JPH07502534A - インビボ進行グリコシル化最終産物の免疫化学的検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インビボ進行グリコジル化最終産物の免疫化学的検出量Ｊ泗−１Ｌ物 下記の論文は、本発明の主題に一般的に関連しているので、記載した：”ＦＵＮ ＣＴＩＯＮＯＦＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥＲＥＣＥＰＴＯＲ）’ＯｒぜＮＯＮＥＮＺ ＹＭＡＴＩＣＡＬＬＹ　ＧＬＹＣＯ３ＹＬＡ丁Ｅ　Ｄ　Ｐ　Ｒ（］　Ｔ已ＩＮＳ 　Ｉｓ　ＭＯＤＵＬＡＴＥＤ　ＢＹ　ｌＮ５ＵＬＩＮ　ＬＥＶＥＬＳ”。

Ｖｌａｓｓａｒａ＋　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　および　Ｃｅｒａｍｉ、ＤＩＡＢＥＴ ＥＳ（１９８６１，Ｖｏｌ、３５　５ｕｐｐ、１．Ｐａｇｅ　１３ａ；ＡＣＣＬ ＪＭＵＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＤＩＡＩ３ＥＴＩＣＲＡＴ　ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＩ 。

ＮＥＲＶＥ　ＭＹＥＬＩＮ　ＢＹ　ＭＡＣＩｔＯＰＨＡＧＥＳ　ＩＮＣＲＥＡ８ ＥＳ　ＷＩＴＨＴＨＥ　ＰＲＥＳＥＮＣＥ　ＯＦ　ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＧＬＹＣ Ｏ３ＹＬＡＴＩＯＮ　ＥＮＤＰＲＯＤＵＣＴＳ”、ＶｌａＳＳａｒａ、Ｈ，。

Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｍ、、および　Ｃｅｒａｍｉ、Ａ、、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤｔ １９８４）、Ｖｏｌ、１６０．ｐｐ、１９７−２０７　；”ＲＥＣＯＧＮ］Ｔ１ ０Ｎ　ＡＮＤ　ＵＰＴＡＫＥ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＤＩＡＢＥＴＩＣＰＥＲＩＰ ＨＥＲＡＬ　ＮＥＲＶＥ　ＭＹＥＬＩＮ　ＢＹ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥＳ”。

Ｖｌａｓｓａｒａ、Ｈ，、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｍ、、および　Ｃｅｒａｒｕｉ。

Ａ、、ＤＩＡＢＥＴＥＳ　ｆ１９８５１．Ｖｏｌ、３４．Ｎｏ、６．　ｐ［）、 ５５３−５５７　；”　ＨＩＧＨＬＹ−ＡＦＦＩＮＩＴＹ−ＲＥＣＥＰＴＯＲ− ＭＥＩ＋ｌ＾ＴＥＤ　ＵＰＴＡＫＥ　ＡＮＤ　ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ　ＯＦ　 ＧＬＵＣＯ５Ｅ−ＭＯＤＩＦＩＥＤ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ａ　ＰＯＴＥＮＴＩＡ Ｌ　ＭＥＣＩＩＡＮＩＳＭ　ＦＯＲＴＨＥ　ＲＥＭＯＶＡＬ　ＯＦ　５ＥＮＥＳ ＣＥＮＴ　ＮＩＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ”、Ｖｌａｓｓａｒａ、Ｈ，、Ｂｒ ｏｗｎｌｅｅ。

Ｍ、、および　Ｃｅｒａｍｉ、Ａ、、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、５（ＩＬ ＩＳＡ　（Ｓｅｐｔ、１９８５１．Ｖｏｌ、８２．ｐｐ、５５８Ｂ−５５９２； ”Ｎ０ＶＥＬ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥ　ＲＥＣＥＰＴＯＲＦＯＲＧＬｕｃｏｓＥ −ＭＯＤＩＦＩＥＤ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ　Ｉｓ　ＤＩＳＴ！ＮＣＴ　ＦＲＯＭＰ ＲＥＶＩＯＵＳＬＹ　ＤＥＳＣＲＩＥＥＤ　５ＣＡＶＥＮＧＥＲＲＬ：ＣｌミＰ ＴＯＲ３”、Ｖｌａｓｓａｒａ、Ｈ，、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｍ、、およびＣｅｒ ａｍｉ、Ａ、、ＪＯＵＲ，ＥＸＰ、ＭＥＤ、（１９８６）、Ｖｏｌ、１６４、ｐ ｐ、１３０１−１３０９；”ＲＯＬＥ　ＯＦ　ＮＯＮＥＮＺＹＭＡＴＩＣＧＬＹ ＣＯ３ＹＬＡＴＩＯＮ　ＩＮ　ＡＴＨＥＲＯＧＥＮＥＳＩＳ″、Ｃｅｒａｍｉ＋ 　Ａ、、Ｖｌａｓｓａｒａ、ｉｉ、、および　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｍ、、ＪＯＵ ＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（１９８６）、Ｖｕｌ、３ ０．ｐｐ、１ｌｌ−１２０，ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ　Ｏ）Ａ　５Ｏ ＬＵＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬ　５ＵＲＦＡＣＥ　ＢＩＮＤＩＮＧＰＲＯＴＥＩ Ｎ　ＯＮ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥＳ　５ＰＥＣＩＦＩＣＦＯＲＰＲＯＴＥＩＮＳ 　ＭＯＤＩＦＩＥＤ　ＮＯＮＥＮＺＹＭＡＴＩＣＡＬＬＹ　ＢＹ　ＡＤＶＡＮＣ ＥＤ　ＧＬＹＣＯ８ＹＬＡＴＩＯＮ　ＥＮＤ　ＰＲＯＤＬＩＣＴＳ″、Ｒａｄｏ ｆｆ、Ｓ、＊　Ｖｌａｓｓａｒａ、Ｈ，、および　Ｃｅｒａｎｔｉ。

Ａ、、ＡＲＣＨ，ＢＩＯＣＨＥＭ、ＢＩＯＰＨＹＳ、（１９８８１，Ｖｏｌ、２ ６３、Ｎｏ、２．ｐｐ、４１Ｂ−４２３；”ｌ５ＯＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　Ａ　５ ｔＪＲＦＡｃＥ　ＢＩＮＤＩＮＧ　ＰＲＯＴＥＩＮ　５ＰＥＩＣＩＦＩＣ）’０ １（ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＧＬＹＣＯ３ＹＬＡＴＩＯＮ　ＥＮＤＰＲＯＤＵＣＴＳ ＦＲＯＭ　ＴＨＥ　ＭＵＲＩＮＥ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥ−ＤＥＲＩＶＥＤ　（ ’ＥＬＬ　ＬＩＮＥ　ＲＡＷ　２６４．７”、Ｒａｄｏｆｆ、Ｓ、、Ｖｌａｓｓ ：＋ｒａ、　Ｈ，、および　Ｃｅｒａｍｉ、Ａ、ＤＩＡＢＥＴＥＳ＋　（１９９ ０１，＼′ｏ１．３９．　ｐｐ、１５１０−１５１８；”ＴＷＯＮ０ＶＥＬ　Ｒ ＡＴ　ＬＩＶＥＲＭＥＭＢＲＡＮＥ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ　ＴＨＡＴ　ＢＩＮＤ　 ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＧＬＹＣＯ６ＹＬＡＴＩＯＮ　ＥＮＤＰＲＯＤＵＣＴＳ：Ｒ ＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰ　Ｔｏ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥ　ＲＥＣＥＰＴＯＲＦＯ ＲＧＬＵＣＯ８Ｅ−ＭＯＤＩＦＩＥＤ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ”、Ｙａｎｇ、Ｚ、、 Ｍａｋｉｔａ＋　Ｚ、＊　Ｈｏｒｉｉ＋　Ｙ、＋　Ｂｒｕｎｅｌｌｅ、Ｓ、＊　 ＣｅｒａｍＬＡ、、５ｅｈａｊｐａ１．ｐ、ｌ　５ｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎ、Ｍ 、およびＶｉａｓｓａｒａ、Ｈ，、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤ、、Ｖｏｌ、１７４．ｐ ｐ、５１５−５２４；”ＨＵＭＡＮ　ＡＮＤ　ＲＡＴ　ＭＥＳＡＮＧＩＡＬ　（ ’：ＥＬＬ　ＲＥＣＥＰＴＯＲ３ＦＯＲＧＬＵＣＯ３Ｅ−ＭＯＤＩＦＩＥＤ　Ｐ ＲＯＴＥＩＮＳ：ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ　ＲＯＬＥ　ＩＮ　ＫＩＤＮＥＹ　Ｔｌ５ ＳＵＥ　ＲＥＭＯＤＥＬＬＩＮＧ　ＡＮＤ　ＤＩＡＢＥＴＩＣＮＥＰＨＲＯＰＡ ＴＨＹ”、　５ｋｏｌｎｉｋ、Ｅ、＋　Ｙａｎｇ、ｚ、、Ｍａｋｉｔａ、Ｚ、、 Ｒａｄｏｆｆ、Ｓ、＋Ｋｉｒｓｔｅｉｎ、Ｍ、、および　Ｖｌａｓｓａｒａ＋　 Ｈ，、Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤ、、Ｖｏｌ、１７４．ｐｐ、９３１−９３９；および 　”ＨＥＭＯＯＬＯＢＩＮ−ＡＧＥ：Ａ　ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＮＧ　ＭＡＲＫＥ ＲＯＦ　ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＧＬＹＣＯ３ＹＬＡＴＩＯＮ″＋　Ｍａ　ｋ　Ｉ　 Ｌａ＋　Ｚ−＋　Ｖ　１　ａ　Ｓ　８　ａ　ｒ　ａ。

Ｈ，、Ｒａｙｆ　１ｅｌｃＬ　Ｅ、、ＣａｒＬｗｒｉｇｈＬ、に、、Ｆｒｉｅｄ ｎｍａｎ、Ｅ、、Ｒｏｄｂｙ＋　Ｒ，、Ｃｅｒａｍｉ、Ａ、、および　Ｂｕｃａ ｌ、ａ。

Ｒ，５ＣＩＥＮＣＥ、（印刷中）。上記の刊行物全ておよび本文に引用したそ０ ）他の参考文献は全て、参考として掲載しである。

兄朋暎Ｒ１ 本発明は、一般に、非酵素的にグリコジル化されたタンパク質類の検出およγト 渕定に関連し、詳細には、インビボで非酵素的にグリコジル化されたタンパク２ ６類の検出および測定のための方法と関連材料に関する。

１光性ＩＩ類、たとえば、グルコースは、タンパク質アミノ基と非酵素的に反応 して、蛍光および架橋性の性質を有する多様なタンパク質結合分子類を形成する ことが示されている。これらの化合物類は、進行グリコジル化最終産物類じＡＧ Ｅｓ”）と称され、加齢およびたとえば長期糖尿病のようなある疾患においでタ ンパク質類の構造的および機能的改変に関与してきた。数種のＡＧＥｓは、デノ ボ合成と組織単離操作に基づいて識別同定されてきた。

還元性糖類とタンパク質類の遊離アミノ基類との反応は、進行グリコジル化と称 される翻訳後修飾プロセスを開始させる。このプロセスは、還元性塘と前記ｙ′ ミノ基との可逆性の反応で開始され、シフ塩基を形成し、共有結合したアマトリ 再転位産物を形成するように進行する。いったん形成されると、前記のアマトリ 産物は、さらに再転位を受け、ＡＧＥｓを形成する。

これらの反応はゆっくりと起こるので、タンパク質類は、インビボで測定回Ｏヒ な量のＡＧＥＳを集積する前に、有意な量のアマトリ産物を集積する。これらの ＡＧＥｓは、タンパク質架橋を起こすことができ、それは次に、臓器および臓器 部分の構造的および／または機能的一体性を減じ、従って、最終的に臓器機能を 低下させるかまたは不全とする。

前記進行グリコジル化プロセスが、特にそれがコラーゲンのような長半減期を有 するタンパク質類中でかつ糖尿病のような実質的に高糖濃度条件下で発生するこ とは、注目に値する。数多くの研究から、ＡＧＥｓが、加齢および慢性疾患時に おいて、タンパク質中で発生する構造的および機能的改変において！要な役割を 果たすことが示唆されている。

さらに、進行グリコジル化最終産物は、糖尿病、ガラクトース血症およびその他 の疾患組織において正常組織中におけるよりも急激に形成されることが示唆され ている。

ある進行グリコジル化最終産物は、特徴的黄色−茶色染色性、特徴的蛍光スペク トルおよびタンパク賀−タンパク質架橋を形成する能力を共通に有していると確 信されている。ＡＧＥｓはインビボで形成され、天然のグリコジル化材料がら単 離されてきた。これらの産物は少量で存在し、構造的に不均質であり、化学的還 元と加水分解を受け易い。デノボ合成と単離操作は、２−（２−フロイル）４　 （５）−＋２−フラニル）−ＩＨ−イミダゾール（”Ｆ’ＦＩ”）；５−ヒトし Ｉキシメチル−１−アルキルビロール−２−カルバルデヒド（”ビラリンｎ）； １種の非蛍光モデルＡＧＥである１−アルキル−２−ホルミル−３，４−ジグリ ーｔシルビロール（ＡＦＧＰ”）；カルボキシメチルリシン；およびペントシジ ンのような数種のＡＧＥｓを識別同定することにつながった。しかし、ＡＧＥｓ のインビボ形成は、これらの明確な化学的化合物類に限定されておらず、さらに 、新たに発見されたＡＧＥｓを本文で説明する。

過去においてインビトロで合成された特定のＡＧＥｓに関する研究では、化学的 還元と加水分解操作の使用を必要とした。このことによって、天然のＡＧＥｓが 、単離されたモデル化合物類と異なる別の構造を有する池の化合物類を含む可能 性が残された。

また、インビボＡＧＥｓに対する抗体を作製することが試みられたが、成功の例 は全く公知でなく、また、報告されてもいない。したがって、Ｎ　ａ　ｋ　ａ　 ｙ　ａ　ｎ＋ａらは、ＢＩＯＣＨＥＭ、ＢＩＯＰＨＹＳ、ＲＥＳ、Ｃ０ＭＭ、、 １６２：２゜ｐｐ、７４０−７４５　（１９８９）において、タンパク質結合Ａ ＧＥｓについて研究し、特に、インビトログリコジル化に由来するＡＧＥ−ＫＬ Ｈｓに対する１ル血清を調製した。これらの抗血清は高いアフィニティ結合を示 し、インビトロで形成されたＡＧＥ−ＢＳＡ＋ＡＧＥ−ＨＳＡおよびＡＧＥ−Ｒ ＮＡｓｅ　Ａの順次希釈曲線が互いに平行であることが示され、これらの特定の ＡＧＥ−タンパク質類で共通の構造が前記の抗血清によって認識されていること が示唆される。１１−１記構造が、シフ塩基付加物類およびアマトリ酸転位産物 順のような進行したマイラードｆＭａｉｌｌａｒｄ）反応からまたは早期の化合 物類から由来する基部類を認識するかどうかを決定するための研究が、いくつか の還元剤を用いてさらに実施された。還元剤によって処理しても、免疫反応性が 低下せず、また、ト“Ｆｌは、前記抗体類によって認識されなかった。Ｎａｋａ ｙａｍａらが調製しかつ調べた前記抗体類は、インビボで形成されたＡＧＥｓと 反応するかどうか決定されなかった。

Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、、２６６　（１２＋、ｐｐ、７ ３２９−７３３２　（１９９１）は、インビトロ由来ＡＧＥ−ウシ血清アルブミ ノに対して作製したポリクローナルおよびモノクローナル抗体類を調製した。前 記のＨｏｒｉｕｃｈｉらの抗体類は、また、インビトロ由来ＡＧＥ−ヒト血清ア ルブミンおよびＡＧＥ−ヘモグロビンを認識したが、非修飾の対応物は認識しな かった。これらのＡＧＥタンパク質類を還元剤で処理しても、免疫活性に全く効 果がなかった。Ｈｏｒｉｕｃｈｉらが調製した抗体類は、Ｎａｋａｙａｍａらの 抗体類と同様に、インビボ形成ＡＧＥｓとの反応性が決定されなかった。

