CN113004402A - 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白 - Google Patents

一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN113004402A
CN113004402A CN201911310313.6A CN201911310313A CN113004402A CN 113004402 A CN113004402 A CN 113004402A CN 201911310313 A CN201911310313 A CN 201911310313A CN 113004402 A CN113004402 A CN 113004402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
complementarity determining
determining region
region cdr
cdr
binding protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911310313.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113004402B (zh
Inventor
崔鹏
何志强
孟媛
钟冬梅
姜瑢瑢
覃婷
游辉
王晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd filed Critical Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911310313.6A priority Critical patent/CN113004402B/zh
Publication of CN113004402A publication Critical patent/CN113004402A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113004402B publication Critical patent/CN113004402B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种包含血红蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述的结合蛋白活性强，与粪便中血红蛋白具有很高的亲和力，可有效应用于粪便潜血的检测。

Description

一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白
技术领域
本发明涉及生物技术和医学技术领域，具体而言，涉及一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白。
背景技术
近几年，消化道疾病类型趋于多样性，肠道肿瘤的发生率和死亡率也呈逐年上升趋势。粪便潜血试验是临床中较为常见的检测技术，对消化道出血诊断有重要价值。消化道肿瘤早期患者很大几率会出现潜血试验阳性,晚期病人的潜血阳性率更高并且呈持续性阳性,因此粪便潜血检查可作为消化道肿瘤筛选的首选指标。
粪便潜血(FecalOccultBlood，FOB)是指消化道出血量在5ml/d以下，肉眼不见血色，显微镜下不见红细胞被破坏的出血。通过检测粪便潜血中血红蛋白，诊断消化道出血。因此，粪便中的血红蛋白(Hb，Hemoglobin)在临床被看作是直肠癌、结肠癌的肿瘤重要标志物之一。
化学法来检测粪便潜血是利用血红蛋白(Hb)中含有亚铁血红素具有类似过氧化物酶作用而设计。这类方法的氧化显色剂较多，如联苯胺、邻-甲苯胺、邻联甲苯胺、愈创木、还原酚酞、氨基吡啉、无色孔雀绿、四甲基联苯胺、二苯胺、二甲基联苯胺等。化学法虽简便易行，使用广泛，但特异性较低、干扰因素较多。动物血、肉、肝脏及富含叶绿素食物、铁剂、维生素C、中药等均可引起假阳性。
近年研发出胶体金免疫层析法。利用血液中血红蛋白(Hb)的亚铁血红素特异性结合人Hb抗原，检测抗人血红蛋白抗体。血红蛋白单克隆抗体检测的免疫法与传统的化学法相比，灵敏度、特异性都有了很大的提高，且不受饮食或相关药物的影响，对早期肿瘤的诊断和治疗发挥了重要的作用。
为便于精确检测潜血，避免假阳性、特异性差的特点，生产高活性和亲和力的抗人血红蛋白单克隆抗体具有很强的实用价值。目前使用杂交瘤技术生产的鼠单克隆抗体已被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗。但由于杂交瘤方式生产采用小鼠腹腔诱生，受小鼠个体影响特较大，存在生产不稳定、批间差异大、小鼠自身抗体纯化难度大等问题。同时本领域常用的血红蛋白结合蛋白存在活性差、亲和力低等问题，无法较好的应用于血红蛋白的检测。因此，本领域对于利用重组技术生产高活性高亲和力有效稳定且特异性结合血红蛋白并对其进行检测的抗体有强烈的需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明涉及一种与血红蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。
所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与血红蛋白具KD≤9.52×10-8mol/L的亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-Y-X1-F-X2-S-Y-X3-M-H，其中：
X1是T或S，X2是T或S，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH2为Y-I-X1-P-Y-X2-D-G-T-X3-Y-N-E-K-X4-K-G，其中：
X1是Q、H或N，X2是Q或N，X3是D或E，X4是F或A；
互补决定区CDR-VH3为A-X1-X2-Y-L-Y-X2-M-D，其中：
X1是K或R，X2是GG或N，X3是I、L或V；
互补决定区CDR-VL1为R-A-S-X1-N-I-X2-S-X3-L-A，其中：
X1是D或E，X2是Y或W，X3是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL2为T-A-X1-X2-L-A-D，其中：
X1是S或T，X2是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-F-W-G-X2-P-X3-T，其中：
X1是N、Q或H，X2是L或I，X3是L或I；
本发明所提供的结合蛋白与目前常用的血红蛋白的结合蛋白相比，活性强，与血红蛋白具有很高的亲和力，能够有效用于粪便潜血的临床检测，特别是作为消化道肿瘤筛选的指标。同时本发明通过重组方式得到的结合蛋白个体差异小、批间差异小、质量稳定。更利于其质量控制和检测稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中抗血红蛋白的重组抗体电泳图。
具体实施方式
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的梭基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：A1a，单字母密码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，c)，谷氨酰胺(G1n，Q)，谷氨酸(G1u，E)，甘氨酸(G1y，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(I1e，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Va1，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。
术语“包括抗原结合结构域的分离的结合蛋白”、“分离的结合蛋白”、“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、抗体最小识别单位和抗体，以及这些抗体和片段的单链衍生物。
“抗体”此用语包括多克隆抗体、单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
