CN111040001A - 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法 - Google Patents

安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111040001A
CN111040001A CN201911377826.9A CN201911377826A CN111040001A CN 111040001 A CN111040001 A CN 111040001A CN 201911377826 A CN201911377826 A CN 201911377826A CN 111040001 A CN111040001 A CN 111040001A
Authority
CN
China
Prior art keywords
purity
target sample
solution
target
separation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911377826.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111040001B (zh
Inventor
贠克明
王乐乐
龚铎
李文越
王学志
王锐利
郑茜
王涛
崔海燕
尉志文
张潮
贾娟
曹洁
胡萌
牛卫芬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Medical University
Original Assignee
Shanxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Medical University filed Critical Shanxi Medical University
Priority to CN201911377826.9A priority Critical patent/CN111040001B/zh
Publication of CN111040001A publication Critical patent/CN111040001A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111040001B publication Critical patent/CN111040001B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/08—Preparation using an enricher
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external

Abstract

本发明提供一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，该方法采用蛋白纯化仪，利用反向填料柱对尿液中的葡萄糖醛酸结合物进行一次分离，将分离后的样品溶液分别进LC‑MS，并与标准品溶液的液质检测结果进行对比，并计算目标物样品的纯度。当纯度合格时，则保存，待用；当纯度不合格时，则需要对其进行二次分离，即利用离子交换的原理进一步分离，然后将所得溶液再次经过反相填料柱分离纯化，得到与目标物标准品的质谱行为相似，且其保留时间、离子丰度比误差均在可接受范围内的目标物样品；混合相同的目标物样品溶液，离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。该方法，简化了操作过程，且成本相对较低，具有更广泛的应用前景。

Description

安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖醛酸结合物的分离制备技术领域，具体涉及一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法。
背景技术
安定(别名：地西泮，DZ)是苯二氮
Figure BDA0002341461780000011
类中最具有代表性的药物之一，其分子式为C16H13ClN2O，分子量为284.74。其在体内的代谢，首先进行的是氧化还原，由1位N去甲基形成去甲安定(去甲西泮，DMDZ)，3位C羟基化形成羟基安定(替马西泮，TZ)，二者可进一步生成去甲羟基安定(奥沙西泮，OZ)；其次是结合反应，肝微粒体中的UDP-葡萄糖醛酸转移酶能够使TZ和OZ分别与葡萄糖醛酸结合生成葡萄糖醛酸结合物，即羟基西泮葡萄糖醛酸苷(TG)和去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷(OG)，而后随尿排出体外，具体代谢途径如图1所示。
基于文献《咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的分离与鉴定》——中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第41卷第6期2010年6月。
文献中报道的技术，其主要缺点在于制备过程繁琐，制备柱填料昂贵。从样品初始处理开始，该技术方法需要四步纯化过程来得到母体的两个葡萄糖醛酸结合物，且每一步所用的分离柱，不仅需要自行装柱，且填料价格也不便宜，尤其是Sephadex LH-20柱，所以这种方法的适用性不太广泛。
因此，该技术所要解决的问题就是要以尽可能小的成本和尽可能便捷的方法来分离制备生物体(如大鼠、家兔)尿液中的葡萄糖醛酸结合物。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用制备液相，分离、纯化生物体体液(尿液)中安定代谢物——葡萄糖醛酸结合物的方法，与现有技术相比，该方法简化了操作过程，且成本相对较低，具有更广泛的适用性。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，以体积份数计，包括以下步骤：