したがって、当技術で抗体類が容易に調製されたにもかかわらず、インビボ１Ｆ ・成ＡＧＥ８との上記抗体類の反応性は、これまで達成されていない。上記抗体 類の調製は、それによって、ヒトを含む哺乳類における進行グリコジル化最終産 物の形成を示す診断および治療プロトコールの開発と実施を可能とするので、望 ましい。

発朋−の嬰り 本発明は、第１に、インビボ産生進行グリコジル化最終産物と反応する抗体類に 関する。したがって、インビボ形成進行グリコジル化最終産物と反応する抗体類 を含有する抗血清も含まれ、下記の特徴を有している：Ａ、それは、インビボ形 成進行グリコジル化最終産物に共通の免疫抗原決定基と反応する； Ｂ、それは、インビトロ形成進行グリコジル化最終産物と交差反応性である；Ｃ ０それは、しかし、形成された下記の進行グリコジル化最終産物と交差反応、性 でない：ＦＦ１．ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、およびベン） リシン。特に、共通の抗原決定基は、還元糖をＲＮＡ５ｅ、リシン、ヘモグロビ ン、コラーゲン■型、ＢＳＡおよびＨＳＡからなる群から選択されたタンパク質 性の物質とインキュベーションすることによって、形成される。

本発明の抗体類は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、か つ、もし後者であれば、ハイブリドーマ法または他の公知の組換え法によっ下調 製できる。前記の抗体類は、本文で例示したように、免疫担当哺乳類中で前記哺 乳類をＡＧＥｓまたはＡＧＥｓが形成された１種のタンパク質で過免疫させるこ とによって、作製できる。前記の作製された抗体類は、インビボ形成ＡＧＥｓ、 たとえば、糖尿病組織または血清のような上記のＡＧＥｓを含有する試料、なら びに、糖碧とのインキュベーションの結果としてタンパク質類上で形成されるイ ンビトロ形成ＡＧＥｓを認識しかつ結合する。

本発明の抗ＡＧＥ抗体類は、同様に、それらが、たとえば、ＦＦＩ、ビラリン、 ＡＦＧＰ、カルボキシメチルリシンおよびペントリシンのような合成的に調製さ れたあるＡＧＥｓを認識しないという点で、特徴的である。

本文で述べた抗ＡＧＥ抗体類は、さらに、下記のような特徴を有している。

（ａ）前記抗体類は、ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅによる哺乳類の過免疫化によって形成 できる； （ｂｌ前記抗体類は、下記のＡＧＥｓと反応性である＋ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ、Ａ ＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−ＢＳＡ、ＡＧＥ−ＨＳＡ、ＡＧＥ−コラーゲン■ 型、ＡＧＥ−ＬＤＬおよびＡＧＥ−リシン。

ｆｃｌ前鍔己抗体類は、非修飾Ｈ３ＡまたはＢＳＡ、ＦＦＩ−ＢＳＡ、ホルミル 化アルブミン、マレイル化アルブミン、ＬＤＬ、コラーゲン■型、アセチル−Ｌ ＬＩＬ、ＦＦ１．ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、ベントリシン 、リシン、デオキシプロピルアミノフラクトースまたはデオキシモルホリノフッ ク１−−スと反応性でない。

さらに本発明の別の面では１本杭ＡＧＥ抗体類は、特定のＡＧＥタンノくり質を 接種した適切な宿主中で作製した抗血清から回収することもできる。好適な方法 は、免疫担当哺乳類に対して有効量のＡＧＥまたは上述のようなＡＧＥｓ含有化 合物類を投与し、本杭ＡＧＥ抗体類の形成を誘発すること、さらに、前記哺乳類 から抗ＡＧＥ抗体類を含有する血清を得ることからなる。特定のＡＧＥタンノ； り質は、ＲＮＡ５ｅをグルコースとインキュベーションした産物からなる。

本発明の別の面では、試料中におけるＡＧＥｓの存在または量を検出する免疫ア ッセイ法に関し、 （ａｌ　ＡＧＥｓ、ＡＧＥ担体、抗ＡＧＥ抗体類または別のＡＧＥ結合対を含有 噛ると疑われる試料を固体支持体に結合させること、（ｂ）前記固体支持体に付 着させた種を、ＡＧＥｓ、抗ＡＧＥ抗体類または他のＡＧＥ結合対の存在を検査 する分析物質と接触させること、（ｃ）前記ＡＧＥｓ、抗ＡＧＥ抗体類または他 のＡＧＥ結合対を検出可能な欅講で！１１Ｍ＠すること、 ＋ｄ）結合挿謹の量を標準と比較すること、からなる。

上記アッセイ方式は、たとえば、食品腐敗の可能性または発生の検出のようなＡ ＧＥｓの存在を植物および動物試料で調べられるように適応でき、本発明Ｃよこ の利用にも拡張することを意図している。

さらに、本発明は、哺乳類中におけるＨｂ−ＡＧＥ、血ＩＡＧＥペプチドお、Ｊ び尿中ＡＧＥのようなＡＧＥｓ異常レベルが存在する点を特徴とする疾患０〕検 １１８のための本抗体類の用途を包含している。前記抗体類は、ポリクローナル であるかまたはモノクローナルのいずれであることもでき、さらに、本文で先に ８己観シ。

たような特徴を有している。

アッセイキットも同様包含され、本文で記載のアッセイおよび、／または診断を 実行するために有用であり、Ｈｂ−ＡＧＥ、尿中−および血清ＡＧＥペプチド順 または他のＡＧＥ結合対のようなＡＧＥｓの検出または定置のための適切な反応 試薬類を含んでいる。

本発明で使用される治療用組成物類および方法類、これらの組成物類を用いた疾 患の診断または治療も同様に包含され、前記組成物を有効量、こうした治療を必 要としている患者に投与することを特徴とする。

さらに、本発明は、以後Ｈｂ−ＡＧＥと称する／＼モグロビンとの複合体が関与 する進行グリコジル化最軒産物にも拡大され、さらに詳細Ｃごがっ特に、診断手 段としてのその能力の観点から検討する。したがって、Ｈｂ−ＡＧＥはおよび／ またはその抗体類が血糖症状態または糖尿病のいずれかの発症を検出する際ばが りでなく上記状態の経過を長期にモニタリングする際にも使用でき、上記状態の 強度が変動することを検出する点で、広範囲の活性を示す。同様に、Ｈｂ−ＡＧ Ｅおよびその拮抗剤類の両者の治療への適用についても、検討している。

本発明は、さらに、尿中−および血清ＡＧＥペプチド類の測定に対して、および その後の診断および治療適用に対しても拡張できる。尿中ＡＧＥペプチドレベル は組ＩＩＡＧＥｓの回転を示唆しており、したがって、糖尿病および糖尿病合併 症の評価、特に短期およびたとえば約６０−９０日までの長期の両者における血 中グルコースレベルのコントロールの評価においても有用である。血清ＡＧＥ・ 。

ブチド煩は、腎疾患を予測し、さらに、測定して糸球体ろ過半（ＧＦＲ）を決定 できる。したがって、腎を含む糖尿病合併症をモニターでき、エッセイＡＧＥペ プチド類を用いて腎および体内の他の部位におけるＡＧＥｓレベルに及ぼす被験 化合物類の効果を評価できる。血清ペプチド類は長寿命のタンパク質類がら由来 しているので、血清ペプチドＡＧＥｓは、また、薬物類のＡＧＥ−誘発または形 成効果を検出するためにかっＡＧＥ阻害剤類の治療効果を評価する際に有用であ る。

したがって、本発明は、また、Ｈｂ−ＡＧＥ、血清ＡＧＥペプチドおよび尿中Ａ ＧＨの測定に関し、かつ、Ｉ！濃度またはＡＧＥｉ１１度のいずれかに関連して いる状態の長期および短期の両者のモニタリングのための関連方法に関する。本 発明は、また、哺乳類および特にヒト血清アルブミンＡＧＥｓ　（ＡＧＥ−Ｈ３ ＡＩ、ならびに腐敗評価のための食品、および、治療剤としての用途を意図して いる組換え調製物を含むタンパク質類の測定を含む。この最後に述べた関連から 、本発明は、上記タンパク質調製物の純度をモニタリングするための方法におい て本ＡＧＥ抗体順の使用、およびそこからグリコジル化タンパク質類を除去する 前記調製物の精製のための関連方法を含む。このような方法は、臨床的に宿主に 有害なように活性であることが公知のグリコジル化蛋白質類の望ましくない投与 を制限するであろう。

Ｈｂ−ＡＧＥがマーカーである疾患の存在または活性を評価する方法は、哺乳類 から血液または池の血清試料を入手すること、前記試料中におけるＨ　ｂ−Ａ　 （ｉＥの存在または量を決定すること、およびこの量を標準と比較することから なる。

Ｈｂ−ＡＧＥ測定値は、ＡＯＥｓによる長期組織修飾の適切な指標を提供し。

種々の糖尿病性および年齢関連合併症に対する進行グリコジル化の寄与を評１１ １ｉ　する際に有用である。ヘモグロビンＡｌｅ　（ＨｂＡｌｃｌは、ヘモグロ ビンβ鎖１４におけるグリケーション（ｇｌｙｃａｔ　１ｏｎｌの程度を予測す るとして報告されてはいるが、Ｈｂ　Ａ　１　ｃは、進行グリコジル化経路にお ける中間体にすぎず、数多くのその他の中間体が存在すると考えられている。さ らに、ＨｂＡｌｃは、病理を予測しない。したがって、Ｈｂ−ＡＧＥレベルは、 疾患、薬剤有効性等のよりすぐれた指標であると考えられている。Ｈｂ−ＡＧＥ ｓは本発明で使用さ１Ｌ、疾患の進行と約３−４週より長い長期の血中糖レベル のコントロールとより容易に相関する。アミノグアニジン療法の結果としてのＨ ｂ−ＡＧＥレベルの低下は。

ヒト対象における進行グリコジル化の薬理的阻害の成功を見いだした最初の例で ある。

結果として、本発明の第１の目的は、インビボ形成ＡＧＥｓを認識し結合する抗 体類を含有する抗血清、およびこれまで作製されたことのない抗ＡＧＥ抗体類を 前記抗血清に含有させる方法を提供することである。

本文で記載した本発明のもうひとつの目的は、上述の抗血清を用いて免疫化１゛ アツセイプロトコールを、進行グリコジル化によって改変されたタンパク質類に 対して提供することである。ＡＧＥ免疫原は、化学的還元および加水分解操作を 使用せずにインビトロで調製され、抗血清は、インビボでこれらのＡＧＥｓを用 いて作製された。

本発明のもうひとつの目的は、ＡＧＥｓによる免疫原性チャレンジに応答して作 製したポリクローナル抗体類ならびに全てがインビボＡＧＥ抗原決定基に特異的 であるモノクローナル抗体類を使用するイムノアッセイプロトコールを提供する ことである。

さらに、もうひとつの本発明の目的は、作製されかつ特性解析された抗ＡＧＥ抗 体類の利点を用いて、種々の生物試料中において、進行グリコジル化最終産物を 測定する迅速かつ信頼性ある方法を提供することである。

さらに、本発明のひとつの目的は、内部標準としてＨｂ−ＡＧＥ、血清ＡＧＥペ プチド類および尿中ＡＧＥペプチド類から選択された１物質を含むＡＧＥｓを測 定するために適した試薬類を含有するキット類を提供することであり、広範囲の 別の免疫プロトコールに適している。

本発明のさらにもうひとつの目的は、Ｈｂ−ＡＧＥ、血清ＡＧＥペプチド順およ び尿中ＡＧＥペプチド類のようなＡＧＥｓを測定することによって、糖尿病を含 む血糖縫状態を、長期にモニタリングする迅速かつ信頼性のある方法を提供する ことである。

これらおよびその他の目的は、下記の図面と関連させた詳細な説明を検討すれば 、当業者に明らかであろう。

Ｉｕ曵鼠星皇塁朋 第１図は、抗ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ抗血清の抗血清希釈曲線である。抗血清は、− 下記の吸収抗原類を用いて、非競合ＥＬＩＳＡで力価を検定した：ＲＮＡ５ｅ１ ０）、グルコース由来ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ　（＊）、ＢＳＡ　（Δ）、グルコー ス由来ＡＧＥ−ＢＳＡ　（Ａ）、およびＧ６Ｐ由来ＡＧＥ−ＢＳＡ　（ｊ）　で ある。

第２図は、抗ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ抗血清のＥＬＩＳＡ競合曲線である。アッセイ は、材料および方法に震己載のように実施し、吸収抗原としてグルコース由来Ａ ＧＥ−ＢＳＡを用いた。全ての点は、三重測定の平均を示している。

（Ｊｌ：＄１々の改変アルブミンとの反応ニゲルコース由来ＡＧＥ−ＢＳＡ　（ ＊）、Ｇ６Ｐ由来ＡＧＥ−ＢＳＡ　（Ａｌ、フラクトース由来ＡＧＥ−ＢＳＡ　 （１、ＦＦｌ−Ｂ５ＡｌΔ）、ホルミル化−ＢＳＡ　（”；７）、−７レイルー ＢＳＡ（◇）、およびＢＳＡ　（○）。

（東夾［）ＡＧＥ修飾および非修飾タンパク質類との反応。０６Ｐ由来ＡＧＥ− ＢＳＡ　（ネ）、グルコース由来ＡＧＥ−ＬＤＬ　（ム）、グルコース由来ＡＧ Ｅ−コラーゲン■型（◆）、グルコース由来ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ　（■ｌ　、　 ＢＳＡ　（０１。

ＬＤＬ　（△）、アセチル−ＬＤＬ　（）、コラーゲン■型（◇）、ＲＮＡ５ｅ （ロ）。ＬＤＬ　ｎｍｏｌｅｓは、アポタンパク質Ｂの分子量を基準として計算 した。

（ＩＪｌモデルＡＧＥｓとの反応。グルコース由来ＡＧＥ−リシン（１，Ｇ６Ｐ 由来ＡＧＥ−リシン（◆）、ＦＦＩ−ＨＡ　ｔｏ）、ビラリン（ム）、Ａ　）’ 　Ｇ　Ｐ（マ）、カルボキシメチルリシン（園）、ペントシジン（ロ）、デオキ シプロピルアミノフラクトース（△）、およびデオキシモルホリノフラクトース （）。

ＡＧＥ−リシン産物類は、等量ｎｍｏｌｅｓのりシンとして添加した。

第３図は、ＡＧＥ関連蛍光と抗体反応性物質の形成の動態関係である。ＢＳＡ（ ５０ｍｇ／ｍｌ）は、材料および方法で述べたように、グルコース（０，５Ｍ＋ とインキュベーションした。アリコツトを示した時間に採取し、非結合物質を除 去するために透析し、ＥＬＩＳＡによって蛍光（λ励起＝３７０ｎｍ、＾放出： ４４０ｎｍ）およびＡＧＥ含量をアッセイした。

第４図は、アミノグアニジンによる抗体−反応性ＡＧＥｓの形成の阻害である。

ＢＳＡ　Ｃ１００ｍｇ／ｍｌ）をグルコース（１００ｍＭ＋と３７°Ｃで２１日 間インキュベーションした［０）。ＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌｌをグルコース（ １００ｍＭ）と、１００ｍＭアミノグアニジン存在下において３７’Ｃで２１日 間インキュベーションした（ネ）。緩衝液条件は、材料および方法に記載したと おりであった。

第５図は、実験ラットにおけるＡＧＥ−コラーゲンの測定である。Ｌｅｗｉｓ材 料および方法に記載のようにして、アロキサンまたはストレブトゾシンを用いて ラットにおいて糖尿病を誘発した。動物６匹を６週間隔で層殺し、大動脈コラー ゲンをＥＬＩＳＡによって分析し、ヒロドキシプロリン、蛍光、およびＡＧＥ含 量をめた。値は、ヒドロキシプロリン１ｍｇ当たりで示しである。二図：λ励起 ＝３７０ｎｍおよび＾放出＝４４０ｎｍ″Ｑ！定した相対蛍光】。下Ｊ　：　Ｅ 　ＬＩＳＡで測定したコラーゲン結合ＡＧＥｓｅ対照ラット（○）、アロキサン 誘発糖尿病ラット（ム）、およびストレプトゾシン誘発糖尿病ラット（マ）。示 した各値は、実験ラット６匹の平均である。

