されているラクト ペルオキシダーゼ法によりヨウ素化し、限外ゲルクロマトグラフィーＡ　ＣＡ　 ４．４により精製した。比活性は２５μＣｉ／μｇであり、固定最大活性は総放 射活性の３０％であった（ブタ甲状腺膜で測定）。

固定試験は、ＰＳＡ（２０ｍＭリン酸塩ｐ）ｆ７．４．０゜２％ウシ血清アルブ ミン＞２００μ１．３Ｘ　１．Ｏ’ｃｐｍの１’５■−ｂＴＳＨ及び種々の量の ｂＴＳＨ（３０ｉ、ｕ／ｍｇ＞を含有する０、２５Ｍショ糖勾配中で１０５個の 細胞を使用して３回行った。

３７°Ｃで３０分開開インキュベーション後恕濁液をＰＳＡ４００μｍ、ＩＭシ ョＮＭ衝液で展開させ、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、 試験管の沈渣を結合して放射活性を測定した。ウサギプロゲステロン受容体のｃ ＤＮＡの発現ベクターでトランスフェクトした細胞を使用して対照実験を行った （Ｇｕ　ｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、）、ウシＴＳＨ固定の 特異性を試験するために、非標識精製ブタＬＦ（ホルモンぐ黄体形成ホルモン） 、及びヒトＦＳＨ（卵胞剰激ホルモン）（１５０Ｌ、ｕ／ｍｇ−Ｍｅｔｒｏｄｉ ｎ　５ｅｒｏｎｏ　−３ｕｉｓｓｅ）を使用することにより競合試験も実施した 。

Ｔ　Ｓ　Ｈに　るアーニル　シクラーゼ゛の　。

６Ｘ１０５個のＣ０Ｓ７細胞を６０　ｎ　Ｍプラークにより展開させ、５μｇの ｐＫＳＶ−ＴＳＨＲ及び５μｇの担体ＤＮＡでトランスフェクトした。４２時間 後、各プラークをゼラチン（１ｍｇ／ｍりを含有するイーグル培地で３回洗浄し た。その後、０．５ｎＭの３−インブチル−１−メチルキサンチンを含有する同 一培地４．５ｍｌと共に各プラークを１５分闇３７℃でインキュベートした。種 々の濃度のウシＴ　Ｓ　Ｈを加え、５分２３７　’Ｃでインキュベーションと実 施した。イーグル培地を回収し、ＩＮ過塩素酸０８ｍ１中で細胞を収集し、遠心 分離した。上清を中和させ、ｃＡＭＰの存在を決定するために試験した（　Ｉ　 ｎ、　ｔ　ｅ　ｒ　ｎａｔｊｏｎａｌ　Ｃｌ５）　。

ポリアデニル化（ポリ（Ａ”））ＲＮＡをヒト甲状腺がら単離し、λｇｔｌＯベ クター中ｃＤＮＡバンクを作製するために使用した。Ｌｏｏｓｆｅｌｔ　Ｈ，ｅ ｔ　ａｌ、。

（１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．　５２５−５２８〉により記載されてい るようなブタＬＨ／ｈＣＧ受容体に対応するプローブでバンクを低ストリンジェ ンスでスクリーニングした。

バンクの１．５Ｘ１０’個のクローンをスクリーニングした処、１８０個の陽性 シグナルが単離された。ブタＬＨ／　ｈ　ＣＧ受容体のｃＤＮＡの５°及び３° 領域に対応するプローブを使用することにより、配列の分析（図ＩＣ）のために ８個のクローンを選択した。

ＬΣ比叉星生みｉ月ｔ±遣・ ヌクレオチド配列はＡＴＧコドンと枠の上流の停止コドンとを有しており、こう して７６４アミノ酸のオーブンリーディングフレーム（７２）を規定する。

Ｎ末端部分は、Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　Ｇ、（１９８６）＜Ｎｕｃｌｅｉｃ　、 へ　ｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４゜４６８３−４．６８６　）により記載 されているような切断部位を有するシグナルペプチドの特徴的な２１アミノ酸配 列をコードする。

