WO2010113988A1 - 抗ｇｐｃｒ抗体の製造方法および抗ｇｐｃｒ抗体 - Google Patents
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- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
Definitions
- the present invention relates to a method for producing an anti-G protein coupled receptor (G-protein coupled receptor, hereinafter referred to as GPCR) antibody and an anti-GPCR antibody obtained by the method. More specifically, the present invention relates to a method for producing an anti-mammalian GPCR antibody and an anti-mammalian GPCR antibody obtained by the method.
- GPCR G-protein coupled receptor
- GPCR is a drug receptor, and it is known that its information is transmitted into cells by binding of physiologically active substances such as hormones.
- GPCR is one of the signal transduction protein family consisting of several thousand kinds of proteins, and the proteins of this family have a structure that penetrates the cell membrane seven times in common (for example, see Non-Patent Document 1). .
- Many proteins belonging to this family also have orphan receptors whose agonists (ligands) are unknown.
- it has been suggested to have an important function in vivo it has been actively studied as a target molecule for therapeutic antibodies, diagnostic agents and the like in recent years.
- An object of the present invention is to provide a method for producing an anti-mammalian GPCR antibody. Another object is to provide an anti-mammalian GPCR antibody obtained by the method.
- anti-mammalian GPCR antibodies can be produced by immunizing fish with the full length or part of mammalian GPCRs such as humans. It came to complete.
- Escherichia coli that can express the full length or a part of a mammalian GPCR serving as an antigen can be exposed as it is, which is very convenient.
- the present invention relates to the following methods (1) to (12) for producing an anti-mammalian GPCR antibody, anti-mammalian GPCR antibodies produced by the production method, and the like.
- a method for producing an anti-mammalian GPCR antibody comprising a step of immunizing a fish with a full length or a part of a mammalian GPCR.
- the step of immunizing fish includes a step of introducing an expression vector incorporating a gene encoding the full length or part of a mammalian GPCR into E. coli or yeast, and a step of exposing the E. coli or yeast to fish.
- the method for producing an anti-mammalian GPCR antibody according to (1) above.
- GPCR antibody The anti-mammalian GPCR antibody according to (7) or (8) above, wherein the mammalian GPCR is human LGR.
- the anti-human GPCR antibody according to any one of (7) to (10) above, wherein the fish is zebrafish, goldfish, crucian carp or carp. (12) A method for detecting an anti-human GPCR antibody using a fish IgM antibody directly labeled with HRP (Horseradic Peroxidase, hereinafter referred to as HRP).
- HRP Haseradic Peroxidase
- the present invention makes it possible to provide a method for producing an anti-mammalian GPCR antibody and an anti-mammalian GPCR antibody obtained by the method. Since the anti-mammalian GPCR antibody obtained by the present invention specifically binds to a mammalian GPCR such as a human, it may be used as a therapeutic antibody or a diagnostic agent that uses the mammalian GPCR as a target molecule.
- the “method for producing an anti-mammalian GPCR antibody” of the present invention includes any method as long as it can produce an anti-GPCR antibody, including the step of immunizing fish with the full length or a part of the mammalian GPCR.
- the mammal may be any, and examples thereof include humans, mice, rats and the like.
- a step of immunizing a fish with a full length or a part of a mammalian GPCR means injecting a fish with a whole (ie, full length of amino acid sequence) or a part (ie, a polypeptide) of a mammalian GPCR, An expression vector in which a gene encoding a part is incorporated is introduced into Escherichia coli or yeast, and the Escherichia coli or yeast is exposed to fish or immunized.
- the “part” of the mammalian GPCR may be any part of the GPCR as long as the “anti-mammalian GPCR antibody” can be produced, but in particular, a Leucine-rich repeat (hereinafter referred to as LRR) at the N-terminus of the GPCR. It is preferable that it is all or part of the part.
- LRR Leucine-rich repeat
- the LRR part in human LGR which is one of human GPCR is mentioned. More specifically, the LRR portion of human LGR3 (accession no. P16473 (SEQ ID NO: 1), hereinafter referred to as human LGR3 (LRR)), or the LRR portion of human LGR4 (accession no. NM — 018490.2, (sequence listing sequence) No. 2), hereinafter referred to as human LGR4 (LRR)) and the like.