第６図は、ヒト血清ＡＧＥレベルの測定値である。ＮＬ：正常者（ｎ＝１２）。

ＤＭ：ＩＩ尿尿意患者ｎ＝２１）、ＤＭ＋ＨＤ＝血液透析を受けている糖尿病患 者（ｎ＝１６１．誤差直線は、Ｓ、Ｅ、　Ｍ、を示している。ＤＭ対ＮＬにツい てＰ＜０．００１゜ＤＭ＋ＨＤ対ＤＭについて、ｐｒｏ、００１゜第７図は、正 常および糖尿病患者の赤血球細胞中のＨｂ　−ＡＧ　ＥおよびＨｂ　Ａ１ｃレベ ルを比較したグラフであり、それによって、前記２者（正常患者＝１）（糖尿病 患者２口）の相関を示している。

第８図は、正常および糖尿病患者におけるＨｂ−ＡＧＥおよびＨｂＡｌ（−レベ ルの平均を示し比較した２種の直線グラフからなる。

第９図は、糖尿病患者２３例（ＤＭ）および非糖尿病の正常血糖値対象（Ｎｂ２ Ｏ例において測定したＨｂ−ＡＧＥレベルのＥＬＩＳＡ結果を示したグラフであ る。ＮＬ：４．３±０．３　ＡＧＥ単位／ｍｇ　Ｈｂ、ＤＭニア、７±０．　６ ＡＧＥ単位／ｍｇＨｂ（平均±Ｓ、Ｅ、）ｅ各値は、測定値がＥＬＩＳＡ標準曲 線の直線範囲内に確実に入るように３−４倍のヘモグロビン希釈でアッセイし。

た三重測定値の平均を示している。ＡＧＥ単位は、記載のように合成しＡＧＥ含 量を分析したＡＧＥ−アルブミン標準に対して計算しである。

第１０図は、正常血糖値９例（０）および糖尿病患者（６１２３例についてのＨ ｂ−ＡＧＥおよびＨｂＡｌｃのレベル間の相関をグラフで示している。ＨｂＡｌ ｃは、ＨＰＬＣによって測定した。

第１１図は、インビトロにおけるＨｂ−ＡＧＥ形成のグラフである。ヒトへヒグ ロビン（５０ｕ＋ｇ／ｍｌｌ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、ｌは、 ０ｍＭグルコース＋０１．５ｍＭグルコース（・）、２０ｍＭグルコース（ム） 、または２０ｍＭグルコースおよび５０ｍＭアミノグアニジン含有０．４ＭＮａ Ｐ　Ｏ４緩衝液（ｐＨ７，４１中において、３７″′Ｃでインキュベーションし た。ヘモグロビンおよび２０ｍＭグルコースを含有するアリコツトを、ＥＬＩＳ Ａｆ１の前に、２００倍モル量過剰のナトリウムボロヒドリドで還元した。アミ ノグアニジン（５０ｍＭｌは、また、５ｍＭグルコース条件においてもＨｂ　− Ａ　ａ　Ｅ　＋＋ｓ成を阻害した（〉９５％）（データを示さず）。アミノグア ニジン（５０ｍＭｌは、ＥＬＩＳＡ分析１時分析１グルコース／ヘモグロビンイ ンキュベーション物中に添加しても、Ｈｂ−ＡＧＥの検出を阻害しなかった（デ ータを示さず）。、１ンキユベーシヨンは、全て、５ｌＩｌろ過後に行った。試 料１ｍｌを舟示した時間に取り、ＥＬＩＳＡ分析前にリン酸緩衝生理食塩水に対 して透析した。

第１２図は、アミノグアニジン療法前（−）および２８日間後（）における糖尿 病患者１８例中におけるＨｂ−ＡＧＥおよびＨｂＡ１ｓレベルをめたものである 。Ｈｂ−ＡＧＥ：　１３．８±０．　８　Ｕ　ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ−＞１０゜０ ±０．９　υ　ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ；１０．１％±０．８％−＞９．２％±０゜ ８％（平均上Ｓ、Ｅ、　）。

楚吋０耗叔ｌ飢朋 多数の略語を本文で用い、使用した用語を開路化し、本発明がよく理解されるよ うにした。下記の略語は、代表的である。

本文で使用したように、用語”ＡＧＥ”およびＡＧＥｓ”は、中間体の形態であ りかつ還元性糖類のタンパク質アミノ基類との反応によってインビボおよびイン ビトロで産生される安定化合物類である進行グリコジル化最終産物類を称呼るた めに適当であるとして使用されている。したがって、ＡＧＥｓは、加齢において 見られるタンパク質の構造的および機能的変化で示唆されている中間体ならびに 安定最終産物を包含する。たとえば、ＡＧＥｓは、遊離ポリペプチドアミ５′基 類と反応し、タンパク質架横をもたらすと認識されている。さらに、このような ＡＧＥＳは、たとえば、糖尿病のようなある疾患において循環および組織中にお いてレベルが上昇していることが観察されている。

名称”ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ”、”　ＡＧＥ−Ｈｂ”、”　ＡＧＥ−ＢＳＡ”、′ ＡＯＥ−Ｈ３Ａ”、”ＡＧＥ−アルブミン”、”ＡＣＥ−コラーゲン”および” ＡＧＥ−ＬＤＬ”を使用する原には、それぞれは、基質ＩＪＩＲＮＡｓｅ、Ｈｂ 、ＢＳＡ、ＢＳＡ、アルブミン、コラーゲンおよびＬＤＬがそれぞれ１１以上の 還元性糖類と化学反応して形成される進行グリコジル化最終産物を意味する。し たがって、ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅは、ウシリボヌクレアーゼと還元性ｔｌｌ［どの 反応の進行グリコジル化最終産物を意味している。

アルブミンは、総称的に記載された際には、たとえば、ヒト、ウシ等のようなそ れが得られたあらゆる種類を称する。

ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンを称する。

ＢＳＡは、ヒト血清アルブミンを称する。

ＲＮＡ５ｅは、一般にリボヌクレアーゼを称し、適切な場合には、特に、ウシ膵 リボヌクレアーゼを称する。

コラーゲンは従来の意味で、全ての種類のコラーゲンを称するために使用され、 および全ての適切な起源に由来する。

ＬＤＬは、また、従来の意味で、低密度リポタンパク質を称するために用いられ る。

ＦＦＩ−ＢＳＡは、２−（２−フロイル）　−４＋５１−　（２−フラニル）− １Ｈ−イミダゾール　ヘキサノン酸をウシ血清アルブミンとインキュベージ：Ｉ ンしかつｍｉ己の反応性化合物類をジシクロへキシルカルボジイミドと結合させ ることによって産生されたモデルＡＧＥ−タンパク質を称する。ホルムアルデヒ ド−Ｉ３ＳＡ、マレイル−ＢＳＡおよびアセチル−ＬＤＬは全て、上記のように して産生された修飾タンパク質類を称している。

本発明は、あるインビボ産生ＡＧＥｓ、および、特に、Ｈｂ−ＡＧＥ、血清ｌ＼ ＧＥペプチド類および尿中ＡＧＥタンパク質類の測定に関し、さらに、こうした 測定を用いる診断および治療上の適用に関する。マーカーとしてのＨｂ−Ａ　Ｇ 　Ｅの使用によって、血糖値の長期測定およびその結果としての糖尿病に存在す るような血糖縫状態をモニタリングする能力が補助される。本文で示したデータ から明らかであるように、Ｈｂ−ＡＧＥは公知の決定因子ＨＢＡ１ｃと対照的に 、インビポグリケーション阻害剤であるアミノグアニジンの投与に応答して減少 し、従って、臨床的に正確な最近の血糖値の時間積分パラメーターメーターを示 しており１診断およびｒＩｊ療の両者の目的のための用途という付加された大き さを有している。

特に、本発明は、その一部を形成しかつ同様に特許出願番号０７／８１１，５７ ９で総括的に示された抗ＡＧＥ抗体顛によって作製された競合的ＥＬＩＳＡを利 用しており、迅速でしかも有効な診断方法からなる。第９図に示したように、Ｈ ｂ−ＡＧＥは、安定かつ信親性のあるグルコース由来回転位アマトリ生成物を示 しており、その周辺で診断手技を開発しかつ実施できる。したがって、本発明は 、インビボ血糖状態の長期モニタリングのためおよび実施できる全てのコントロ ール措置の有効性を同時に評価するための方法にも拡張される。

本発明は、また、その他のＡＧＥｓおよび特に血清および尿中ＡＧＥベブチ１順 の測定にも拡張される。血清および尿中ＡＧＥペプチド類は、Ｈｂ−ＡＧＥと同 様、ＡＧＥ集積の厘環マーカーを示しており、こうした集積が特徴的である病理 およびその他の欠陥の発症と程度を反映している。したがって、たとえば、動脈 硬化、白内障および糖尿病性ネフロパチーのようなＡＧＥｓの上昇レベルが観察 される年齢関連および糖尿病状態は、これらのＡＧＥｓを測定することによ−） て、特に本文に開示した診断方法に依存することによって、長期にわたりモニタ リングできかつ評価できる。

同様に、マーカー類または決定因子類としてのＨｂ−ＡＧＥまたは上述のＡＧＥ ペプチド類を含む方法類は、これらのＡＧＥｓと相互作用できる薬物類またはそ の他の手段の識別のため、薬物発見アッセイとして使用できる。Ｈｂ−ＡＧＥの 場合、血糖濃度またはＨｂ−ＡＧＥそれ自体の形成のいずれかをコントロールで きる物質類を発見することが可能である。このような場合におけるアッセイまた は検査キットは、本文で後に述べたこのようなキット類について記載した試Ｊｋ 類を、リガンドまたは結合対としてのＨｂ−ＡＧＥとともに含有するであろう。

類似のアッセイまたはキットは、Ｈｂ　−Ａ　Ｇ　Ｅと同様の能力で役に立つ上 述のΔＧＥペプチド類によって調製できる・ インビボにおけるＡＧＥ形成の研究は、特殊なアッセイ方法がないことによ−り ておよびインビボ分析が組織ＡＧＥｓについてできなかったことによって、障害 されてきた。ＨＢＡｌｃのようなアマトリ生成物がＡＧＥ前駆体であるというこ とが［！ｌされ、ヘモグロビンも、また、最近開発されたＥＬＩＳＡｆｆｌによ って測定できるＡＧＥ修飾を受けるかも知れないと考又られるようになった。

Ｈｂ−ＡＧＥは、循環しているヒトヘモグロビンの約０．４２％を占めると決定 されている。この分画は、糖尿病誘発過血糖症の患者において、約０−　７５　 ′Ａ；に増加する。インビボにおけるＡＧＥ形成の阻害剤であるアミノグアニジ ンで２８日間治療を受けていた糖尿病患者は治療期間の終了時点で、Ｈｂ−ＡＧ Ｅしｌ−ルが有意に低下していることに、注目されたい。

進行グリコジル化が原因で生じた組織および末端臓器傷害は、何カ月から何年の 期間にわたり集積する。糖尿病合併症は、同様の期間にわたり、進行する。

上記にも述べたように、特に好適な本発明の面は、糖尿病患者における血糖のコ ントロール程度の指標としてのＨｂ−ＡＧＥの使用である。正常Ｈｂ−ＡＧＥレ ベルおよびＨｂ−ＡＧＥが形成される反応時間を考慮すれば、血中に存在するＨ ｂ−ＡＧＥレベルは、Ｈｂ−ＡＧＥレベルが正常値以上である疾患と病因を予測 できる。

同様に、血清ペプチドＡＧＥｓは、糸球体ろ過半（ＧＦＲ）および％ｆ傷害を反 映する指揮として使用できる。尿中’ＡＧＥペプチド類は、組織タンパク質類中 、さらに詳細には組織−ＡＧＥタンパク質類における回転を測定するための指標 として使用できる。

Ｈｂ−ＡＧＥおよび血清ＡＧＥペプチドアッセイの両者において、血液試料を、 採取し分離操作を用いることができる。細胞性の血液成分類は血清から分離し、 Ｈｂ−ＡＧＥアッセイにおいて、そのヘモグロビンは赤血球細胞から抽出できる 。

ＡＧＥ−ペプチド類の血清レベルおよびＨｂ−ＡＧＥの存在または存在すればト １ｂ−ＡＧＥの程度を、その復評価できる。

単一血液試料で両検査を実施することによフて、血糖レベルがコントロール不可 となった時間わくを、たとえば、Ｈｂ　−Ａ　Ｇ　Ｈによって予測可能な６０日 という範囲のように広く推定でき、Ｈｂ−Ａｌｅによって予測可能な３−４週の 時間枠の前、その間またはその後の期間に拡張される。もし所望であれば、Ｈｂ −５〜ＧＥおよび血清ＡＧＥペプチド類の分析は、また、血中または尿中グルコ ースレベルの測定、グルコース耐性試験、およびその他の尿中ＡＧＥペプチド類 の測定を含む！尿意コンｊロールの評価に有用なその他のＥ験とともに実施でき 、完璧な患者プロフィールが得られる。

本発明のもうひとつの面は、尿中で検出可能な進行グリコジル化最終産物に関す る。ペプチド類を含めてタンパク質類は、正常者では低レベルで尿中に排泄され 、かつ、疾患のある者では、おそらく高レベルで排泄される。組織ＡＧＥｓの代 謝を反映する尿中ＡＧＥペプチド類の存在および／またはレベルを測定でき、特 定の疾患または状態に相関しておりかつ予測可能である。たとえば、正常尿中に 見られるペプチド類の量は、通常、約２５乃至５０ｍｇ／日であり、主要血液タ ンパク質類であるアルブミンおよびグロブリンとは極めて異なる性質を有するミ クロタンパク質類かも構成されている。

尿中におけるタンパク質類の存在は、宿主または患者が感染によってのように侵 襲を受けている際に存在するような正味の異化状態を反映する多数の疾患または 状態の兆候であるのかも知れない。このような状況において、宿主は、同化エネ ルギー保存活性および細胞性修復活性を停止させ、代わりに、エネルギー保存の 異化的枯渇と、白血球および刺激と闘いかつそれを中和するその他の因子間を促 進するサイトカイン類のような多数の因子を分泌することによって、侵襲性の刺 激に対して稼働する。この活性の結果、組織タンパク質レベルおよび組１ｉ−Ａ ＧＥｓの対応するレベルが対応して上昇するので、尿中ＡＧＥペプチド類の測定 によって、さらに、悪液質およびショックのような宿主中において起こり得る侵 襲性活性のもうひとつの指標を提供する。したがって、尿中ＡＧＥペプチド類の 存在またはレベルを測定し、このレベルを標準と相関させることができる。正常 者では、正常レベルは、ゼロであるかまたはゼロに近似している。ｍ尿意患者ま たは感染その他の創傷を経験している患者では、ＡＧＥペプチド類の正常レベル は、有意に高くなる。したがって、腎合併症の発生前に、糖尿病の進行または悪 化、または感染の存在を、ＡＧＥペプチドの尿中レベル上昇を検出することによ って、検出できた。

同様に、正常よりも速くタンパク質類をグリコジル化する者を検出することがで きる。この例では、たと又は、体タンパク１！ｌ類によってＡＧＥＩｆ二成また は放出を誘発する化合物であるグルコースによる特異的チャレンジの結果として 尿中へ〇Ｅペプチド類のレベル、または、尿中ペプチドＡ（３Ｅレベルがたとえ ばアミノグアニジンのようなＡＧＥ阻害化合物の投与中止後に増加する速度を測 定できる。