従って、成熟タンパク質は恐ら＜８４５０１ダルトンの分子量を有する７４３ア ミノ酸配列から構成されると予想される。

ＴＳＨの受容体の親疎水性プロフィル（図ＩＡ）から明らかなように、タンパク 質の構造を以下のように予想することができる。大きい細胞外ドメインは、Ｎ末 端からアミノ酸３９４まで伸びている。該ドメインは窒素により結合された６個 の予想グリコジル化部位を含む。この領域は５個のセグメント（図ＩＢ）Ｅｌ〜 Ｅ５に分割される。ドメインＥ３（第５番目のドメイン）は強酸性（ＰＫ　ｉ　 ＝４゜１４）であり、配列とＬＨの受容体の同様に酸性の対応領域の長さとが相 違する。

膜ドメインは約２６６個のアミノ酸分含み、７個のトランスメンブランセグメン トを含み得る。

ＴＳＨの受容体の細胞内部分は８３個のアミノ酸を含み、非常に塩基性（ＰＫｉ ＝９．６）である。

この部分の第１のセグメントは、Ｌ　）（、／　ｈ　ＣＧの受容体と相同性を有 する。第２のセグメントは特にＣ末端部分のレベルで相違する。細胞内ドメイン は高比率のセリン及びトレオニン型アミノ酸と、プロティンキナーゼＣによるリ ン酸化に関するコンセンサス部位とを含む（図２）。特異的キナーゼによるリン 酸化は、受容体とプロティンＧとの特異的結合分離における役割を果たす。

ポリ　Ａ″　ＲＮＡ　（、パ３）　び　ＲＮＡのノー　ンブロッＦ立逝： この分析は種々の器官の複数のＲＮＡを用いて実施し、甲状腺中における４３０ ０ヌクレオチドの主要メツセンジャー型及び３９００ヌクレオチドのより少数の バンドの存在を示す。もっと小さい１７００〜１１００ヌクレオチド程度の種も 証明された。精巣、卵巣、膵臓及び肝臓中にはメツセンジャーは観察されなかっ た。

クローン　ｃＤＮＡの　： λ）ＩＴｓＨＲ２及びλＨＴＳＨＲ，がらコーディング領域全長を再構築しく図 ＩＣ）、発現ベクターｐＫｓＶ１０に挿入し、ＣＯ３７細胞にトランスフェクト した（Ｋａｔａｍｉｎｅ　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　１９８８．　Ｍｏ１．ＣｅＩｆ　 Ｂｉｏｌ、８．　２５９−２６６に記載）。

この操作の結果、ヨウ素１２５で標識したウシＴＳＨ（”’Ｉ−ｂＴＳＨ）に固 定するタンパク質が細胞膜上に得られた。固定は飽和性（非標識ＴＳＨでは変動 ）、特異的（目５■−ｂＴＳＨ）であったが、ブタＬＨホルモン（ｐＬＨ）又は ヒトＦＳＨホルモン（ｈＦＳＨ）では変動し得なかったく図４）、更に、ウサギ プロゲステロン受容体をコードする対照発現ベクターｐＫｓＶ１０で細胞をトラ ンスフェクトした場合には、１２５Ｔ−ｂＴＳＨの飽和性の固定は観察されなか った。ベクターｐＫＳＶ−ＴＳＨＲでトランスフェクトした細胞をＴＳＨと共に インキュベートした処、ｃＡＭＰ（サイクリックＡＭＰ、［］４の枠内）の蓄積 の増加が判明した。アデニル酸シクラーゼのこのような刺激は、対照発現ベクタ ーでトランスフェクトした細胞では観察されなかった。

ＴＳＨ扁′体に・するモノクローナル　体の１遣ベタ　−の１′告 ＴＳＨの受容体をコードするｃＤＮＡ及びこのｃＤＮＡの部分を、β−ガラクト シダーゼ又はヒトユビキチンをコードする遺伝子と融合させた。

融合の結果として得られるこれらのヌクレオチド配列を使用してクローニング及 び発現用ベクターを修飾した。この融合時に、β−ガラクトシダーゼの１０２３ 個のアミノ酸及びユビキチンの７６個のアミノ酸を維持した。

使用したＴＳＨ受容体のＤＮＡの特徴的ｃＤＮＡは以下の通りであった。

−ＴＳＨ受容体の遺伝子のｃＤＮＡ全体、−受容体の配列■の１９位（ロイシン ）〜２４３位（セリン）の間に含まれるアミノ酸鎖をコードするｃＤＮＡフラグ メント、 一受容体の配列■の２４６位（ロイシン）〜５２６位（アラニン）の間に含まれ るアミノ酸鎖をコードするｃＤＮＡフラグメント、 一受容体の配列■の６０４位（インロイシン）〜７６４位（ロイシン）の間に含 まれるアミノ酸鎖をコードするｃＤＮＡフラグメント。