S1、取生物体，空腹灌胃生物体重量×2×LD50剂量的安定，收集生物体尿液样品，并于-20℃下储存，待用；
S2、取1份尿液样品，用3份甲醇溶液提取，振荡、离心，取上清液用氮气吹干，再用1份超纯水复溶，振荡，0.22um水膜过滤，用超纯水稀释100倍后进蛋白纯化仪，利用反向填料柱RESOURCETM RPC进行一次分离；
S3、将S2中分离得到的若干样品，分别用液相串联质谱仪进行检测，并与目标物标准品进行对比，定性目标物样品，并计算目标物样品的纯度；
S4、判断S3中的目标物样品的纯度是否合格，当目标物样品的纯度合格时，保存，待用；当目标物样品的纯度不合格时，将不合格的目标物样品依次通过离子交换型制备柱HiTrapTM Q HP、蛋白纯化仪进行分离，并依照S3方法计算目标物样品纯度；
S5、将S4得到的相同的目标物样品溶液混合后，离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。
进一步，S1中，生物体为家兔，家兔的LD50剂量为129.48mg/kg。
进一步，S2中，甲醇溶液是由体积比3:2的甲醇-水混合得到的。
进一步，S2中，离心的转速为5000r/min，离心的时间为20min；氮气吹干时的加热温度为37℃。
进一步，S2中，利用反向填料柱进行一次分离所用的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，其中，以体积百分比计，所述洗脱液A包括0.065％甲酸、2％乙腈、其余为水；所述洗脱液B包括0.05％甲酸、80％乙腈、其余为水。
进一步，S3中，进液相串联质谱前，需要取100ng/ml目标物标准品，经紫外分光光度仪明确目标物的最大吸收波长。
进一步，S4中，判断S3中的目标物样品的纯度是否合格的标准为：当目标物样品的纯度≥95％时，判定目标物样品的纯度为合格；反之为不合格。
进一步，S4中，通过离子交换型制备柱进行分离的步骤如下：
S4.1、取1倍体积量的水对离子交换型制备柱进行预活化处理；
S4.2、将不合格的目标物样品溶液的pH用10％氢氧化钠溶液调至11～12，上样；
S4.3、用1倍体积量的pH 2～3的生理盐水进行洗脱，得到洗脱液；
其中，pH 2～3的生理盐水是用10％盐酸溶液将生理盐水调节至pH 2～3得到的。
进一步，S4中，纯度合格的目标物样品的保存温度为-20℃。
进一步，S5中，离心浓缩的温度为4℃。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明提供一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的分离纯化方法，该方法采用蛋白纯化仪，利用反向填料柱对尿液中的葡萄糖醛酸结合物进行一次分离，将分离后的样品溶液分别进LC-MS，并与标准品溶液的液质检测结果进行对比，确定目标物样品，并采用峰面积归一化法计算目标物样品的纯度。
当纯度合格，即纯度≥95％时，则保存，待用；当纯度不合格，即纯度＜95％时，则需要对其进行二次分离，即利用离子交换的原理进一步分离，然后将所得溶液再次经过反相填料柱分离纯化，得到与目标物标准品的质谱行为相似，且其保留时间、离子丰度比误差均在可接受范围内的目标物样品，并采用峰面积归一化法计算目标物样品的纯度。
对一次分离得到的样品重复上述操作，分批纯化，将临时分离所得溶液保存在-20℃温度条件下，并将所有相同的目标物样品溶液混合，4℃条件下，离心浓缩得到最终的产物，纯度均在95％以上，且1ml家兔尿液可分离纯化出250～300ug目标物样品。
与现有技术相比，本发明的方法，简化了操作过程，且成本相对较低，具有更广泛的应用前景。
附图说明
图1为现有技术中安定的代谢途径路线图。
图2为本发明实施例1中安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的分离纯化工艺流程图。
图3为本发明实施例1中家兔尿液经蛋白纯化仪首次分离结果图。
图4为本发明实施例1中OG标准品的液相-质谱(LC-MS)色谱图。
图5为本发明实施例1中OG标准品的总离子流(TIC)色谱图。
图6为本发明实施例1中OG标准品的多反应监测(MRM)图。
图7为本发明实施例1中TG标准品的LC-MS色谱图。
图8为本发明实施例1中TG标准品的TIC色谱图。
图9为本发明实施例1中TG标准品的MRM图。
图10为本发明实施例1中一次分离1号管溶液的LC-MS色谱图。
图11为本发明实施例1中一次分离1号管溶液的TIC色谱图。
图12为本发明实施例1中一次分离1号管溶液的MRM图。
图13为本发明实施例1中一次分离2号管溶液的LC-MS色谱图。
图14为本发明实施例1中一次分离2号管溶液的TIC色谱图。
图15为本发明实施例1中一次分离2号管溶液的MRM图。
图16为本发明实施例1中一次分离中2号管溶液经离子交换后再次分离结果图。
图17为本发明实施例1中二次分离13号管溶液的LC-MS色谱图。
图18为本发明实施例1中二次分离13号管溶液的TIC色谱图。
图19为本发明实施例1中二次分离13号管溶液的MRM图。
图20为本发明实施例1中一次分离5号管溶液的LC-MS色谱图。
图21为本发明实施例1中一次分离5号管溶液的TIC色谱图。
图22为本发明实施例1中一次分离5号管溶液的MRM图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、仪器和标准品
1.1、仪器设备
双光束紫外可见分光光度计，P7型，上海美谱达仪器有限公司；
蛋白纯化仪，AKTA PurifierTM 10，瑞典；
