CN1079825A - 体内高级糖基化终产物的免疫化学检测 - Google Patents

体内高级糖基化终产物的免疫化学检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了作为以存在AGE浓度可测性变 化为特征的疾病或功能紊乱的长期标记的循环性高 级糖基化终产物Hb-AGE，血清AGE-肽和尿 AGE-肽。本发明还公开了利用这些AGE特征的 诊断和治疗方案和识别并结合体内形成的高级糖基 化终产物的抗体。本发明也公开了利用这些抗体和 药物组合物的方法以及大量的诊断性应用，包括在植 物和动物(包括人)中，以及在作治疗用途的培养和合 成蛋白材料中检测高级糖基化终产物存在与含量的 方法。

Description

下列文献因一般性地涉及本发明主题而被摘录如下：
“FUNCTION    OF    MACROPHAGE    RECEPTOR    FOR    NONENZYMATICALLY    GLYCOSYLATED    PROTEINS    IS    MODULATED    BY    INSULIN    LEVELS"，Vlassara，Brownlee    and    Cerami，DIABETES（1986），Vol.35    Supp.1，Page    13a;"ACCUMULATION    OF    DIABETIC    RAT    PERIPHERAL    NERVE    MYELIN    BY    MACROPHAGES    INCREASES    WITH    THE    PRESENCE    OF    ADVANCED    GLYCOSYLATION    ENDPRODUCTS"，Vlassara，H.，Brownlee，M.，and    Cerami，A.J.EXP.MED.（1984），Vol.160，pp.197-207;"RECOGNITION    AND    UPTAKE    OF    HUMAN    DIABETIC    PERIPHERAL    NERVE    MYELIN    BY    MACROPHAGES"，Vlassara，H.，Brownlee，M.，and    Cerami，A.DIABETES（1985），Vol.34，No.6，pp.553-557;"HIGH-AFFINITY-RECEPTOR-MEDIATED    UPTAKE    AND    DEGRADATION    OF    GLUCOSE-MODIFIED    PROTEINS：A    POTENTIAL    MECHANISM    FOR    THE    REMOVAL    OF    SENESCENT    MACROMOLECULES"，Vlassara    H.，Brownlee，M.，and    Cerami，A.，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.（Sept.1985），Vol.82，pp.5588-5592;"NOVEL    MACROPHAGE    RECEPTOR    FOR    GLUCOSE-MODIFIED    PROTEINS    IS    DISTINCT    FROM    PREVIOUSLY    DESCRIBED    SCAVENGER    RECEPTORS"，Vlassara，H.，Brownlee，M.，and    Cerami，A.JOUR.EXP.MED.（1986），Vol.164，pp.1301-1309;"ROLE    OF    NONENZYMATIC    GLYCOSYLATION    IN    ATHEROGENESIS"，Cerami，A.，Vlassara，H.，and    Brownlee，M.，JOURNAL    OF    CELLULAR    BIOCHEMISTRY（1986），Vol.30，pp.111-120;"CHARACTERIZATION    OF    A    SOLUBILIZED    CELL    SURFACE    BINDING    PROTEIN    ON    MACROPHAGES    SPECIFIC    FOR    PROTEINS    MODIFIED    NONENZYMATICALLY    BY    ADVANCED    GLYCOSYLATION    END    PRODUCTS"，Radoff，S.，Vlassara，H.and    Cerami，A.，ARCH    BIOCHEM.BIOPHYS.（1988），Vol.263，No.2，pp.418-423;"ISOLATION    OF    A    SURFACE    BINDING    PROTEIN    SPECIFIC    FORADVANCED    GLYCOSYLATION    ENDPRODUCTS    FROM    THE    MURINE    MACROPHAGE-DERIVED    CELL    LINE    RAW    264.7"，Radoff，S.，Vlassara，H.，and    Cerami，A.，DIABETES，（1990），Vol.39，pp.1510-1518;"TWO    NOVEL    RAT    LIVER    MEMBRANE    PROTEINS    THAT    BIND    ADVANCED    GLYCOSYLATION    ENDPRODUCTS：RELATIONSHIP    TO    MACROPHAGE    RECEPTOR    FOR    GLUCOSE-MODIFIED    PROTEINS"，Yang，Z.，Makita，Z.，Horii，Y.，Brunelle，S.，Cerami，A.，Sehajpal，P.，Suthanthiran，M.    and    Vlassara，H.，J.EXP.MED.，Vol.174，pp.515-524;"HUMAN    AND    RAT    MESANGIAL    CELL    RECEPTORS    FOR    GLUCOSE-MODIFIED    PROTEINS：POTENTIAL    ROLE    IN    KIDNEY    TISSUE    REMODELLING    AND    DIABETIC    NEPHROPATHY"，Skolnik，E.，Yang，Z.，Makita，Z.，Radoff，S.，Kirstein，M.，and    Vlassara，H.，J.EXP.MED.，Vol.174，pp.931-939;and    "HEMOGLOBIN-AGE：A    CIRCULATING    MARKER    OF    ADVANCED    GLYCOSYLATION"，Makita，Z.，Vlassara，H.，Rayfield，E.，Cartwright，K.，Friedman，E.，Rodby，R.，Cerami，A.，and    Bucala，R.，SCIENCE，（In    Press）.
所有上述出版物和所有本申请引用的其它文献均被引入本说明书用为参考。
本发明一般地涉及非酶学性糖基化蛋白质的检测和测量，并且，本发明特别涉及检测和测量已在体内被非酶学性糖基化的蛋白质的方法及相关材料。
已经证明，还原糖（如葡萄糖）可与蛋白质的氨基发生非酶学性反应，形成具有荧光和交联特性基团的各种蛋白质系列。这些化合物被称作高级糖基化作用终产物（“AGEs”），它们牵涉到在衰老及某些疾病（如长程糖尿病）过程中蛋白质结构和功能的改变。在重新开始合成和组织分离过程的基础上鉴定出了数种AGE。
还原糖和蛋白质的游离氨基之间的反应启动了被称为高能糖基化作用的翻译后修饰加工过程。该加工过程以还原糖与氨基间的可逆性反应开始，形成Schiff碱，然后加工过程继续进行，生成以共价键相联系的Amadori重排产物。Amadori产物一旦形成，即进行更进一步地重排，产生AGE。
因为上述这些反应缓慢发生，所以，在体内的AGE积累至一个可测量之前蛋白质可积累足够量的Amadori产物。这些AGE能导致蛋白质交联，继而减弱各种器官及器官局部的结构和/或功能的完整，最终极大地减弱或损害了器官功能。
高级糖基化加工过程特别值得注意的是它见于具有长半衰期的蛋白质中，如胶原蛋白，以及相对高的糖浓度条件下，如糖尿病。大量的研究表明，AGE在衰老和慢性疾病过程中出现的蛋白质结构和功能性变化方面起着重要作用。
此外还注意到，高级糖基化终产物在糖尿病、半乳糖血症以及其它疾患组织中比在正常组织中更容易形成。
据信，某些高级糖基化终产物普遍具有特征性棕黄色色素沉积、特征性荧光谱和形成蛋白质-蛋白质交联的能力。AGE在体内形成，并已从天然糖基化材料中分离出来。这些产物以低含量存在，具有结构异源性，并对于化学还原反应和水解反应具不稳定性。再合成和分离方法已鉴定出数种AGE，如2-（2-呋喃甲酰）-4（5）-（2-呋喃基）-1-氢-咪唑（“FFI”）;5-羟甲基-1-烷基吡咯-2-甲醛（“Pyrraline”）;1-烷基-2-甲酰基-3，4-二糖基吡咯（“AFGF”，一种非荧光型AGE）;羧甲基赖氨酸以及戊糖苷定（Pentosidine）。但是，体内形成的AGE并不限于这些确知的化学物质，而且本文还提及新发现的AGE。
过去，对体外合成的特定AGE的研究必需应用化学还原和水解方法。这就产生了一种可能性，即天然存在的AGE将包括具有不同于已分离出的典型化合物的其他结构的其它化合物。
人们还做出各种努力去激发产生抗体内AGE的抗体，但至今还不知道或未见报道有成功的例子。因此，Nakayama等人（BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMM.，162∶2，p740-745，1989）研究了被蛋白质结合的AGE，并专门还生产了针对来源于体外糖基化作用的AGE-KLH的抗血清。这些抗血清显示出了高的亲和结合力，并且所记录的体外形成的AGE-BSA、AGE-HSA和AGE-RNAseA的系列稀释曲线为彼此平行，这表明在这些特定AGE-蛋白质中存在被抗血清识别的共有结构。使用一些还原剂进行进一步的研究以确定被识别的结构是否源于高级Maillard反应物或早期的化合物，如Schiff碱加合物和Amadori重排产物。用还原剂进行的处理并没有降低免疫反应性，而FFI不被抗体识别。重要的是，由Nakayama等人制备和试验的抗体并没有被确定与体内形成的AGE反应。
