CN103529135A - Lc-ms/ms法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法。样品采用固相萃取，色谱分离采用C18（Waters

Description

LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法

技术领域

本发明属药物分析领域，涉及一种采用LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法。

背景技术

地西泮是世界卫生组织颁布的基本药物目录中的重要药物之一，且在基本卫生保健制度最低医疗需求名单之列。主要用于治疗失眠、肌肉松弛、惊厥等疾病。地西泮除正当用药外，常存在于临床和法医毒理学药物误用或者滥用引起的自杀、麻醉抢劫等各种犯罪案件中。因此，检测人体检材中痕量的地西泮有非常重大的意义。

地西泮的体内代谢物主要为去甲地西泮、替马西泮、奥沙西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷。作为苯二氮卓类的典型药物，地西泮及其代谢物在尿液中的含量要高于在其他生物基质中的含量，因此通常选择尿液分析检测苯二氮卓类药物。研究表明，服用苯二氮卓类药物后至少有75%的剂量以葡萄糖醛酸结合物的形式从尿液排出，所以尿液中葡萄糖醛酸结合物的含量要高于其他代谢物的含量。但是由于葡萄糖醛酸结合物极性比较大不易于直接测定，以往文献报道主要是分析尿样或者其他生物基质中地西泮及其游离代谢物。很少有报道直接分析地西泮的葡萄糖醛酸结合代谢物。

现有技术中，通常采用酶水解或者酸水解法分析尿样中苯二氮卓类药物代谢物，水解法可以将葡萄糖醛酸结合的药物或代谢物生成游离的药物或代谢物，然后用GC-MS或者LC-MS/MS分析。但酶水解法存在一定的局限性。首先，水解不同的化合物所用酶的种类不同，且水解条件的优化费时费力；第二，酶的竞争性抑制作用可能导致水解不完全；第三，由于某些结合物的结构问题导致结合物可能不会那么容易水解；第四，可能会引起某些化合物结构的转化，生成另外的化合物。ShanLin Fu等人发现尿样中酶水解过程会使奥沙西泮或者奥沙西泮葡萄糖醛酸苷转化为去甲地西泮，随后他们还发现其他苯二氮卓类C3位置的羟基也存在这种异常转化，包括替马西泮和劳拉西泮，其中酶水解尿样使替马西泮转化为地西泮。此研究结果表明酶水解法测定尿中地西泮及代谢物可能会产生某些化合物的假阳性结果。酸水解法虽然更简便，但会使苯二氮卓类药物分解为苯甲酮类，导致识别的特异性受影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法。本发明方法不经酶水解或酸水解过程，采用LC-MS/MS分析方法可直接检测尿样中地西泮及体内代谢物。并用该方法对口服地西泮志愿者服药后尿样进行了检验，可直接获得地西泮及其代谢物在人体内的最长检测时限。

所述的LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法，其LC-MS和MS检测条件分别如下：

1）LC-MS色谱条件：

色谱柱为MS C18，2.1×150mm，3.5μm；

流动相由A、B组成，其中A为含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的水，B为含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的乙腈；梯度洗脱，流速为0.20mL/min，柱温45℃，进样量10μL；

2）MS质谱条件：

Quattro Premier XE串联质谱，ESI源，正离子模式，多反应监测MRM，电喷雾电压3500V，雾化气氮气流速为750L/h，温度为450℃，锥孔反吹气氮气流速50L/h，离子源温度120℃，碰撞气为氩气，压力保持在0.35Pa；

3）内标：地西泮-d5。

其中，上述分析方法中，所述流动相的梯度洗脱如下：10%B：0-0.5min，10-20%B：0.5-2min，20-50%B：2-6min，50-70%B：6-13min，70-95%B：13-13.5min，95%B：13.5-16.5min，95-10%B：16.5-17min，10%B：17-21min。

所述的地西泮体内代谢物包括：三个游离代谢物去甲地西泮、奥沙西泮和替马西泮，和两个葡萄糖醛酸结合物奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮葡萄糖醛酸苷。