- the “anti-mammalian GPCR antibody” of the present invention includes any antibody as long as it can recognize mammalian GPCR, and may be an antibody that recognizes only a specific part of mammalian GPCR.
- any protein of “GPCR” may be targeted.
- LGR etc. are mentioned, More specifically, LGR3, LGR4 etc. are mentioned.
- the “fish” used in the production of the anti-mammalian GPCR antibody of the present invention may be any fish as long as it is a fish, and examples thereof include zebrafish, goldfish, crucian carp and carp.
- a fish IgM antibody directly labeled with HRP or the like can be used.
- the fluorescent substance may be any conventionally known substance, and examples thereof include 3,3′-Diaminobenzodinine, tetrahydrochloride; DAB, Chemi-Lumi One (nacalai; 07880-70) and the like.
- Preparation of antigen 1) Preparation of GPCR-expressing Escherichia coli Human LGR3 (LRR) or human LGR4 (LRR) was incorporated into an expression vector (pET15b, pET21b or pET22b, all manufactured by Novagen) as a mammalian GPCR, and LGR3 (LRR) Alternatively, pET15b-hLGR3 (LRR), pET22b-hLGR3 (LRR), pET21b-hLGR4 (LRR), and pET22b-hLGR4 (LRR) were prepared as LGR4 (LRR) expression vectors.
- Each of the expression vectors prepared above was introduced into Escherichia coli (BL21) to try to express human LGR3 (LRR) or human LGR4 (LRR).
- the presence or absence of human LGR3 (LRR) or human LGR4 (LRR) was analyzed by Western blotting using an anti-His tag antibody (manufactured by GE Healthcare) from the protein expressed by each E. coli.
- an anti-His tag antibody manufactured by GE Healthcare
- FIG. 1 or 2 it was confirmed that both human LGR3 (LRR) and human LGR4 (LRR) were expressed.
- human LGR3 (LRR) expressed using pET15b-hLGR3 (LRR) as an expression vector is highly expressed in E.
- FIGS. 1 and 2 show the results of SDS-PAGE, and (B) shows the results of Western blotting. From this result, it was confirmed that Escherichia coli introduced with these expression vectors can be used as an antigen.
- zebrafish Preparation of immunized animal (zebrafish) A zebrafish was used that was bred at a water temperature of 27.5 ° C, a light period of 14 hours, and a dark period of 10 hours. One test section was 50 fishes, and a total of 6 test plots and 300 zebrafish were provided. 20 L of environmental water was poured into a water tank having a width of 60 cm, a depth of 30 cm, and a height of 30 cm, and six water tanks were prepared and reared with 50 fish tanks.
- the production method of the present invention has made it possible to produce anti-mammalian GPCR antibodies in mammals such as humans using fish. Since the production method of the present invention is simple, an anti-mammalian GPCR antibody can be produced easily. Further, since the anti-mammalian GPCR antibody obtained by the production method of the present invention specifically binds to a GPCR of a mammal such as a human, it may be used as a therapeutic antibody or a diagnostic agent using the mammalian GPCR as a target molecule. Can be useful for these studies.