“抗体片段”(“antibody fragment”或“antibody fragments”)仅是抗体的一部分，其中该部分保持至少一种、优选地许多或所有的与存在于完整抗体中时该部分通常相关的功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)抗体分子；由具有相同特异性的多拷贝的相同抗体片段形成的多价抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差别在于，在重链CH1结构域的羧基端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中表示这样的Fab’：其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。F(ab’)2抗体片段最初被生产为Fab’片段对，它们具有在它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“Fv”表示含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。该区域由紧密地非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成(本领域已经描述了二硫键连接的Fv，Reiter等人(1996))。在该构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。来自每个VH和VL链的一个或多个CDR的组合一起赋予抗体抗原结合特异性。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
术语“载体”指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。
术语“骨架”、“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语“亲和力”表示两种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为KD。结合蛋白对配体的亲和力(诸如抗体对表位的亲和力)可以是，例如，约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)。本文使用的术语“亲合力”表示，2种或更多种试剂的复合物在稀释以后对解离的抵抗力。通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定表观亲和力。
本发明还提供了含有前述重组载体的重组宿主细胞。基于高水平的表达、目标蛋白的组成型表达和来自宿主蛋白的最小污染来选择特别优选的细胞系。可用作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括许多永生化细胞系，诸如但不限于COS-7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其他的，包括淋巴来源的细胞系，诸如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。用于转化载体和表达本发明的抗体的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、人骨肉瘤(SP20)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和淋巴来源的其他细胞系，诸如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。本发明的抗体可以在除了杂交瘤中以外的细胞系中表达。也可以替代地使用其他真核宿主，诸如酵母。抗体和更具体地其抗原结合片段也可以从原核细胞诸如大肠杆菌产生。包含编码根据本发明的抗体的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。
本发明提供了一种制品(例如试剂盒)，所述制品包含可用于检测消化道出血的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。适合的容器包括，例如，瓶子或注射器等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于诊断粪便潜血的另一种组合物结合。组合物中至少一种活性试剂是本发明提供的结合蛋白。
本发明所述的“功能片段”特别地指对于血红蛋白具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
本发明说述“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。
当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
本发明的示例性实施例
本发明提供的一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区，或与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与血红蛋白具有KD≤9.52×10-8mol/L亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-Y-X1-F-X2-S-Y-X3-M-H，其中：
X1是T或S，X2是T或S，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH2为Y-I-X1-P-Y-X2-D-G-T-X3-Y-N-E-K-X4-K-G，其中：
X1是Q、H或N，X2是Q或N，X3是D或E，X4是F或A；
互补决定区CDR-VH3为A-X1-X2-Y-L-Y-X2-M-D，其中：
X1是K或R，X2是GG或N，X3是I、L或V；
互补决定区CDR-VL1为R-A-S-X1-N-I-X2-S-X3-L-A，其中：
X1是D或E，X2是Y或W，X3是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL2为T-A-X1-X2-L-A-D，其中：
X1是S或T，X2是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-F-W-G-X2-P-X3-T，其中：
X1是N、Q或H，X2是L或I，X3是L或I；
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与上述互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与血红蛋白结合的KD≤9.52×10-8mol/L，KD值也可以为2×10-8mol/L、3×10-8mol/L、4×10-8mol/L、5×10-8mol/L、6×10-8mol/L、7×10-8mol/L、8×10-8mol/L、9×10-8mol/L；9×10-9mol/L、8×10-9mol/L、7×10-9mol/L；
或者7.27×10-9mol/L≤KD≤9.52×10-8mol/L；
其中，亲和力按照本发明实施例中的方法测定。
在一些实施方式中：
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是S；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是F；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；
所述互补决定区CDR-VL1中，X2是Y；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是T；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L。
在一些实施方式中：
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是A；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；
所述互补决定区CDR-VL1中，X2是W；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I；
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是H。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是D。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是E。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是GG。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是I。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是V。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是D。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是E。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是H。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是H。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是H。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是L。
在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是I。
在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：
Figure BDA0002324333180000081
Figure BDA0002324333180000091
可选的，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：
Figure BDA0002324333180000092
Figure BDA0002324333180000101
在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。
在一些实施方式中，本申请所述结合蛋白中可以包含3个CDRs、4个CDRs、5个CDRs、6个CDRs，可选的，所述CDRs可以是选自重链CDR区域和/或轻链CDR区域的任意组合。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位。
在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FRH1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
在一些实施方式中，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。
在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；
在另一些实施方式中，所述
轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的另一方面，本发明的恒定区可以来源于人，以构成人源化的抗体。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体可以携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
在一些实施方式中，所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备粪便中血红蛋白检测剂中的应用。
在一些实施方式中，粪便中血红蛋白含量相关的疾病包括消化道肿瘤疾病，如直肠癌、结肠癌。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中血红蛋白的方法，其包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的血红蛋白抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述血红蛋白的存在。
在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述粪便中血红蛋白结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合血红蛋白的不同抗原表位；
所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述粪便中血红蛋白抗原结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。SMARTERTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-FOB单克隆抗体的杂交瘤细胞株为本申请人实验室已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。
1、引物
扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：
SMARTER II AOligonucleotide:
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’
5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：
5’>(T)25VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；
Universal Primer A Mix(UPM):5’>
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’
Nested Universal Primer A(NUP):
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’
mIgG CKR：5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’
mIgG CHR：5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’
2、抗体基因克隆及测序
从分泌Anti-FOB单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACEcDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer AMix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.75KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。
Anti-FOB抗体基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为324bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为351bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
4、重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4
Figure BDA0002324333180000131
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计Anti-FOB抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：
FOB-HF：
5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC<3’；
FOB-HR:
5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCTC<3’；
FOB-LF:
5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTA<3’；
FOB-LR:
5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA<3’；
通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.4kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
5、筛选稳定细胞株
5.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液稀释人血红蛋白到指定浓度，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗人血红蛋白都有活体对性。
5.2重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
5.3重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
6.重组抗体生产
6.1细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
实施例2
实施例1中得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11所示的轻链以及12所示的重链。其具备一定的结合血红蛋白的能力，亲和力较好，为进一步筛选亲和力更好的抗体，申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行突变。
经分析，重链的互补决定区(WT)：