按每个化合物选取2个母离子/子离子对结合保留时间定性来确定MRM参数。

尿样中地西泮及其体内代谢物用甲醇溶解分别配制成储备液和工作液。

尿样采用以下方法进行前处理：依次用甲醇、去离子水、乙酸-乙酸铵缓冲液活化Oasis HLB柱，吸取尿样加入乙酸-乙酸铵缓冲液，再加入地西泮-d5，涡旋混匀后上柱，用含2%氨水的甲醇溶液、去离子水淋洗柱子，最后用甲醇洗脱，洗脱液在50-60℃水浴空气流下吹干，残渣用流动相溶解，转移至自动进样小瓶中，进样。

本申请成功建立了一种人尿样中奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮葡萄糖醛酸苷、奥沙西泮、去甲地西泮、替马西泮及地西泮的LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）的直接分析方法。样品采用固相萃取，色谱分离采用C18（Waters

MS C18，3.5μm×2.1×150mm）色谱柱，以流动相水（含2mM甲酸铵和0.05%甲酸）和乙腈（含2mM甲酸铵和0.05%甲酸）梯度洗脱。质谱采用电喷雾电离（ESI），多反应监测（MRM）模式检测目标化合物。所有待测物提取回收率均在65-122%，日间精密度和日内精密度均在11.2%以内，质控样品的浓度：奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷为10、50、200、500ng/mL，奥沙西泮为4、20、800、2000ng/mL，去甲地西泮、替马西泮及地西泮为1、5、200、500ng/mL。奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷线性范围为5-1000ng/mL，奥沙西泮的线性范围为2-4000ng/mL，去甲地西泮、替马西泮及地西泮线性范围为0.5-1000ng/mL，线性关系良好，相关系数r²均大于0.99。奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮葡萄糖醛酸苷的检测限为2ng/mL，奥沙西泮的检测限为0.4ng/mL，去甲地西泮、替马西泮和地西泮的检测限为0.1ng/mL。将本方法应用于三名服用5mg地西泮片的健康志愿者尿样分析。结果显示三人中地西泮最长检测时限为68小时，同一个人检测时限最长的游离代谢物去甲地西泮能检测到252小时，而奥沙西泮葡萄糖醛酸苷的检测时限比去甲地西泮长312小时，比地西泮长496小时，另外两名志愿者尿液分析也得到了相似的结果。

附图说明

图1为添加到尿样中的不同pH的缓冲液对各目标物基质效应的影响，其中：1为地西泮，2为去甲地西泮，3为奥沙西泮，4为奥沙西泮葡萄糖醛酸苷，5为替马西泮，6为替马西泮葡萄糖醛酸苷，7为地西泮-d5（内标溶液）。

图2为不同梯度洗脱程序与目标化合物峰面积的关系。

图3为空白尿样A的MRM色谱图，其中：（1）为奥沙西泮葡萄糖醛酸苷，（2）为替马西泮葡萄糖醛酸苷，（3）为奥沙西泮，（4）为去甲地西泮，（5）为替马西泮，（6）为地西泮，（7）为地西泮-d5（内标溶液）。

图4为添加定量限浓度标准品的尿样B的MRM色谱图，其中：（1）为奥沙西泮葡萄糖醛酸苷，（2）为替马西泮葡萄糖醛酸苷，（3）为奥沙西泮，（4）为去甲地西泮，（5）为替马西泮，（6）为地西泮，（7）为地西泮-d5（内标溶液）。

图5为服药10h后的尿样C的MRM色谱图，其中：（1）为奥沙西泮葡萄糖醛酸苷，（2）为替马西泮葡萄糖醛酸苷，（3）为奥沙西泮，（4）为去甲地西泮，（5）为替马西泮，（6）为地西泮，（7）为地西泮-d5（内标溶液）。

图6为服药480h后的尿样D的MRM色谱图，其中：（1）为奥沙西泮葡萄糖醛酸苷，（2）为替马西泮葡萄糖醛酸苷，（3）为奥沙西泮，（4）为去甲地西泮，（5）为替马西泮，（6）为地西泮，（7）为地西泮-d5（内标溶液）。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