β−ガラクトシダーゼをコードする完全遺伝子及びヒトユビキチンをコードする 完全遺伝子とのＣ末端にこれらのｃＤＮＡ配列の各々を融合させた。

その後、得られた組換ＤＮＡの各々とベクターｐＵＲ２９２（Ｒ，ｕｔｈｅｒ　 ｅｔ　ａｌに記載）及びベクターｐＮＭＨＵＢ（Ｍｏｎｉａ　ｅｔ　ａｌに記載 ）に挿入することにより融合ベクターを作製した。

ベクターのポリリンカーのレベルでクローニングを行った。

Δタンパク　の 上記段階で得られた組換ベクターを使用して大腸菌細胞をトランスフェクトした 。総タンパク質に対してこれらの！！含タンパク質を５％以上産産生る細胞を選 択した。

１１叉２三１１ 細胞溶解物の遠心分離、沈渣のストリンジェント洗浄（０，５Ｍβ−メルカプト エタノールの存在下、ＬＭ　Ｎａｃｌ、１％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｒ＋Ｘ１００．６ Ｍ塩化グアニジン）、最後に０．０１Ｍリン酸ナトリウム及び０．１５Ｍ塩化ナ トリウムの緩衝液を使用して尿素８Ｍで透析することにより、大腸菌の封入体を 作製した。

タンパク質抽出物をこの段階で変性電気泳動により分析し、融合タンパク質に関 する量の関数として選択した。融合タンパク質が総タンパク賓の２０％を越える 場合には付加的な精製と実施せず、そうでない場合にはＳＰ　丁ＫＥＲｅｔ　ａ ｔ（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　９１．　ｐ　２１４−２３６ ．　１９８３＞に従って融合タンパク質を電気泳動、次いで電気溶離により精製 した。

モノクローナル１木ｆｆｌ 上記段階に従って得られた融合タンパク質をマウスに注特に、１５日間隔で５回 皮下注射（１００μｇ／注射液）し、その後、５回目の皮下注射後に、ＴＳＨ受 容体の配列■のフラグメント１９〜２４３に対応し、β−ガラクトシダーゼと融 合して電気泳動及び電気溶離により精製した組換タンパク質を腹膜内及び静脈内 注射した。

こうして免疫したマウスのＩｔ！！！［胞を３日後にミエローマ細胞と融合させ 、アザセリン及びヒボキサンチンを含有する培地中で選択したハイブリドーマを 形成した。

培養培地中でこれらのハイブリドーマにより産生される抗体を試験し、所望の特 異性に対応する２種のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を選択した。

−これらの抗体はＥＬＩＳＡ型の試験（抗原とプラスチッりに固定し、培養上清 と反応させ、その後、Ａ、　ｇ−Ａ　ｂ複合体をペルオキシダーゼに結合したマ ウスの抗Ｉｇ抗体により検出する）においてマウスを免疫するために使用した抗 原、即ちヒトユビキチンに融合した上記フラグメント１９〜２４３により構成さ れる組換タンパク質により構成される抗原と反応し、非組換β−ガラクトシダー ゼとは反応しない。

−これらの抗体は患者のヒト甲状腺生検の免疫細胞化学標識試験で反応する。

ネフーグメント１９〜２４３　ユビ　ンヒトユビキチンと融合したＴＳＨ受容体 の配列■のフラグメント１９〜２４３を含む組換タンパク質を発現させ、大腸菌 の封入体を上記記載に従って作製した。

可溶化後、総タンパク質に対して約３０％の組換タンパク質を含むこれらの封入 体を、フラグメント１９〜２４３とβ−ガラクトシダーゼとの融合により得られ る組換タンパク質について記載したと同一の手順に従ってマウスに注射した。

免疫したマウスの肺細胞及びミエローマ細胞から同様にハイブリドーマを作製し 、産生されたモノクローナル抗体を選択した。４種のモノクローナル抗体を選択 した。

−これらの抗体はＥＬＩＳＡ試験において、マウスを免疫するために使用した抗 原及びフラグメント１９〜２４３／β−ガラクトシダーゼに対応する融合タンパ ク質と特異的に反応し、非組換ユビキチンとは反応しない。