したがって、十分な臨床面が明らかとなるであろう。

本発明は、また、上記ＡＧＥペプチド類の血清中存在またはレベルを検出するこ とに関する。これでは、ＡＧＥ集積と細胞外および細胞性血液タンパク質類、タ ンパク質断片類および循環系に見られるペプチド類（短鎖のアミノ１１１類であ り、たとえば、長さがアミノ酸約５０（Ｉまでである）との反応の程度を考慮す ることができる。これらを評価して、ＡＧＥｓの存在または請求めた進行グリケ ーションの程度がわかり、たとえば、正常ペプチドグリケーションレベルのよう な標準と比較できる。たとえば、もし血液中でＡＧＥタンパク貢レベルが上昇し ・ていることを検出すると、これを患者が保持している腎障害の程度と相関させ ることができる。

アマトリ生成物は、ゆっくりと可逆化でき、３−４週間の期間で平衡に達すると 考えられている。ＡＧＥｓは、対照的に、タンパク質類に不可逆的に付着したま まであり、前記タンパク質の寿命において集積を続ける。進行グリコジル化の長 期インビボマーカーとしてのＨｂ　−Ａ　Ｇ　Ｅ測定値の用途が、それによって 、認識できる。

先にも述べたように、本発明は、また、インビボ形成進行グリコジル化最終産物 を認識しかつそれに結合する抗血清および対応する抗体類を識別することからな る。本文で後で述べる実施例にも明らかにしたように、ポリクローナルＡＧト、 −リボヌクレアーゼ抗血清が調製されかつ競合的ＥＬＩＳＡ系で使用され、イビ トロおよびインビボ由来産物類に対するこの抗血清の特異性を調べるために用い た。生成した抗血清は異常上昇レベルのＡＧＥｓを含有することが公知の糖尿病 組織および血清中においてインビボＡＧＥｓを認識しかつ結合し、それらの間に 共通の抗原決定基が存在するという結論に到達した。対照的に、前記モデル合成 されかつ試験した合成ＡＧＥｓのそれぞれは前記のポリクローナル抗血清と１・ り応しなかったが、その他のインビトロ形成ＡＧＥｓは反応性である。

前記還元性糖類によるインキュベーション型反応のために適したタンパク質類お よびタンパク質含有物質順の例として、たとえば、ＲＮＡ５ｅ、ヘモグＵビン、 コラーゲン、ＢＳＡおよびＨ３Ａが挙げられ、そのそれぞれが、たとえば、グル コース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ″）、フラクトースまたはリボースと インキュベーションでき、抗ＡＧＥｔＸ体類形成を誘発するために通したへ〇Ｅ 免疫原を産生ずる。

このような抗ＡＧＥ抗体類は、また、患者治療に使用でき、たとえば、膵、１１ １゜腎または脳のようなある組織中における異常上昇レベルで存在することがあ る循ｆｆ１ＡＧ　ＥまたはＡＧＥ３のレベルを低下させる。

さらに、インビボにおいてＡＧＥ上昇レベルを治療するために有用な薬物類また は化合物類の設計、スクリーニングおよび／または賦活化のために、Ｉｆ記抗Ａ ＧＥａ体顛を利用することも、本文に記載した発明の範囲内である。この観点か らして、前記抗ＡＧＥ抗体類を用いて、治療薬剤としての用途のために特に地汚 したかまたは作製したタンパク質類を精製することができる。先にも述べたよう に、このようなタンパク質類の治療上の用途は、その卓越性および重要性が増大 しており、その他の宿主細胞と同様、上記タンパク質類はグリケーションを受け かつＡＧＥｓを形成する。上記ＡＧＥｓは臨床的に活性であるので、治療中は宿 主への導入を制限することが望ましい。結果として、本発明は、これらのタンハ クｍｕのパッチを、たとえば、適当な基質に固定化したある量の抗ＡＧＥ抗体類 と接触させることによってそれらを精製する方法を包含している。このように１ ゜て、前記グリコジル化タンパク質類は、従来の操作によフて、前記パッチの残 りから分離できる。前記基質は、商業的プロセスの場合には、定期的に新しくず 乙かまたは交換でき、その結果、基質を通過したタンパク質物質の連続的循環お よびその後の前記タンパク質ＡＧＥ成分の分離が実施できる。先の構成が例示の ためのみ示したものであることは当然であり、当業者の能力の範囲内でかつ本発 明の範囲内で設計および実施がさまざまに変化できることも当然である。

本発明は、また、前記の抗ＡＧＥ抗体顛を利用して、上記進行グリコジル化最終 産物煩の存在、量、位置および効果をアッセイすることによって、植物類おＪび 動物類の両者におけるタンパク貢老化を測定する方法を包含している。へ〇トＳ 含有が疑われる産物試料を抗ＡＧＥ抗体類と反応させることによって、植物性お よび動物飼料について、食品腐敗とそのような影響を受けているタンパ′）ｗヂ ［物質類の変性を査定し、評価できる。進行グリコジル化を受ける血液、血５Ｊ Ｊ３．Ｊび尿を含む体液、組織試料、およびＤＮＡのような生体分子類を含む動 物のアッセイは、病理またはその他の全身性機能低下の検出を補助する。

さらに、このようなアッセイを用いて、培養されたか、摘出されたかまたはそう でなけれ組換え法で治療上の用途のために調製されたタンパク質類の変性の程度 を評価でき、このような物質類がグリコジル化されたかどうかおよび／またはそ の程度を知ることができる。このアッセイを単独でまたは精製操作と併用して使 用し、前記のタンパク質物質が先に定めたしきい値レベルのグリコジル１しを行 ったことが決定されると、上記に述べたような精製法をパッチ毎にまたは連続基 準で実施する必Ｗ性が指示される。

本発明のアッセイ法は、標識されていようがまたはｍｉｉされていなかろうが本 文に述べた前δ己の抗ＡＧＥ抗体類、前記分析物、および／またはリガンド、前 記抗体に対する１種以上の結合対、およびそれに対する適用可能な結合対を用い て、いくつかのアッセイプロトコールを実施することからなる。

用語”結合対”は、互いに認識するかおよび／または結合するアッセイで使用さ れる要素類を称するために一般的意味で使用される。したがって、ｉｌｍの抗へ ＧＥ抗体および前記抗体によって認識されるＡＧＥｓは、結合対として考えられ る。

用語”結合対”は、また、ＡＧＥ結合対に結合するＡＧＥ誘導誘導体上うな本発 明で有用なリガンドを包含している。これらのリガンド類は、単独かつ直接に、 またはアビジンまたはビオチンのような２次横田対と併用して、検出できる。合 成ＡＧＥの適切な誘導体間は、グルコース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐｌ 、フラクトースまたはリボースのような還元性糖類、およびペプチド類、タンパ ン質類およびＢＳＡ、アビジン、ビオチン誘導体間のようなその他の生化学物質 類１、およびアルカリホスファターゼ類のような酵素類の反応生成物から選択さ れる。

本発明で有用であるのは、酵素類および進行グリコジル化を受けたその他の担体 類である。これらのＡＧＥＮ素類は索類発明のアッセイにおいて、好適な＊縄す ガンド頑として役に立つ。その他の適切なリガンド類には、進行グリコジル化を 受けることができる担体類との前記還元性糖類との反応生成物が挙げられる。

適切な担体類は、炭水化物類、タンパク質類、合成ポリペプチド傾、脂質類、生 体適合性の天然および合成樹ＩＩｌ類、およびその混合物順から選択された物質 からなる。

本発明のアッセイは、前記リガンドまたは前記結合対のいずれかが基質に結合す る様式に従っている。同様に、前記アッセイには、放射性元素類、＃３ＩｌＩＪ ！および蛍光を発する化学物質類から選択できる標識体の使用が含まれる。

本方法は、広範囲のＮＩｓ系状態の検出および評価のための手段が提供された、 −一において、特に治療との関連を有している。メイラード（Ｍａｉ　ｌ　１ａ ｒｄｌプロセスは、体内の重要なタンパク質物質のいくつかに急激に影響を及ぼ し、それらの中には、コラーゲン、エラスチン、ガラス体タンパク質類、およ腎 糸球体基底膜がある。これらのタンパク質類は、年齢とともに（したがって、用 ！ｌｊ’タシバク質老化”が適用される）および上昇血糖値に長期に曝されたこ とおよびＡＧＥ形成の結果としての両者によって劣化し、後者は、次に、病理に よることが頻繁である。

このようにして、体内において進行グリコジル化最終産物の位置と相対的濃度が 確認できる。さらに、異なる臓器試料をアッセイすることによって、Ａ　（ｉ　 Ｅ　”患者プロフィール”が得られ、すなわち、患者におけるＡＧＥｓの位置と 相対的濃度が確認できる。本方法は、特に、アテローム性プラーク中におけるよ うな進行グリコジル化最終産物の異常濃度識別に有用である。このようにして、 将来の全身性機能不良の位置を識別できる。

したがって、本アッセイ方法は、概して、Ａ、前記進行グリコジル化最終産物を 含有する疑いのある少なくとも１ｍの試料を調製すること、 Ｂ、前記試料順に対して作製した少なくとも１ｆｌの抗ＡＧＥ抗体を調製し、前 記抗ＡＧＥ抗体は、インビボ産生進行グリコジル化最終産物と反応性で下記の特 徴を有している： ｉ、それは、前記インビボ形成進行グリコジル化最軒産物に共通の免疫抗原決定 基と反応性である； ｉｉ、それは、インビトロで形成された進行グリコジル化最終産物と交差反応性 である； ｉ　ｉ　ｉ、　それは、しかし、形成された下記の進行グリコジル化最終産物と 交差反応性でない＋　ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、 およびヘントシジン； Ｃ９前記試料、前記抗ＡＧＥ抗体に対するリガンド、および前記抗ＡＧＥ抗体か らなる詳から選択された物質に検出可能な標識体を配置すること；Ｄ９段階Ｃか らの前記標識物質を、標識されていない段ＮＣからの物質からなる群から選択さ れた物質と接触するように配置すること；およびＥ０段階りの結果として生成し た試料について、前記標識物質の結合程度を評語すること、 からなる。

評価可能な適切な分析物質類は、たとえば、植物質、食べられる動物質、血液、 血漿、尿、＃Ｉ髄液、リンパ液、および組織、およびタンパク質アルブミンのよ うな担体タンパク質類にそれぞれ結合しているある合成化合物類から選択できる 。

また、前記分析物質は、たとえば、還元性糖とのタンパク質または別の高分子の 反応によってＩＩＩ製された合成的に誘導した進行グリコジル化最終産物からな る。

この反応生成物は、単独または担体と併用して使用できる。

前記担体は、炭水化物類、タンパク質類、合成ポリペプチド類、核酸類、脂質類 、生体適合性の天然および合成ＩＭ脂類、抗原類およびその混合物類からなる群 から選択できる。

本文に記載した抗ＡＧＥ抗体類は、植物質、食べられる動物質等における夕。

バク質類の進行グリコジル化の変性効果を診断するため、および、進行グリコジ ル化最終産物の蓄積の悪影響を検出するための両者のために、使用できる。動脈 、皮膚のしわ、動脈塞栓、および糖尿病、網膜および腎障害の年齢または糖尿病 関連硬化のような状態は、全て、進行グリコジル化最軒産物類の量の増加として 起こる過剰蓄積またはトラッピングの結果として生じる。したがって、本発明の 齢断方法は、上記ＡＧＥｓＯ皿と位置をモニタリングすることによって、体内に Ｔける進行グリコジル化最終産物類の蓄積が少なくとも一部には原因である病理 を回避することを目的としている。

本発明を用いて、刺激された、自然発症または特発性の病理状態の哺乳類中（− おける存在を、進行グリコジル化最経産物類の対応しての存在を測定することに よって、評価および／または検出できる。さらに詳細には、ＡＧＥｓの存在また は量は、存在する抗ＡＧＥ抗体類または少なくともそれらの結合対のｉｌｌの適 切な標識された量を上述のようにして用いることによって、本文に記載したもの のようなアッセイ法によって直接、追跡できる。これとは別に、存在する抗へＧ ト。

抗体間と反応性の抗１決定基順を規定するＡＯＥｓは合成でき、結合対（または 、このような結合対に対する拮抗剤類）を作製するために使用でき、それらは、 次に、標識しその中のＡＧＥｓの存在と量を検査する媒質中に導入でき、それに Ｊつで、媒質を取りだした宿主の状態を評価できる。

したがって、ＡＧＥレセプター類およびそれに対した調製した全ての結合対類は 両者とも、ラジオイムノアッセイのようなイムノアッセイを含む種々のお断Ｉｊ 法と併用して、たとえば、標識されていないかまたは標識されている場合、放射 性付加、ナトリウムボロヒドリド、または放射性ヨウ素化のいずれかによって揮 縄されているＡＧＥに対するレセプターまたはその他のりガントを用いて、調製 できる。

一般的アッセイ操作およびそれらの適用は全て当業者に公知であり、本文では例 示のためのみに３己載されており、本発明の範囲内で利用できる操作を制限する ものではない。

進行グリコジル化最終産物は１種以上の結合対と複合体を形成し、前記複合体の １員を、検出可能ｔｌ［ｆｆｌで標識できる。複合体が１個形成されたことおよ びもし。

所望であればその量を、たとえばＩｇＧ！！ｉおよび形成された複合体類との反 応のような適用可能な検出方法で決定できるという事実。

適切な放射性元素類は、３Ｈ１ｌ’ｃ、　”Ｐ、”−Ｃ１、”Ｃｒ、ＣＯ１”Ｃ ｏ、″Ｆｅ、”Ｙ、１２′工、１３Ｉ１．およびＩｆ′’Ｒｅからなる群から選 択できる。上記同位元素類の１種を用いて調製したもののように放射性標識を使 用する場合には、公知の現在使用可能な計測操作を利用できる。

前記ｔｌｆｌが酵素である場合、検出は、現在利用され当技術で公知の比色法、 化学発光・分光分析、蛍光分析、熱計測、電流計測または気体計測法のいずれか によってｉｔできる。前δ己酵素は、カルボジイミド類、ジイソシアナート類、 ゲルタールアルデヒド類等のような橋掛は分子との反応によって、進行グリコジ ル化最終産物類、それらの結合対または担体分子類に連結できる。また、かつ本 発明の特定の態様において、前記酵素類自体が、上述のようにして糖との反応に よって進行グリコジル化最終産物類に修飾できる。

これらの操作で使用できる多くの酵素類は、周知であり利用できる。検出に好適 なｅｍｕは、パーオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシＵ− ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ崎パオキ シダーゼ、ヘキソキナーゼ＋ＧＤＰａｓｅ、ＲＮＡ、ｓｅ、グルコースオキシダ ーゼ＋アルカリホスファターゼ、ＮＡＤオキシドレダクターゼ＋ルシフ上ラーゼ 、ホスホフルクトキナーゼ＋ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アス パラギン酸アミノトランスフェラーゼ＋ホスホエノールピルビン酸デカルボＡシ ラーゼ、およびアルカリホスファターゼである。米国特許３，６５４，０９（１ 号、３，８５０，７５２号、および４，０１６，０４３号は、異なる標識材料と 方法の開示のために例として引用している。

標識として利用できるいくつかの蛍光物質類が、同様に、公知である。これらに は、たとえば、フルオロセイン、ローダミン、およびオーラミンが挙げられる。

特に好適な検出材料には、ヤギで調製しかつイソチオシアナートによってフルＡ ロセインと連結された抗つサギ抗体順上の１種以上の蛍光ｔ＊ｒａｕが挙げられ る。

１種のアッセイ様式では、リガンドと分析物質を添加した蛍光抗体を中Ｉシ１と （。

ている。結果として生成した基質を次に洗浄し、その後、抗体に結合した分析物 質の量を測定して検出が進行する。第２の様式では、抗体および分析物質を添加 した結合リガンドを用いる。これらの様式の両者ともに、分析物質との競合反応 に基づいており、一方、第３の様式は、結合分析物質と抗体との直接結合反応か らなる。後者の２ｔｌの様式では、抗体結合程度を直接ｎＡｒ＠または樟謀した 結合対によって測定する。