本发明所用试剂及仪器如未特殊说明，其来源如下：

奥沙西泮葡萄糖醛酸苷（100μg/mL）、替马西泮葡萄糖醛酸苷锂盐（100μg/mL，以游离酸的形式计算）、去甲地西泮（1mg/mL）、替马西泮（1mg/mL）及内标地西泮-d5（1mg/mL）均购自美国Cerilliant公司；奥沙西泮、地西泮均购自中国药品生物制品检定所。色谱纯乙腈、甲醇均购自Merck公司，色谱纯甲酸、甲酸铵均购自德国GNW公司；其他试剂均为国产分析纯：乙酸、乙酸铵、二氯甲烷、氨水、环己烷、乙醚、苯、氢氧化钠（上海凌峰化学试剂公司）；磷酸二氢钠（广东汕头市金砂化工厂有限公司）。

去离子水由ELGA Labwater PURELAB ULtra系统过滤，Oasis HLB（1cc/30mg）柱购自美国Waters公司。

基质：空白尿样取自六位健康志愿者。4℃冰箱保存。

实施例1储备液及工作液的配制

称取适量的奥沙西泮、地西泮用甲醇溶解，分别配制成0.5mg/mL的储备液。替马西泮、去甲地西泮用甲醇稀释成0.09mg/mL和0.1mg/mL的储备液，内标地西泮-d5稀释到0.1mg/mL。

将地西泮、去甲地西泮、替马西泮以及奥沙西泮用甲醇配制成浓度分别为10μg/mL、10μg/mL、10μg/mL、40μg/mL的混合工作液，奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷用甲醇稀释至5μg/mL，用于配制线性及质控样品所需的各浓度溶液。地西泮-d5储备液用甲醇稀释到500ng/mL的工作液。

实施例2LC-MS色谱条件

Waters Alliance 2695 HPLC系统，Waters

MS C18色谱柱（2.1×150mm，3.5μm），Waters

MS C18保护柱（2.1×10mm，3.5μm）。

流动相A（含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的水）和B（含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的乙腈）。梯度10%B（0-0.5min），10-20%B（0.5-2min），20-50%B（2-6min），50-70%B（6-13min），70-95%B（13-13.5min），95%B（13.5-16.5min），95-10%B（16.5-17min），10%B（17-21min），流速为0.20mL/min，柱温45℃，进样量10μL。

实施例3MS质谱条件

Quattro Premier XE串联质谱（Waters MS TechnoLogies，Manchester，UK），ESI源，正离子模式，多反应监测（MRM），电喷雾电压3500V，雾化气（氮气）流速为750L/h，温度为450℃，锥孔反吹气（氮气）流速50L/h，离子源温度120℃，碰撞气为氩气，压力保持在0.35Pa（3.5×10^-3mBar）。

每个化合物选取2个母离子/子离子对结合保留时间定性，各参数列于表1。数据处理应用的是MassLynx V4.1配备的QuanLynx软件。

表1地西泮、去甲地西泮、奥沙西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮、替马西泮葡萄糖醛酸苷及内标的质谱MRM参数

注：划线的子离子用于定量。

实施例4尿样的前处理

依次用1mL甲醇、1mL去离子水、1mL乙酸-乙酸铵缓冲液（0.2M，pH6.0）活化Oasis HLB柱，吸取1mL尿样加入1mL乙酸-乙酸铵缓冲液（0.2M，pH6.0），再加入50μL地西泮-d5（500ng/mL），涡旋混匀后上柱，用1mL2%氨水5%甲醇溶液、1mL去离子水淋洗柱子，最后用1mL甲醇洗脱。洗脱液在60℃水浴空气流下吹干，残渣用100μL初始流动相溶解，转移至自动进样小瓶中，进样。

实施例5方法学验证

1）专属性

同样条件分析6份空白尿样，观察待测物出峰位置是否有杂质峰干扰。

2）标准曲线的测定

分别配制奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷浓度5、50、100、200、500、1000ng/mL，去甲地西泮、替马西泮和地西泮浓度0.5、10、50、200、500、1000ng/mL，奥沙西泮2、40、200、800、2000、4000ng/mL的混合尿样，按实施例4操作，以待测物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，样品中化合物的浓度为横坐标，最小二乘法进行线性回归，权重1/x²制作标准曲线。数据分析采用QuanLynx V4.1软件。

奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷浓度均为10、50、200、500ng/mL，地西泮、去甲地西泮和替马西泮均为1、5、200、500ng/mL，奥沙西泮为4、20、400、2000ng/mL的混合尿样作为质控样品。

3）检测限（LOD）和定量限（LOQ）

分析物色谱峰高相当于基线噪音3倍的浓度确定为检出限（LOD），峰高相当于基线噪音10倍的浓度确定为定量限（LOQ）。

4）精密度和准确度

四个浓度的质控尿样按实施例4操作，将各化合物峰面积与内标峰面积的比值代入各自的标准曲线方程求得浓度与实际添加的浓度的比值×100%为准确度。日内重复测定5次和连续测定3天（每日5次），计算实测浓度的相对标准偏差（RSD），得到日内和日间精密度。

5）基质效应和回收率

基质效应又分为绝对基质效应和相对基质效应。绝对基质效应评价质谱信号的增强或者抑制，空白尿样经实施例4处理后加入各目标物制成质控浓度的样品得到的峰面积为B，另取相同量的对照品溶液，吹干，初始流动相溶解后进样得到的峰面积为A，则绝对基质效应即为B/A×100%。

相对基质效应是评价不同来源的基质之间的差异，取6份空白尿样添加一定浓度的标准品经实施例4处理，计算各目标物峰面积的相对标准偏差（RSD）。

提取回收率则是空白尿样添加质控浓度的标准品及内标液按实施例4处理得到的峰面积（C）与空白尿样经实施例4处理后添加同样浓度的标准品及内标得到的峰面积（B）的比值，即C/B×100%。

6）稳定性测定

稳定性实验主要是考察样品分析过程中可能影响测定结果的因素。主要包括尿样4℃放置24h，-20℃放置7天，处理后的样品8℃放置5h、24h，冻融实验。考察冻融稳定性时，空白尿样（n=3）添加质控浓度的标准品，-20°C冰箱存放24h，室温放置1h解冻，然后加入内标按实施例4处理测定准确度。

7）样品检测

3名健康志愿者各口服地西泮5mg，服药后的第一天收集尿样三次，接下来的6天每天收集尿样两次，之后每天收集一次尿样直至待测物的浓度低于定量限。按上述方法测定尿样中地西泮代谢物，由工作曲线计算各分析物测定值。

实施例6

1.样品处理条件的优化

葡萄糖醛酸结合物极性较大且易溶于水，很难采用传统的液液萃取进行提取分离，本文采用固相萃取法（SPE）去除尿样中的内源性物质进而提取地西泮及其代谢物。清洗溶液及洗脱液是改善回收率和基质效应的两个主要因素，下面主要优化这两个因素。

1.1清洗溶液的优化

考查水、5%甲醇溶液、5%甲醇溶液（含2%甲酸）、5%甲醇溶液（含2%氨水）、5%甲醇溶液（含0.05%甲酸）、环己烷、乙醚、苯及不同比例、不同顺序对基质效应的影响，结果表明1mL 5%甲醇溶液（含2%氨水）、1mL水淋洗HLB柱基质干扰相对较小。为了考查不同pH尿样的影响，向尿样中加入乙酸-乙酸铵缓冲液（0.2M，pH 3.0-6.0）和磷酸盐缓冲液（0.2M，pH7.0-8.0）调整尿样的pH，淋洗溶液选用1mL 5%甲醇溶液（含2%氨水）、1mL水，结果见图1。

从图1可以看出，尿样添加pH7.0和8.0的磷酸盐缓冲液后处理，各目标化合物的基质效应均表现为抑制作用，且奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷的基质效应均低于40%，尿样添加乙酸-乙酸铵缓冲液（pH3.0-6.0）处理，对于地西泮、替马西泮、去甲地西泮基质效应的影响不是十分显著，对其它成分的影响仍然较大，但是在pH6.0时，奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷的基质效应均高于其他pH条件，而这两种物质是延长地西泮检测时限的关键化合物，因此最后选定1mL尿样中添加1mL乙酸-乙酸铵缓冲液（0.2M，pH6.0）。