Horiuchi等人（J、BIOL.CHEM.，266（12），p7329-7332，1991）制备了抗体外来源的AGE-牛血清白蛋白的多克隆和单克隆抗体。Horiuchi等人的抗体也识别体外来源的AGE-人血清白蛋白和AGE-血红蛋白，但不识别未修饰的配对物，用还原剂处理这些AGE蛋白质不影响免疫反应性。与Nakayama等人制备的抗体一样，也未确定Horiuchi等人制备的抗体与体内形成的AGE发生反应。
据此，尽管现有技术已熟练地制备了有关抗体，但这类抗体与体内形成的AGE的反应是以前所未能达到的。这类抗体的制备是必需的，因为它有可能发展和完善有关在包括人类的哺乳动物中对高级糖基化终产物形成所设计的诊断和治疗。
首先，本发明涉及与体内产生的高级糖基化终产物反应的抗体。因而还包括一种含有与体内形成的高级糖基化终产物发生反应的抗体的抗血清，并具有如下特性：
A.它与体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇反应;
B.它与体外形成的高级糖基化终产物有交叉反应;
C.但与所形成的下列高级糖基化终产物不具交叉反应：FFI、AFGP、Pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（Pentosidine）。特别是，还原糖与选自RNAse、赖氨酸、血红蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、LDL、BSA和HSA的蛋白质材料一起孵育形成共同抗原决定簇。
本发明的抗体可以是多克隆的或是单克隆的，并且，如果是单克隆抗体，则可以通过杂交瘤方法或其它已知重组技术进行制备。正如本文所描述的，用AGE或已在其上形成了AGE的蛋白质对有免疫能力的哺乳动物进行超免疫，即可在所说的哺乳动物中产生抗体。所产生的抗体识别并结合体内形成的AGE、含有这类AGE的样本（如糖尿病组织或血清）以及与糖类一起孵育后在蛋白质上形成的体外形成的AGE。
本发明的抗AGE抗体的特征同样在于它们不识别某些已合成生产的AGE，如FFI、Pyrraline、AFGP、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（Pentosidine）。
本文所描述的抗AGE抗体还具有如下特征：
（a）.抗体可以通过用AGE-RNAse对哺乳动物进行超免疫而形成;
（b）.抗体可与下列AGE反应：AGE-RNAse、AGE-血红蛋白、AGE-BSA、AGE-HSA、AGE-Ⅳ型胶原蛋白、AGE-LDL和AGE-赖氨酸;
（c）.抗体不与下列未修饰的物质发生反应：HSA或BSA、FFI-BSA、甲酰化白蛋白、顺丁烯二酰化白蛋白、LDL、Ⅳ型胶原蛋白、乙酰-LDL、FFI、AFGP、Pyrraline、羧甲基赖氨酸、戊糖苷定（Pentosidine）、赖氨酸、脱氧丙氨基果糖或脱氧吗啉代果糖。
其次，本发明的抗AGE抗体可以从已用某一特定AGE-蛋白质接种的适宜宿主产生的抗血清中回收。优选的方法包括给有免疫能力的哺乳动物施用有效量的AGE或上述含AGE的复合物以诱导本发明抗AGE抗体的形成，从哺乳动物获取含抗AGE抗体的血清。所说的特定AGE-蛋白质包括RNAse与葡萄糖一起孵育的产物。
本发明另外还涉及对样本中AGE的存在或含量进行检测的免疫测定法，包括：
（a）.将疑为含有AGE的样本、AGE载体、抗AGE抗体或另外一种AGE结合配对物结合到固相载体上;
（b）.将附着于固相载体上的标本与准备进行AGE存在或含量测定的分析物、抗AGE抗体或其它AGE结合配对物接触;
（c）.用可检测的标记物标记AGE、抗AGE抗体或其它结合配对物;
（d）.与标准品比较被结合的标记物量。
上述检测方案适用于检查植物和动物材料中AGE的存在，例如，用于检测食物腐败的可能性或发生，并且，本发明有意于扩大这方面的应用。
本发明进一步包括本发明抗体在哺乳动物疾病检测中的应用，所说疾病的特征在于存在不正常的AGE水平，如Hb-AGE、血清AGE肽和尿AGE肽。所用的抗体可以是多克隆抗体或是单克隆抗体，其特征如前文所述。
本发明还包括适用于本文所述检测/诊断检测试剂盒，它包括用于检测或定量AGE，如样本中的Hb-AGE、尿和血清AGE-肽、AGE-抗体或其它AGE结合配对物的合适试剂。
本发明还包括治疗组合物和这些组合物在疾病的预防、诊断或治疗中的应用方法，其中，给需要这种处理的病人施用有效量的上述组合物。
本发明进一步还延伸到涉及与血红蛋白形成复合物的高级糖基化终产物（下文称作Hb-AGE），并对它进行了进一步详细的评说，尤其是在Hb-AGE作为诊断工具的能力方面。据此，Hb-AGE显示出了广泛的活性，即Hb-AGE和/或其抗体不仅可用于检测血糖病理状况或糖尿病的发生，还可以用于这类病理状态过程中的长程监测，以检测这种状况程度的变化。同样，本发明还研究了Hb-AGE和其拮抗剂的临床应用。
本发明还延伸到有关尿和血清中AGE-肽的测量以及随后的诊断与治疗应用。尿AGE-肽水平是组织AGE翻转的象征，因而还在糖尿病及糖尿病并发症的评估中有用，并且特别是在短程和长程（如，达到约60-90天）的血糖水平控制中有用。血清AGE-肽对肾性疾患有预见作用，特别是可以对其测量以确定肾小球滤过率（GFR）。因此，波及到肾脏的糖尿病性并发症可以进行监测，并且可以用血清AGE-肽评估试验药物对肾脏的作用及身体其它部位的AGE水平。血清AGE-肽还可用于检测药物的AGE诱导或AGE-形成作用和评价AGE抑制剂的治疗效果，因为血清肽源于长生命蛋白。
因此，本发明还涉及到Hb-AGE、血清AGE-肽和尿AGE-肽的测量和进行有关糖浓度或AGE浓度的病理状态的长程和短程监控相关方法。本发明也包括对哺乳动物、尤其是人血清白蛋白AGE（AGE-HSA）的测量，以及对食品腐败的评估和对包括重组制备物在内的欲用作治疗药的蛋白质的测量。在上述最后一个方面，本发明包括本发明的AGE抗体在上述蛋白制剂纯度监测方法中的应用和从制剂中去除糖基化蛋白的有关纯化方法中的应用。这类方法可以限制使用必要的已知临床上对宿主有害的糖基化蛋白。
确定以Hb-AGE作标致的疾病的存在或程度的方法包括从哺乳动物采血或其它血清样本，确定样本中Hb-AGE的存在或含量，将该含量与标准相比较。
Hb-AGE检测提供了一个长期的组织改变的合适指标，并有助于确定高级糖基化作用在各种糖尿病及老化相关性并发症中的分布。尽管报道认为血红蛋白A10（HbA10）是作为血红蛋白β链上糖基化（glycation）程度的预兆，HbA10仅是高级糖基化作用途径中的中间体，并且相信存在大量其它的中间体。但是，HbA10并不代表病理状态，因而相信Hb-AGE水平是疾病、药物有效性等的最好检测指标。Hb-AGE用于本发明更易于涉及到疾病的进展和血糖水平的长期调控（大于约3-4周）。氨基胍治疗所致的Hb-AGE水平的降低，就是在人体中检测到对高级糖基化作用进行成功的药物性抑制的基本例子。
因此，本发明的主要目的是提供一种含有能识别并结合到体内形成的AGE上的抗体的抗血清和制备含有至今未生产过的抗AGE抗体的抗血清的方法。
本发明的目的还在于提供了用上述抗血清对经高级糖基化作用修饰的蛋白质进行检测的免疫化学测定技术。不用化学还原和水解方法已在体外制备了AGE免疫原，并用这些AGE在体内产生了抗血清。
本发明的目的还在于提供免疫测定技术，包括AGE免疫激发产生的多克隆抗体及单克隆抗体的应用，所用的抗体都对体内的AGE抗原决定簇具有特异性。
本发明的目的还在于提供了一种在各种生物样本中检测高级糖基化终产物的快速、可靠方法，其中利用了已经制备并进行特征鉴定的抗AGE抗体。
本发明的目的还在于提供了含有用于检测AGE的合适试剂的试剂盒，包括选用Hb-AGE、血清AGE-肽和尿AGE-肽作内在标准物质，适用于广泛选择的免疫学方法。
本发明的目的还在于提供了对包括糖尿病在内的血糖病理状况进行长期监测的方法，该方法通过检测AGE，如Hb-AGE、血清AGE-肽及尿AGE-肽进行，方法快速、可靠。
综观本文的详细描述并结合下面的附图，普通的专业技术人员将很容易理解本发明的上述目的和其它目的。
图1是抗AGE-RNAse抗血清的抗血清稀释曲线，用下列被吸附的抗原在非竞争性ELISA中对抗血清滴定：RNAse（○）、来源于葡萄糖的AGE-RNAse（●）、BSA（△）、来源于葡萄糖的AGE-BSA（▲）和源于G6P的AGE-BSA（
Figure 921152353_IMG8
）;
图2是抗AGE-RNAse抗血清的ELISA竞争曲线。检测根据材料与方法部分所述进行，应用源于葡萄糖的AGE-BSA作吸附抗原。所有的点代表三份试样测定的平均数。
（上图）：与各种被修饰的白蛋白的反应：源于葡萄糖的AGE-BSA（●）、源于G6P的AGE-BSA（▲）、源于果糖的AGE-BSA（ ）、FFI-BSA（△）、甲酰化BSA（
Figure 921152353_IMG10
）、顺丁烯二酰基-BSA（◇）和BSA（○）。
（中图）：与AGE修饰的和未修饰的蛋白质的反应：源于G6P的AGE-HSA（●）、源于葡萄糖的AGE-LDL（▲）、源于葡萄糖的AGE-Ⅳ型胶原蛋白（◆）、源于葡萄糖的AGE-RNAse（■）、HSA（○）、LDL（△）、乙酰基-LDL（
Figure 921152353_IMG11
）、Ⅳ型胶原蛋白（◇）、RNAse（□）。在载脂蛋白B分子量的基础上计算LDL的毫微摩尔量。
（下图）：与标准AGE的反应：源于葡萄糖的AGE-赖氨酸（●）、源于G6P的AGE-赖氨酸（◆）、FFI-HA（○）、Pyrraline（▲）、AFGP（
Figure 921152353_IMG12
）、羧甲基赖氨酸（■）、戊糖苷定（Pentosidine）（□）、脱氧丙氨基果糖（△）和脱氧吗啉代果糖（
Figure 921152353_IMG13
）。加入与赖氨酸相当毫微米摩尔的AGE-赖氨酸产品;
图3是AGE相关性荧光形成和抗体反应材料间的动力学关系。BSA（50mg/ml）与葡萄糖（0.5M）一起孵育（见材料与方法部分所述）。在指定时间取等份试样，透析去掉未结合物，通过ELISA检测荧光（λ激发＝370nm，λ发射＝440nm）和AGE含量;
图4是氨基胍对抗体反应性AGE形成的抑制作用。BSA（100mg/ml）与葡萄糖（100mM）在37℃孵育21天（○）。BSA（100mg/ml）与葡萄糖（100mM）在100mM氨基胍存在条件下于37℃孵育21天（●）。缓冲液条件同材料与方法部分;