液相色谱(Agilent 1260)-质谱(Agilent 6460)联用仪，Agilent，美国；
Infinity Lab Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7Micron，Agilent，美国)；
反相填料柱RESOURCETM RPC(17-1181-01,1mL)，瑞典；
离子交换型制备柱HiTrapTM Q HP(29-0513-25,1*1mL)，瑞典。
1.2、目标物标准品和试剂
目标物标准品OG、TG(Cerilliant Corporation，Lot：FE080310-01，FE071411-01)；
甲醇，Sigma,美国；
乙腈，Sigma,美国；
超纯水Milli-Q Academi，美国；
生理盐水，石家庄四药有限公司；
安定，纯度98.8％，批号C-D170103，泉州易初生物医药科技有限公司。
所述材料及设备，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
2、制备方法
一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，参见图2所示，包括以下步骤：
S1、取雄性家兔一只，体重2kg，适应性喂养3天，空腹下经口灌胃518mg的安定(其中，LD50＝129.48mg/kg，家兔的重量为2kg，给药剂量为2×129.48mg/kg×2kg＝518mg)，24小时后开始收集家兔尿液样品，尿液样品的体积约为10mL，并储存于-20℃的冰箱中，待用；
S2、取100ng/ml目标物标准品(Cerilliant Corporation)，经紫外分光光度仪明确目标物的最大吸收波长(208nm)；
S3、取家兔尿液样品1mL，加入3mL体积比3:2的甲醇-水混合溶液，振荡、离心(转速为5000r/min，离心时间为20min)，取上清液，37℃水浴下，用氮气吹干；再用1mL超纯水复溶，振荡1min，0.22um水膜过滤，用超纯水稀释100倍后进蛋白纯化仪，利用反向填料柱(RESOURCETM RPC)进行一次分离，其中，以体积百分比计，洗脱液A包括0.065％甲酸、2％乙腈、其余为水；所述洗脱液B包括0.05％甲酸、80％乙腈、其余为水；分离结果如图3所示；
S4、将S3中分离得到的若干样品，分别用液相串联质谱仪进行检测，并与已知目标物标准品(OG、TG)进行对比，定性目标物样品，同时采用峰面积归一化法计算目标物样品的纯度；
S5、判断S3中的目标物样品的纯度是否合格，当目标物样品的纯度合格，即纯度≥95％时，将目标物样品在-20℃的冰箱中保存，待用；当目标物样品的纯度不合格，即纯度＜95％时，将一次分离不合格的目标物样品依次通过离子交换型制备柱(HiTrapTM Q HP)、蛋白纯化仪进行分离，并依照S4方法计算目标物样品纯度；具体方法包括如下步骤：
S5-1、用1mL水对离子交换型制备柱(HiTrapTM Q HP)进行预活化处理；
S5-2、将不合格的目标物样品溶液的pH用10％氢氧化钠溶液调至11～12，并将1mLpH 11-12的待分析溶液上样；
S5-3、用1mL pH 2～3的生理盐水进行洗脱，得到洗脱液；其中，pH 2～3的生理盐水是用10％盐酸溶液将生理盐水调节至pH 2～3得到的。
S5-4、将S5-3得到的酸性洗脱液重新进蛋白纯化仪，依照步骤S3方法利用反相填料柱(RESOURCETM RPC)进行分离纯化；
S5-5、将S5-4分离所得若干样品分别用液相串联质谱仪进行检测，并与已知目标物标准品(OG、TG)进行对比，进而定性，同时采用峰面积归一化法计算目标物样品的纯度；
S6、将S3中分离得到的若干样品依次重复上述操作S4-S5，并混合相同的目标物样品溶液，利用离心浓缩仪，在4℃条件下进行离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。
3、结果分析：
3.1、家兔尿液分离结果
将S3处理后的家兔尿液稀释100倍后，经蛋白纯化仪首次分离结果，如图3所示。
其中，曲线I为仪器对波长为208nm检测的信号曲线；
曲线II为洗脱液B的浓度变化曲线；
分隔符III为按峰收集后各管溶液之间的截止符。
经过蛋白纯化仪首次分离后收集的样品，包括1号管溶液、2号管溶液、3号管溶液、4号管溶液、5号管溶液和6号管溶液。
3.2、标准品分析
将OG标准品、TG标准品分别进行LC-MS、TIC、MRM分析，得到结果如图4～9及表1所示。
表1 OG标准品、TG标准品的LC-MS、TIC、MRM检测结果
Figure BDA0002341461780000081
3.3、家兔尿液分离分析
将家兔尿液分离收集的1号管溶液～6号管溶液分析进行LC-MS、TIC、MRM分析，结果如图10～22及表2-3所示。
表2家兔尿液一次分离样品的LC-MS、TIC、MRM检测结果
Figure BDA0002341461780000082
表3一次分离2号管溶液的二次分离样品的LC-MS、TIC、MRM检测结果
Figure BDA0002341461780000091
将1号管溶液的检测结果与标准品溶液的检测结果进行对比，发现1号管溶液与OG标准品的质谱行为相似，其保留时间(±2.50％)、离子丰度比(相对丰度)误差均在可接受范围(±25.00％)内，故认为一次分离后1号管中物质即为OG，利用峰面积归一化法计算纯度为100％。
将2号管溶液的检测结果与标准品溶液的检测结果进行对比，发现2号管中溶液可能是葡萄糖醛酸结合物OG和TG的混合溶液，因此，需要对其进行二次分离，即利用离子交换的原理进一步分离，然后将所得溶液再次经过反相填料分离纯化，具体结果如图16所示。
其中，曲线I为仪器对波长为208nm检测的信号曲线；曲线II为洗脱液B的浓度变化曲线；分隔符III为按峰收集后各管之间的截止符。收集^标记的管，即13号管溶液；将2号管溶液经二次分离后的13号管溶液进行LC-MS、TIC、MRM检测，检测结果如图17～19所示。