本文に開示したプロトコールの全ては、進行グリコジル化最終産物の定性的およ び定量的測定、および進行グリコジル化最終産物の増加が関係している病因の診 断とサーベイランスに適用できる。糖尿病、および、動脈硬化および皮膚のしわ のような加齢に関連している状態のような条件は、非限定期な例を示しており。

したがって、これらの状況の給断およびモニタリングのための方法は１本発明の 範囲内に包含される。

本発明はまた、進行グリコジル化最終産物類の存在の程度の定性的および／また は定量的分析のためのアッセイおよび検査キット類を包含している。このような アッセイ系および検査キット類は、たとえば、本文に記載した放射性および／′ または酵素法のひとつによって１ｌｌｌた標識成分、１種の標識対を抗ＡＧＥ抗 体または本文に列挙した結合対に結合させること；および１種以上の付加的免疫 化学試薬類、そのひとつが遊離または固定化リガンドであり、前記ＪＰｒａ成分 、そσ１結合対、測定すべき成分の１１またはそれらの結合対（煩）どの結合が いずれ／〕・可能であるような試薬類からなることができる。本文に記載したキ ット類の成うＩ類のひとつは、典型的には、標識または非標識形態の抗ＡＧＥ抗 体である。

さらに本発明の態様において、市販の食品技術者によるある例における用途およ び医療専門家によるその他の例に適した検査用キット類は、進行グリコジル（し 最終産物類の存在または非存在をめるために調製できる。先にも述べたように、 このキット類は、組換えまたはその他のｎ製タンパク質類上の進行グリコジル化 ＪＩ＆！産物顛の存在を決定するために使用でき、さらに、特に治療用途を目的 としたものでは、それらの１次段階においてアッセイしかつ２次段階においてさ らにｎＩ製を補助する。

上記に述べた検査法によれば、このようなキット類のｌｌ１ｌｌは、少なくとも 、標！１ＡＧＥ、または上述のようなそれの結合対、および、たとえば、°°競 合性”、”サンドイッチ”、’ＤＡＳＰ”等のような選択した方法に応じて当然 指示書を含んでいる。前記キット類は、また、緩衝液、安定剤等のような末梢的 試薬類も含有している。

したがって、好適な検査キットは、ＡＧＥｓの存在、量または活性を明らかにす るために調製でき、 （ａ）本発明の抗ＡＧＥｔＡ体順またはそれに対する特定の結合対の検出可能標 識への直接または間接結合によって得られた少なくともＩＩの標識免疫化学活性 成分の既定量。

（ｂｌその他の試薬類、および （ｃｌ前記キットの指示書、 からなる。

さらに詳細には、好適な診断検査キットは、（ａ）上述の抗ＡＧＥ抗体への結合 対またはそのリガンドの既知量であり、通常固体表面に結合しイムノソルベント を形成しているか、または別に、適切なｔｌｌｌｆｌ物または複数のそのような 末端生成物等（またはそれらの結合対ｍｌに結合しでおり、それぞれのひとつ： ｔｂｌもし必要であれば、その他の試薬類；および（ｃｌ前記検査キット類の指 示書、 かうなる。

さらにバリエーションとして、前記好適な検査キットは、（ａｌ前記抗ＡＧＥ抗 体の結合対を検出可能標識に結合させることによって得られた５ｌｌ成分； （ｂｌ少なくとも１種の試薬がリガンドまたは固定化リガンドである１種以上の 付加的免疫化学試薬類であり、そのリガンドは、（１）前護己標識成分（ａ）と 結合可能なリガンド；ｆｉ　Ｌｌ前前記ｌＩＩｌ成分（ａｌの結合対と結合可能 なリガンド；（ｉ　ｉ　ｉｌ測定すべき成分（類）の少なくとも１種と結合可能 なリガンド。

（ｉｖ１ｉ１１定すべき成分＋ＩＪ）の少なくともＩＩの結合対の少なくとも１ １と結合可能なりガント；からなる群から選択され、および（Ｃ）前記抗ＡＧＥ 抗体とそれに対する特定の結合対の間の免疫反応の１種以上の成分類の検出およ び／または測定のためのプロトコール実施のための指示書、からなる。

本発明は、哺乳類における抗ＡＧＥ抗体類の産生、および、前記抗体類を含む抗 血清の産生にも拡張される。例としておよび本文で例示したように、哺乳類を還 元性糖と遊離のアミノ基類を含有する全てのタンパク質とのインキュベーション 産物で免疫し、アマトリ転位に供し、それによって、ＡＧＥｓを得ることがしき る。

本文で使用したように、用語”免疫した”および”過免疫した”は、本文のｉＭ でさらに詳細に説明する特定の免疫操作を称し、抗体反応を惹起するために使用 し、本発明の抗血清および抗体類を得る。前記タンパク質または１１以上の還元 性糖類とインキュベーションした上述のタンパク質の反応生成物を使用できる。

坑ＡＧＥ抗体類の形成を誘発するために有効な量で免疫担当哺乳類に対して、免 疫原の１次投与量をおよそ４回、通常投与する。また、適切であれば、ブースタ ー免疫投与量も投与できる。

宿主哺乳類のタンパク質それ自体またはたど又はＡＧＥ−ＲＮＡｓｅのようなＡ ＧＥタンパク質由来ＡＧＥｓによる免疫によって、免疫原それ自体に由来するＡ ＧＥｓまたはその他のタンパク質類に由来するＡＧＥｓに反応性の抗体類が産生 される。たとえば、ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅの投与によって、ＡＧＥ−ＲＮＡｓｒ、 ＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−ＢＳＡ、ＡＧＥ−ＨＳＡ、ＡＧＥ−ＬＤＩ、お 」、びＡＧＥ−コラーゲン■と反応性であるが非修飾ＲＮＡ５ｅ、ＢＳＡまたは ＨＳＡど反応性でないポリクローナル抗ＡＧＥ抗体類を産生ずる。

上記のようにして作製された抗体類は、また、モデルＡＧＥｓ　ＦＦ１．ＡＩ’ ＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシンおよびベントシジンのような、化学加 水分解または還元を伴う操作によって合成的に作製されたモデルＡＧＥＳと反応 性でなかった。これらのモデル化合物類のいずれも、作製した前記の抗Ａ　（ｉ 　Ｅ抗体類によってｉｘ謹されなかった。

本文にｌ己載の発明は、これらのインビボ由来ＡＧＥｓおよび特殊な化学的加水 分解または還元をぜずに産生されたインビトロ産生ＡＧＥｓ上に存在する抗原Ｃ １；定本を利用している。前記抗原決定基は、インビボ由来ならびにインビトロ 出来物質上においてＡＧＥｓを検出するための数多くのプロセスにおいて利用で きる。

たとえば、抗ＡＧＥ抗体類の結合アブイニテイは、非競合および競合ＥＬ　Ｉ　 ＳＡにおいて、ならびに、異なるイムノアッセイ構成を利用する他のプロトコー ルにおいて、使用できる。

グルコースとの長期インキュベーションによって修飾されたりボヌクレアーＵは ・種々のＡＧＥ修飾タンパク質類に対する高力価、高ＡＧＥ抗体類のｇｉｌＥの ための適切な免疫原であることがわかった。グルコースで調製された進行グリコ Ｓル化最終産物類は最大阻害を示し、次に、０６ＰおよびフラクトースでＩＩ製 したＡＧＥｓが続いた。０６Ｐおよびフラクトースの両者がグルコースよりも速 い速度でタンパク質類と反応し、茶色の蛍光ＡＧＥＳを産生した。

グルコース、ＧＡＰおよびフラクトースのような異なるグリコジル化糖類は、イ ンビトロでタンパク質とインキュベーションすると、抗原的には交差反応性の抗 原決定基を産生ずる。対照的に、グルコース（ＦＦ１．０６Ｐ、ビラリン）とポ リペプチド類またはアミン類とのインビトロインキュベーション混合物類由来ま たはインビボでグリコジル化されたくペントシジン）組織由来の特定産物の精製 によって、抗−（ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅｌ抗血清との明らかな交差反応性を有して いない化合物類が産生じた。このことは、これまで記載してきたモデルＡＧＥＳ が抗原的にはマイナーな産物であるかまたは試料からのＡＧＥｓ単離に典型的に 使用される精製操作が抗ＡＧＥ抗体類の反応性が根本的に消失するような構造的 変化をもたらしたかのいずれかを示唆している。

インビトロにおける時間経過の研究から、進行グリコジル化の特徴的蛍光が抗Ａ ＧＥ反応性部分の発現に先行することが明らかになった。したがって、前記の抗 ＡＧＥ抗血清は、蛍光原形成後に形成される”後期の”進行グリコジル化最終産 物（類）と最も反応性であるらしい。

本発明で有用なりガント類は、好適には、ＡＧＥ結合対に結合したインビボ産生 ＡＧＥｓである。これらのりガント類は、単独でまたはアビジンおよび／または ビオチンのような２次検出対と併用して、検出できる。これらのシグナル増幅因 子類を使用した際の適切なりガント類は、グルコース、ＧａＰ、フラクト−へ、 リボース等のような還元性ｗＩｌＪ＋とペプチド類、タンパクＴＲ類、およびＢ ＳＡ、アビジン、ビオチン、およびアルカリホスファターゼのような酵素類のよ うな他の生化学物ｌｊ類との反応生成物から選択できる。

本発明は、本文で先に検討したように、たとえば、融合マウス膵リンパ球および 骨髄細胞を用いて、ハイブリドーマ法によってｒ１４製可能なモノクローナル抗 ΔＧＥ抗体類に拡張される。また、Ｂリンへ球の発ガン性ＤＮＡによる直接形質 転換またはニブスティンパーウィルスによる形質移入のような融合以外の方ムに １って、不滅の抗体産生性細胞株が作製できる。

特定のポリクローナル抗体類は、異なる好適な宿主種において作製できる。通常 、これらの抗体類が、本発明に従って作製できる抗体調製物を単に例示している に過ぎないのは、当然である。

特定のプロトコールを必要に応じて下記に例示した。本文に記載したプロトコー ルは、ＡＧＥＳの定性的および定量的測定およびＡＧＥｓの増加が関連している 病理の同時診断とサーベイランスに適用できる。糖尿病および、動脈硬化および 皮膚のしわのような加齢に関連している状態のような条件は、非限定期な例を示 している。したがって、これらの状態の診断およびモニタリングのための方ｉｂ は、本発明の範囲内に包含される。

下記に示した生化学および生物学的試薬類は、市販されているがまたは認定され たプロトコールにしたがって作製される。本文に引用した刊行物は全て、本文で 参考として引用した。

桂料粛表囚方私 下記に記載のアッセイで使用した試薬量は入手したが、または、下記のＪ、うに して調製した： ウシ膵リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ５ｅ”）、ウシ血清アルブミン（”ＢＳΔ′″ ）、ヒト血清アルブミン（’ｌｌ５Ａ″）、コラーゲン■型、コラゲナーゼ、ゾ ルコース、グルコース−リン酸（”Ｇ６Ｐ″）、フラクトース、リボース、おＪ 、びナトリウムボロヒドリドは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｓ　ｔ、Ｌ 　ｏ　ｌ＋ｉｓ、ＭＤｌ　から入手した。

ＡＧＥ−ヘモグロビンは、赤血球を単離し、それらをトルエンによって溶血させ 、赤血球溶血物をトリクロロ畦酸［ＴＣＡｌによって処理し、調製した。特に７ ＲＢＣａ血物５０−１００μｌ試料を調製し、水３ｍｌおよび２４％（ｗｔ、／ Ｖｏ１１ＴｃＡ　１ｍｌを添加した。この混合物を撹拌し、その後、３０００　 ｒ　ｐｍで３０分間、遠心分離した。生成した上清を吸引ろ過し、その後、Ｎ　 ａ　ＯＨｌ　５０４１を添加し、その後、水を総量０．５ｍｌとなるように添加 した。この物質を次に、０．３Ｍ　ＫＨ；ＰＯ４ｐＨ７，４によって、１：２か らに２〔」０まで希釈し、アッセイ実施の準備をした。

ＡＧＥ−アルブミンは、アルブミン（５０ｍｇ／ｍｌｌ　を、０．２Ｍ　Ｎａ＋ ’０４緩衝液中で６０日間、０．５Ｍグルコース、０６Ｐ、またはフラクトース どインキュベーションし、調製した。

ＡＧＥ−：Ｉラーゲンは、コラーゲン（５５ｍｇ／ｍｌｌを、０．　２Ｍ　Ｎａ ＰＯ，（ｐＨ７，４）緩衝液中で９０日間、１Ｍグルコースとインキュベーショ ンし、調製した。

ＦＦＩ−ＢＳＡは、ＦＦｌ−ヘキサノン酸をカルボジイミドでＢＳＡに結合させ ることによって、調製した。

ホルムアルデヒド−ＢＳＡ、マレイル−ＢＳＡおよびアセチル−ＬＤＬは、１１ ｏｒｉｕｃｈｉ、Ｓ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、４＋２６０，４３２．４３ ８　（１９８５）；Ｔａｎａｋａ、に、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、、９４：２７３−２８０　（１９８９１；およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ 、、１゜Ｌ、　ら＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７７ ：３３：Ｉ−：＋３７　（１９７９）に記載の操作に従って、合成した。

ＡＧＥ−ＬＤＬは、Ｋｉｒｓｔｅｉｎ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８７：９０１０−９０１４　＋１９９０１に従って、自然 酸化が最少となるようなプロトコールによって調製した。

ＡＧＥ−ＢＳＡは、Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒ、Ｒ，ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥＩＩ２５ ｍｏ１．．１０６　：　７７−８７　（１９８４１にδ己載のように、ナトリウ ムボロヒドリドによって還元した。未反応ポロヒドリドは全て、ＰＢＳに対する 透析にＪ２って除去した。

アミノグアニジン阻害のため、ＢＳＡ　（１００ｍｇ／ｍｌ）を１００　ｍ　Ｍ グルコースおよび１００ｍＭアミノグアニジン塩酸塩＋Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ ｍｉｃａ１社、ミルウォーキー、ＷＩＩとＯ，ＩＭ　ＮａＰＯ＋緩衝液（ｐＨ７ ，４１中で３７６０で２１日間、インキュベーションした。試料を分析前に、Ｐ ＢＳに対して透析した。

リシン−由来ＡＧＥｓは、ＩＭ　グルコース−６−リン酸またはＩＭ　グルコー スを０．２Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ’７．４１中で５０ｍＭ　Ｌ−リ シンと３７＠Ｃで１０日間、インキュベーションし、ＥＩＩＷした。

１−デオキシ−１−モルホリノ−Ｄ−フラクトースは、Ｓ　ｉ　ｇ　ｍ　ａ　Ｃ ｂ　ｅ　ｍｌｃａｌ社から入手し、１−デオキシ−１−プロピルアミノ−Ｄ−フ ラクト−スは、Ｍｉｔｃｈｅｌ、Ｆ、、Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、、９２：　２８３６ −２８４０ｆ１９５９）に従って、α−Ｄ−グルコースおよびＮ−プロピルアミ ンから調製した。２−（２−フロイルｌ　−４（５１−（２−フラニル１−ＩＨ −イミダゾールは、フリルグリオキサールおよび６−アミノヘキサノン酸の水性 混合物がら音成し、シリカゲルで中等度圧のクロマトグラフィで精製した。

■−アルキルー２−ホルミルー３，４−ジグリコシルービロール（Ａ　Ｆ　Ｑ　 Ｐ　＋は、グルコースを６−アミノへキサノン酸および亜硫酸ナトリウムと３７ ６ＣＦ２６日間インキュベーションした後、Ｄｏｗｅｘ　ＡＧ　１ｘ４陰イオン 交換樹脂によるクロマトグラフィとＨＰ　Ｌ　Ｃを行い調製した。