图5是实验大鼠中AGE-胶原蛋白的测定。如材料和方法部分所述，用阿脲或链脲佐菌素在Lewis大鼠中诱发糖尿病。每隔16周，处死6只动物，通过ELISA对主动脉胶原进行羟脯氨酸、荧光及AGE含量分析。测量值以每毫克的羟脯氨酸表示。上图：在λ激发＝370nm和λ发射＝440nm时测得的相对荧光。下图：由ELISA测得的胶原结合的AGE。对照鼠（○），由阿脲诱发糖尿病的大鼠（△），由链脲佐菌素诱发糖尿病的大鼠（
Figure 921152353_IMG14
）。所显示的每一测量值都是6只实验动物的平均数;
图6是人血清AGE水平的测定。NL：正常个体（n＝12）。DM：糖尿病个体（n＝21）。DM+HD：进行血液透析的糖尿病个体（n＝16）。误差短线表示标准误（S.E.M.），DM与NL相比P＜0.001，DM+HD与DM相比P＜0.001;
图7是正常和糖尿病病人红细胞中Hb-AGE和HbA1C水平的比较图，因而描绘了两者（正常病人＝■，糖尿病病人＝□）间的关系;
图8包括表示和比较正常及糖尿病病人的Hb-AGE与HbA1C水平平均值的两个条图;
图9描绘了通过ELISA在23个糖尿病个体（DM）和9个非糖尿病的正常血糖个体（NL）中检测Hb-AGE水平的结果。NL：4.3±0.3AGE单位/mg    Hb，DM：7.7±0.6AGE单位/mg    Hb，（平均数±标准差）。每个值代表三份试样测定的平均数，于3-4个血红蛋白稀释度进行检测以保证检测值落入标准ELISA曲线的线性范围。AGE单位相对于合成的AGE-白蛋白标准品进行计算，并按所述分析AGE含量。
图10表示了9个正常血糖个体（○）和23个糖尿病个体（●）中Hb-AGE和HbA1C水平间的关系。HbA1C通过HPLC测量。
图11是体外Hb-AGE形成图。人血红蛋白（50mg/ml）（Sigma Chemical Co.）在含0mM葡萄糖（○）、5mM葡萄糖（●）、20mM葡萄糖（▲）或20mM葡萄糖与50mM氨基胍（◆）的0.4M NaPO4缓冲液（pH7.4）中于37℃孵育。在进行ELISA（
Figure 921152353_IMG15
）前用200倍克分子浓度的过量溴化钠还原含血红蛋白和20mM葡萄糖的等份试样。在存在5mM葡萄糖的条件下氨基胍（50mM）还抑制（＞95%）Hb-AGE的形成（数据未给出）。在进行ELISA分析前的1小时将氨基胍（50mM）加入到葡萄糖/血红蛋白孵育体系中不抑制对Hb-AGE的检测（数据未给出）。所有的孵育在灭菌过滤后进行。在指定的时间点取1ml样，并在ELISA分析前对磷酸缓冲盐溶液进行透析。
图12是18个糖尿病患者在氨基胍治疗前（■）和治疗（
Figure 921152353_IMG16
）28天后的Hb-AGE和HbA/c水平的测定。Hb-AGE：13.8±0.8U AGE/mg Hb→10.0→0.9U AGE/mg    Hb;HbA/c：10.1%±0.8%→9.2%±0.8%（平均数±标准误）。
本文采用了大量缩写以简化所用的术语并利于更好地理解本发明。下而说明各缩写所代表的含义。
本文所用的术语“AGE”和“AGEs”恰当地是指中间体形式的高级糖基化作用终产物，和通过还原糖与蛋白质氨基反应在体内和体外产生的稳定化合物。因此AGEs包括与年龄老化过程中所出现的蛋白质结构与功能改变相关的中间体及稳定的终产物。例如，AGE被认为与游离的多肽氨基反应，导致蛋白质交联。此外，在某些疾病中，如糖尿病中，还观察到循环及组织中的这些AGE水平提高了。
所使用的命名“AGE-RNAse”、“AGE-Hb”、“AGE-BSA”、“AGE-HSA”、“AGE-白蛋白”、AGE-胶原蛋白和“AGE-LDL”各指在底物RNAse、Hb、BSA、HSA、白蛋白、胶原蛋白和LDL分别与一种或多种还原糖进行化学反应的基础上形成的高级糖基化终产物。因此，AGE-RNAse指的是牛核糖核酸酶与一种还原糖之间进行反应的高级糖基化终产物。
白蛋白在一般性叙述时指的是任何可以得到的种类，如人、牛等。
BSA指的是牛血清白蛋白。
HSA指的是人血清白蛋白。
RNAse一般指的是核糖核酸酶，而在适当之处特别指的是牛胰腺核糖核酸酶。
所说的胶原蛋白在常规意义上指的是任何类型的胶原蛋白，并具有任何合适的来源。当象在实施例中那样用到具体类型的胶原蛋白时，就描述为特定的类型。当然，应该认识到所用的胶原蛋白类型是可以选择的。
LDL在常规意义上指的是低密度脂蛋白。
FFI-BSA指的是通过将2-（2-呋喃甲酰）-4（5）-（2-呋喃基）-1-咪唑己酸与牛血清白蛋白一起孵育并将反应复合物与二环己基碳化二亚胺偶联产生的典型AGE-蛋白质。甲醛-BSA、顺丁烯二酰-BSA和乙酰-LDL都是指如下文所述产生的修饰蛋白。
本发明涉及某些体内生成的AGE，特别是Hb-AGE，血清AGE肽和尿AGE肽的检测，本发明还涉及应用上述检测的诊断和治疗。将Hb-AGE用为一种标记加以应用有助于血糖水平的长期检测，继而能够监测诸如存在于糖尿病中的血溏病理状况。正如本文提供的资料所证实的，Hb-AGE与已知的测定因子HbA1C相比，其水平因施用体内糖基化反应（glacation）抑制剂氨基胍被降低，并因此代表了新近血糖水平的一种临床精确时间结合参数，该参数在诊治方面具有更广泛的用途。
本发明特别利用了使用抗AGE抗体的竞争性ELISA系统，做为该系统的一部分，抗AGE抗体在专利申请序号07/811，579中有全面地描述。并包括了一种快速、有效的诊断方法，如图9所示，Hb-AGE代表一种稳定的和可靠的来源于葡萄糖的重排Amadori产物。围绕该产物可设计和施行一种诊断方案。因此，本发明延伸及进行体内血糖病理状况长期监测的方法对伴随完成的任何对照检测之功效的评估。
本发明还延伸及其它AGE，特别是血清和尿AGE肽的检测。象Hb-AGE一样，血清和尿AGE-肽代表AGE积聚的循环标记物，而这种积聚反映了以积聚为特征的病理状态和其它功能紊乱的发生和程度。因此，通过检测这些AGE，特别是借助于本文公开的诊断方法，可以对已观察到AGE水平增加的老化相关性及糖尿病性病理状态（例如动脉粥样硬化、白内障和糖尿病性肾病）进行长期的监测和评估。
同样，包括以Hb-AGE或所提及的AGE-肽作为标记物或测定因子的方法可用作药物筛选测定方法，以鉴别可与这些AGE相互作用的药物或其它物质。以Hb-AGE为例，它可能检出控制血糖浓度或控制Hb-AGE自身形成的因子。在这种情况下，检测或测定试剂盒将包括在后文为这些试剂盒提出的那些试剂，以Hb-AGE作为配体或配对物。还可以用与Hb-AGE具有相同作用的所述AGE肽制备类似的检测或试剂盒。
由于缺乏特异性检测方法和体内分析普遍难得到组织AGE，阻碍了对体内AGE形成的研究。了解了Amadori产物（如HbA1C）是AGE前体，才认识到血红蛋白也可以获得能用新近发展的ELISA技术检测到的AGE修饰作用。
已确定Hb-AGE占循环的人血红蛋白的约0.42%。在糖尿病引起的高血糖症病人中，该比例增加到约0.75%。重要的是，用体内AGE形成的抑制剂氨基胍治疗28天的糖尿病患者在治疗末期表现出AGE水平的显著降低。
由高级糖基化作用所致的组织和终末器官损害经数月至数年的积累而成。糖尿病并发症同期发展。
如上所述，本发明尤其重要的方面是在糖尿病患者中应用Hb-AGE作为血糖控制程度的指标。考虑到正常Hb-AGE水平和Hb-AGE形成过程中的反应时间，存在于血液中的Hb-AGE水平能够对疾病起预见作用，并可预见当Hb-AGE水平高于正常值时出现病理状态。
同样，血清肽-AGE也能用作反映肾小球滤过率（GFR）和肾损害的指标。尿AGE-肽也可以用作检测组织蛋白质变化，尤其是组织AGE蛋白质变化的指标。
在Hb-AGE和血清-肽检测中，抽取血样并进行分离。可将血细胞成分与血清分离，而在Hb-AGE检测中，可从红细胞中提取血红蛋白，从而估计AGE-肽的血清水平和Hb-AGE的存在或含量。
在用单个血样进行所述两种测定时，可以估计血糖水平发生不可控制变化的更宽时间范围，例如由Hb-AGE推断的60天的范围，把由Hb-A10预计的3-4周时间范围扩展到该范围前，中、后。如果需要的话，Hb-AGE的血清AGE-肽的分析也可以与血糖或尿糖水平测定、葡萄糖耐量试验和包括检测尿AGE-肽在内的评估糖尿病控制的其它有用的试验一起进行，以给出一个全面的病人档案。
本发明的另一方面涉及能在尿中检测的高级糖基化终产物。在正常的个体中，蛋白质（包括肽）可以以低含量从尿中排出，而在患病个体中可能以增高的含量排出。可以确定反映组织AGE变化的尿AGE-肽的存在和/或水平，它可预见并与特定疾病或病理状态有关。例如见于正常尿液中的肽含量范围通常是25-50mg/天，并且由微蛋白组成，其性质与占主要量的血蛋白质、白蛋白和球蛋白有很大差别。
尿蛋白的存在可以是大多数疾病或病理状态下的一个症状，反映了存在于正在遭受感染侵袭的宿主或患者体内的基本代谢状态。在这种情况下，宿主通过分泌大量因子（如细胞分裂素，cytokines）进行对抗外来刺激的动员，中止合成能量贮存活动及细胞修复活动，取而代之的是促进能量贮存代谢耗尽和白细胞及其它因子的再补充，以对抗和中和外来刺激。由于上述作用导致组织蛋白质水平的相应提高，及组织AGE相应水平提高，尿AGE-肽的检测又提供了检测可能对宿主产生侵袭活动（如恶病质和休克）的另外一个指标。因此，人们可以检测尿液中AGE-肽的存在或含量，并与标准值相比较。在正常的个体中，正常的水平等于或近乎于零。在糖尿病患者或正在经受感染或其它损伤的患者中，AGE-肽的正常水平会明显提高。因此，通过检测到尿AGE-肽水平的提高能够在肾并发症发生前检测出糖尿病的进展或恶化，或者检测出感染的存在。
同样，还可以检测产生蛋白质糖基化作用比正常人快的个体。在这种情况下，可以测定在用诸如葡萄糖（一种可以诱导机体蛋白质形成或释放AGE的化合物）进行特定刺激后的尿AGE-肽水平，或者测定停止施用一种AGE抑制剂（如氨基胍）之后尿肽-AGE水平增加的速度。因而一个全面的临床写照将变得显而易见。
本发明还涉及检测这类AGE-肽在血清中的存在或含量。这种检测可以考虑包括AGE积聚的程度和与循环系统中出现的胞外及胞内血液蛋白、蛋白片段和肽（较短链氨基酸，如长度为约50个氨基酸）的反应。可以估计AGE的存在或含量，测定高级糖基化（ghycation）的程度，并与标准值（如正常的肽糖基化（glycation）水平）进行比较。例如，如果检测到血中AGE-肽水平的增高，即可将此与病人遭受的肾损害程度相联系。
Amadori产物具有缓慢的可逆性，据信在3-4周期间恢复平衡。相反，附着于蛋白质上的AGE保持不可逆性，并在蛋白质的生命期中持续积聚。因而，将Hb-AGE检测作为高级糖基化作用的长期体内标记加以应用是合适的。