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Abstract
抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法の提供および、当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供。 哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に曝露する等の方法によって、免疫を行うことで抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造を行い、この製造方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を提供する。
Description
本発明は、抗Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲとする）抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗ＧＰＣＲ抗体に関する。さらに詳しくは、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体に関する。
ＧＰＣＲは薬物受容体であり、ホルモンなどの生理活性物質が結合することによって、その情報を細胞内に伝達する働きが知られている。ＧＰＣＲは、数千種類のタンパク質からなるシグナル伝達系のタンパク質ファミリーのひとつであり、このファミリーのタンパク質は、細胞膜を７回繰り返して貫通する構造を共通して有する（例えば、非特許文献１参照）。
このファミリーに属するタンパク質には、作用物質（リガンド）が不明なオーファン受容体も多く存在する。しかし、生体内で重要な機能を持つことが示唆されていることから、治療用抗体や診断薬等の標的分子として、近年盛んに研究されている。
このファミリーに属するタンパク質には、作用物質（リガンド）が不明なオーファン受容体も多く存在する。しかし、生体内で重要な機能を持つことが示唆されていることから、治療用抗体や診断薬等の標的分子として、近年盛んに研究されている。
この研究において、様々な抗ＧＰＣＲ抗体の提供が望まれている。しかし、ＧＰＣＲは上記のような複雑な立体構造を有することから、タンパク質の作製が難しく、従来のタンパク質を免疫する方法では、抗ＧＰＣＲ抗体を得ることができなかった。
そこで、Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで標識分子の免疫領域を選択し、このｃＤＮＡをクローニングした発現ベクターを動物へ導入しハイブリドーマ細胞を作製するというＤＮＡ免疫法が開発された（例えば、非特許文献２参照）。この方法により、様々な抗ＧＰＣＲ抗体の製造が可能となり、各メーカーから販売されている。しかし、この抗体の製造方法では、免疫領域の選択やハイブリドーマ細胞の作製といった複数の手順を要し、手間や時間が係るという問題があった。
そこで、Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで標識分子の免疫領域を選択し、このｃＤＮＡをクローニングした発現ベクターを動物へ導入しハイブリドーマ細胞を作製するというＤＮＡ免疫法が開発された（例えば、非特許文献２参照）。この方法により、様々な抗ＧＰＣＲ抗体の製造が可能となり、各メーカーから販売されている。しかし、この抗体の製造方法では、免疫領域の選択やハイブリドーマ細胞の作製といった複数の手順を要し、手間や時間が係るという問題があった。
Ｎａｔｕｒｅ．２００７ Ｏｃｔ ２５；４４９（７１６５）：１００３−７．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｏｃｔ １４
生物工学会誌，８６（８），３８４−３８６（２００８）
本発明は、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法の提供を課題とする。また、当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト等の哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫することで、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体が製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の製造方法における魚類への免疫には、抗原となる哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を発現し得る大腸菌をそのまま曝露することもでき、非常に簡便である。
すなわち、本発明は次の（１）~（１２）の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法、該製造方法によって製造される抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体等に関する。
（１）哺乳類のＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（２）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入する工程、および当該大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程を含む工程である上記（１）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（３）哺乳類がヒトである上記（１）または（２）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（４）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＬＧＲとする）である、上記（１）~（３）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（５）ヒトＬＧＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（４）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（６）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（１）~（５）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（７）哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む製造方法によって得られる、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（８）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程である、上記（７）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（９）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲである上記（７）または（８）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１０）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（９）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１１）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（７）~（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＧＰＣＲ抗体。
（１２）ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下、ＨＲＰとする）で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いる抗ヒトＧＰＣＲ抗体の検出方法。