1.2洗脱溶剂的选择

考查不同比例的二氯甲烷和甲醇对尿样中各化合物基质效应的影响，三种比例分别为⑴二氯甲烷:甲醇=0:100，⑵二氯甲烷:甲醇=1:1，⑶二氯甲烷:甲醇=9:1。洗脱尿样，结果表明二氯甲烷未改善化合物的基质效应，本申请选用1mL纯甲醇为洗脱液。

2.色谱条件的优化

流动相的成分影响检测灵敏度，考查三种流动相组成对检测灵敏度的影响。第一种是流动相中A为纯水、B为纯乙腈，第二种是流动相中A为水、B为乙腈（含0.1%甲酸），第三种是流动相中A为水（含2mM甲酸铵和0.05%的甲酸）、B为乙腈（含2mM甲酸铵和0.05%的甲酸）。结果表明最后一种流动相灵敏度更高。甲酸铵可以提高仪器信号的响应值，分别在A、B两相中加入相同浓度的甲酸和甲酸铵，可以改善色谱峰面积的稳定性。

不同的梯度洗脱程序对化合物的峰面积和基质效应也有影响，如图2。

15min：10%B（0-0.5min），10-20%B（0.5-2min），20-95%B（2-8min），95%B（8-11min），95-10%B（11-11.5min），10%B（11.5-15min）。

20min：5%B（0-0.5min），5-10%B（0.5-1min），10-50%B（1-4min），50-70%B（4-11min），70-95%B（11-11.5min），95-100%B（11.5-14.5min），100-5%B（14.5-20min）。

21min：10%B（0-0.5min），10-20%B（0.5-2min），20-50%B（2-6min），50-70%B（6-13min），70-95%B（13-13.5min），95%B（13.5-16.5min），95-10%B（16.5-17min），10%B（17-21min）。

30min：5%B（0-0.5min），5-10%B（0.5-1min），10-20%B（1-5min），20-50%B（5-10min），50-70%B（10-18min），70-100%B（18-20min），100-5%B（20-23min），5%B（23-30min）。

从图2可以看出，在上述21min的梯度洗脱程序下大多数化合物均得到了较高的响应值。

实验结果表明延长色谱分离过程可以使尿样中的杂质与待测物在色谱柱上得到较好地分离从而改善化合物的基质效应，两种延长地西泮检测时限的关键物质奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷的基质效应在21min和30min得到的结果均优于另外的洗脱程序，综合上述因素及节省时间的考虑，最后选择21min的洗脱程序作为色谱分离条件。

3.方法学验证

3.1专属性

不同的空白尿样固相萃取后得到的MRM色谱图显示在目标物出峰位置无其他杂质峰干扰。图3-6为空白尿样、加药尿样及实际样品的典型MRM色谱图。

3.2线性和灵敏度

各化合物线性关系良好，线性系数r²均大于0.99，各化合物的线性方程、检测限、定量限列于如下表2。奥沙西泮葡萄糖醛酸苷与替马西泮葡萄糖醛酸苷的定量限均为5ng/mL，地西泮、去甲地西泮和替马西泮均为0.5ng/mL，奥沙西泮为2ng/mL。检测灵敏度较高。

表2地西泮、去甲地西泮、奥沙西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮、替马西泮葡萄糖醛酸苷的线性关系、检测限及定量限

3.3准确度和精密度

所有化合物的准确度均大于88%。日内精密度（RSD范围1.5-11.2%）和日间精密度（RSD范围0.4-11.2%），结果见如下表3。

表3地西泮、去甲地西泮、奥沙西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮、替马西泮葡萄糖醛酸苷准确度、日内及日间精密度

3.4稳定性

稳定性实验结果表明质控样品4℃存放24h，-20℃存放7天，处理后的样品8℃环境下存放24h，一次冻融后化合物均未发生较明显的变化。实验过程中发现尿样最好不要经过多次冻融后测定，以免影响测定结果。

3.5提取回收率和基质效应

提取回收率和基质效应的结果见如下表4，除了浓度1ng/mL的替马西泮回收率为70%，浓度1ng/mL地西泮回收率为65%，浓度10ng/mL的奥沙西泮回收率为122%，其余化合物各浓度回收率均在93-119%范围内。基质效应范围为50-132%。提取后添加标准品的六份空白尿样之间测定的RSD小于20%，说明基质效应不会影响化合物的定量测定结果。

表4地西泮、去甲地西泮、奥沙西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷、替马西泮、替马西泮葡萄糖醛酸苷及内标的提取回收率和基质效应

4.实际尿样的检测

本试验目的是验证直接测定葡萄糖醛酸结合物是否可以延长地西泮的检测时限。然而，由于服用剂量、检测灵敏度、剂型、给药方式、长期服药或者单次服药，个体之间代谢差异等因素的影响，比较难以给出一种药物具体的检测时间。但同一个人服用地西泮使用同样检测方法测定尿样中地西泮及代谢物，其葡萄糖醛酸结合物与游离代谢物的检测时间具有可比性。三名健康志愿者口服5mg地西泮，然后取尿样采用本方法检测。服药后待测物的浓度低于定量限的最长的时间定为检测时间。

试验数据表明，奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷的检测时间均明显长于地西泮原体及其游离代谢物，且奥沙西泮葡萄糖醛酸苷最长。表5显示，奥沙西泮葡萄糖醛酸苷检测时间最长的一人为564h，同一人中原体药物地西泮检测到68小时（也为三人中最长），此人检测时间最长的游离代谢物去甲地西泮，检测时间为252h，奥沙西泮葡萄糖醛酸苷检测时间比去甲地西泮多312h，比地西泮多496h，其他两位志愿者测定结果也得到了类似的数据。地西泮的检测时限得到了显著地延长，是临床和法医学研究中的重大突破。

表5三名志愿者服用5mg地西泮后尿样中地西泮及其代谢物的检测时间

本发明成功建立了一种SPE-LC-ESI-MS/MS法直接分析检测人尿样中地西泮及其游离代谢物、葡萄糖醛酸结合物的分析方法并进行了方法学验证，该法快速、灵敏、简便，同时可应用于实际服药后尿样的分析检测，结果表明直接分析地西泮葡萄糖醛酸结合代谢物显著延长了地西泮的检测时限。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其体内代谢物的分析方法，其特征在于，所述的LC-MS/MS的检测条件如下：

1）LC-MS色谱条件：

色谱柱为MS C18，2.1×150mm，3.5μm；

流动相由A、B组成，其中A为含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的水，B为含2mM甲酸铵和0.05%甲酸的乙腈；梯度洗脱，流速为0.20mL/min，柱温45℃，进样量10μL；

2）MS质谱条件：

Quattro Premier XE串联质谱，ESI源，正离子模式，多反应监测MRM，电喷雾电压3500V，雾化气氮气流速为750L/h，温度为450℃，锥孔反吹气氮气流速50L/h，离子源温度120℃，碰撞气为氩气，压力保持在0.35Pa；

3）内标：地西泮-d5。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的梯度洗脱如下：10%B：0-0.5min，10-20%B：0.5-2min，20-50%B：2-6min，50-70%B：6-13min，70-95%B：13-13.5min，95%B：13.5-16.5min，95-10%B：16.5-17min，10%B：17-21min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述地西泮的体内代谢物包括：去甲地西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸苷和替马西泮葡萄糖醛酸苷。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，每个化合物选取2个母离子/子离子对结合保留时间定性来确定MRM参数。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，尿样中地西泮及其体内代谢物用甲醇溶解分别配制成储备液和工作液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，尿样采用以下方法进行前处理：依次用甲醇、去离子水、乙酸-乙酸铵缓冲液活化Oasis HLB柱，吸取尿样加入乙酸-乙酸铵缓冲液，再加入地西泮-d5，涡旋混匀后上柱，用含2%氨水的甲醇溶液、去离子水淋洗柱子，最后用甲醇洗脱，洗脱液在50-60℃水浴空气流下吹干，残渣用流动相溶解，转移至自动进样小瓶中，进样。

Images