如前所述，本发明还包括一种能识别并结合体内形成的高级糖基化终产物的抗血清及相应抗体的鉴别。正如下文实施例所示，已制备了多克隆AGE-RNA酶抗血清，并应用于竞争性ELISA体系中研究该抗血清对体外及体内来源的产物的特异性。所制得的抗血清在已知含有异常水平的AGE糖尿病组织和血清中识别并结合体内的AGE，因而得出了在它们中存在共同抗原决定簇的结论。相对之下，被合成和测试的每一种典型的合成AGE不与多克隆抗血清反应，尽管其它体外形成的AGE具有反应性。
适用于与还原糖进行孵育型反应的蛋白质及含蛋白质物质的例子包括例如RNA酶、血红蛋白、胶原蛋白、BSA和HSA，它们中的每一种都能与例如葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸（“G6P”）、果糖或核糖一起孵育，产生用于诱导抗AGE抗体形成的合适AGE免疫原。
这类抗AGE抗体也可以用于治疗病人，以降低循环AGE的水平或降低存在于某些组织中（如胰、肝、肾、脑）异常增高的AGE水平。
此外，本发明的范围还希望包括应用抗AGE抗体进行有益于治疗体内AGE水平增高的药物或化合物的设计、筛选和/或增效。在这方面，抗AGE抗体可用于纯化经特定培养或生产的蛋白质用作治疗剂。如前所述，不断增加这类蛋白质的治疗应用正显得突出和重要，并且这类蛋白质与其它的宿主细胞一样，易于糖基化（glycation）和形成AGEs，因为这类AGEs特别具有临床活性，因而希望在治疗过程中限制其引入宿主体内。所以本发明包括批量纯化这类蛋白的方法，包括使之与例如大量固定于某种合适底物上的抗AGE抗体接触。这样，就可以通过常规方法将糖基化的蛋白质与其余的同批材料分开。在商业性工艺过程中可对底物进行周期性再生或替代，以进行蛋白质材料通过底物的连续循环，继而分离蛋白质-AGE成分。当然，所述的方案仅为说明起见，可以在本发明范围内和本领域技术人员设计和施行上述方案时进行各种改变。
本发明还包括通过用抗AGE抗体测定所说高级糖基化终产物的存在、含量、位置和作用所进行的检测植物和动物中蛋白质老化的方法。借助于抗AGE抗体与疑为含有AGE产物的样本、植物材料和动物食品样本的反应可以估定食品腐败和受此影响的蛋白材料的变质，而对能够进行高级糖基化作用的动物，包括体液（如血液、血浆和尿液）、组织样本和生物分子（如DNA）进行检测有助于发现病理状况或其它系统性功能紊乱。
更进一步，上述检测可用于估计已经培养、收集或经另外的重组技术制备来作治疗性应用的蛋白质降解的程度，可用于确定这些材料是否发生了糖基化和/或发生糖基化的程度如何。该检测方法可以单独应用，或者与一种纯化方法结合应用，这样，蛋白材料已达到糖基化预定阈值水平的确定将表明有必要分批或连续进行如上所述的纯化过程。
本发明的检测方法涉及几个检测方案的实施，涉及标记或非标记的本文所描述的抗AGE抗体。分析物，和/或配体，一种或多种结合抗体的配对物以及作为可应用的结合配对物。
一般意义上的术语“结合配对物”指的是在检测中所用的彼此识别和/或结合的成分。因此，抗AGE抗体和被抗体识别的AGE被认为是结合配对物。
术语“结合配对物”也还包括用于本发明的配体，如结合至AGE结合配对物上的AGE衍生物。这些配体可以被逐一直接地检测，或者与第二检测配对物（如亲和素或生物素）相结合进行检测。适宜的合成AGE衍生物选自还原糖（如葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸（G6P）、果糖和核糖）和肽，蛋白质和其它生物分子（如BSA、亲和素、生物素衍生物）和酶（如碱性磷酸酶）的反应产物。
酶类和其它已进行高级糖基化作用的载体可用于本发明。这些AGE-酶作为本发明检测中的优选标记配体，其它合适的配体可包括还原糖直接与能够进行高级糖基化作用的载体反应的产物，合适的载体由选自碳水化合物、蛋白质、合成多肽、脂类、生物相容性的天然和合成树脂及上述物质的混合物的材料组成。
本发明的检测的形式是配体或结合配对物被结合到底物上，同样，检测要使用标记物，标记选自放射性元素、酶和发荧光的化学物质。
本发明的方法具有特殊的临床治疗相关性，因为它提供了检测和评估广谱器官体系状况的手段。Maillard过程灵敏地影响了体内几个较大的蛋白质类群，它们是胶原蛋白、弹性蛋白、晶体蛋白和肾脏的肾小球基底膜。这些蛋白质随着年龄的增长（因此而应用了术语“蛋白质老化”）和因长期暴露于增高的血糖水平及AGE形成而变质，后者继而频繁地导致病理状况。
以这种方式，可以鉴别高级糖基化终产物在体内的位置及相关浓度。因而通过检测不同的器官样本即可获取AGE“病人档案”，也就是鉴定AGE在病人体内的位置和相关浓度。该技术特别适用于鉴别异常深度的高级糖基化终产物，如在动脉粥样硬化斑中。用同样的方式能够鉴定将来的系统性功能紊乱的部位。
因此，本发明检测方法广泛地包括如下步骤：
A.制备至少一种疑为含有所说高级糖基化终产物的样本;
B.制备至少一种针对所说样本的抗AGE抗体，其中的抗AGE抗体与体内生成的高级糖基化终产物反应，并具有下列特征：
ⅰ.它与所说体内形成的高级糖基化终产物相同的免疫抗原决定簇反应;
ⅱ.它与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ.但它不与任何方式形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、Pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（Pentosidine）。
C.在选自所说的样本、所说抗AGE抗体的配体和所说抗AGE抗体的一种材料中加入可检测标记;
D.将步骤C标记的材料与一种选自步骤C的但未标记的材料接触;
E.对步骤D所得的样本，评价所说标记材料相结合的程度。
可进行评估的合适分析物分别选自例如植物材料、动物类食品、血液、血浆、尿液、脑脊液、淋巴液和组织及某些合成化合物，并结合到载体蛋白，如白蛋白上。分析物还可包括合成来源的高级糖基化终产物，例如，通过蛋白质或其他的大分子与一种还原糖反应制备的。该反应产物可以单独应用或与载体联合应用。
载体可选自碳水化合物、蛋白质、合成的多肽、核酸、脂类、生物相容性的天然和合成树脂、抗原及上述物质的混合物。
本发明所描述的抗AGE抗体可用于在植物、动物类食品等材料中诊断蛋白质高级糖基化的降解作用和检测高级糖基化终产物集结的不利作用。动物体内与年龄或糖尿病相关的动脉硬化、皮肤皱褶、动脉栓塞和糖尿病、视网膜及肾损害这类的病理状态都由在高级糖基化终产物数量增加时发生的过度积聚或沉积所致。因此，本发明的诊断方法通过监测这类AGE的含量和位置以寻求改变至少部分由体内高级糖基化终产物积聚所致的病理变化。
利用本发明，通过测定相应的高级糖基化终产物的存在可以估计和/或检测哺乳动物中激发的、自发的或原发性病理状态的存在。更具体地说，通过诸如本文曾讨论的检测技术，应用合适标记量的本发明抗AGE抗体或至少一种本文提到的抗体结合配对物，可以直接了解AGE的存在和含量。此外，可以合成由AGE限定并能与本发明抗AGE抗体反应的抗原决定簇，并用它产生结合配对物（或针对该结合配对物的拮抗剂），继而标记所说的结合配对物，并引入到样本中测定其中AGE的存在与含量，并因此估计样本来源宿主的状态。
因此，制备的AGE受体和任何结合配对物能够与各种诊断技术联合加以应用，这些技术包括免疫测定法，如放射免疫测定，可应用例如标记或未标记的受体或其它的AGE配体，如果是标记的话，那么要通过放射加成作用、用氢硼化钠的还原作用进行，或者经放射碘化作用进行。
一般性检测方法及其应用是本领域技术人员熟悉的，并且仅在本文用说明性描述，并不是对可以在本发明范围内进行应用的方法的限制。
高级糖基化终产物与一种或多种结合配对物形成复合物，并且能用一种可检测性标记物对复合物之一进行标记。通过实用性检测方法，如IgG识别和与所形成的复合物的反应来确定复合物的形成，并且如果需要的话，可以确定复合物的量。
合适的放射性元素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。在选用放射性标记的情况下，如利用上述同位素之一进行制备，那么现行已知可行的计数方法都可以使用。
在用酶进行标记时，借助于现有技术已知的任何现行比色技术、化学发光技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、测温技术、电流测定技术或气体定量技术可以完成酶标的检测。通过与桥联分子（如碳化二亚胺、二异氰酸、戊二醛等）反应，酶可以与高级糖基化终产物、其结合配对物或载体分子结合。而且，在本发明的一个具体实施方案中，酶本身也可以通过与本文所说的糖类反应而修饰成高级糖基化终产物。
能用于这些方法中的许多酶都是已知的，并能被加以利用。优选用于检测的酶是过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酸、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶、己糖激酶加谷丙转氨酶、RNA酶、葡萄糖氧化酶加碱性磷酸酶、NAD氧化还原酶加荧光素酶、磷酸果糖激酶加磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、天冬氨酸转氨酶加磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和碱性磷酸酶。美国专利3，654，090、3，850，752和4，016，043通过实施例的方式提到了他们公开的不同标记材料和方法。
大量可作为标记物并加以利用的荧光材料是已知的。它们包括如二氢荧光素、若丹明和金胺。特别优选的检测材料包括一种或多种结合在抗免抗体上的荧光标记物，所说的抗体在山羊中制备，并通过一种异硫氰酸盐与二氢荧光素结合。
在一种检测方案中研究了向其中加入配体和分析物的结合抗体。冲洗所得的底物，然后通过测定与抗体结合的分析物的量而进行的检测。第二种方案应用了向其中加入抗体和分析物的结合配体。这两种方案都是基于与分析物的竞争性反应，而第三种方案包括被结合的分析物与抗体之间的直接结合反应，在后两种方案中，通过一个直接标记物或被标记的结合配对物检测抗体结合的程度。
本文公开的所有方案都可以用于高级糖基化终产物的定量及定性测定和用于牵涉高级糖基化终产物的病理变化的诊断和监视。糖尿病样的病理状态和与老化相关的病理状态（如动脉粥样硬化和皮肤皱褶）代表的是非限定性例子，因此用于诊断和监测这些病理状态的方法也包括在本发明的范围内。