−これらの抗体は同様に、免疫細胞化学的標識試験でヒト甲状腺の生検と反応す る。

上記６種の特異的モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを制限希釈によ りクローニングし、慣用技術に従ってマウスで腹水を生成し、その後、Ｍａｂを プロティンＡ−セファロース上で精製した。この抗体はＴＳＨ受容体のＮ末端部 分に特異的である。

＊フラグメント６０４〜７６４　−ガラクトシダーゼアミノ酸６０４〜７６４に 含まれるフラグメントは主に受容体の細胞内領域に対応する。

β−ガラクトシダーゼと融合したこのフラグメントに対応する組換タンパク質を 、総タンパク質に対して約５０％の割合で大腸菌封入体として作製した。

可溶化後、封入体をマウスに注射した（１００μｇ／注射液を１５日間隔で５回 皮下注射し、その後、５日後に静脈内及び腹膜的注射した）。

ハイブリドーマの作製後、１０種のモノクローナル抗体を上記技術（免疫抗原及 び６０４〜７６４　、／ユビキチン融合タンパク質によるＥＬＩＳＡ試験、免疫 細胞化学的試験）に従って選択した。

これらのモノクローナル抗体のうち３種は患者の甲状腺生検の免疫細胞化学的試 験で強い応答を与えた（細胞中の特定領域及び抗体濃度が非常に低く、特に１μ ｇ　／　ｍ　１未満の特定細胞型の強い応答）。

これらの３種の高感度のＭａｂは、非常に少量の受容体を検出するので、甲状腺 のレベルで正常状態を腫瘍状態から区別するために特に有用である。

上記Ｍ　ａ　ｂを使用してＴＳＨ受容体を甲状ａｍ胞の細胞外膜の下側部に位！ 付けた。

これらの３種のＭａｂは、それ自体ＴＳＨ受容体のｃＤＮＡにより修飾されたバ キュロウィルスにより形質転換された昆虫細胞中に存在するＴＳＨ受容体をイム ノプロットにより検出することが可能であった。

にｂ　； ０．７２ 一一晴←↑−ルｔン　（μＮ） シュビｌユ ｉ刀 本発明は、ＴＳ）ｌのヒト受容体分コードする核酸、又←受容体の構造特性及び ／又は機能特性及び／又は抗原特性を有するこの核酸の変異体もしくは一部に係 る。本発明は更に、受容体に対する抗体にも係る。本発明は更に、所定の甲状腺 疾患の誇断手段にも係る。