将上述检测结果与标准品溶液的检测结果进行对比，发现13号管溶液与TG标准品的质谱行为相似，其保留时间(±2.50％)、离子丰度比误差均在可接受范围(±25.00％)内，故认为二次分离后13号管中物质即为TG，利用峰面积归一化法计算纯度为97.33％。
对一次分离5号管溶液的检测结果与标准品溶液的检测结果进行对比，发现5号管溶液与TG标准品的质谱行为相似，其保留时间(±2.50％)、离子丰度比误差均在可接受范围(±25.00％)内，故认为一次分离后5号管中物质即为TG，利用峰面积归一化法计算纯度为100％。
重复上述操作，分批纯化，将临时分离所得溶液保存在-20℃的冰箱内，最后将所有溶液一一对应，各自混合，4℃条件下，离心浓缩得到最终产物。
利用去皮法称重所得产物质量，结果为：2*LD50剂量灌胃后，1mL 24小时家兔尿液可以得到去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷(OG)250ug，羟基西泮葡萄糖醛酸苷(TG)590ug，纯度分别为87.17％，100％。
由上述结果可知，最终得到的OG的纯度相比首次分离所得的OG纯度有所下降，甚至低于95％，而TG的纯度则相对稳定。这是由于完成一次制备(1mL家兔尿液)所需的时间为3天，使最终得到的OG的纯度由最初的100％降低至87.17％。由此可见，去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷(OG)的稳定性不是很好，所以在实际应用中应该注意，对于该物质的使用应当尽量现用现制。而羟基西泮葡萄糖醛酸苷(TG)稳定性则相对较好，且纯度很高，对于实际应用具有重要意义。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，以体积份数计，包括以下步骤：
S1、获取含有安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的尿液；
S2：用甲醇溶液提取，振荡、离心，上清液用氮气吹干，再用超纯水复溶，振荡，0.22um水膜过滤，用超纯水稀释100倍后进蛋白纯化仪，利用反向填料柱RESOURCETM RPC进行一次分离纯化；
S3、将S2中分离得到的若干样品，分别用液相串联质谱仪进行检测，并与目标物标准品进行对比，定性目标物样品，并计算目标物样品的纯度；
S4、判断S3中的目标物样品的纯度是否合格，当目标物样品的纯度合格时，保存，待用；当目标物样品的纯度不合格时，将不合格的目标物样品依次通过离子交换型制备柱HiTrapTM Q HP、蛋白纯化仪进行分离纯化，并依照S3方法计算目标物样品纯度；
S5、将S4得到的相同的目标物样品溶液混合后，离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。
2.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S1中，所述含有安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的尿液的获取过程如下：
通过空腹灌胃家兔一定剂量的安定后收集的尿液样品，并于-20℃下储存，待用；其中，安定的用药剂量为家兔重量×2×LD50，家兔的LD50剂量为129.48mg/kg。
3.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S2中，尿液与甲醇溶液的体积比为1:3，甲醇溶液是由体积比3:2的甲醇-水混合得到的。
4.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S2中，离心的转速为5000r/min，离心的时间为20min；氮气吹干时的加热温度为37℃。
5.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S2中，利用反向填料柱进行一次分离所用的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，其中，以体积百分比计，所述洗脱液A包括0.065％甲酸、2％乙腈、其余为水；所述洗脱液B包括0.05％甲酸、80％乙腈、其余为水。
6.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S3中，进液相串联质谱前，需要取100ng/ml目标物标准品，经紫外分光光度仪明确目标物的最大吸收波长。
7.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S4中，判断S3中的目标物样品的纯度是否合格的标准为：当目标物样品的纯度≥95％时，判定目标物样品的纯度为合格；反之为不合格。
8.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S4中，通过离子交换型制备柱进行分离的步骤如下：
S4.1、取1倍体积量的水对离子交换型制备柱进行预活化处理；
S4.2、将不合格的目标物样品溶液的pH用10％氢氧化钠溶液调至11～12，上样；
S4.3、用1倍体积量的pH 2～3的生理盐水进行洗脱，得到洗脱液；
其中，pH 2～3的生理盐水是用10％盐酸溶液将生理盐水调节至pH 2～3得到的。
9.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S4中，纯度合格的目标物样品的保存温度为-20℃。
10.根据权利要求1所述的安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于，S5中，离心浓缩的温度为4℃。