CDR-VH1为G-Y-T(X1)-F-T(X2)-S-Y-I(X3)-M-H；
CDR-VH2为Y-I-Q(X1)-P-Y-Q(X2)-D-G-T-D(X3)-Y-N-E-K-A(X4)-K-G；
CDR-VH3为A-K(X1)-GG(X2)-Y-L-Y-I(X3)-M-D；
轻链的互补决定区：
CDR-VL1为R-A-S-D(X1)-N-I-W(X2)-S-Q(X3)-L-A；
CDR-VL2为T-A-S(X1)-Q(X2)-L-A-D；
CDR-VL3为Q-N(X1)-F-W-G-L(X2)-P-I(X3)-T；
其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。
表1与抗体活性有关的突变位点
Figure BDA0002324333180000151
Figure BDA0002324333180000161
发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。
包被液稀释人血红蛋白到3μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的人血红蛋白单克隆抗体，100μl/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。部分结果如下：
表2抗体活性数据
Figure BDA0002324333180000162
从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点，部分结果如下。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
Figure BDA0002324333180000163
Figure BDA0002324333180000171
亲和力分析
利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10μg/ml，人血红蛋白用PBST进行梯度稀释：2400nmol/ml、2000nmol/ml、1600nmol/ml、1200nmol/ml、800nmol/ml、0nmol/ml；运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。KD表示平衡解离常数即亲和力。
表4亲和力分析数据
Figure BDA0002324333180000181
Figure BDA0002324333180000191
从表4可以看出，表3中的突变后序列均具有较好的亲和力，能够有效和血红蛋白结合。
为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，所述突变如表5所示，并对其进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下表6所示。
表5以WT为骨架进行的突变
Figure BDA0002324333180000192
表6亲和力分析数据
Figure BDA0002324333180000193
Figure BDA0002324333180000201
从表5和表6分析，以WT为基础进行突变获得的序列，均与血红蛋白具有一定的亲和力。
将表4中所述抗体与内部另一株抗体做配对抗体实验验证，经双抗夹心法配对实验验证，相比WT序列，由于突变后抗体活性和亲和力的升高而表现出了更高的灵敏度。
稳定性分析
将基于突变1的同批次抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随温度的升高呈下降越势，这说明上述抗体稳定性较好，且不同突变位点获得的突变序列均具有优秀的稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白
<130> 2019.10.18
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asp Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Asn Ile Trp Ser Gln
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Gln Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Phe Trp Gly Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 12
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Gln Pro Tyr Gln Asp Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Ala
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asp Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Leu Tyr Ile Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
435 440

Claims (10)

1.一种包含血红蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：
互补决定区CDR-VH1为G-Y-X1-F-X2-S-Y-X3-M-H，其中：
X1是T或S，X2是T或S，X3是I、V或L；
互补决定区CDR-VH2为Y-I-X1-P-Y-X2-D-G-T-X3-Y-N-E-K-X4-K-G，其中：
X1是Q、H或N，X2是Q或N，X3是D或E，X4是F或A；
互补决定区CDR-VH3为A-X1-X2-Y-L-Y-X2-M-D，其中：
X1是K或R，X2是GG或N，X3是I、L或V；
互补决定区CDR-VL1为R-A-S-X1-N-I-X2-S-X3-L-A，其中：
X1是D或E，X2是Y或W，X3是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL2为T-A-X1-X2-L-A-D，其中：
X1是S或T，X2是Q、H或N；
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-F-W-G-X2-P-X3-T，其中：
X1是N、Q或H，X2是L或I，X3是L或I；
或与上述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与血红蛋白具有KD≤9.52×10-8mol/L的亲和力；
优选的：
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是S；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是F；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；
所述互补决定区CDR-VL1中，X2是Y；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是T；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L；
可选的：
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VH2中，X4是A；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；
所述互补决定区CDR-VL1中，X2是W；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是H；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是GG；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是H；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是H；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是H；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是I；
优选的，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：
Figure FDA0002324333170000031
Figure FDA0002324333170000041
可选的，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：