国際調査報告 ｂ−１ｌｓ−＾−ｋｍ−ＩｏρＣＴ／ＦＲ９１１０００２５に＠９ｎｗｍｎｈ嘩 Ａｅｅｋｃ＋ｂｓ＊Ｎｅ、ＰＣＴ／ＦＲ９１１０○０２５国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列ＩＩ又は配列ＩＩに対する抗体により認識されることが可能な この配列の一部に合致するタンパク質を特異的に認識する能力を有することを特 徴とするポリクローナル又はモノクローナル抗体。
2. ２．ＴＳＨ受容体の配列ＩＩの特徴を有しており且つフラグメント１９〜２４３ 、２４６〜５２６又は６０４〜７６９に対応するアミノ酸鎖の１種を特異的に認 識するか又は、これらの鎖の一部もしくはこれらの鎖を含むポリペプチドを認識 することを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ３．例えば抗毒素を形成するように化学的に修飾されていることを特徴とする請 求項１又は２に記載の抗体。
4. ４．例えばバセドウ病もしくはアシモト病のような自己免疫疾患の診断もしくは 治療用、又はアミノ酸配列ＩＩの全部もしくは一部を含むタンパク質の精製用と しての、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
5. ５．下記アミノ酸配列ＩＩ、又は場合によりＩＩ中の対応配列を修飾したこの配 列の一部であって、こうして形成されるタンパク質がＴＳＨのヒト受容体の構造 特性及び／又は機能特性及び／又は抗原特性を有するかもしくはこれらの特性を 併有するために十分な部分に合致することを特徴とするタンパク質。 【配列があります】 【配列があります】
6. ６．フラグメント１．９〜２４３、２４６〜５２６又は６０４〜７６４に対応す る配列ＩＩのアミノ酸鎖の１種であることを特徴とする請求項５に記載のポリペ プチド。
7. ７．下記ヌクレオチド配列Ｉに合致することを特徴とする核酸、 【配列があります】 【配列があります】 又は該核酸の変異体もしくは該核酸のフラグメントであって、ＴＳＨのヒト受容 体の構造特性及び／又は機能特性及び／又は抗原特性を有するかもしくはこれら の特性を併有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする変異体もしくは フラグメント。
8. ８．シグナルペプチドをコードする配列を欠失していることを特徴とする請求項 ７に記載の核酸。
9. ９．１位〜３９４位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、３９５位〜 ６６０位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、６６１位〜７４３位の アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、１９位〜２４３位のアミノ酸配列 をコードするヌクレオチド配列、２４６位〜５２６位のアミノ酸配列をコードす るヌクレオチド配列、６０４位〜７６４位のアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列の１種を含むことを特徴とする請求項７に記載の核酸。
10. １０．アミノ酸配列ＩＩに合致するタンパク質、又は該タンパク質の変異体もし くは一部であって、配列ＩＩの構造特性及び／又は機能特性及び／又は抗原特性 を有するかもしくはそれらの特性を併有する変異体もしくは一部をコードするこ とを特徴とする核酸。
11. １１．ベクター複製に非必須の部位に挿入された請求項７から１０のいずれか一 項に記載の外来核酸を含むことを特徴とし、特に、ブラスミド、ファージ、コス ミド、バクテリオファージ、特にバキュロウイルスのウイルス誘導体であり、ベ クターに含まれる核酸が所定の細胞宿主中でこの核酸の発現を助長及び調節し得 る調節エレメントの制御下におかれることを特徴とする、特に発現及びクローニ ング用の組換ベクター。
12. １２．例えば細菌（特に大腸菌）のような原核細胞系、又は特に酵母、昆虫細胞 （特にショウジョウバエ細胞）もしくは動物細胞（例えば哺乳動物細胞）のよう な真核細胞系中で発現される能力を有することを特徴とする請求項１１に記載の 組換ベクター。
13. １３．ベクターに挿入された外来核酸を発現させることが可能な条件下で請求項 １１又は１２に記載の組換ベクターにより形質転換されていることを特徴とし、 特に細菌（例えば大腸菌）のような原核細胞系、又は特に酵母、昆虫細胞（例え ばショウジョウバエ細胞）もしくは動物細胞（特に哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ 細胞）のような真核細胞系であることを特徴とする細胞宿主。
14. １４．請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸又は核酸フラグメントによ りそれ自体修飾されたバキュロウイルスにより形質転換された昆虫細胞、例えば ショウジョウバエ細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞宿主。
15. １５．特に天然コンホメーションにおけるＴＳＨのヒト受容体又はこのタンパク 質の一部を発現させることが可能であることを特徴とする請求項１３又は１４に 記載の細胞宿主。
16. １６．発現された受容体が、ｉｎ　ｓｉｔｕで天然に行われる翻訳後修飾を場合 により含むことを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の細胞宿 主。
17. １７．請求項１３から１５のいずれか一項に記載の形質転換細胞宿主により発現 されるＴＳＨ受容体又は該受容体のフラグメント。
18. １８．請求項５又は６に記載のタンパク質の製造方法であって、調節エレメント 、特に細胞宿主のポリメラーゼにより認識され且つ請求項７から１０のいずれか 一項に記載の外来核酸を細胞宿主で発現させることが可能なブロモ−ターの制御 下に、該外来核酸を含む組換ベクターでコンピテント細胞宿主を形質転換させる 段階と、該核酸を発現させることが可能な条件下で形質転換細胞宿主を培養し、 場合により、発現されたタンパク質を細胞宿主の膜に向かって輸送する段階とを 含むことを特徴とする方法。
19. １９．ＴＳＨのヒト受容体に対する抗体の存在を生物サンプルでｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ診断するための方法であって、生物学的サンプル、特に血漿を請求項１又は２ に記載のＭａｂにより場合により構成される支持体に予め固定した請求項５又は ６に記載のタンパク質と接触させる段階と、場合により形成されたタンパク質− 抗体複合体を検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
20. ２０．ＴＳＨのヒト受容体に対する抗体の存在を生物サンプルでｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ診断するためのキットであって、請求項１又は２に記載のＭａｂにより場合に より構成される支持体に固定された請求項５又は６に記載のタンパク質又はタン パク質の一部と、タンパク質−抗体複合体の形成の検出手段とを含むことを特徴 とするキット。
21. ２１．請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸又はその相補的配列もしく は対応するＲＮＡとハイブリダイズすることを特徴とする合成又は非合成ヌクレ オチドプローブ。