（１）哺乳類のＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（２）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入する工程、および当該大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程を含む工程である上記（１）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（３）哺乳類がヒトである上記（１）または（２）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（４）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＬＧＲとする）である、上記（１）~（３）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（５）ヒトＬＧＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（４）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（６）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（１）~（５）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（７）哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む製造方法によって得られる、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（８）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程である、上記（７）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（９）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲである上記（７）または（８）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１０）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（９）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１１）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（７）~（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＧＰＣＲ抗体。
（１２）ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下、ＨＲＰとする）で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いる抗ヒトＧＰＣＲ抗体の検出方法。
本発明により、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供が可能となった。本発明で得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体は、ヒト等の哺乳類ＧＰＣＲに特異的に結合することから、哺乳類ＧＰＣＲを標的分子とする治療用抗体や診断薬等に用い得る可能性がある。
本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法」には、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗ＧＰＣＲ抗体が製造できる方法であればいずれの方法も含まれる。ここで哺乳類とは、いずれであってもよいが、例えばヒト、マウス、ラット等が挙げられる。
「哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程」とは、哺乳類ＧＰＣＲタンパク質の全部（すなわちアミノ酸配列の全長）または一部（すなわちポリペプチド）を魚類に注射したり、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入し、この大腸菌や酵母を魚類に曝露したりして免疫することをいう。
哺乳類ＧＰＣＲの「一部」としては、「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体」が製造できる部分であればＧＰＣＲのいずれの部分であってもよいが、特にＧＰＣＲのＮ末端にあるＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（以下、ＬＲＲとする）部分の全部または一部であることが好ましい。
このような部分としては、ヒトＧＰＣＲのひとつであるヒトＬＧＲにおけるＬＲＲ部分が挙げられる。さらに詳しくはヒトＬＧＲ３のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｐ１６４７３（配列表配列番号１）、以下、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）と示す）、またはヒトＬＧＲ４のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０１８４９０．２、（配列表配列番号２）、以下、ヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）と示す）等が挙げられる。
「哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程」とは、哺乳類ＧＰＣＲタンパク質の全部（すなわちアミノ酸配列の全長）または一部（すなわちポリペプチド）を魚類に注射したり、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入し、この大腸菌や酵母を魚類に曝露したりして免疫することをいう。
哺乳類ＧＰＣＲの「一部」としては、「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体」が製造できる部分であればＧＰＣＲのいずれの部分であってもよいが、特にＧＰＣＲのＮ末端にあるＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（以下、ＬＲＲとする）部分の全部または一部であることが好ましい。
このような部分としては、ヒトＧＰＣＲのひとつであるヒトＬＧＲにおけるＬＲＲ部分が挙げられる。さらに詳しくはヒトＬＧＲ３のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｐ１６４７３（配列表配列番号１）、以下、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）と示す）、またはヒトＬＧＲ４のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０１８４９０．２、（配列表配列番号２）、以下、ヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）と示す）等が挙げられる。
本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体」は、哺乳類ＧＰＣＲを認識できる抗体であればいずれの抗体も含まれ、哺乳類ＧＰＣＲの特定の部分のみを認識する抗体であってもよい。また、「ＧＰＣＲ」のうち、いずれのタンパク質を対象としてもよい。例えば、ＬＧＲ等が挙げられ、さらに詳しくはＬＧＲ３、ＬＧＲ４等が挙げられる。
本発明の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造に用いる「魚類」は、魚類であればいずれの魚であってもよいが、例えば、ゼブラフィッシュ、金魚、フナ、コイ等が挙げられる。
本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の検出方法」には、ＨＲＰ等で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いることができる。蛍光物質は従来知られているいずれの物質でもよいが、例えば３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＤＡＢ、Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ；０７８８０−７０）等が挙げられる。蛍光物質を直接標識した抗体を用いることにより、高い検出感度で抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を検出することができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．抗原の調製
１）ＧＰＣＲ発現大腸菌の作製
哺乳類のＧＰＣＲとしてヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）をそれぞれ発現用ベクター（ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ２１ｂまたはｐＥＴ２２ｂ、いずれもＮｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、ＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＥＴ２１ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
上記で作製した発現ベクターを大腸菌（ＢＬ２１）にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を試みた。それぞれの大腸菌が発現するタンパク質から、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の有無を、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図１または２に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）がいずれも発現したことが確認された。また、ｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）を発現ベクターとして用いて発現させたヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）は、大腸菌においてＩＰＴＧ添加の有無にかかわらず、高発現することが確認された。なお、図１および２の（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。
この結果より、これらの発現ベクターを導入した大腸菌が抗原として用い得ることが確認された。
１）ＧＰＣＲ発現大腸菌の作製
哺乳類のＧＰＣＲとしてヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）をそれぞれ発現用ベクター（ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ２１ｂまたはｐＥＴ２２ｂ、いずれもＮｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、ＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＥＴ２１ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
上記で作製した発現ベクターを大腸菌（ＢＬ２１）にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を試みた。それぞれの大腸菌が発現するタンパク質から、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の有無を、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図１または２に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）がいずれも発現したことが確認された。また、ｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）を発現ベクターとして用いて発現させたヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）は、大腸菌においてＩＰＴＧ添加の有無にかかわらず、高発現することが確認された。なお、図１および２の（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。
この結果より、これらの発現ベクターを導入した大腸菌が抗原として用い得ることが確認された。
２）免疫用飼料の作製
上記１）で作製した抗原タンパク質を発現する大腸菌をＯ．Ｄ．０．５付近まで培養し、発現誘導を行った後（誘導条件：ｐＥＴ：１ｍＭ ＩＰＴＧ，２５℃，４時間；ｐＣｏｌｄＴＦ：０．１ｍＭ ＩＰＴＧ，１５℃，２４時間）、２５００ｇ、１０分間遠心分離して集菌した。
湿重量で１ｇの大腸菌に対して２ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムと４ｇのテトラミン粉末の割合となるよう混合し、ペースト状にして、エサ作製用テルモシリンジ（先をガスバーナーで熱し穴をふさいだ後，針（Ｇ２１）で穴をあけたもの）で糸状の大腸菌入り餌とした。これを約２ｍｍの粒状に刻み、免疫用飼料として用いた。
上記１）で作製した抗原タンパク質を発現する大腸菌をＯ．Ｄ．０．５付近まで培養し、発現誘導を行った後（誘導条件：ｐＥＴ：１ｍＭ ＩＰＴＧ，２５℃，４時間；ｐＣｏｌｄＴＦ：０．１ｍＭ ＩＰＴＧ，１５℃，２４時間）、２５００ｇ、１０分間遠心分離して集菌した。
湿重量で１ｇの大腸菌に対して２ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムと４ｇのテトラミン粉末の割合となるよう混合し、ペースト状にして、エサ作製用テルモシリンジ（先をガスバーナーで熱し穴をふさいだ後，針（Ｇ２１）で穴をあけたもの）で糸状の大腸菌入り餌とした。これを約２ｍｍの粒状に刻み、免疫用飼料として用いた。
２．免疫動物（ゼブラフィッシュ）の調製
ゼブラフィッシュは水温２７．５℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育したものを使用した。１試験区を５０尾とし、合計６試験区、３００尾のゼブラフィッシュを供した。幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、その水槽を６個作成し、１水槽５０尾で飼育した。
ゼブラフィッシュは水温２７．５℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育したものを使用した。１試験区を５０尾とし、合計６試験区、３００尾のゼブラフィッシュを供した。幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、その水槽を６個作成し、１水槽５０尾で飼育した。
３．免疫
上記１．で調製した免疫用飼料をゼブラフィッシュに給餌することで、ヒトｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）をそれぞれゼブラフィッシュに曝露した。
第１回目に曝露（これを０日目とする）してから１０日目に第２回目の曝露を行い、１６日目に血液を採取した。
曝露によってヒトＬＧＲ３に対する抗体またはヒトＬＧＲ４に対する抗体が得られたか否かはドットブロット法を用いて確認した。
上記１．で調製した免疫用飼料をゼブラフィッシュに給餌することで、ヒトｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）をそれぞれゼブラフィッシュに曝露した。
第１回目に曝露（これを０日目とする）してから１０日目に第２回目の曝露を行い、１６日目に血液を採取した。
曝露によってヒトＬＧＲ３に対する抗体またはヒトＬＧＲ４に対する抗体が得られたか否かはドットブロット法を用いて確認した。
４．確認
１）抗体力価検出用タンパク質の作製
ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現用ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ、ＴａＫａＲａ社製）に組み込み、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
これらを大腸菌にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現させた。得られたタンパク質を精製し、市販抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図３に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）は、いずれも可溶性画分に高発現していることが確認された。なお、図３（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図３（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。このうち精製ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）を濃度既知のタンパク質標品として抗体の発現確認に用いた。
１）抗体力価検出用タンパク質の作製
ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現用ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ、ＴａＫａＲａ社製）に組み込み、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
これらを大腸菌にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現させた。得られたタンパク質を精製し、市販抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図３に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）は、いずれも可溶性画分に高発現していることが確認された。なお、図３（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図３（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。このうち精製ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）を濃度既知のタンパク質標品として抗体の発現確認に用いた。
２）抗体の発現確認
上記３．の抗原曝露後のゼブラフィッシュより採取した血清について、ＨＲＰで直接標識（ＧＥヘルスケア社製）した抗ゼブラフィッシュＩｇＭ抗体（本発明者研究室所有）を用いてドットブロット解析を行った。なお、比較として免疫をしていないマウス血清およびゼブラフィッシュ血清を用いた。
その結果、図４（Ａ）に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）（１００ｎｇ）におけるドットブロットにおいて、優位にスポットが検出された。また蛍光強度を数値化した結果、図４（Ｂ）に示したように、抗原タンパク質であるヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）が２５０ｎｇ以上では飽和しており、１００ｎｇ以下の濃度で直線的な相関を示すことが確認された。
以上の結果より、ヒトＬＧＲ３発現大腸菌を曝露したゼブラフィッシュ血清は抗ヒトＬＧＲ３抗体を生産していることが確認された。
上記３．の抗原曝露後のゼブラフィッシュより採取した血清について、ＨＲＰで直接標識（ＧＥヘルスケア社製）した抗ゼブラフィッシュＩｇＭ抗体（本発明者研究室所有）を用いてドットブロット解析を行った。なお、比較として免疫をしていないマウス血清およびゼブラフィッシュ血清を用いた。
その結果、図４（Ａ）に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）（１００ｎｇ）におけるドットブロットにおいて、優位にスポットが検出された。また蛍光強度を数値化した結果、図４（Ｂ）に示したように、抗原タンパク質であるヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）が２５０ｎｇ以上では飽和しており、１００ｎｇ以下の濃度で直線的な相関を示すことが確認された。
以上の結果より、ヒトＬＧＲ３発現大腸菌を曝露したゼブラフィッシュ血清は抗ヒトＬＧＲ３抗体を生産していることが確認された。
本発明の製造方法により、魚類を用いたヒト等の哺乳類における抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造が可能となった。本発明の製造方法は簡便であるため、容易に抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を製造することができる。また、本発明の製造方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体は、ヒト等の哺乳類のＧＰＣＲに特異的に結合することから、哺乳類ＧＰＣＲを標的分子とする治療用抗体や診断薬等として用い得る可能性があり、これらの研究に役立てることもできる。
Claims (12)
- 哺乳類のＧ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）の全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- 魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入する工程、および当該大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程を含む工程である請求項１に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- 哺乳類がヒトである請求項１または２に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- 哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である請求項１~３のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- ヒトＬＧＲが、ヒトＬＧＲ３（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）またはヒトＬＧＲ４（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４）である請求項４に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- 魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである、請求項１~５のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
- 哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む製造方法によって得られる、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
- 魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程である請求項７に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
- 哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲである請求項７または８に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
- 哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である請求項９に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
- 魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである、請求項７~１０のいずれかに記載の抗ヒトＧＰＣＲ抗体。
- ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いる抗ヒトＧＰＣＲ抗体の検出方法。
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| ES2332025T3 (es) * | 1998-03-26 | 2010-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Nuevos receptores de mamiferos acoplados a la proteina g que tienen regiones extracelulares de repeticion ricas en leucina. |
| RU2010111725A (ru) * | 2007-08-28 | 2011-10-10 | Юниверсите Де Льеж (Be) | Рекомбинантный герпесвирус кои (khv) или герпесвирус 3 семейства карповых (cyhv-3) и вакцина для профилактики заболевания, вызванного khv/cyhv-3 у cyprinus carpio или cyprinus carpio koi |
-
2010
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| NATURE., vol. 449, no. 7165, 14 October 2007 (2007-10-14), pages 1003 - 7 |
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| SEIBUTSU-KOGAKU KAISHI, vol. 86, no. 8, 2008, pages 384 - 386 |
| SHIN'ICHI AKIYAMA ET AL.: "Development of antibody-producing system in fish for the recombinant products expressed by E. coli", ABSTRACTS OF THE 59TH ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY, 2008, pages 148, XP009161924 * |
| TAKESHI KOBAYASHI: "DNA Men'ekiho ni yoru Kotai no Sakusei", JOURNAL OF THE SOCIETY FOR BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, JAPAN, vol. 86, 2008, pages 384 - 386 * |
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| US9359627B2 (en) | 2011-03-17 | 2016-06-07 | National University Corporation Mie University | Antibody production method |
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| EP2426147A1 (en) | 2012-03-07 |
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