本发明还包括用于高级糖基化终产物存在程度的定性和/或定量分析的检测和试验试剂盒。这类检测系统和试剂盒可以包括一种被标记的成分，例如通过本文所讨论的一种放射学和/或酶学技术将标记物与抗AGE抗体或本文所列举的结合配对物偶联而制得;和一种或多种其它的免疫化学试剂，其中之一可以是游离的或固定的配体，能够与被标记成分、其结合配对物、待测成分或其结合配对物中的任何一种相结合，本文所述的试剂盒中的成分之一典型地是一个标记或非标记形式的抗AGE抗体。
在本发明的另一个实施方案中，可以制备适合于由食品技术人员和由医学专家使用的商业性试验试剂盒，以测定高级糖基化终产物存在与否。如前文所述，试剂盒可以用于测定重组的或其它纯化蛋白中高级糖基化终产物的存在，特别是那些指定为治疗用途的蛋白质，在第一种情况和第二种情况下对它们进行测定，有助于它们的进一步纯化。
根据上述试验技术，所说试剂盒中的一种将至少含有标记的AGE或其上述的结合配对物，则所作的说明当然是根据所选的方法，如“竞争性”、“夹心法”、“DASP”等。试剂盒还含有外围试剂，如缓冲液、稳定剂等。
因此，可以制备测试AGE存在、含量或活性的优选试验试剂盒，包括：
（a）至少一种预定量的被标记免疫化学反应成分，它通过将本发明的抗AGE抗体或其特异性结合配对物直接或间接附着于可检测的标记上而获得;
（b）其它试剂;
（c）应用所说试剂盒的说明。
更确切地说，优选的诊断测试试剂盒可以包括：
（a）已知量的上述抗AGE抗体的结合配对物或其配体，一般结合到固相上形成免疫吸附剂，或者换一种形式，结合到一种合适的附属物上，或多个这种终产物的每一种上，及（或它们的结合配对物）
（b）其它试剂，如果需要的话;
（c）应用所说测试试剂盒的说明。
经进一步地改变，优选的测试试剂盒可以包括：
（a）一种标记成分，通过偶联抗AGE抗体的结合配对物与可检测标记获得;
（b）一种或多种其它的免疫化学试剂，其中至少一种试剂是一种配体或一种被固定的配体，配体选自下列物质：
（ⅰ）一种能与标记成分（a）结合的配体;
（ⅱ）一种能与标记成分（a）的结合配对物结合的配体;
（ⅲ）一种能与至少一种待测成分结合的配体;
（ⅳ）一种能与至少一种待测成分的至少一种结合配对物结合的配体;
（c）说明书，说明用于检测和/或测定一种或多种抗AGE抗体与其特异性结合配对物间免疫化学反应成分方案的实施。
本发明延伸及哺乳动物中抗AGE抗体的产生和含所说抗体的抗血清的产生。例如，正如本文所述可以用还原糖和任何含有自由氨基，并进行Amadori重排因而产生AGE的蛋白质的孵育产物免疫一种哺乳动物。
本文所用的术语“免疫”和“高免疫”指的是下文也将详述的特异性免疫方案，它用于诱发产生本发明的抗血清和抗体的抗体反应。可以应用蛋白质或上述与一种或多种还原糖一起孵育的蛋白质的反应产物。给有免疫力的哺乳动物施用一般的4个初级剂量的抗原可有效地诱导抗AGE抗体形成。也可以适当地施用强化免疫剂量。
用蛋白质本身或用源于AGE-蛋白质（如AGE-RNA酶）的AGE对哺乳动物宿主进行免疫产生能与源于抗原本身的AGE或源于其它蛋白质的AGE反应的抗体。例如，施用AGE-RNA酶产生的抗AGE多克隆抗体能与AGE-RNA酶、AGE-血红蛋白、AGE-BSA、AGE-HSA、AGE-LDL和AGE-Ⅳ型胶原蛋白反应，但不与未修饰的RNA酶、BSA或HSA反应。
上述产生的抗体一般也不与通过涉及化学水解或还原方法合成制备的典型AGE反应，如典型AGE    FFI、AFGP、Pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（Pentosidine）。这些典型化合物中无一被产生的抗AGE抗体所识别。
本文所述的发明利用了体内来源的AGE上和不经特殊化学水解或还原条件产生的体外来源AGE上的抗原决定簇。所说抗原决定簇可以数种方式加以利用以检测体内来源及体外来源材料上的AGE。例如，抗AGE抗体的结合亲合力可用于非竞争性和竞争性ELISA测定中，以及其它利用不同免疫检测构型的方法中。
已经发现，经过长时间与葡萄糖一起孵育而修饰的核糖核酸酶可成为用于产生抗各种AGE修饰蛋白的高滴度抗AGE抗体的合适抗原。用葡萄糖制备的高级糖基化终产物显示出最大的抑制作用，其次是由用G6P与果糖制备的AGE。G6P和果糖均以快于葡萄糖的速度与蛋白质反应，生成棕色、荧光的AGE。
不同的糖基化糖，如葡萄糖、G6P和果糖在体外与蛋白质孵育时产生抗原交叉反应性抗原决定簇。相反，从多肽或胺与葡萄糖的体外孵育混合物中纯化的特定产物（FFI、AFGP、Pyrraline）或从体内糖基化的组织中纯化的特定产物没有显示出与抗（AGE-RNA酶）抗血清的交叉反应活性。这表明本文范围已述的典型AGE是抗原性较小的产物，或者是一般用于从样本中分离AGE的纯化方法导致了结构的变化，因而与抗AGE抗体的反应性基本消除。
体外的时间进程研究表明，高级糖基化作用的特征性荧光先于抗AGE反应性部分的出现。因此，抗AGE抗血清与荧光团形成后产生的“晚期”高级糖基化终产物有最大的反应性。
用于本发明的配体优选体内生成的、与AGE结合配对物结合的AGE。这些配体可以单独被检测，或者与第二检测配对物，如亲和素和/或生物素相结合进行检测。当使用这些信号放大物质时，合适的配体可选自还原糖（如葡萄糖、G6P、果糖、核糖等）与肽、蛋白质和其它生物分子（如BSA、亲和素、生物素和酶，如碱性磷酸酶）的反应产物。
如前文所述，本发明涉及抗AGE单克隆抗体，它们可以通过杂交瘤技术，如利用将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而制得。还可以利用除融合以外的技术，例如用癌基因DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒进行转染来制备不死的产抗体细胞系。
在各种不同的优选宿主种类中可以生产特异性多克隆抗体。当然，这些抗体仅用以说明根据本发明进行的抗体制备。
下面有必要说明具体的方案。本文所公开的方案可用于AGE的定性及定量测定和与AGE积聚有关的病理变化同步诊断和监视，糖尿病样病理状态和那些与老化有关的病理状态，如动脉粥样硬化和皮肤皱褶，代表非限定性实例。因此，对这些病理状态进行诊断和监测的方法也包括在本发明范围内。
下面列举的生化试剂和生物试剂是可以从商业上获得或根据已知方法制得。本文引用的所有出版物都引入本文作为参考。
材料与方法
试剂
用于下述测定中的试剂通过如下途径获得或制备：
牛胰核糖核酸酶（RNA酶）、牛血清白蛋白（“BSA”）、人血清白蛋白（“HSA”）、Ⅳ型胶原蛋白、胶原酶、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸（“G6P”）、果糖、核糖和氢硼化钠均购自Sigma    Chemical    Corp.（st.Louis，MO）。
AGE-血红蛋白的制备包括分离血红细胞、用甲苯进行溶血、用三氯乙酸（TCA）处理红细胞溶血产物样本。具体地说，制备50-100μl红细胞溶血产物样本，并加入3ml水和1ml 24%（W/V）的TCA。搅拌混合物，然后于3000rpm离心30分钟。吸出所得的上清，然后加入150μl 1N NaOH，最后加水至总体积为0.5ml。然后用0.3M KH2PO4（pH7.4）对上述材料进行1∶2-1∶200的稀释，以备测定所用。
AGE-白蛋白的制备是通过将白蛋白（50mg/ml）与溶于0.2M NaPO4缓冲液（pH7.4）中的0.5M葡萄糖G6P或果糖一起孵育60天。
通过胶原蛋白（5mg/ml）与溶于0.2M NaPO4缓冲液（pH7.4）中的0.5M葡萄糖一起孵育21天合成AGE-胶原蛋白。
AGE-RNA酶的制备是将RNA酶（25mg/ml）与溶于0.2M NaPO4缓冲液（pH7.4）中的1M葡萄糖一起孵育90天。
FFI-BSA通过碳化二亚胺使FFI-己酸与BSA偶联制得。
甲醛-BSA、顺丁烯二酰基-BSA和乙酰基-LDL是根据下列文献所描述的方法合成的：Horiuchi，S.et    al.，J.BIOL.CHEM.，4：260，432，438（1985）;Takata，K.et    al.，BIOCHIM    BIOPHYS.ACTA.，94：273-280（1989）;Goldstein，et    al.，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA，77：333-337（1979）。
根据Kirstein等人的方法（Kirstein，M.et    al.，PRCC.NATL.ACAD.SCI.USA，87：9010-9014，1990）按照一个使自发性氧化作用减至最小的方案制备AGE-LDL。
如Flückiger等人所述（Flückiger，R.et    al，METHODS    ENZYMOL.，106：77-87，1984）用氢硼化钠还原AGE-BSA。通过对PBS透析去掉任何未反应的氢硼化物。
为了研究氨基胍的抑制作用，将BSA（100mg/ml）与溶于0.2M NaPO4缓冲液（pH7.4）中的100mM葡萄糖和100mM氨基胍氢氧化物（Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI）一起于37℃孵育21天。在进行分析之前，样本对PBS透析。
赖氨酸衍生的AGE的制备是通过将1M的葡萄糖-6-磷酸或1M葡萄糖与溶于0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.4）中的50mM    L-赖氨酸一起于37℃孵育10天。
1-脱氧-1-吗啉代-D-果糖得自Sigma    Chemicals，Inc.而1-脱氧-1-丙氨基-D-果糖从α-D-葡萄糖和N-丙胺制得（根据Mitchel，F.et    al.，CHEM.BER.，92：2836-2840，1959）。2-（2-呋喃甲酰基）-4（5）-（2-呋喃基）-1-氢-咪唑从呋喃基乙二醛和6-氨基己酸的水溶液混合物中合成，并通过硅胶中压层析纯化。
1-烷基-2-甲酰基-3，4-二糖基-吡咯（AFGP）的制备是通过将葡萄糖与6-氨基己酸和亚硫酸钠一起于37℃孵育26天，继而进行Dowex    AG1×4阴离子交换树脂层析和HPLC。
其它方法
对抗AGE抗体及其与来源于体内的AGE的反应性和与通过水解还原方法化学合成的AGE的非反应性进行评估。根据Bradford的方法（Bradford，M.，ANAL.BIOCHEM.，72：248-252，1976）测定蛋白质浓度，并用BSA作为标准。通过SDS-PAGE，并将考马斯蓝染色条带与RNA酶标准物进行比较另外测定核糖核酸酶和AGE-RNA酶蛋白质的量。根据Edward等人的方法（Edward，C.et    al.，CLIN.CHIM.ACTA，104：161-167，1980）测定羟脯氨酸含量。利用LS-3B荧光分光光度计（Perkin-Elmer，Norwalk，CT）测量基于370nm处激发的440nm处发射进行胶原蛋白AGE特异性荧光测定。
对照组白蛋白的制备也是于没有糖存在的上述相同条件下孵育。所有的孵育过程都在无菌、避光和37℃条件下进行。孵育之后，通过对磷酸缓冲盐（PBS）的全面透析或通过Sephadex    G-10（Pharmacia，Uppsala，Sweden）的凝胶过滤去除未结合的物质。
单个标准AGE-BSA制备物（1mM AGE-BSA：12A350）用作参考。用荧光强度标准品校准和监测仪器的操作。测定蛋白浓度为1mg/ml时测试物质的荧光值，并以与AGE-BSA标准品相比较所得的相对荧光百分数表示。
抗AGE抗体的生产
以前在生产抗天然AGE抗血清方面的努力总地说来不成功，或是未能检测体内存在的AGE。
为了诱导抗AGE抗体的形成，如上所述在不采用水解或化学还原反应的情况下于体外生产合成的AGE。蛋白质一般与一种还原糖一起孵育形成AGE。
最好把葡萄糖用作体外的糖基化试剂，因为它是主要的循环糖，并且它在体外产生的AGE近似于体内形成的AGE。RNA酶选作进行高级糖基化作用的靶蛋白，因为它易于形成AGE及AGE介导的分子间交联。
根据R.Bucala等人（R.Bucala，et    al.，Mol.Immunol.，20：1289-1292，1983）（高免疫计划）用于转录后修饰蛋白质的方法，两只雌性新西兰大白兔接受用Freund氏完全佐剂乳化的RNA酶或AGE-RNA酶进行的4次初级免疫和一次加强免疫，具体情况如下。每只大白兔在背部接受4次皮内注射（每次200μg）和在每只后腿接受1次注射（每次100μg）。每周重复进行上述过程共6周。休息两周后，大白兔接受一次1mg加不完全Freund氏佐剂抗原的加强注射。这次注射后的第十天给动物放血。通过Ouchterlony双扩散和非竞争性ELISA每周监测抗体反应。
应用上述高免疫计划，获得了高滴度抗RNA酶（载体蛋白）的兔多克隆兔抗血清。在非竞争性ELISA中测定的抗RNA酶滴度大于10-5。测试下列吸附抗原：RNA酶、衍生于葡萄糖的AGE-RNA酶、BSA、衍生于葡萄糖的AGE-BSA和衍生于G6P的AGE-BSA。结果显示于图1中。
观察到了免疫原AGE-RNA酶明显高于RNA酶的反应性。抗AGE-RNA酶抗血清也与通过和葡萄糖或G6P孵育修饰的白蛋白反应，但不与未修饰的白蛋白反应，这表明存在AGE特异性抗体。
实施例1    ELISA测定
为了监测抗AGE抗体的形成，在一非竞争性ELISA体系中滴定如上所述生成的免抗血清。RNA酶、AGE-RNA酶和AGE-BSA用作吸附抗原。
将吸附抗原与兔血清接触，使得含于血清中的抗AGE抗体形成复合物。然后通过加入结合至碱性磷酸酶（Organon Technica，Durham，North Carolina）上的抗兔IgG抗体评估所形成的复合物水平。抗（AGE-RNA酶）抗血清的滴度定义为显示出50%的最大OD405信号的血清稀释液。
用竞争性ELISA进行配体的抑制作用和AGE的测定。向96孔微量滴定板中的各孔加入0.1ml的AGE-BSA溶液（10μg/ml，溶于PBS中）并在室温孵育2小时，用AGE-BSA（按上述方法获得）包被滴定板，然后用0.15ml含PBS.0.05%吐温-20和1mM NaN3（PBS-吐温）的溶液洗各孔3次。
通过与0.1ml含山羊血清、0.1%BSA和1mM NaN3的PBS溶液孵育1小时对井孔进行闭封，用PBS-吐温洗涤闭孔后加入50μl竞争性抗原，继而加入50μl源于兔的抗血清（最终稀释度1∶1000）。
平板于室温下孵育3小时，之后用PBS-吐温洗涤滴定孔，并以对-硝基苯磷酸作为比色底物用连接抗兔IgG（在山羊中产生）的碱性磷酸酶进行显色。
试验结果用B/Bo表示，其中Bo是缺乏竞争性抗原时抗体被结合的最大量，B是存在竞争性抗原时抗体被结合的量。Bo和B都相对于本底进行修正（参见Robard，CLIN.CHEM.，20：1255-1270，1974）并计算为[405nm处的实验性光密度-本底光密度（无抗体]/[总的光密度（无竞争性）-本底光密度]。
测定出3mg源于葡萄糖的AGE-BSA标准品抑制了50%抗血清结合。该标准品每毫摩尔白蛋白产生的A350为12。
用各种AGE修饰的蛋白、未修饰的蛋白和合成的AGE检测抗（AGE-RNA酶）的抗血清特异性。如图2（上图）所示，得到了在竞争性ELISA体系中以AGE-BSA作吸附抗原测试的抗不同修饰白蛋白的抗（AGE-RNA酶）抗血清结果。所有的点代表三份测定的平均值。
通过BSA与葡萄糖孵育制备的AGE-白蛋白显示出了最大的抑制作用，其次是由BSA与葡萄糖-6-磷酸和与果糖孵育制备的AGE-白蛋白。
携带合成的AGE配体FFI的BSA衍生物FFI-BSA不被抗血清识别。在体内产生可被白蛋白摄取的特异性识别信号的其它白蛋白修饰，如甲酰化和顺丁烯二酰化同样不表现与抗血清的任何交叉反应。
当AGE修饰作用存在于不同的载体蛋白上时（图2中图）它在竞争性ELISA中竞争结合抗体。因此，源于G6P的AGE-HSA、源于葡萄糖的AGE-LDL和源于葡萄糖的AGE-胶原蛋白（Ⅳ型）都显示出能抑制抗体与源于葡萄糖的AGE-BSA的结合。相反，未修饰的HSA、未修饰的LDL和未修饰的胶原蛋白没有这种竞争。LDL的修饰形式乙酰基-LDL能被细胞清除受体特异性识别和摄取，也不能被抗（AGE-RNA酶）识别。
还测试了抗AGE抗血清对典型的结构明确的AGE的竞争拮抗作用（图2下图）。所测试的典型AGE产物是FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖甘定（pentosidine）。这些化合物从胺与还原糖的孵育物中或从经还原及酸水解的组织胶原中分离出来。它们以高浓度用于测试使得即使低水平的抑制作用也易于测出。这些产品没有一个与抗血清向AGE-BSA的结合竞争。
葡萄糖和G6P与赖氨酸一起孵育以确定低分子量AGE能否与所获得的抗血清反应。这些产物在不进行化学还原或水解的情况下于体外将葡萄糖或G6P与赖氨酸一起孵育而产生。所得的产物用于测试竞争性ELISA中的反应性。
仅含糖或只含赖氨酸的对照孵育物未显示任何竞争作用（结果未示出）。二种典型的Amadori产物脱氧丙氨基果糖和脱氧吗啉代果糖也进行了测试，没有一种化合物抑制抗血清的结合。AGE-BSA的氢硼化钠还原作用没有减弱在竞争性ELISA中的反应性这一事实，进一步证实了Amadori产物不被抗血清识别（结果未出示）。
为了进一步揭示体内产生的、能与抗（AGE-RNA酶）抗血清反应的AGE的特征性质，在高级糖基化作用抑制剂氨基胍存在的条件下合成AGE。氨基胍是一种联氨样化合物，在高级糖基化过程的中期发生反应，抑制结合蛋白的荧光物质及交联的形成。如图4所示，氨基胍存在于体外葡萄糖和BSA孵育中的结果是明显抑制能结合到抗AGE抗血清上并与之反应的AGE形成。
实施例2    AGE形成动力学
对AGE相关性荧光形成和结合至抗AGE抗血清上的产物形成之间的动力学关系也进行了评定。图3表明了荧光和抗AGE抗体反应材料显现的时间进程。BSA与葡萄糖孵育，于各种时间间隔取等份试样，进行透析以去除未结合物，然后测定。观察到AGE-荧光团在0-40天之间快速形成，并先于抗体反应产物的形成。
当用ELISA进行测定时，直到第20天才测出AGE，然后于30-70天之间快速形成。AGE荧光团和抗体反应性产物两者的形成最终达到稳定状态。
实施例3    糖尿病评价
如上所述，本发明提供了进行糖尿病及其它AGE水平异常的疾病状态检测和评价特别有效的手段。下文描述了有效评估糖尿病组织中AGE的存在和/或AGE的含量方法以及应用本文所述的AGE测定以揭示已知为糖尿病的哺乳动物综合性状况的特征。
这了确定组织AGE能否通过抗AGE    ELISA进行检测，对患有实验诱导性糖尿病的大鼠进行了评价。
通过快速静脉内注射阿脲（40mg/Kg）或链脲佐菌素（65mg/Kg）在8周龄雄性Lewis大鼠中诱发糖尿病，经测定血糖确认为高糖血症。每隔16周测定血糖，在阿脲处理的动物中（n＝24）平均浓度为20.5±2.4mM，在链脲佐菌素处理的动物中（n＝24）平均浓度为23.5±3.9mM。在对照、经阿脲处理或经链脲佐菌素处理的动物中血糖没有随着时间发生显著变化。
每隔4月，处死6只动物，取出主动脉并冻存于-80℃用于以后的分析。缓慢融解动脉组织，用PBS冲洗并用剪刀剪成细片。用丙酮/氯仿（1∶1）于4℃温和振摇过夜提取脂质。然后经真空离心干燥样本并悬浮于0.2M NaPO4缓冲液（pH7.4）。再以1/100（W/W）的比例加入胶原蛋白酶（Ⅶ型），混合物于37℃轻摇孵育48小时。加入1滴甲苯保持无菌。被消化的样本于15，000×g离心，澄清的上清液用于荧光、AGE和羟脯氨酸的测定。
在糖尿病动物中（阿脲+链脲佐菌素组）相对荧光值从16周时的13.7%+2.4%增至64周时的23.7%±3.0%（P＜0.001）。在对照的非糖尿病动物中，荧光在上述时期中轻度增加（8.3%±1.0%至9%±0.8%，无统计学显著性）。组织及血清AGE值以AGE单位表示。一个AGE单位定义为相当于1μg    AGE-BSA标准物中的抗体反应性材料的量。P值的计算是通过组间比较进行未配对Student′s    t-检验评价。
通过ELISA进行的AGE含量分析表明了在糖尿病动物中AGE含量随时间增加了大约2倍（16周时的4.8±0.5U/mg，P＜0.001）。在对照的非糖尿病动物中随着时间变化动脉的AGE含量也增加了，但其增加率远低于糖尿病动物中的增加（16周时的2.5±0.6U/mg相比于64周的4.3±0.4U/mg，P＜0.001）。
还获得了来自正常及糖尿病患者的人血清。也研究了遭受肾功能损害的患者，因为已发现这组病人循环的血清AGE水平有明显增高。
这些循环的血清AGE主要是低分子肽的形式，通过血液透析治疗不能有效地清除。
得到非糖尿病患者（n＝12）、糖尿病患者（n＝21）以及进行血液透析的糖尿病患者（n＝16）的血清样本。血清用PBS稀释3倍并在分析前通过0.22μm微孔滤器（Millipore，Bedford，MA）进行过滤灭菌。
当以AGE    U/ml表示时，正常病人（非糖尿病、正常肾功能）具有的血清平均水平为10.5±1.3U/ml。在糖尿病患者中的AGE水平提高了2倍多（24.7±2.4U/ml，糖尿病患者（DM）与正常患者（NL）相比P＜0.001），而进行血液透析的糖尿病患者的AGE水平提高了几乎8倍（79.4±9.9U/ml，DM+HD相比于DM    P＜0.001）。这些结果与利用放射性受体测定对得自糖尿病患者和得自进行血液透析的糖尿病患者的血清的AGE-肽含量检测所得的新近研究结果有很好的相关性。
实施例4
根据上述实施例3的方案，用采自正常及糖尿病患者的样本进行时间相关性血糖水平测定。所测的结果与用已知的HbA10标准品检测时间相关性血糖所得的值进行比较，并在图7和图8中表示。
参考图7和图8可以看出，用AGE-血红蛋白作为标准品进行的本发明测定完全可与已知的测定因子及标准HbA10进行比较，并能够用于任何需要进行后一种测试的情况。所得的数据测定实际上是一致的，因而本测定的临床完整性很高。
本发明进一步的诊断应用在于测定源于果糖的AGE。对源于果糖的AGE的测定目前被认为是AGE形成速度的一个明显决定因素，并且也标志着伴随病变及该反应相关的其它后遗症（如糖尿病）的发生和程度。Swarez等人（J.BIOL.CHEM.，264：3674-3679，1989）和McPherson等人（BIOCHEMISTRY，27：1901-1907，1988）认为果糖存在于和参予蛋白质的交联预示了对衍生于果糖的AGE给予检测和控制的重要作用，而有意义的是，Ahmed等人（CLIN.CHEM.，38（7）：1301-1303，1992）表示通过现行已知的测定不能够有效诊断果糖化的Hb。
因此，本发明适当地涉及到源于果糖的AGE的测定，用全面的努力去更好理解和处理源于果糖的AGE与体内蛋白积聚反应的不利作用。
实施例5
把为检测体内形成的AGE而产生的抗AGE抗体用于竞争性ELISA中以测定红细胞溶血产物中连接血红蛋白的AGE。图9表示对于得自糖尿病个体（DM）和非糖尿病非糖血症个体（NL）的32份红细胞样本进行分析的结果。在两组对象中检测了连接血红蛋白的AGE，但明显较高的含量只存在于糖尿病组中（NL[n＝9]：4.3±0.3U    AGE/mg    Hb;DM[n＝23]：7.7±0.6U    AGE/mg    Hb，[平均数±标准误]，通过Student的未配对t-检验，P＜0.001）。
以AGE单位表示的抗体反应活性相对于合成的AGE-白蛋白标准品进行计算。另外的实验表明，血红蛋白-AGE修饰作用对于透析、酸沉淀和蛋白水解是稳定的，并不受氢硼化钠还原作用的影响（结果未出示）。这些证据与以前有关抗AGE抗体特异性的研究共同证明血红蛋白-AGE部分是一种稳定的源于葡萄糖的Amadori后产物。红细胞HbA10水平与Hb-AGE水平具有统计学意义的相关性。
实施例6
在体外证实了从血红蛋白和葡萄糖形成的Hb-AGE。纯化的人血红蛋白与模拟为正常糖血症（5mM）和高糖血症的葡萄糖浓度于37℃孵育。血红蛋白-AGE的形成取决于一定的时间和浓度（参见图11）。由于观察到，一旦形成Hb-AGE产物，能改变Amadori产物抗原决定簇的氢硼化钠还原反应并不影响Hb-AGE产物的检测，从而证实了在本系统中早期的Amadori糖基化产物不与抗-AGE抗体发生反应。氨基胍的加入阻止了血红蛋白相关系AGE的形成。
在得自正在接受氨基胍治疗的病人的血液样本中进行血红蛋白-AGE测定。病人组包括18名长期患糖尿病的患者。在用氨基胍治疗病人前和后28天采取血样，并用ELISA测定Hb-AGE水平。如图12所示，氨基胍治疗的结果是Hb-AGE平均值明显降低（13.8±0.8U    AGE/mg    Hb相比于10.0±0.9U    AGE/mg    Hb[平均数±标准误]，通过Student的配对t-检验，P＜0.001）。
HbA1C值不受氨基胍治疗的影响（10.1%±0.8%相比于9.2%±0.8%，[平均数±标准误]P＝NS）。在得自接受安慰剂对照的6名病人组的血样中观察到Hb-AGE或HbA1C水平没有明显改变（结果未出示）。
AGE修饰的血红蛋白的存在在以下几个方面值得注意。首先，一般认为AGE的形成需要数月到数年的一个时间过程，甚至是在高糖血症的病理状态下也如此。该结果表明在循环红细胞的寿命期内，如约120天内，形成了大量的AGE修饰血红蛋白。如果以相对于合成的AGE-白蛋白标准品表示的Hb-AGE单位被重新计算，作为总的红细胞血红蛋白的一部分，那么Hb-AGE值占循环血红蛋白的0.42±0.07%。在所研究的糖尿病组中该水平升至0.75±0.08%的平均数。这些值与在正常血糖和糖尿病组中分别为5.8%和8.9%的相应的HbA1C部分形成对照。
与积聚于结缔组织或基底膜胶原蛋白的AGE相比，在血红蛋白上的大量AGE积聚反映了正常改变过程中受体介导的结缔组织AGE的改变，或者表明了内在性增强了AGE在作为蛋白底物的血红蛋白上的形成速度。另外，循环性红细胞血红蛋白易于被以高含量存在于患有糖尿病、肾功能不足或其它病理性患者中的反应性血浆AGE进行修饰。不管形成的机理如何，对体内生成的AGE进行ELISA定量测定表明与血红蛋白形成的AGE比结缔组织胶原蛋白形成的AGE要快。
因此Hb-AGE可以充当一个用于体内高级糖基化作用的有意义生物性指标。Hb-AGE的形成反映了血糖浓度的时间总进程，这明显地比为HbA1C所建立的时间总进程（3-4周）长。用氨基胍进行的4周药理学干预足以显著降低（28%）被治疗糖尿病群体中的Hb-AGE水平。
Hb-AGE测定有助于进行多种有关糖尿病和老化相关性并发症的病理生理学研究。这些研究包括以阐明葡萄糖的严格控制在预防糖尿病并发症方面的益处为目的的临床研究，以及有关高级糖基化作用在糖尿病及老化相关性病理状况（如动脉粥样硬化、高血压和肾性疾患）的发病学中的作用的实验性研究。
实施例7    氨基胍对正常和糖尿病大鼠中尿AGE水平的影响
正常的和链脲佐菌素性糖尿病大鼠组在11周内不进行治疗。然后开始通过管饲法用70mg/Kg氨基胍盐酸（AG    HCl）对上述两组动物中每组的一半动物每天进行治疗，而另外一半动物通过管饲法给予蒸馏水。10周后从所有的动物中收集24小时尿。
离心尿样，并用0.3M磷酸钾缓冲液（PH7.4）将上清液稀释8倍，用稀释的尿样进行上述AGE测定。这些结果示于下表中。
表
处理    尿AGE:每24小时排出的单位
正常大鼠    5400±1200
用70mg/kg/天AG  HCl    2200±190
处理的正常大鼠
糖尿病大鼠    9400±340
用70mg/kg/天AG  HCl    4100±1200
治疗的糖尿病大鼠
从上表可以观察出糖尿病大鼠的尿AGE排泄在21周内比经施用氨基胍而正常化的正常动物增加了1.7倍。氨基胍处理的正常大鼠表现出对尿AGE排泄的60%抑制作用。因此，上述结果证实了尿AGE和AGE肽的测定对于监测那些组织AGEs改变可作为临床长期有效诊断指标的疾病如糖尿病的相关性和价值，以及氨基胍可作为明显有效的治疗药物。
在不背离本发明精神或其基本特征的情况下可以用其它形式体现本发明，或用其它途径实施本发明。因此应认为本文所公开的是作为全面的说明而非限制。本发明的范围将由所附的权利要求表明，并且，落入本发明同类含义和范围中的所有变化都将包含于本文中。

Claims (58)

1、一种检测生物样本中高级糖基化终产物存在的方法，包括下列步骤：
(a).制备至少一种疑为含有所说高级糖基化终产物的生物样本；
(b).制备至少一种针对所说样本的、由一种抗AGE抗体组成的相应结合配对物；
(c).在选自所说样本、对应所说结合配对物的配体和所说结合配对物中的一种物质上结合可检测性标记；
(d).将步骤(c)的被标记物与步骤(c)的未标记物接触；
(e).检查步骤(d)所得样本中所说标记物质与未标记物的结合程度；
(f).其中所说的抗AGE抗体与体内生成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
i它与所说的体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应；
ii它与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应；
iii但不与所形成的下列糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸、和戊糖苷定(pentosidine)。
2、一种检测生物样本中高级糖基化终产物存在的方法，包括下列步骤：
（a）.制备至少一种疑为含有高级糖基化终产物的生物样本;
（b）.制备至少一种针对所说样本的对应结合配对物，所说的结合配对物选自抗AGE抗体、对应于疑为存留于所说样本中AGE的配体和两者的结合体;
（c）.将步骤（b）的结合配对物中的一种固定于固相载体上;
（d）.给步骤（b）的结合配对物中的一种结合上可检测标记;
（e）.将步骤（d）的被标记物与步骤（b）中未标记物和步骤（a）的样本两者中的一种物质接触;
（f）.检测步骤（e）所得的物质以确定所说标记物结合至所说未标记物上的程度;
（g）.其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  它与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸、和戊糖苷定（pentosidine）。
3、一种在生物样本中测定体内形成的高级糖基化终产物存在或含量的方法，所说方法包括：
（a）.抗AGE抗体结合至固相载体上;
（b）.在选自所说抗体和另外一个对应所说抗体的结合配对物中的一种物质上结合可检测标记;
（c）.所说的抗体与疑为含有AGE的样本和所说结合配对物接触;
（d）.将结合至固相载体上的标记量与标准比较：
（e）.其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸、和戊糖苷定（pentosidine）。
4、一种检或评估一种表现为哺乳动物患者体内AGE水平异常的疾患存在的方法，包括：
（a）.抗AGE抗体结合至固相载体上;
（b）.抗AGE抗体暴露于患者体液或组织样本一段时间，并且其温度可有效地使已结合的抗AGE抗体结合样本中的任何AGE;
（c）.用被标记的AGE结合配对物接触结合的复合物;
（d）.对结合至固相载体上的标记量与标准进行比较：
（e）.其中所说抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并且具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
5、权利要求1-3中任何一个权利要求的方法，其中所说的生物样本选自血液、血浆、尿液、脑脊液、淋巴液、组织、植物材料、可食性动物材料、蛋白质和糖的反应产物、DNA和糖的反应产物及其混合物。
6、权利要求1-3或4中任何一个权利要求的方法，其中的待测AGE选自Hb-AGE、哺乳动物血清白蛋白-AGE、血清AGE-肽、尿AGE-肽和上述一种或多种物质的结合物。
7、权利要求1-3中任何一个权利要求的方法，其中的待测AGE选自食物材料-AGE和将用作治疗剂的蛋白质的蛋白-AGE。
8、权利要求6的方法，其中所说的哺乳动物血清白蛋白-AGE包括AGE-HSA。
9、权利要求6的方法，包括监测选自下列疾病的方法：糖尿病、糖血症、泌尿性疾病和功能紊乱、慢性老化、蛋白老化效应及其相结合。
10、权利要求6的方法，包括长期监测患者体内时间相关性血糖水平的方法。
11、权利要求7的方法，监测所说的蛋白质-AGE，所说的方法包括测定作为治疗剂的蛋白质糖基化程度的方法。
12、权利要求1-3或4中任何一个权利要求的方法，所说的标记选自酶、可发荧光的化学物质和放射性元素。
13、权利要求9的方法，其中的标记选自酶、经荧光化学物质和放射性元素。
14、权利要求9的方法，其中包括从正常对象或疑为正患有所说疾病的对象中采集多种生物样本，比较所说样本高级糖基化终产物含量的检测结果，从进行的比较确定所说疾病的存在和程度。
15、在分析物中测定高级糖基化终产物含量的方法，包括：
（a）.制备一种所说分析物结合至底物上的样本;
（b）.向步骤（a）的样本中加入大量含AGE受体的配体;
（c）.向步骤（b）的样本中加入大量抗高级糖基化终产物的抗血清;
（d）.通过检测存在于步骤（c）结合底物样本上的抗血清量测定结合至所说分析物上的所说高级糖基化终产物含量;
（e）.其中所说抗血清与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
16、一种用于检测分析物中存在高级糖基化终产物的测试剂盒，包括：
A.至少一种预定量的标记免疫化学反应成份，该成份的获得方法是把对应于高级糖基化产物的结合配对物，与所说高级糖基化终产物的配体、与所说结合配对物反应的配体或其特异性结合配对物直接或间接结合到一种可测标记上;所说对应于高级糖基化终产物的结合配对物、配体或作为抗AGE抗体的特异性结合配对物中的至少一种，其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并且具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）;
B.其它试剂;
C.应用所说试剂盒的说明书。
17、权利要求16的测试试剂盒，其中所说的试剂盒用于检测的分析物选自血液、血浆、尿液、脑脊液、组织、蛋白质和糖的反应产物、DNA和糖的反应产物及其混合物。
18、权利要求16的测试试剂盒，其中所说的分析物是含氨基化合物，选自取代和未取代氨基酸、取代和未取代蛋白质及取代和未取代的含氨基酸生物聚合物。
19、权利要求18的测试试剂盒，其中所说的含氨基化合物选自6-氨基己酸、甲胺、聚L-赖氨酸、α-t-BOC-赖氨酸、白蛋白、胶原蛋白、DNA和具有葡萄糖残基的化合物，所说的葡萄糖残基将被另外一种还原糖的残基取代。
20、权利要求17的测试试剂盒，其中所说的分散物选自食品、血液、血清、尿液和制备用作治疗剂的蛋白质，而所说的高级糖基化终产物选自Hb-AGE、AGE-HSA、血清AGE-肽、尿AGE-肽和治疗剂蛋白-AGE。
21、权利要求20的测试试剂盒，其中所说的试剂盒包括一种生物样本，可以向其中加入一种可能的试剂或据信具有对抗所说高级糖基化终产物形成和增加的活性的药物，以评估其活性，而所说的试剂盒被用作发现药物的检测。
22、权利要求16的试剂盒，其中的标记是酶、发荧光的化学物质或放射性元素。
23、一种用于检测和/或监测哺乳动物体内果糖水平的方法，包括实施权利要求1-4中的任何一种方法。
24、一种用于监测药物或定食疗法进程和功效的体外方法，其中涉及高级糖基化终产物存在及含量方面的改变，包括权利要求1-4的任何一种方法的实施。
25、权利要求24的方法，其中的待测AGE选自Hb-AGE、AGE-HSA、血清AGE-肽、尿AGE-肽和从制备用作治疗剂的蛋白质形成的蛋白-AGE，而所说的方法包括用于长期评估血糖和/或肾功能的方法。
26、一种用于检测糖尿病发病的方法，包括实施权利要求1-4的任一方法。
27、治疗症状之一为AGE水平异常的疾患的方法，包括将患者血清暴露于抗AGE抗体，形成抗AGE抗体：AGE复合物，并且从血清中去除复合物;
其中所说抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
28、权利要求27的方法，其中所说的A
Figure 921152353_IMG2
AGE、血清AGE-肽和尿AGE-肽。
29、权利要求28的方法，其中的标记
Figure 921152353_IMG3
或放射性元素。
30、一种药物组合物，由被抗AGE抗体识别并结合至抗体AGE抗体上，而且抑制哺乳动物AGE受体识别AGE的化合物与药用可接受载体联合组成;
其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并且具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ 但不与所形成的下列高级糖基化终产物
Figure 921152353_IMG4
FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
31、一种含有抗AGE抗体和药用可接受载体的药物组合物：
其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
32、权利要求30或权利要求31的药物组合物，其中的高级糖基化终产物选自Hb-AGE、AGE-HSA、血清AGE-肽、尿AGE-肽和其组合物。
33、一种治疗哺乳动物中特征为AGE水平增高的疾病的方法，包括给所说哺乳动物施用权利要求30或31的有效量组合物。
34、一种用于长期检测哺乳动物中血糖的存在、水平或控制血糖的方法，包括：
获取哺乳动物的血红蛋白或血清蛋白样本;
测定所说血红蛋白或血清蛋白高级糖基化终产物的水平;
将高级糖基化的血红蛋白或血清蛋白的水平与标准比较。
35、一种用于纯化一批用作治疗剂的蛋白材料以去除其中存在的任何蛋白-AGE的方法，所说的方法包括下列步骤：
（a）将所说量的疑为含有所说蛋白质-AGE的蛋白材料与抗AGE抗体接触一段时间足以使所说蛋白质-AGE结合到所说抗AGE抗体上;
（b）从剩余的所说蛋白材料中分离结合至所说抗AGE-抗体上的蛋白-AGE;
（c）其中所说的抗AGE抗体与体内形成的高级糖基化终产物发生反应，并具有下列特征：
ⅰ  与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
ⅱ  与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
ⅲ  但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
36、一种检测哺乳动物宿主体内分解代谢活性发生或存在的方法，包括实施权利要求6的方法。
37、权利要求36的方法，包括检测哺乳动物中存在的侵袭性或特发性刺激的方法。
38、一种抗血清，含有一种或多种与体内形成的高级糖基化终产物发生反应的抗体，并具有下列特征：
A.与所说体内形成的高级糖基化终产物共有的免疫性抗原决定簇发生反应;
B.与体外形成的高级糖基化终产物发生交叉反应;
C.但不与所形成的下列高级糖基化终产物发生交叉反应：
FFI、AFGP、pyrraline、羧甲基赖氨酸和戊糖苷定（pentosidine）。
39、权利要求38的抗血清，其中在体内形成并与所说抗血清发生反应的高级糖基化终产物是选自AGE-RNA酶、AGE-血红蛋白、AGE-白蛋白、AGE-LDL、AGE-Ⅳ型胶原蛋白、用NaBH4还原的AGE-BSA及混合物。
40、权利要求38的抗血清，其中所说的抗血清通过用一种外源蛋白或蛋白质与一种还原糖孵育的反应产物免疫哺乳动物制备。
41、权利要求40的抗血清，其中所说的抗血清是用AGE-RNA酶免疫哺乳动物制得。
42、权利要求38的抗血清，其中所说的抗血清与高级糖基化终产物水平增高的糖尿病组织和血清发生反应。
43、权利要求38的抗血清，其中所说的抗血清与
Figure 921152353_IMG5
发性糖尿病的大鼠主动脉胶原蛋白及糖尿病患者的人血清发生反应。
44、权利要求38的抗血清，其中所说的抗血清是
Figure 921152353_IMG6
。
45、权利要求44的抗血清，其中的效价测定
Figure 921152353_IMG7
磷酸酶的第二抗体和对-硝基苯磷酸作为比色底物时产生50％最大OD405信号的血清稀释度。
46、权利要求44的抗血清，其中所说的高效价至少包括由非竞争性ELISA测定的10-5。
47、权利要求38的抗血清，其中所说的抗原决定簇是通过还原糖与选自RNA酶、血红蛋白、赖氨酸、Ⅳ型胶原蛋白、LDL、BSA和HSA的蛋白质性材料一起孵育形成的。
48、权利要求47的抗血清，其中的还原糖选自葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖和核糖。
49、权利要求38的抗血清，其中所说的抗原决定簇是通过葡萄糖与RNA酶孵育形成的。
50、权利要求38的抗血清，其中形成了能与所说抗血清反应的体内形成的高级糖基化终产物并显示出荧光。
51、权利要求38的抗血清，其中用能够与早期糖基化产物的活性羰基反应的高级糖基化作用抑制剂，对能与所说抗血清反应的体内形成的高级糖基化产物在其形成过程中进行抑制。
52、一种从权利要求38的抗血清制备的针对体内形成的高级糖基化终产物的抗AGE抗体。
53、一种从抗AGE-RNA酶抗血清制备的抗体内形成的高级糖基化终产物的抗AGE抗体。
54、权利要求53的抗体，其中所说的抗血清是多克隆的，并且在兔中产生，抗与葡萄糖一起孵育的牛RNA酶。
55、权利要求53的抗血清、用一种可测标记进行标记。
56、权利要求52、53或54中任何一个权利要求的抗体，用一种可检测标记进行标记。
57、权利要求55的抗血清，其中所说的标记选自酶、发荧光的化学物质和放射性元素。
58、权利要求56的抗体，其中所说的标记选自酶、发荧光的化学物质和放射性元素。
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