他−０方Ａ 前記抗ＡＧＥ抗体およびインビボ由来ＡＧＥｓとのその反応性、加水分解または 還元を伴う方法によって化学的に合成されたＡＧＥｓとのその非反応性を、評価 した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、、ＡＮＡＬ、ＢＩＯＣＩＨ： Ｍ、、７２　：　２４８−２５２　＋１９７６１１．ｍ従ッテｉｌＮ定し、がっ 、ＢＳＡは、！が準どして用いた。リボヌクレアーゼおよびＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ タンパク質１は、さらに、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＮＡ５ｅｔｌ準品とのクー マシーブルー染色バンドを比較して測定した。ヒドロキシプロリン含量は、Ｅｄ ｗａｒｄ、Ｃら、ＣＬＩＮ、ＣＨＩＭ、ＡＣＴＡ、、１０４　：１６１−１６７ 　（１９８０１Ｌ：よ勺て、測定した。コラーゲンＡＧＥ特異的蛍光洞窟は、Ｌ Ｓ−３Ｂ蛍光分析＃ＮＩ“ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴＩを 用いて、３７０　ｎ　ｍ励起（。

よる４４０ｎｍ放出を測定して、実施した。

対照アルブミンの調製物は、また、上記と同一の条件で糖なしでインキュベーシ ョンした。インキュベーションは全て、暗所でがっ３７’Ｃで無菌条件下で行っ た。インキュベーション後、非結合物質をリン酸ｌ！衝生理食塩水（ＰＩ３Ｓｌ に対する長時間の透析がまたは５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ。

Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎｌ上でのゲルろ過によって、除去した。

単一標準であルＡ　Ｇ　Ｅ　−Ｂ　Ｓ　Ａ　ＥＩ製物（１ｍＭ　ＡＧＥ−ＢＳＡ ＝１２　Ａ３５０１を参考として用いた。蛍光強度標準を用いて、機器の性能を 校正しかつｔニタリングした。被験物質の蛍光値をタンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ で測定して。

ＡＧＥ−ＢＳＡ標準品と比較しての相対蛍光百分率として示した。

抗込仄し【坑井ｌしり１± 天然のＡＧＥｓに対して抗血清を作製するこれまでの努力は、通常、成功せｉ゛ または、インビボで生じるＡＧＥｓを検出できなかった。

抗ＡＧＥ抗体類の形成を誘発するため、加水分解または化学還元反応に頗る。− となく、合成ＡＧＥｓは、上記のようにしてインビトロで作製された。前記夕。

バク質は、通常、還元性糖とインキュベーションし、ＡＧＥｓを形成した。

グルコースは、それが主な循環筒でありかつインビボで形成されたＡＧＥｓと極 めて類似しているＡＧＥｓをインビトロで形成するので、インビトロにおけるグ リコジル化剤として好適には用いられた。ＲＮ　Ａ　ｓ　ｅは容易にＡＧＥ８を 形成しかつＡＧＥ媒介分子間架橋を形成するので、ＲＮＡ５ｅは、進行グリコリ ル化のためのターゲットタンパク質として選択された。

Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギ雌性２匹は、Ｒ，Ｂｕｃａｌａら、Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２０：１２８９−１２９２　＋１９８３１　（”過免疫プロ トコール”）による翻訳後修飾タンパク質類のためのプロトコールに従ってが− ）下記のようにして、１次免疫４回およびフロイント完全アジュバントに乳化し たＲＮＡ５ｅまたはＡＧＥ−ＲＮＡｓｅのブースター免疫を１回受けた。したが って、各ウサギは、背部に４回、皮肉注射を受け（各回２００μｇ）、各後脚蹄 Ｎ例部に注射を１回受けた。この操作を１週間隔で６週間、繰り返した。２週間 休んだ後、このウサギに対して、フロインド不完全アジュバント中の抗原１ｍｇ をブースター注射した。動物を、この注射第１０日に出血させた。抗体応答をオ クタし１ニ一二重拡散および非競合ＥＬＩＳＡによって毎週モニタリングした。

上記に述べた過免疫プロトコールを用いて、ＲＮＡ５ｅに対する高力価のポリク ローナルウサギ抗血清を得た。この抗ＲＮＡ５ｅ力価は、非競合ＥＬＩＳＡで１ ０−５よりも高いことがわかった。下記の吸収抗原類を試験した：ＲＮＡ５ｅ、 グルコース由来ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ、ＢＳＡ、グルコース由来ＡＧＥ−ＢＳＡ、 およびＧ６Ｐ由来ＡＧＥ−ＢＳＡであった。結果を下記の第１図に示した。

ＲＮＡ５ｅよりも統計的に有意に高い反応性が免疫原ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅについ て観察された。抗ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ抗血清は、また、非修飾アルブミンとでは なくグルコースまたは０６Ｐのいずれかとインキュベーションすることによって 修飾されたアルブミンと反応し、ＡＧＥｓ特異的抗体類の存在を示唆している。

！ｉ！Ｊｉ［Ｉ ＥＬＩＳΔＬｌ土イ 抗ＡＧＥ抗体類の形成をモニタリングするため、ウサギ抗血清を上述のようにし て作製し、非競合ＥＬＩＳＡ系で力価を検定した。ＲＮＡ５ｅ、ＡＧＥ−ＲＮＡ ｓｅ、およびＡＧＥ−ＢＳＡは、吸収抗原類として使用した。

吸収された抗原は、ウサギ血清と接触させ、前記血清中に含まれる抗ＡＧＥ抗体 が複合体を形成できるようにした。次に、形成された複合体のレベルを、アＩ【 カリホスファターゼに連結された抗つサギＩｇＧ抗体（Ｏｒｇａｎｏ口　］′ｅ （ｈｎｉｃａ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ）を添加すること によって、評価した。抗（ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅｌ抗血清の力価は、その後、最太 りＤ　４ｕ５シグナルの５０％を付与する血清希釈倍数として定義した。

次に、リガンド阻害およびＡＧ　ＥｉＰＩ定を競合ＥＬＩＳＡで実施した。９６ 穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Ｇｉｂｃｏ 、（Ｉｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）に対して、各ウェルにＡＧＥ−ＢＳＡＷ ｉｌｌ　（１０μ１．ＰＢＳ中に溶解１０．１ｍｌを添加しかつ室温で２時間イ ンキュベーションし、ＡＧＥ−ＢＳＡ　（上述のようにして得た）を塗布した。

ウェルをＰＢＳ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０、および１ｍＭ　ＮａＮ＋含有 溶液０．１５＋ｏｌて３回洗浄した。

ウェルを、２％ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、および１ｍＭ　ＮａＮ３含有ＰＢＳ 溶液０．１ｍｌで１時間インキュベーションし、ブロックした。ブロックしたウ ェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、競合抗原５０μｍを添加し、ウサギ由 来抗血清（最終希釈度、１／１０００１５０μｍを次に添加した。

その後、プレートを室温で３時間インキュベーションし、次に、ウェルをＰＬ３ Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ｐ−ニトロフェニルリン酸を比色基質として用いて、 アルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ（ヤギ中で作製）で発色させた。

結果を、Ｂ／ＢＯとして示したが、ＢＯは、競合抗原不在下での最大結合抗原量 であり、Ｂは、競合抗原存在下での結合抗原量である。ＢＯおよびＢの両者でパ ックグラウンドを調整しており（Ｒｏｂａｒｄ、ＣＬＩＮ、ＣＨＥＭ、、２０： 　１２５５−１２７０　ｆ１９７４）ｌ、および［４０５ｎｍにおける実験的光 字密度−バックグラウンド光学密度（抗体無し川／［總（競合剤無し）−ハッン グラウンド光学密度］として計算した。

グルコース由来ＡＧＥ−ＢＳＡＩＩ準３μｇが、抗血清結合を５０％阻害したこ とが判明した。この標準は、Ａ３５０　１２ｍＭ　’のアルブミンを生成した。

前記抗（ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ）抗血清の特異性は、したがって、種々のＡＧＥ修 飾タンパク賀類、非修飾タンパク質類、および合成ＡＧＥｓを用いて、試験した 。第２図（上１！ｔｉｌｌに示したように、ＡＧＥ−ＢＳＡを吸収抗原として用 いる競合ＥＬＩＳＡ系で異なる修飾アルブミン類に対して作製した抗（ＡＧＥ− ＲＮＡｓｅｔ抗血清を試験することによって、結果が得られた。全点は、３ｆｆ ｉｉｌ１１定の平均を示している。

ＢＳＡをグルコースとインキュベーションすることによって調製したＡＧＥ−ア ルブミンは、最大阻害を示し、グルコース−６−リン酸およびフラクトースによ って調整したＡＧＥ−アルブミンが続いた。

合成ＡＧＥリガンドＦＦＩを有するＢＳＡＭ導体のひとつであるＦＦＩ−ＢＳＡ は、前記の抗血清によって認識されなかった。ポルミル化またはマレイル化のよ うなその他のアルブミン修飾方法はインビボにおけるアルブミン取り込みのため の特異的認識シグナルを産生ずるが、同様に、前記の抗血清といがなる交差反応 性も示さなかった。

それがＩ々の担体タンパク質類上に存在するとき、ＡＧＥ修飾体類は、競合εＬ ＩＳＡにおいて抗体結合を競合した（第２図、中央）。したがって、０６Ｐ由来 ＡＧＥ−ＢＳＡ、グルコース由来ＡＧＥ−ＬＤＬ、およびグルコース由来ＡＧＥ −コラーゲン（■型）は全て、グルコース由来ＡＧＥ−ＢＳＡに対する抗体結合 を特異的に阻害することが明らかになった。対照的に、非修飾ＨＳＡ、非修飾Ｌ ＤＬ、および非修飾コラーゲンは、そのように競合しなかった。アセチル−ＬＤ Ｌは細胞性スキャベンジャ−レセプター類によって特異的に認識され取り込まれ るＬＤＬの修飾形であり、同様に、前記の抗（ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅｌによって認 識されなかった。

前δ８抗ＡＧＥ抗血清も、同様に、モデル、構造的に規定されたＡＧＥｓに対す る競合を試験した（第２図、下図）。試験した前記モデルＡＧＥ生成物類は、Ｆ Ｆ１．ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、およびベントシジンであ った。これらの化合物類を、アミン類を還元性糖類とインビトロでインキュベー ションしたものからかまたは還元および酸加水分解した後の組織コラーゲンがら 単離した。これらの化合物類は、低レベルの阻害も容易に検出されるように、高 濃度で試験した。これらの生成物のいずれも、ＡＧＥ−ＢＳＡへの抗血清結合を 競合しなかった。

グルコースおよびＧ６Ｐは、リシンとインキュベーションし、低分子ＩＡＧＥＳ が得られた前記抗血清と反応可能であるかを調べた。これらの生成物は、グルコ ースまたは０６Ｐのりシンとのインビトロにおけるインキュベーションによって 、化学的還元または加水分解もなく、生成された。結果どして生成した生成物を 、競合ＥＬＩＳＡにおいて反応性を試験した。

塘またはりシンのいずれかからなる対照インキュベーションも、いがなる競谷も 示すことがなかった（データを示さず）。２種のアマトリ転位生成物であるデオ キシプロピルアミノフラクトースおよびデオキシモルホリノフラクト−スも同様 に試験し、各化合物は、抗血清結合を阻害しなかった。アマトリ生成物が１Ｉｉ ｆ記抗血清によって＃：ｔ！！されないという証拠が、さらに、ＡＧＥ−ＢＳＡ のすｌ・リウムボロヒドリド還元が競合ＥＬＩＳＡにおける反応性を消失させな かった（データを示さず）という事実によって得られる。

抗（ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅｌ抗血清と反応するインビボ生成ＡＧＥｓの性質をさら に特性解析するため、進行グリコジル化阻害剤アミノグアニジン存在下において 、ＡＧＥｓを合成した。アミノグアニジンはヒドラジン様化合物であり、進行グ リコジル化プロセスの中間段階で反応し、タンパク質結合蛍光生成物類および架 橋の形成を阻害する。第４図に示したように、グルコースおよびＢＳＡのインビ トロインキュベーション中にアミノグアニジンを取り入れることで、抗ＡＧＥ抗 血清と反応しかつ結合するＡＧＥｓの形成が有意に阻害された。

犬旌例） Ｎ旦旦肛成史店 ＡＧＥ関連蛍光の形成と抗ＡＧＥ抗血清に結合する生成物の形成の間の動態関連 を同様に評価した。第３図は、蛍光と抗ＡＧＥ抗体反応性物質の発現の時間ＩＰ Ｉ経過を示している。ＢＳＡは、グルコースとインキュベーションし、アリコツ トを種々の時間間隔で取り出し、透析して未結合生成物類を除去し、その後アッ セイした。ＡＧＥ−蛍光原は０〜４０日に急激に形成され、がっ、抗体反応性生 成物の形成に先行することが観察された。

ＥＬＩＳＡによって測定すると、ＡＧＥｓは、第２０日まで検出されず、その後 、第３０日から第７０日に急速に形成された。ＡＧＥ蛍光原と抗体反応性生成物 の両者の形成は、最軽的にプラトーに達した。

Ｕｌｉｌす １１ＪＪ！ｉＪ！Ｊｉ 上述のように、本発明は、糖尿病ならびにＡＧＥレベルが異常となるその他の疾 患状態の検出と評価のための特に有効な手段を提供する。糖尿病組織中における ＡＧＥｓの存在および／または量の有効な評価、および糖尿病であることが公知 の哺乳類の総合的状態の特性解析のための本文に記載したＡＧＥアッセイの用途 について、下記で説明する。

糖尿病を、アロキサン（４０ｍｇ／ｋｇｌまたはストレブトゾシン（６５ｍＫ／ ’ｋｇ）の急速静注によって、８適齢の雄性１，６ｗ１ｓラツトに誘発した。過 血糖は、血糖値をアッセイし、確認した。血糖は、１６週間隔で測定し、アロキ →ノン装置動物（ｎ＝２４）で平均２０．５±２．４ｍＭであり、ストレブトゾ シン処置動物（ｎ＝２４）で平均２３．５±３．９であった。対照、アロキサン 処置またはストレブトゾシン処置動物で時間と共に血糖値に有意な変化が全くな かった。

４力月間隔で、動物６匹を層殺し、大動脈を摘出し後で分析するために、−８０ ″Ｃで凍結した。動脈組織は、ゆっくりと融解し、ＰＢＳで洗浄し、さらに、は さみで細かくした。ｍ質は、４＠Ｃで一晩穏やかに損とうして、アセトン／クロ ロホルムｆ１　：　１）で抽出した。その後、試料を真空遠心分離によって乾燥 させ、０．２Ｍ　ＮａＰ０４ａ衝液（ｐＨ７，４１中に再懸濁した。コラゲナー ゼ（■型）をその後１／１００　（Ｗ／Ｗ）比率で添加し、混合物を４８時間３ ７゛Ｃで穏やかに損とうしながらインキュベーションした。トルエン１滴を含ま せ、無菌性を保持した。その後、消化された試料を１５．ＯＯＯＸｇで遠心分離 し、澄明な上清を用いて蛍光、ＡＧＥ、およびヒドロキシプロリン測定を行った 。

糖尿病動物（アロキサン＋ストレブトゾシン詳）において、相対蛍光は、１０週 における１３．７％±２．４％から６４週における２３．７％±３．０％に増加 した（ｐ＜０．００１１゜対照である非糖尿病動物における蛍光はこの期間にお いてわずかに増加した（８．３％±１．０％から９％±０．８％まで、統御１的 に有意ではない）。組織および血清ＡＧＥ値を、ＡＧＥ単位量として示した。Ａ ＧＥ　１単位は、抗体反応性物質の量として定義され、それは、ＡＧＥ−ｆｌｓ Ａ揮準１μｇにおけるそれに等しかった。Ｐ値は、群間の比較のため、ｕｌｌｌ ｌａｌｒｅｄ　５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　ｔ、検定によって計算した。

ＥＬＩＳＡによるＡＧＥ含量の分析から、糖尿病動物において約２倍の増加が示 された（１６週における４１．８±０．５Ｕ／ｍｇ対６４週における１０．５± １．８Ｕ／ｍｇ、ｐｒｏ、００１１゜また、動脈ＡＧＥ含量も対照である非糖尿 病ラットで増加していたが、糖尿病動物におけるよりもはるかに遅い速度であっ た（１６週における２、５±０．６Ｕ／ｍｇ対６４週における４、３±０．４Ｌ Ｉ／ｍｇ、ｐｒｏ、００１）。