Figure FDA0002324333170000042
2.如权利要求1所述包含血红蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs；
优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；
优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
3.如权利要求1或2所述包含血红蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；
优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何一个恒定区的序列；
优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；
优选的，所述恒定区来源于鼠；
轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。
5.一种载体，其特征在于，其包含权利要求4所述的核酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求4所述的核酸或权利要求5所述的载体。
7.一种生产权利要求1～3任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在合适的培养条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
8.权利要求1～3任一项所述的结合蛋白在制备粪便血红蛋白检测试剂中的应用。
9.一种检测测试样品中的血红蛋白的方法，其包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的血红蛋白抗原与权利要求1～3中任意一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在；
优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；
优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述粪便中血红蛋白结合。
10.一种试剂或试剂盒，其包含权利要求1～3任一项所述的结合蛋白；优选的，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
CN201911310313.6A 2019-12-18 2019-12-18 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白 Active CN113004402B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911310313.6A CN113004402B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911310313.6A CN113004402B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113004402A true CN113004402A (zh) 2021-06-22
CN113004402B CN113004402B (zh) 2022-11-04

Family

ID=76381128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911310313.6A Active CN113004402B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113004402B (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63292063A (ja) * 1987-05-25 1988-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗−ヒトヘモグロビンモノクロ−ナル抗体
JP2002209579A (ja) * 2001-01-16 2002-07-30 Matsushita Electric Ind Co Ltd 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、およびそれを産生する細胞株またはそれを含むヒトヘモグロビン検出用キット
CN1428353A (zh) * 2001-12-25 2003-07-09 甘肃省医学科学研究院 抗人血红蛋白单克隆抗体
KR20060023098A (ko) * 2004-09-08 2006-03-13 주식회사 바이오포커스 당화헤모글로빈에 대해 특이성을 갖는 단일클론항체 개발및 정제방법
US9169320B2 (en) * 2008-12-11 2015-10-27 Sekisui Medical Co., Ltd. Antibody to N-terminal region of hemoglobin β-chain
CN102226171B (zh) * 2011-03-29 2012-08-15 成都华西海圻医药科技有限公司 一种包含抗犬血红蛋白单克隆抗体的诊断试剂盒及其应用
CN109320608B (zh) * 2018-09-21 2021-10-08 武汉戴安生物技术有限公司 一种血红蛋白抗体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113004402B (zh) 2022-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109053883B (zh) Ns1蛋白的结合蛋白
CN112979788A (zh) 特异性结合HBeAg的结合蛋白、诊断HBV感染的试剂和试剂盒
CN115785276A (zh) 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN111217912B (zh) 一种抗pgⅱ的抗体及其应用
CN109081869B (zh) Ns1蛋白的结合蛋白
CN112898430B (zh) Ca242的结合蛋白及其应用、检测方法和试剂盒
CN111349168B (zh) 一种抗人ckmb的抗体及其应用
CN111018983B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN115819601A (zh) 一种抗Taq DNA聚合酶的抗体及其应用
CN113004402B (zh) 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白
CN112745390B (zh) 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白
CN113121694B (zh) 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其制备方法和应用
CN112898429B (zh) 针对cyfra21-1的结合蛋白、其应用、肿瘤诊断试剂和试剂盒
CN112979799B (zh) 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白
CN111217913B (zh) 一种抗pg ii的抗体及其应用
CN112979787A (zh) 结合HBeAg的结合蛋白及其应用
CN112940130A (zh) 能够特异性结合mpo的结合蛋白、其用途、试剂、试剂盒和检测mpo的方法
CN112979816B (zh) 针对ckmb的结合蛋白及其应用
CN112707964B (zh) 一种抗n末端脑钠肽前体的重组抗体
CN111018980B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN111018979B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN113121693B (zh) 具有与hpg i结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白及引物组合物、制备方法和应用
CN111018978B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN111018981B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN113004411B (zh) 可特异性结合ckmb的结合蛋白、其应用以及检测ckmb的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant