KR20060023098A

KR20060023098A - 당화헤모글로빈에 대해 특이성을 갖는 단일클론항체 개발및 정제방법

Info

Publication number: KR20060023098A
Application number: KR1020040072794A
Authority: KR
Inventors: 김주호
Original assignee: 주식회사 바이오포커스
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2006-03-13

Abstract

본 발명은 대표적인 성인병중의 하나인 당뇨병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈액 속에 존재하는 당뇨병 표지 물질인 당화헤모글로빈을 측정하기 위한 단일클론항체의 개발에 관한 것이다. 혈액속의 당화헤모글로빈을 측정하기 위한 방법에는 크게 3가지 방법으로 구분할 수 있다. 첫째는 헤모글로빈에 당이 결합하였을때 발생하는 전하차를 이용한 이온교환크로마토그라피법이고, 둘째는 당이 헤모글로빈에 cis-diol결합한 것을 인식하는 boronate물질을 이용하는 방법, 그리고 셋째로 항원 · 항체반응을 이용한 면역분석법이다. 면역분석법을 이용하기 위해서는 당이 헤모글로빈에 결합한 것을 특이하게 인식하는 항체를 개발하는 것이 필수적이며 본 발명에서는 세포융합기술을 이용하여 당화헤모글로빈에 특이한 항체를 생산하는 세포주를 개발하였고, 세포주를 배양하여 생산된 항체를 항체친화크로마토그라피법을 이용하여 정제하였다. 정제한 항체를 면역분석법을 이용하여 그 역가가 우수한 것을 확인하였고, 발색물질과 결합시켜서 혈액속의 당화헤모글로빈을 선별적으로 측정할 수 있음을 확인하였다.

당뇨병, 당화헤모글로빈(glyHb), HbAlc, 탈당헤모글로빈(Degly-HbAo), 단일클론항체, 이온교환크로마토그라피, boronate,

Description

당화헤모글로빈에 대해 특이성을 갖는 단일클론항체 개발 및 정제방법{Development of monoclonal anti-glycohemoglobin antibody and purification method of the monoclonal antibody}

도 1은 본 발명을 통하여 제조한 당화헤모글로빈에 대해 특이성을 갖는 단일클론항체인 anti-gHb70을 제조 · 정제한 후에 전기영동한 결과임

도 2는 anti-gHb70이 당화헤모글로빈에 대해서만 특이성을 보이는 ELISA결과임

본 발명은 대표적인 성인병중의 하나인 당뇨병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈액 속에 존재하는 당뇨병 표지 물질인 당화헤모글로빈을 측정하기 위한 단일클론항체의 개발에 관한 것이다. 당뇨병의 진단방법은 채혈하는 순간에 대한 혈당측정방법뿐만 아니라 과거 평균 2∼3개월의 평균혈당을 반영하는 당화헤모글로빈을 함께 검사하는 것이 중요하게 대두되고 있다.

당화헤모글로빈의 측정은 1971년 Trivelli등이 임상검사실에서 쉽게 할 수 있는 column방법을 소개한 이래 이온교환 크로마토그라피법, HPLC법, 친화성크로마 토그라피법, 면역분석법 등의 여러가지 방법들이 개발되어 왔다.

이온교환 크로마토그라피법은 포도당이 헤모글로빈과 결합한 당화헤모글로빈과 결합하지 않은 헤모글로빈을 분리하여 측정할 수 있는 최초의 방법으로서 그동안 임상에서 오랫동안 사용되어왔다. 이 방법은 비용이 많이들고 분리 수행시 시간이 많이 소모되는 단점을 가지고 있으며, 검사실의 온도, 완충액의 pH 및 이온강도에 영향을 받기 쉽기 때문에 측정법의 표준화가 어려우며, 최근의 혈당변화가 심한 경우 당화헤모글로빈의 전단계물질인 labile aldimine농도가 증가하여 당화헤모글빈과 함께 용출되므로 증가쪽의 오차(positive interference)를 가져올 수 있다. 또한 HbF 및 여러가지 비정상적인 헤모글로빈도 영향을 미칠 수 있으므로 특히 HbF가 증가하는 임산부나 6개월 이내의 유아, 혈액학적 질환에서 해석에 유의해야 하는 단점이 있다.

HPLC방법은 1984년에 당화헤모글로빈(HbAlc)의 측정에 도입되어 당화헤모글로빈의 분획량을 정확히 측정하게 되었다. HPLC법은 검사실 온도의 영향을 받지 않고 각각의 당화헤모글로빈 분획을 나타내는 표준방법으로 알려져 있다. 당화헤모글로빈 전용 기기가 사용되고 있으나 고가라는 점과 HbF의 용출로 인한 오차영향을 완전히 배제하지 못했다는 단점이 있다.

이 HPLC법은 본래 연구실내의 분석기기이며 검사조건설정이 번잡함으로 인해 정확한 데이터 산출을 위해서는 분석자의 숙련된 기술이 요구된다. 그러나 근래에 개발된 임상검사실용 HPLC기기들은 이들 결점들을 상당히 보완한 바 있으며, 최근에 개발된 라텍스법 등을 이용한 자동화학분석장치용 분석시약들이 나오고 있어 추 가적인 보완이 이루어지고 있으나 아직까지는 기술적인 보완이 필요하다.

친화성크로마토그라피법은 1980년대초 agarose bead에 phenyl boronic acid를 부착시켜 포도당의 cis-diol기가 특이하게 반응하는 원리를 이용한 방법으로서 Mini Column 등이 있다. 이 방법은 총당화헤모글로빈를 측정하며 온도나 labile aldimine, HbF 등의 영향이 없이 이온교환크로마토그라피의 단점을 보완할 수 있는 방법이다.

면역분석법은 항원항체간의 면역침강(immunoprecipitation)법으로 정량분석이 가능하게 되면서 면역학적인 기술들이 임상진단분야에 적용되기 시작하였다. 이렇게 개발된 면역분석(immunoassay)법은 표지물질의 종류에 따라 radio immunoassay(RIA), enzyme immunoassay(EIA), fluorescent immunoassay (FIA), chemi-luminescent immunoassay(CLIA) 등으로 구분될 수 있다. 이러한 면역분석방법은 검사의 정확성, 민감도 측면에서 기존의 진단방법보다 우수하여 적용범위가 확대되고 있다.

특히, 단일클론항체기술의 발전은 면역분석법의 임상적용을 앞당기는 계기가 되었으며, 유전자재조합기술의 출현으로 재조합 항원의 대량생산이 가능함에 따라 면역분석에 사용하던 시약의 성능과 경제성 등에서의 개선을 가져오게 되었다.

본 발명기술은 당화헤모글로빈에 특이성이 있는 단일클론항체를 개발하고 정제하는 것에 관한 것이다. 당화헤모글로빈에는 크게 두가지 형태가 있다.

혈액 내에 혈당이 높아지면 일부 혈당은 혈당농도에 비례해서 헤모글로빈에 비가역적으로 결합하게 되는데, 혈당이 헤모글로빈 단백질 β-subunit의 아미노말단(-NH₂) 부분에 결합한 것을 HbAlc라 하고, 두 번째 형태는 혈당이 헤모글로빈 단백질 β-subunit의 아미노말단(-NH₂) 부분이 아닌 다른 부분 즉, 헤모글로빈을 구성하는 아미노산 중에서 lysine의 ε-아미노기(-NH₂)에 결합하는 형태가 있는데 이를 협의의 당화헤모글로빈이라고 한다. 통상적으로는 당화헤모글로빈이라고 하면 HbAlc와 협의의 당화헤모글로빈을 모두 포함하는 개념으로 사용하기도 하는데 두 가지 형태 모두 혈당의 농도에 비례하여 생성되는 것으로 알려져 있다. 면역분석 방법은 HbAls에 대한 항체나 협의의 당화헤모글로빈에 대한 항체를 이용하고 있으며, 지금까지 개발되어 진단키트에 사용되고 있는 항체는 특이도에 있어서 한계가 있어서 직접적으로 당화헤모글로빈을 인식하는 직접방법(direct method)를 사용하지 않고, 항체에 대한 친화력이 약간 떨어지는 당화헤모글로빈 유사물질을 이용하여 당화헤모글로빈과 경쟁적으로 반응시키는 간접방법(indirect method)를 사용하고 있다. 따라서 특이도가 아주 우수한 항체를 개발하여 직접방법(direct method)으로 당화헤모글로빈을 측정하는데 이용한다면 그 적용범위를 더 넓힐 수 있고, 진단키트의 성능도 한단계 향상시킬 수 있는 것이다.

본 발명은 당화헤모글로빈에 특이하게 결합하는 단일클론항체를 개발하는 것에 관한 것으로, 당화헤모글로빈을 암컷 생쥐 Balb/c에 주사하여 면역시키고 이렇게 면역시킨 생쥐에서 비장을 추출하여 비장으로부터 비장세포를 분리하여 비장세 포와 마우스 암세포를 세포융합하였다. 세포융합한 융합세포를 한정희석법을 통하여 단일클론항체를 분비하는 세포주를 획득하였고 이 세포주로부터 단일클론항체를 분리 · 정제하여 그 역가를 확인하였다.

실시예. 당화헤모글로빈에 대한 단일클론항체 제조 및 정제

(1) 당화헤모글로빈 주사

당화헤모글로빈 50㎍을 인산완충용액에 용해시키고 이 용액을 프로인트완전면역보조제(FCA)에 1:4의 비율로 섞어준 후 암컷 생쥐 Balb/c에 0.5mL씩 1차 주사하였다. 2주일 지나서 인산완충용액에 용해시킨 당화헤모글로빈 50㎍을 프로인트불완전면역보조제(FIA)에 1:4의 비율로 섞어준 후 다시 0.5mL씩 2차 주사하였다. 3차 주사와 4차 주사는 2주일 간격으로 2차 주사와 같은 방법으로 실시하였다. 4차 주사 후 3일 뒤에 생쥐의 눈에서 혈액을 채취하여 항체의 역가를 ELISA법으로 분석하였다.

(2) 세포융합

항원 주사를 한 생쥐에서 항체의 역가가 높게 나오면 3일 동안 당화헤모글로빈 항원을 매일 주사하여 충분한 면역을 시킨 후에 생쥐를 죽여서 비장을 취하여 10⁸이상의 비장세포를 얻어냈다. 비장세포와 생쥐의 골수종 암세포(SP2/0)를 PEG존재 하에 세포융합하여 융합잡종세포를 얻은 후 HAT 배지에서 계대배양하면서 완전한 융합잡종세포를 얻었다. 융합잡종세포를 배양하면서 얻은 배양상등액을 취하여 ELISA법으로 당화헤모글로빈에 대한 항체역가가 높은 융합잡종세포를 선별하여 한 정희석법을 통하여 단일클론항체를 생산하는 융합잡종세포주를 얻었고 이것을 gHb70세포주로 명명하였다.

(3) 단일클론항체 정제

gHb70세포주를 대량 배양하여 수획한 후 수획한 세포주를 약 10⁶개로 조절하여 생쥐에 복강주사 하였고, 7∼10일이 경과한 후에 복강으로부터 복수액을 취하였다. 복수액을 암모니움설페이트(ammonium sulfate)로 처리하여 원심분리 후에 상등액은 버리고 침전물을 인산완충용액으로 용해시켜 준비하였다. CNBr로 활성화된 세파로즈 컬럼(column)에 항-마우스 항체를 결합시키고 그 컬럼에 위에서 준비하여둔 암모니움설페이트 처리액을 넣어서 친화크로마토그라피법에 의한 정제를 하여 당화헤모글로빈에 특이한 순수한 단일클론항체를 얻었고 이렇게 얻은 항-인간 당화헤모글로빈 단일클론항체를 Anti-gHb70으로 명명하였다.

(4) Anti-gHb70 항체의 특성 분석

SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 하여 anti-gHb70이 순수하게 정제된 것을 확인하였고, 항체 type은 IgM type임을 확인(도 1)하였다.

Anti-gHb70의 특이성을 확인하기 위하여 ELISA용 96웰 플레이트(Nunc제품)에 HbAlc, 당화헤모글로빈(glyHb), 탈당헤모글로빈(DeglyHbAo)를 10ng/mL∼ 10ug/mL 농도범위로 희석하여 고정화시킨 후에 ELISA법에 의해서 anti-gHb70의 특이성을 검사한 결과 당화헤모글로빈에 대해서만 높은 특이성을 갖는 것을 확인하였다(도 2).

당뇨병으로 진단되거나 당뇨병을 가지고 있는 동안에는 각 분야의 전문의에 의한 정기적인 검사가 필요하게 된다. 이러한 검사는 자주 받을수록 좋지만, 환자입장에서의 경제적인 면과 검진에 따르는 고통과 번거로움 등을 고려하여 일정한 간격을 둔 정기검사가 필요하며 검사항목 중에서 당화헤모글로빈은 2∼3개월의 주기로 검사를 추천하고 있다. 1998년 제57차 미국당뇨병학회에 보고된 전문위원회의 보고자료(Diabetes Care, 21(S1), S5∼S19, 1998)에 따르면, 당화헤모글로빈검사는 당뇨병진단에서 권장할 수 없다고 했었다. 그러나, 미국의 당뇨병협회(ADA)의 최근 권고사항(Diabetes Care, 25(S1), S97∼S99, 2002)에서는 환자의 지난 2∼3개월간의 혈당조절과정을 가장 정확히 반영할 수 있는 지표가 당화헤모글로빈이라고 지적하고, 당뇨환자에게 당화헤모글로빈의 농도가 7%이하가 되도록 치료에 대한 목표치를 설정하여 권고한 바 있다. 당화헤모글로빈의 진단은 혈당측정결과를 확진시켜주고 지난 2개월 이상의 환자에 대한 당뇨치료과정의 효과를 확인시켜주는 결과로 이용되고 있다. 따라서, 당화헤모글로빈의 진단결과는 기존의 혈당측정결과를 대체시키는 경쟁관계의 진단방식이 아니라 오히려 상보적인 진단방식으로 볼 수 있어 모든 당뇨환자를 대상으로 한 확진진단방식으로서의 파급효과도 기대된다.

현재까지 개발된 당화헤모글로빈에 관한 진단기술은 HPLC방식, 면역분석방식, 자동분석방식, Mini-Column방식 및 POCT방식 등이 적용되어 왔다. 그러나 현장진단방식은 검사시간의 단축과 더불어 환자의 만족도, 입원기간의 단축, 시현성, 경비감소, 유사시 대비 등의 잇점으로 인해 일반적인 의료진단기기의 기술은 사용자중심의 제품사용이 확대되면서 소위 중앙검사실로부터 의사와 간호사, 임상병리 사 및 심지어 환자스스로 진단할 수 있는 기기로 개발되고 있는 추세이다. 본 발명을 통해서 개발된 당화헤모글로빈에 대한 단일클론항체를 이용하여 당화헤모글로빈에 대한 진단기기를 개발할 수 있으며 이 경우도 현장검사방법(POCT)의 개념을 가지고 있어 중앙검사실에서 측정하는 기존의 진단방식들과 대등한 검사결과를 확보할 경우 기존 방식에 비해 경쟁력이 있을 것으로 보인다.

Claims

당화헤모글로빈에 특이한 IgM 형태의 단일클론항체인 anti-gHb70
제 1항의 anti-gHb70과 같은 IgM 형태의 단일클론항체를 항-마우스 항체를 이용한 친화크로마토그라피법에 의해 정제하는 방법
제 1항의 IgM 형태의 단일클론항체인 anti-gHb70을 나이트로셀룰로오즈멤브레인이나 단백질을 결합시킬 수 있는 다른 종류의 멤브레인이나 플라스틱에 결합시켜 혈액 속에 포함되어 있는 당화헤모글로빈을 포획하게 하는 방법
제 1항의 IgM 형태의 단일클론항체인 anti-gHb70을 콜로이드골드와 결합시키거나 염색물질, 효소 또는 형광물질등과 결합시켜 발색시키는 방법
제 1항의 IgM 형태의 단일클론항체인 anti-gHb70을 이용하여 당화헤모글로빈을 측정하는 정성, 정량 분석방법