ヒト血清は、また、正常者および糖尿病患者から得た。腎機能障害の患者も、本 群の患者が循環血清ＡＧＥｓレベルが著明に上昇していることが見いだされてい たので、調べた。

これらの循環血清ＡＧＥｓは主に低分子量ペプチドの形態であり、血液透析療法 では効率的に除去されない。

血清試料を非糖尿病＋ｎ＝１２）、糖尿病（ｎ＝２１１、および血液透析を受け ている糖尿病（ｎ＝１６１から入手した。血清をＰＢＳで３倍に希釈し、０゜２ ２μｍのミリポアフィルタ−（Ｍｉｌｌｌｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ＋で ろ過殺菌した後、分析した。

ＡＧＥ　Ｕ／ｍｌとして示した際に、正常患者（非糖尿病、正常腎機能）は平均 レベル１０．５±１．３Ｕ／ｍｌ血清を有していた。ＡＧＥレベルは、糖尿病（ ＤＭ）対正常者（ＮＬＩについて、糖尿病患者において、２倍以上増加して１５ す（２４，７土２．４　Ｕ／ｍ１．ｐ＜０．００１１、かつ、血液透析を受けて いる糖尿病患者において、はとんど８倍以上であった＋７９．４±９−　９　Ｕ 　、’　ｍｌ、ＤＭ＋ＨＤ対ＤＭについてＰ＜０．００１１゜これらの結果は、 ラジオレセプターアッセイを用いて糖尿病患者および血液透析を受けている糖尿 病患者かも得た血清のＡＧＥペプチド含量を測定した最近の研究の知見と良好に 相関していた。

！Ｕ聰−伝Ａ 時間積算血糖値レベルのアッセイを、上記の実施例３で従ったプロトコールを用 いて、正常者および糖尿病患者から採取した試料について、実施した。本アッセ イの結果を、時間積算血糖値を公知の標準ＨＢＡ１ｃを用いて測定した際に受け た値と比較し、第７図および第８図に示した。

第７図および第８図について述べると、標準としてＡＧＥ−ヘモグロビンを用い る本アッセイの性能は公知の決定基および標準ＨｂＡｌｃと好適に匹敵すること がわかり、後者の試験が必要とされている場合にはいかなる場合でも使用できる 。受けとったデータの測定値は実質的に同等であり、本アッセイの臨床的完全性 が、その結果、高い。

さらに本発明の診断への適用は、フラクトース由来ＡＧＥｓの測定にある。フラ クトース由来ＡＧＥｓの測定は、ＡＧＥ形成速度の重要な決定因子であるとして 認識されており、糖尿病のような本反応に関連している病理とその他の結果の同 時発生と程度、５ｕａｒｅｚら、（１９８９）、Ｊ、ＢＩＯＬ、ＣＨＥＭ、。

２６４　：　３６７４−３６７９、およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、＋１９８８１ 、Ｉ３１０ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２７：１９０１−１９０７は、両者ともに、タ ンパク質架橋中におけるフラクトースの存在および関与が、それの測定とコン） ・ロー１１を開始させるフラクトース由来ＡＧＥｓの重要な役割を予見しており 、Ａ　ｂ　ｍ　ｅｄら、　＋１９９２）ＣＬＩＮ、ＣＨＥＭ、、３８　（７１： 　１３０１−１３ｒＪ３がフラクトース化されたＨｂが現在公知の臨床的アッセ イによって有効な＃断ができないことを示唆しているのは、重要である。

したがって、本発明は、体タンパク質によるフラクトース由来ＡＧＥｓの集積反 応の悪影響について理解を深めかつ治療するための総合的努力において、フラク トース由来ＡＧＥｓの測定にも拡張される。

！Ｕ［則 インビボ形成ＡＧＥｓの検出のために開発された抗ＡＧＥ抗体類を競合的Ｅ１、 ＩＳＡに用いて、赤血球溶血物中におけるヘモグロビン連結ＡＧＥｓを測定した 。

第９図は、糖尿病患者（ＤＭＩおよび非糖尿病正常血糖値の者（ＮＬ）から得た 赤血球試料３２検体の本分析の結果を示している。ヘモグロビン連結Ａ　Ｇ　Ｅ 　ｓは、両群で検出されたが、糖尿病で有意に高い量が存在していた（ＮＬ［ｎ ＝（ｌ］４．３±０．３単位ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ　；ＤＭ　［ｎ＝２３］　：　 ７．７±０．　６中位　ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ、　［平均±Ｓ、Ｅ、］、Ｐｒｏ、 ００１、Ｓ　ｔ　ｕ　ｄ　ｅ　ｎｔ’　ｓ　ｕｎｐａｉｒｅｄ　を検定による） 。

ＡＧＥ単位で示した抗体活性は１合成ＡＧＥ−アルブミン標準に対して相対的に 計算した。付加的実験から、ヘモグロビン−ＡＧＥ修飾が透析、酸沈澱およびタ ンパク質溶解に対して安定であることを示しており、ポロヒドリド還元によって 影響されない（データを示さず）。これらのデータは、抗ＡＧＥ抗体特異性につ いてのこれまでの研究とともに、前記ヘモグロビン−ＡＧＥ部＞ｔが安定グルコ ース由来アマトリ転位後の生成物であることを確認させる。赤血球ＨｂＡｌｃの レベルは、統計的に有意にＨｂ−ＡＧＥＬベルと相関している。

実１１列ｌ ヘモグロビンおよびグルコースからのＨｂ−ＡＧＥ形成をインビトロで確認した 。ｎＩ製したヒトＨｂを、正常血糖値（５ｍＭ］および過血糖値（２０ｍ　Ｍ　 ｌを模擬するグルコース濃度において、３７”Ｃでインキュベーションした。ヘ モグロビン−ＡＧＥが時間とともにおよび濃度依存性に形成された。第１１図を 参照。

初期アマドリグリケーション産物順が抗ＡＧＥ抗体順に非反応性であることは、 アマトリ生成物抗原決定基を改変するナトリウムボロヒドリド還元がいったん形 成されたＨｂ−ＡＧＥ生成物の検出に影響を及ぼさなかったという観察によって 、本系で確認された。アミノグアニジンを添加すると、ヘモグロビン会合ＡＯＥ ｓの形成が防止された。

ヘモグロビン−ＡＧＥｓｉｌｌ定は、アミノグアニジン治療を受けている患者か う得た血液標本中で実施した。本患者詳は、長期にわたる糖尿病の患者１８例で あった。血液試料をアミノグアニジン治療前および治療２８日後に得、ＨｂＡＧ ＥレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。第１２図に示したように、平均Ｈｂ　 −ＡＧＥ値はアミノグアニジン治療の結果、有意に減少した。（１３，８±０． ８単位ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ対１０．０±０．９単位ＡＧＥ／ｍｇ　Ｈｂ［平均± Ｓ。

Ｅ、］ｐ＜０．００１，５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　ｕｎｐａｌｒｅｄ　Ｌ検定によ るヤＨＢＡｉｃ値は、アミノグアニジン治療によって影響を受けなかった（１０ ゜１％±０．８％対９．２％±０．８％、［平均±Ｓ、Ｅ、］Ｉ）＝ＮＳｌ。ブ ラセボ対照を投与されている患者６例の詳から得た血液試料では、Ｈｂ−ＡＢＥ またはＨｂＡ１ｃレベルのいずれにおいても有意な変化は観察されなかった（デ ータを示さず）。

ＡＧＥ修飾ヘモグロビンの存在は、いくつかの観点からして注目すべきである。

第１に、過血糖状態においてさえも、ＡＧＥｓは１通常、形成に何カ月から何年 もの時間的経過を必要とすると考えられてきた。本知見は、たとえば約１２０日 である循環赤血球の寿命のうちに、有意な量のＡＧＥ修飾ヘモグロビンが形成さ れることを示唆している。もし合成ＡＧＥ−アルブミン標準との相対として示し たＨｂ−ＡＧＥ単位を総赤血球ヘモグロビンの分画として再度計算すると、＋（ ｂ−ＡＧＥは、循環ヘモグロビンの０．４２±０．０７％を占めるようである。

このレベルは、研究した糖尿病群において、平均０．７５±０．０８％に増加す る。

これらの値は、正常面１１１Ｍおよび糖尿病群でそれぞれ、５．８％および８． ９′ｌ！＋’。

の対応するＨｂＡｉｃ分画と対照的である。

結合組織または基底膜コラーゲンに比較してヘモグロビン上におけるＡＧＥ集積 が多量であることは、正常リモデリングにおける結合組１＠ＡＧＥｓのレセフタ ー媒介回転を反映しているか、または、タンパク質基質としてのヘモグロビン上 におけるＡＧＥ形成の速度が本質的に上昇していることを示唆している。これと は別に、循環赤血球ヘモグロビンは、糖尿病、腎不全またはその他の疾患状態の 患者において増加量で発生する反応性のプラズマＡＧＥｓによって修飾を受ける ことができる。形成機構にかかわらず、インビボ生成ＡＧＥｓの測定に定１【的 ＣＬＩＳＡ法を適用し、ＡＧＥ形成が結合組織コラーゲンによるよりもヘモグロ ビンでより迅速に起こることが示唆される。

Ｈｂ−ＡＧＥは、したがって、インビボにおける進行グリコジル化の有用な生化 学的ｍ探として役立つ。Ｈｂ−ＡＧＥ形成は、ＨｂＡｌｃについて確立されてい るそれ（３−４週）よりも有意に長い血中グルコース濃度時間積分を反映してい る。アミノグアニジンによる４週間の薬理学的介入は、治療糖尿病群でこの日ｂ −ＡＧＥレベルを有意に低下させる（２８％）のに十分であった。

Ｈｂ−ＡＧＥ測定は、糖尿病および年齢関連合併症の両者の病理生理学の方へ種 々の研究を向けさせることができる。これらには、糖尿病合併症予防における厳 密なグルコースコントロールの利点を解明することを目的とした臨床研究、なら びに糖尿病状態および動脈硬化、高血圧および腎疾患のような年齢関連状態の発 生病理における進行グリコジル化の役割の実験的研究が含まれる。

爽獲■ｌ Ｌ常Ｒ４び　−・・　に　番る　）１」少４ルぐ及（ｆ（アミノグアニ）＞少力 課−一 正常およびストレブトゾシンー糖尿意うット群を未治療のまま１１週間放雪した 。前記２群の各群における動物の半数は、次に、ガバーシュによって、アミノグ アニジン塩酸塩７０ｍｇ／ｋｇの毎日処置を開始させ、前記動物の他の半分は、 ガバーシュによって精製水を開始した。さらに１０週後に、尿を２４時間にわた り全動物について回収した。

尿試料は、遠心分離し、上清を０．３Ｍ　リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，４で８ 倍に希釈した。希釈尿試料について、上述のＡＧＥ　ＥＬＩＳＡアッセイを（テ つだ。これらの測定の結果を、下記の表に示した。

表 処置　尿中ＡＧＥｓ：２４時間あたり排泄された単位量正常ラット　５４００± １２００ ＡＧ　ＨＣ１７０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ　２２００±　１９０処置正常ラツト 糖尿病ラット　９４００±　３４０ ＡＧ　ＨＣ１７０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ　４１００±１２００処置糖尿病ラツト 上記から、２１週の糖尿病は、正常動物のそれの１．７倍の尿中ＡＧＥ排泄をも たらし、アミノグアニジン投与によって正常に戻ることが観察された。アミノグ アニジンも置正常ラットは、尿中ＡＧ　Ｅｖ＃泄を６０％阻害することが示され た。

したがって、上記データは、組織ＡＧＥの回転が臨床的に有効な長期決定因子で ある糖尿病のような状態のモニタリングのための尿中ＡＧＥｓおよびＡＧＥ＝タ ンパク質類の測定の正当性および価値、ならびに、アミノグアニジンの治療薬剤 としての明らかな有効性が、確認される。

本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の形態で実施で きるかまたはその池の方法で実施できる。本開示は、したがって、あらゆる観点 からして例示的でありかつ制限的ではないとみなされ、本発明の範囲は、付属の 請求の範囲によって示唆され、さらに、均等の意味および範囲内におさまる変Ｊ Ｊｔ＋ ｖｓｏ　ａｎ／ｖｓｏ−３ＴＶ　Ｏｎ’（ｃ）（％）￥喜トγ目素 年齢（週） 年齢（週） −叩　Ｕ）　寸　へ　０ （ｘ）　ｐｔｖｑＨ インキュベーション時間（日） Ｈｂ−ＡＧＥ　ＨｂＡ１ｃ １．１１．、Ｉ、、＋Ｎ畠ρＣＴ／ＵＳ９２／１１１５８フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ・、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　Ｓ Ｄ、　ＳＥ

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．生体試料中における進行グリコシル化最終産物類の存在を測定する方法で、 （ａ）前記進行グリコシル化最終産物類を含有する疑いのある少なくとも１種の 生体試料を調製すること； （ｂ）前記試料に対した作製された抗ＡＧＥ抗体からなる少なくとも１種の対応 する結合対を調製すること； （ｃ）前記試料、前記結合対に対するリガンド、および前記結合対からなる群か ら選択された物質上に検出可能な標識物を配置すること；（ｄ）段階（ｃ）から の標識物賞を標識されていない段階（ｃ）からの物質と接触するように配置する こと； （ｅ）前記非標識物質に対する前記標識物置の結合程度を、段階（ｄ）から生成 した試料について調べること； からなり、 （ｆ）前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性で あり、および、下記の特性： （ｉ）それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； （ｉｉ）それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および （ｉｉｉ）それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、 およびベントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
2. ２．生体試料中における進行グリコシル化最終産物類の存在を測定する方法で、 （ａ）前記進行グリコシル化最終産物類を含有する疑いのある少なくとも１種の 生体試料を調製すること； （ｂ）前記試料に対した作製された少なくとも１種の対応する結合対を調製し、 前記結合対は、抗ＡＧＥ抗体、前記試料中に存在する疑いのあるＡＧＥＳに対す るリガンド、および両者の組み合わせから選択されていること；（ｃ）段階（ｂ ）の結合対類のひとつを固体支持体上に固定すること；（ｄ）段階（ｂ）の結合 対類のひとつに検出可能な標識物を配置すること；（ｅ）段階（ｄ）からの標識 物質を、標識されていない段階（ｂ）からの物質および段階（ａ）からの試料か らなる群から選択された物質と接触するように配置すること； （ｅ）前記非標識物質に対する前記標質物質の結合程度を、段階（ｅ）から生成 した物質について調べること； からなり、 （ｆ）前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性で あり、および、下記の特性： （ｉ）それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； （ｉｉ）それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および （ｉｉｉ）それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、 およびペントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
3. ３．生体試料中におけるインビポ産生ＡＧＥｓの存在を測定する方法で、前記方 法が、 （ａ）抗ＡＧＥ抗体類を固体支持体上に結合させること；（ｂ）前記抗体類およ び前記抗体類に対するもうひとつの結合対から選択された物質上に検出可能な標 識物を記配置すること；（ｃ）前記結合対を含有する疑いのある試料および前記 結合対に前記抗体類を接触させること； （ｄ）前記固体支持体に結合した標識物の量を標準と比較すること；からなり、 （ｆ）前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性で あり、および、下記の特性： （ｉ）それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； （ｉｉ）それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および （ｉｉｉ）それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ．ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、 およびベントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
4. ４．異常ＡＧＥレヘルが哺乳類患者中に存在している疾患の存在を検出するかま たは評価する方法で、 （ａ）抗ＡＧＥ抗体類を固体支持体上に結合させること；（ｂ）前記抗体類をあ る長さの時間および患者体液または組織試料に含まれる全てのＡＧＥｓを結合抗 ＡＧＥ抗体類に結合させるために有効な温度で、前記患者体液または組織試料に 暴露させること；（ｃ）前記結合複合体類を標識ＡＧＥ結合対と接触させること ；（ｄ）前記固体支持体に結合させた標識物の量を標準と比較すること；からな り、 （ｅ）前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性で あり、および、下記の特性： （ｉ）それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； （ｉｉ）それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および （ｉｉｉ）それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、 およびペントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
5. ５．請求項１−３項のいずれかに記載の方法で、前記生体試料が、血液、血漿、 尿、脊髄液、リンパ液、組織、植物質、食べられる動物質、タンパク質と糖の反 応生成物、ＤＮＡと糖の反応生成物、およびその混合物類からなる群から選択さ れることを特徴とする方法。
6. ６．請求項１−３項または請求項４項のいずれかに記載の方法で、前記測定され るＡＧＥが、Ｈｂ−ＡＧＥ、哺乳類血清アルブミン−ＡＧＥ、血清ＡＧＥ−ペプ チド類、尿中ＡＧＥ−ペプチド類、および上記の１種以上の組み合わせからなる 群から選択されることを特徴とする方法。
7. ７．請求項１−３項のいずれかに記載の方法で、前記測定されるＡＧＥが、食品 −ＡＧＥおよびタンパク質が治療剤として使用されることになっているタンパク 質−ＡＧＥであることを特徴とする方法。
8. ８．請求項６項に記載の方法で、前記哺乳類血清アルブミン−ＡＧＥがＡＧＥ− ＨＳＡからなることを特徴とする方法。
9. ９．糖尿病、血糖症、尿疾患および機能障害、年齢的な老化、タンパク質老化の 効果、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された疾患のモニタリンク 方法からなる請求項６項に記載の方法。
10. １０．ある患者における時間積分血糖値の長期モニタリングの方法からなる請求 項６項に記載の方法。
11. １１．前記タンパク質−ＡＧＥｓをモニタリングすること、および、前記方法が 治療剤として使用されるタンパク質のグリコシル化の程度をアッセイするための 方法からなることを特徴とする請求項７項に記載の方法。
12. １２．前記標識物が酸素類、蛍光を発する化学物質類および放射性同位元素類か らなる群から選択されることを特徴とする請求項１−３項または４項のいずれか に記載の方法。
13. １３．前記標識物が酵素類、蛍光を発する化学物質類および放射性同位元素類か らなる群から選択されることを特徴とする請求項９項に記載の方法。
14. １４．複数の生体試料を正常者および前記疾患に罹患している疑いのある対象か ら採取し、前記試料の進行グリコシル化最終産物類の測定結果を比較し、前記比 較が上記疾患の存在および程度を決定することになる請求項９項に記載の方法。
15. １５．分析物質中における進行グリコシル化最終産物類の量を測定する方法で、 （ａ）基質に結合した前記分析物質の試料を調製すること；（ｂ）段階（ａ）の 試料に対して、ＡＧＥレセプター類を含有するある量のリガンドを適用すること ； （ｃ）段階（ｂ）の試料に対して、進行グリコシル化最終産物類に対するある量 の抗血清を適用すること； （ｄ）段階（ｃ）の結合墓質試料上に存在する抗血清の量を検出することによっ て、前記分析物質に結合した前記進行グリコシル化最終産物類の量を測定ずるこ と、 からなり、 （ｅ）前記抗血清がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性であり、 および、下記の特性： ｉ．それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原決 定基と反応性であること； ｉｉ．それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性である こと；および ｉｉｉ．それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交差 反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、お よびぺントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
16. １６．分析物質中における進行グリコシル化最終産物類の存在を測定するための 検査キットであり、 Ａ．進行グリコシル化最終産物類に対する結合対、前記進行グリコシル化最終産 物類に反応性のリガンド類、前記結合対に反応性のリガンド類、またはそれらに 対する特異的結合対の検出可能標識物に対する直接または間接結合によって得ら れた標識された免疫化学的に反応性の少なくとも１種の成分の既定量であり、前 記進行グリコシル化最終産物類に対する結合対、リガンド類または特異的結合対 の少なくともひとつが、抗ＡＧＥ抗体であり、前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成 進行グリコシル化最終産物類と反応性であり、および、下記の特性（ｉ）それが 、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原決定基と反応 性であること； （ｉｉｉ）それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性で あること；および （ｉｉｉ）それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、 およびベントシジン、 を有していること； Ｂ．その他の試薬類；および Ｃ．前記キット使用のための指示書、 からなることを特徴とする検査キット。
17. １７．請求項１６項に記載の検査キットで、前記キットが、血液、血漿、尿、脊 髄液、リンパ液、組織、植物質、食べられる動物質、タンパク質と糖の反応生成 物、ＤＮＡと糖の反応生成物、およびその混合物類からなる群から選択された分 析物質とともに使用されることを特徴とする検査キット。
18. １８．請求項１６項に記載の検査キットで、前記分析物質が、置換および未置換 アミノ酸類、置換および未置換タンパク質類、および置換および未置換アミノ酸 含有生体高分子からなる群から選択されたアミノ基含有化合物であることを特徴 とする検査キット。
19. １９．請求項１８項に記数の検査キットで、前記アミノ基含有化合物が、６−ア ミノヘキサノン酸、メチルアミン、ポリ−Ｌ−リシン、α−ｔ−ＢＯＣ−リシン 、アルブミン、コラーゲン、ＤＮＡ、および、グルコース残基が別の還元性糖の 残基類によって置換されている前記グルコース残基保有化合物類からなる詳から 選択されていることを特徴とする検査キット。
20. ２０．前記分析物質が、食品、血液、血清、尿および治療剤として用途のために 調製したタンパク質類であり、および、前記進行グリコシル化最終産物が、Ｈｂ −ＡＧＥ、ＡＧＥ−ＨＳＡ、血清ＡＧＥ−ペプチド類、尿中ＡＧＥ−ベブチド類 、および治療剤タンパク質−ＡＧＥから選択されることを特徴とする請求項１７ 項に記載の検査キット。
21. ２１．前記キットが、前記進行グリコシル化最終産物類の形成および増加に対し て活性であると考えられている潜在的物質または薬物を生体試料に添加して、そ の活性を評価するための生体試料を含有していることおよび前記キットが薬物発 見アッセイとして使用されることを特徴とする請求項２０項に記載の検査キット 。
22. ２２．前記標識物が酸素、蛍光を発する化学物質および放射性同位元素であるこ とを特徴とする請求項１６項に記載の検査キット。
23. ２３．請求項１項乃至４項のいずれか１項に記載の方法を実施することからなる 、哺乳類におけるインビボフラクトースレベルの測定および／またはモニタリン グからなる方法。
24. ２４．進行グリコシル化最終産物類の存在および量の変化が関連している薬物ま たは食事療法の過程と奏功性をモニタリングするためのインビトロ方法で、請求 項１項乃至４項のいずれか１項に記載の方法を実施することを特徴とする方法。
25. ２５．請求項２４項に記載の方法で、前記測定されるＡＧＥが、Ｈｂ−ＡＧＥ、 ＡＧＥ−ＨＳＡ、血清ＡＧＥ−ペブチド類、尿中ＡＧＥ−ペブチド類、および治 療剤としての用途のために調製したタンパク質類から形成したタンパク質−ＡＧ Ｅから群から選択されること、および、前記方法が血糖および／または腎機能の 長期評価のための方法からなることを特徴とする方法。
26. ２６．請求項１項乃至４項のいずれか１項に記載の方法を実施することからなる 、糖尿病の発症を検出するための方法。
27. ２７．ひとつの兆候が異常ＡＧＥｓレベルである疾患を患者において治療する方 法で、前記患者血清を抗ＡＧＥ抗体類に暴露させ、抗ＡＧＥ抗体：ＡＧＥ複合体 を形成させること、および 前記複合体を前記血清から除去することからなる方法で、 前記抗ＡＧＥ抗体類がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性であり 、および、下記の特任： ｉ．それらが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； ｉｉ．それらが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および ｉｉｉ．それらが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、 およびペントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
28. ２８．前記ＡＧＥｓがＨｂ−ＡＧＥ、血清ＡＧＥ−ペブチド類、および尿中ＡＧ Ｅ−ペプチド類からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７項の方法 。
29. ２９．前記標識物が、酵素、蛍光を発する化学物質および放射性同位元素である ことを特徴とする請求項２８項に記載の検査キット。
30. ３０．抗ＡＧＥ抗体類によって認識されおよび抗ＡＧＥ抗体類に結合し、および 、哺乳類ＡＧＥレセプター類によるＡＧＥｓの認識を阻害する化合物を薬剤学的 に許容できる担体と併用してなる薬剤組成物で、前記抗ＡＧＥ抗体類がインビポ 生成進行グリコシル化最終産物類と反応性であり、および、下記の特性： ｉ．それらが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原 決定基と反応性であること； ｉｉ．それらが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であ ること；および ｉｉｉ．それらが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交 差反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、 およびペントシジン、 を有していることを特徴とする組成物。
31. ３１．薬剤学的に許容できる担体と併用した抗ＡＧＥ抗体類を含有する薬剤組成 物で、 前記抗ＡＧＥ抗体類がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性であり 、および、下記の特性： ｉ．それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原決 定基と反応性であること； ｉｉ．それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性である ｉｉｉ．それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交差 反応往でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、お よびペントシジン、 を有していることを特徴とする組成物。
32. ３２．請求項３０項または３１項のいずれかに記載の薬剤組成物であり、前記進 行グリコシル化最終産物類が、Ｈｂ−ＡＧＥ、ＡＧＥ−ＨＳＡ、血清ＡＧＥ−ベ ブチド類、および尿中ＡＧＥ−ベブチド類およびその組み合わせからなる群から 選択されることを特徴とする組成物。
33. ３３．哺乳類における疾患を治療する方法で、その特徴のひとつが、ＡＧＥｓの 増加レベルであり、前記哺乳類に対して請求項３０項または３１項のいずれかに 記載の組成物の有効量を投与することからなる方法。
34. ３４．哺乳類における血糖の存在、程度またはコントロールを長期測定する方法 で、ヘモグロビンまたは血清タンパク質試料を前記哺乳類から得ること；前記ヘ モグロビンまたは血清クンバク質の進行グリコシル化のレベルを測定すること； 進行グリコシル化ヘモグロビンまたは血清タンパク質のレベルを標準と比較する こと、 からなる方法。
35. ３５．治療剤としての用途のために調製したある量のタンパク質物質を、その中 に存在する全てのタンパク質−ＡＧＥｓを除去するために精製する方法で、前記 方法が、 （ａ）前記タンパク質−ＡＧＥｓ含有が疑われる前記量のタンパク質物質を、前 記タンパク質−ＡＧＥｓが前記抗ＡＧＥ抗体に結合するために十分な時間、前記 抗ＡＧＥ抗体に接触させること；および（ｂ）前記抗ＡＧＥ抗体に結合した前記 タンパク質−ＡＧＥｓを前記タンパク質物質の残りから分離すること； からなり、 （ｃ）前記抗ＡＧＥ抗体がインビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性で あり、および、下記の特性： ｉ．それが、前記インビポ形成連行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原決 定基と反応性であること； ｉｉ．それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性である こと；および ｉｉｉ．それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交差 反応性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ピラリン、カルボキシメチルリシン、お よびペントシジン、 を有していることを特徴とする方法。
36. ３６．請求項６項に記載の方法を実施することからなる、哺乳類宿主における異 化活性の発現または存在を検出する方法。
37. ３７．哺乳類における侵製性または特発性の刺激の存在を決定する方法からなる 請求項３６項に記載の方法。
38. ３８．インビポ生成進行グリコシル化最終産物類と反応性である１種以上の抗体 類を含有しおよび下記の特性： Ａ．それが、前記インビポ形成進行グリコシル化最終産物類に共通の免疫抗原決 定基と反応性であること； Ｂ．それが、インビトロ形成進行グリコシル化最終産物類と交差反応性であるこ と；および Ｃ．それが、しかし、形成された下記の進行グリコシル化最終産物類と交差反応 性でないこと：ＦＦＩ、ＡＦＧＰ、ビラリン、カルボキシメチルリシン、および ペントシジン、 を有していることを特徴とする抗血清。
39. ３９．インビトロで形成されおよび前記抗血清に反応性の進行グリコシル化最終 産物類が、ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅ、ＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−アルブミン、 ＡＧＥ−ＬＤＬ、ＡＧＥ−コラーゲンＩＶ型、ＮａＢＨ４還元ＡＧＥ−ＢＳＡ、 および混合物類からなる群から選択されたことを特徴とする請求項３８項に記載 の抗血清。
40. ４０．前記抗血清が、外来性のタンパク質または還元性糖とインキュベーション したタンパク質の反応生成物で哺乳類を免疫することによって調製されたことを 特徴とする請求項３８項に記載の抗血清。
41. ４１．前記抗血清が、哺乳類をＡＧＥ−ＲＮＡｓｅによって免疫して調製された ことを特徴とする請求項４０項に記載の抗血清。
42. ４２．前記抗血清が、増加レベルの進行グリコシル化最終産物類を含有する糖尿 病組織および血清と反応することを特徴とする請求項３８項に記載の抗血清。
43. ４３．前記抗血清が、実験的誘発糖尿病の対象由来のラット大動脈コラーゲン、 および、糖尿病対象からのヒト血清と反応することを特徴とする請求項４２項に 記載の抗血清。
44. ４４．前記抗血清が高力価であることを特徴とする請求項３８項に記載の抗血清 。
45. ４５．力価が、アルカリホスファターゼ連結２次抗体および比色基質としてのｐ −ニトロフェニルリン酸を用いて、５０％最大ＯＤ４０シグナルを付与する血清 希釈度から求められることを特徴とする請求項４４項に記載の抗血清。
46. ４６．前記高力価が、非競合ＥＬＩＳＡで求めた場合、少なくとも１０からなる ことを特徴とする請求項４４項に記載の抗血清。
47. ４７．前記抗原決定基が、ＲＮＡｓｅ、ヘモグロビン、リシン、コラーゲンＩＶ 型、ＬＤＬ、ＢＳＡおよびＨＳＡからなる群から選択されたタンパク質性物質と 還元性糖とをインキュベーションすることによって形成されたことを特徴とする 請求項３８項に記載の抗血清。
48. ４８．前記還元性糖が、グルコース、グルコース−６−リン酸、フラクトースお よびリポースからなる群から選択されたことを特徴とする請求項４７項に記載の 抗血清。
49. ４９．前記抗原決定基がグルコースをＲＮＡｓｅとインキュベーションすること によって形成されたことを特徴とする請求項３８項に記載の抗血清。
50. ５０．前記抗血清が反応性であるインビポ形成進行グリコシル化最終産物類が形 成され蛍光を発することを特徴とする請求項３８項に記載の抗血清。
51. ５１．前記抗血清が反応性であるインビポ形成進行グリコシル化最終産物類が、 初期グリコシル化生成物の活性カルボニルに反応可能である進行グリコシル化最 終産物類グリコシル化阻害剤の存在によって、それらの形成が阻害されることを 特徴とする請求項３８項に記載の抗血清。
52. ５２．請求項３８項に記載の抗血清から調製されたインビポ産生進行グリコシル 化最終産物類に対する抗ＡＧＥ抗体。
53. ５３．ＡＧＥ−ＲＮＡｓｅに対する抗血清から調製されたインビポ産生進行グリ コシル化最終産物類に対する抗ＡＧＥ抗体。
54. ５４．前記抗血清がホリクローナルでありおよびグルコースでインキュベーショ ンしたウシＲＮＡｓｅに対してウサギで作製されたことを特徴とする請求項５３ 項に記載の抗体。
55. ５５．検出可能標識物によって標識された請求項５３項に記載の抗血清。
56. ５６．検出可能標識物によって標識された請求項５２、５３または５４項に記載 の抗血清。
57. ５７．前記標識物が、酸素類、蛍光を発する化学物質類および放射性同位元素類 からなる群から選択されることを特徴とする請求項５５項に妃載の抗血清。
58. ５８．前記標識物が酸素類、蛍光を発する化学物質類および放射性同位元素類か らなる群から選択されることを特徴とする請求項５８項に記載の抗体。