JPWO2010113988A1

JPWO2010113988A1 - 抗ｇｐｃｒ抗体の製造方法および抗ｇｐｃｒ抗体

Info

Publication number: JPWO2010113988A1
Application number: JP2011507242A
Authority: JP
Inventors: 浩田丸
Original assignee: Mie University NUC
Current assignee: Mie University NUC
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2012-10-11
Also published as: US20120135422A1; EP2426147A4; EP2426147A1; WO2010113988A1

Abstract

抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法の提供および、当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供。哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に曝露する等の方法によって、免疫を行うことで抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造を行い、この製造方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を提供する。

Description

本発明は、抗Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲとする）抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗ＧＰＣＲ抗体に関する。さらに詳しくは、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体に関する。

ＧＰＣＲは薬物受容体であり、ホルモンなどの生理活性物質が結合することによって、その情報を細胞内に伝達する働きが知られている。ＧＰＣＲは、数千種類のタンパク質からなるシグナル伝達系のタンパク質ファミリーのひとつであり、このファミリーのタンパク質は、細胞膜を７回繰り返して貫通する構造を共通して有する（例えば、非特許文献１参照）。
このファミリーに属するタンパク質には、作用物質（リガンド）が不明なオーファン受容体も多く存在する。しかし、生体内で重要な機能を持つことが示唆されていることから、治療用抗体や診断薬等の標的分子として、近年盛んに研究されている。

この研究において、様々な抗ＧＰＣＲ抗体の提供が望まれている。しかし、ＧＰＣＲは上記のような複雑な立体構造を有することから、タンパク質の作製が難しく、従来のタンパク質を免疫する方法では、抗ＧＰＣＲ抗体を得ることができなかった。
そこで、Ｉｎｓｉｌｉｃｏで標識分子の免疫領域を選択し、このｃＤＮＡをクローニングした発現ベクターを動物へ導入しハイブリドーマ細胞を作製するというＤＮＡ免疫法が開発された（例えば、非特許文献２参照）。この方法により、様々な抗ＧＰＣＲ抗体の製造が可能となり、各メーカーから販売されている。しかし、この抗体の製造方法では、免疫領域の選択やハイブリドーマ細胞の作製といった複数の手順を要し、手間や時間が係るという問題があった。

Ｎａｔｕｒｅ．２００７Ｏｃｔ２５；４４９（７１６５）：１００３−７．Ｅｐｕｂ２００７Ｏｃｔ１４生物工学会誌，８６（８），３８４−３８６（２００８）

本発明は、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法の提供を課題とする。また、当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト等の哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫することで、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体が製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の製造方法における魚類への免疫には、抗原となる哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を発現し得る大腸菌をそのまま曝露することもでき、非常に簡便である。

すなわち、本発明は次の（１）〜（１２）の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法、該製造方法によって製造される抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体等に関する。
（１）哺乳類のＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（２）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入する工程、および当該大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程を含む工程である上記（１）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（３）哺乳類がヒトである上記（１）または（２）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（４）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＬＧＲとする）である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（５）ヒトＬＧＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（４）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（６）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
（７）哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む製造方法によって得られる、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（８）魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程である、上記（７）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（９）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲである上記（７）または（８）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１０）哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である上記（９）に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
（１１）魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＧＰＣＲ抗体。
（１２）ＨＲＰ（ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下、ＨＲＰとする）で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いる抗ヒトＧＰＣＲ抗体の検出方法。

本発明により、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法および当該方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の提供が可能となった。本発明で得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体は、ヒト等の哺乳類ＧＰＣＲに特異的に結合することから、哺乳類ＧＰＣＲを標的分子とする治療用抗体や診断薬等に用い得る可能性がある。

ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を確認した図である（実施例）。ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を確認した図である（実施例）。ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を確認した図である（実施例）。（Ａ）抗ヒトＬＧＲ３抗体の発現の有無を確認した図である（実施例）。（Ｂ）抗ヒトＬＧＲ３抗体の蛍光検出の結果を示した図である（実施例）。

本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法」には、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗ＧＰＣＲ抗体が製造できる方法であればいずれの方法も含まれる。ここで哺乳類とは、いずれであってもよいが、例えばヒト、マウス、ラット等が挙げられる。
「哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程」とは、哺乳類ＧＰＣＲタンパク質の全部（すなわちアミノ酸配列の全長）または一部（すなわちポリペプチド）を魚類に注射したり、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入し、この大腸菌や酵母を魚類に曝露したりして免疫することをいう。
哺乳類ＧＰＣＲの「一部」としては、「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体」が製造できる部分であればＧＰＣＲのいずれの部分であってもよいが、特にＧＰＣＲのＮ末端にあるＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔ（以下、ＬＲＲとする）部分の全部または一部であることが好ましい。
このような部分としては、ヒトＧＰＣＲのひとつであるヒトＬＧＲにおけるＬＲＲ部分が挙げられる。さらに詳しくはヒトＬＧＲ３のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｐ１６４７３（配列表配列番号１）、以下、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）と示す）、またはヒトＬＧＲ４のＬＲＲ部分（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＭ＿０１８４９０．２、（配列表配列番号２）、以下、ヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）と示す）等が挙げられる。

本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体」は、哺乳類ＧＰＣＲを認識できる抗体であればいずれの抗体も含まれ、哺乳類ＧＰＣＲの特定の部分のみを認識する抗体であってもよい。また、「ＧＰＣＲ」のうち、いずれのタンパク質を対象としてもよい。例えば、ＬＧＲ等が挙げられ、さらに詳しくはＬＧＲ３、ＬＧＲ４等が挙げられる。

本発明の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造に用いる「魚類」は、魚類であればいずれの魚であってもよいが、例えば、ゼブラフィッシュ、金魚、フナ、コイ等が挙げられる。

本発明の「抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の検出方法」には、ＨＲＰ等で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いることができる。蛍光物質は従来知られているいずれの物質でもよいが、例えば３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＤＡＢ、Ｃｈｅｍｉ−ＬｕｍｉＯｎｅ（ｎａｃａｌａｉ；０７８８０−７０）等が挙げられる。蛍光物質を直接標識した抗体を用いることにより、高い検出感度で抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を検出することができる。

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．抗原の調製
１）ＧＰＣＲ発現大腸菌の作製
哺乳類のＧＰＣＲとしてヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）をそれぞれ発現用ベクター（ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ２１ｂまたはｐＥＴ２２ｂ、いずれもＮｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、ＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＥＴ２１ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）、ｐＥＴ２２ｂ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
上記で作製した発現ベクターを大腸菌（ＢＬ２１）にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の発現を試みた。それぞれの大腸菌が発現するタンパク質から、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）の有無を、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図１または２に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）がいずれも発現したことが確認された。また、ｐＥＴ１５ｂ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）を発現ベクターとして用いて発現させたヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）は、大腸菌においてＩＰＴＧ添加の有無にかかわらず、高発現することが確認された。なお、図１および２の（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。
この結果より、これらの発現ベクターを導入した大腸菌が抗原として用い得ることが確認された。

２）免疫用飼料の作製
上記１）で作製した抗原タンパク質を発現する大腸菌をＯ．Ｄ．０．５付近まで培養し、発現誘導を行った後（誘導条件：ｐＥＴ：１ｍＭＩＰＴＧ，２５℃，４時間；ｐＣｏｌｄＴＦ：０．１ｍＭＩＰＴＧ，１５℃，２４時間）、２５００ｇ、１０分間遠心分離して集菌した。
湿重量で１ｇの大腸菌に対して２ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムと４ｇのテトラミン粉末の割合となるよう混合し、ペースト状にして、エサ作製用テルモシリンジ（先をガスバーナーで熱し穴をふさいだ後，針（Ｇ２１）で穴をあけたもの）で糸状の大腸菌入り餌とした。これを約２ｍｍの粒状に刻み、免疫用飼料として用いた。

２．免疫動物（ゼブラフィッシュ）の調製
ゼブラフィッシュは水温２７．５℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育したものを使用した。１試験区を５０尾とし、合計６試験区、３００尾のゼブラフィッシュを供した。幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、その水槽を６個作成し、１水槽５０尾で飼育した。

３．免疫
上記１．で調製した免疫用飼料をゼブラフィッシュに給餌することで、ヒトｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）をそれぞれゼブラフィッシュに曝露した。
第１回目に曝露（これを０日目とする）してから１０日目に第２回目の曝露を行い、１６日目に血液を採取した。
曝露によってヒトＬＧＲ３に対する抗体またはヒトＬＧＲ４に対する抗体が得られたか否かはドットブロット法を用いて確認した。

４．確認
１）抗体力価検出用タンパク質の作製
ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現用ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ、ＴａＫａＲａ社製）に組み込み、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）発現ベクターとしてｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはｐＣｏｌｄＴＦ−ｈＬＧＲ４（ＬＲＲ）を作製した。
これらを大腸菌にそれぞれ導入し、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）またはヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）を発現させた。得られたタンパク質を精製し、市販抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いてウェスタンブロット法により解析した。
その結果、図３に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）およびヒトＬＧＲ４（ＬＲＲ）は、いずれも可溶性画分に高発現していることが確認された。なお、図３（Ａ）にはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図３（Ｂ）にはウェスタンブロットの結果を示した。このうち精製ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）を濃度既知のタンパク質標品として抗体の発現確認に用いた。

２）抗体の発現確認
上記３．の抗原曝露後のゼブラフィッシュより採取した血清について、ＨＲＰで直接標識（ＧＥヘルスケア社製）した抗ゼブラフィッシュＩｇＭ抗体（本発明者研究室所有）を用いてドットブロット解析を行った。なお、比較として免疫をしていないマウス血清およびゼブラフィッシュ血清を用いた。
その結果、図４（Ａ）に示したように、ヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）（１００ｎｇ）におけるドットブロットにおいて、優位にスポットが検出された。また蛍光強度を数値化した結果、図４（Ｂ）に示したように、抗原タンパク質であるヒトＬＧＲ３（ＬＲＲ）が２５０ｎｇ以上では飽和しており、１００ｎｇ以下の濃度で直線的な相関を示すことが確認された。
以上の結果より、ヒトＬＧＲ３発現大腸菌を曝露したゼブラフィッシュ血清は抗ヒトＬＧＲ３抗体を生産していることが確認された。

本発明の製造方法により、魚類を用いたヒト等の哺乳類における抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造が可能となった。本発明の製造方法は簡便であるため、容易に抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体を製造することができる。また、本発明の製造方法によって得られる抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体は、ヒト等の哺乳類のＧＰＣＲに特異的に結合することから、哺乳類ＧＰＣＲを標的分子とする治療用抗体や診断薬等として用い得る可能性があり、これらの研究に役立てることもできる。
［配列表］

Claims

哺乳類のＧ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）の全長または一部を魚類に免疫する工程を含む、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターを大腸菌または酵母に導入する工程、および当該大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程を含む工程である請求項１に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
哺乳類がヒトである請求項１または２に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ）である請求項１〜３のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
ヒトＬＧＲが、ヒトＬＧＲ３（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ３）またはヒトＬＧＲ４（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ４）である請求項４に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体の製造方法。
哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部を魚類に免疫する工程を含む製造方法によって得られる、抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
魚類に免疫する工程が、哺乳類ＧＰＣＲの全長または一部をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された大腸菌または酵母を魚類に曝露する工程である請求項７に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲである請求項７または８に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
哺乳類ＧＰＣＲが、ヒトＬＧＲ３またはヒトＬＧＲ４である請求項９に記載の抗哺乳類ＧＰＣＲ抗体。
魚類がゼブラフィッシュ、金魚、フナまたはコイである、請求項７〜１０のいずれかに記載の抗ヒトＧＰＣＲ抗体。
ＨＲＰ（ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で直接標識した魚類ＩｇＭ抗体を用いる抗ヒトＧＰＣＲ抗体の検出方法。