CN201911377826.9A 2019-12-27 2019-12-27 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法 Active CN111040001B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911377826.9A CN111040001B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911377826.9A CN111040001B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111040001A true CN111040001A (zh) 2020-04-21
CN111040001B CN111040001B (zh) 2021-04-16

Family

ID=70240645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911377826.9A Active CN111040001B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111040001B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1079825A (zh) * 1991-12-20 1993-12-22 洛克菲勒大学 体内高级糖基化终产物的免疫化学检测
CN103529135A (zh) * 2012-07-03 2014-01-22 上海市刑事科学技术研究院 Lc-ms/ms法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法
CN107271599A (zh) * 2016-04-08 2017-10-20 上海市刑事科学技术研究院 一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线spe lc-ms/ms分析方法
CN109342604A (zh) * 2018-11-27 2019-02-15 北京市化工职业病防治院 尿液中二甲苯代谢物的检测方法
CN109765306A (zh) * 2018-12-20 2019-05-17 山东省海洋资源与环境研究院 一种淡水中地西泮的检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1079825A (zh) * 1991-12-20 1993-12-22 洛克菲勒大学 体内高级糖基化终产物的免疫化学检测
CN103529135A (zh) * 2012-07-03 2014-01-22 上海市刑事科学技术研究院 Lc-ms/ms法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法
CN107271599A (zh) * 2016-04-08 2017-10-20 上海市刑事科学技术研究院 一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线spe lc-ms/ms分析方法
CN109342604A (zh) * 2018-11-27 2019-02-15 北京市化工职业病防治院 尿液中二甲苯代谢物的检测方法
CN109765306A (zh) * 2018-12-20 2019-05-17 山东省海洋资源与环境研究院 一种淡水中地西泮的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何文婷 等: ""固相萃取HPLC法同时测定兔血中地西泮及其代谢产物"", 《中西医结合心脑血管病杂志》 *
王乐乐 等: ""SPE-HPLC/MS/MS法检测人唾液中地西泮及其代谢物"", 《中国法医学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111040001B (zh) 2021-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ou-yang et al. Pharmacokinetic study of rutin and quercetin in rats after oral administration of total flavones of mulberry leaf extract
van Breemen et al. Electrospray liquid chromatography/mass spectrometry of ginsenosides
Gulyassy et al. Isolation and chemical identification of inhibitors of plasma ligand binding
CN110231424B (zh) 一种同时定量检测血浆中双参平肺颗粒主要成分的方法
Yuan et al. How to realize the linear scale-up process for rapid purification using high-performance counter-current chromatography
Xue et al. An improved ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization/quadrupole-time-of-flight high-definition mass spectrometry method for determining ingredients of herbal Fructus corni in blood samples
Qu et al. Combined application of macroporous resin and high speed counter‐current chromatography for preparative separation of three flavonoid triglycosides from the leaves of A ctinidia valvata D unn
Halliday et al. Mass spectrometric assay of stable isotopic enrichment for the estimation of protein turnover in man
CN111040001B (zh) 安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法
Hou et al. Development of a method to screen and isolate bioactive constituents from Stellera chamaejasme by ultrafiltration and liquid chromatography combined with semi‐preparative high‐performance liquid chromatography and high‐speed counter current chromatography
Dyfverman et al. A novel liquid-gel chromatographic method for extraction of unconjugated steroids from aqueous solutions
CN108802230A (zh) 生物样品中丹参素及其代谢产物的检测方法
Zhao et al. pH‐Zone‐refining counter‐current chromatography for two new lipo‐alkaloids separated from refined alkaline extraction of Kusnezoff monkshood root
Shibusawa et al. Separation of nucleobases and their derivatives with organic-high ionic strength aqueous phase systems by spiral high-speed counter-current chromatography
Jia et al. Comparative pharmacokinetic study of five flavonoids in normal rats and rats with gastric ulcer following oral administration of Mongolian medicine, Shudage-4 by UPLC–ESI–MS/MS
CN112630338B (zh) 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法
CN115856153A (zh) 一种检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法
Petersen et al. Analysis of thyroid hormones as their heptafluorobutyryl methyl ester derivatives by gas chromatography-mass spectrometry
Wang et al. Identification of active compounds and their metabolites by high‐performance liquid chromatography/electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry from Xiao‐xu‐ming decoction (XXMD)
Myung et al. Identification of IY81149 and its metabolites in the rat plasma using the on-line HPLC/ESI mass spectrometry
CN110068618A (zh) 一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法
Murray et al. Microbore high-performance liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry of steroid sulphates
CN109633039B (zh) 生物样品中羟基多甲氧基黄酮化合物及其代谢产物的检测方法
Jin et al. Determination of soyasaponins Ba and Bb in human serum by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry
Coassolo et al. Determination of midazolam and its major hydroxy metabolite in plasma by gas liquid chromatography. Application to a pharmacokinetic study

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant