CN112083107B - 检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法。该方法包括：将蜂蜜基质样品与内标物接触，以便得到样品混合物；将所述样品混合物进行稀释提取和固相萃取净化，以便得到提取液；以及采用液相色谱串联质谱对所述提取液进行检测，以便对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测。该方法针对蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行检测，填补了该化合物检测的空白，并且检测方法快速、准确、灵敏度高。

Description

检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地，涉及检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法。

背景技术

蜂蜜中磺胺类抗生素残留是蜂蜜检测的重要项目。我国国家安全标准GB14963-2011中要求蜂蜜中兽药残留限量应符合相关标准的规定。相关标准规定包括：1.卫生部在2011年4月发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中指出蜂蜜中可能残留磺胺类抗生素。2.无公害蜂蜜(NY5134-2008)中对抗生素的安全指标是四环素族抗生素≤0.5mg/kg，磺胺类抗生素类≤0.05mg/kg，其他兽药限量应符合国家有关规定。常用的磺胺类抗生素的名称见表1。

表1常用的磺胺类抗生素名称

名称	英文缩写	分子式	分子量
				磺胺嘧啶	SDZ	C<sub>10</sub>H<sub>10</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	250.28
磺胺吡啶	SPD	C<sub>11</sub>H<sub>11</sub>N<sub>3</sub>O<sub>2</sub>S	249.29
				磺胺噻唑	STZ	C<sub>9</sub>H<sub>9</sub>N<sub>3</sub>O<sub>2</sub>S<sub>2</sub>	255.32
磺胺甲基嘧啶	SM1	C<sub>11</sub>H<sub>12</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	264.30
				磺胺二甲嘧啶	SM2	C<sub>12</sub>H<sub>14</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>S	278.33
磺胺二甲氧哒嗪	SDT	C<sub>12</sub>H<sub>14</sub>N<sub>4</sub>O<sub>4</sub>S	310.30
				磺胺甲噁唑	SMZ	C<sub>10</sub>H<sub>11</sub>N<sub>3</sub>O<sub>3</sub>S	253.05

蜂蜜成分中绝大部分为还原单糖，其中果糖含量约31-44％，葡萄糖含量23-41％和0.3-8％的蔗糖。磺胺抗生素分子的氨基(-NH2)会与蜂蜜中还原糖分子的醛基(-COH)发生醛酸反应生成磺酰胺基苯糖共轭类物质，这种葡萄糖醛酸结合物的形成会降低蜂蜜中磺胺类抗生素的定量结果。为准确测定蜂蜜中磺胺类药物的含量，蜂蜜中磺胺类化合物的前处理方法中，通常含有水解步骤，以释放自由态磺胺类药物。

然而，对于蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物是否均能完全水解，鲜有文献报道研究。又知，磺胺类药物与还原糖的结合反应在短时间不能达到动态平衡，即短时间内蜂蜜中添加的磺胺不能完全模拟真实蜂蜜中磺胺类药物的实际分散和结合程度，纵使添加回收率接近100％，也不能证明蜂蜜中与葡萄糖结合的磺胺类药物均能被完全水解释放。因此，蜂蜜中磺胺类药物测量准确性评价方法的合理性存在问题，测量结果的准确性难以保障。

由此，蜂蜜中磺胺类药物的准确性检测方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，能准确地定性和定量检测糖结合的磺胺类药物，填补了该检测项目的空白。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将蜂蜜基质样品与内标物接触，以便得到样品混合物；将所述样品混合物进行稀释提取和固相萃取净化，以便得到提取液；以及采用液相色谱串联质谱对所述提取液进行检测，以便对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测。

根据本发明实施例的检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，针对现在蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行检测，填补了该化合物检测的空白，并且检测方法快速、准确、灵敏度高。此外，磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的准确的定性和定量检测，也克服了现有的蜂蜜中磺胺类药物检测因糖结合的磺胺类药物导致磺胺类药物含量检测结果偏低的缺陷，提高了检测的准确度。

另外，根据本发明上述实施例的检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品和提取液的检测结果，对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测。

根据本发明的实施例，所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物标准品的制备方法包括：

将所述磺胺类药物与还原糖溶液混合，得到预备液；

将所述预备液静置不少于13天，以便得到所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品。

根据本发明的实施例，所述还原糖溶液为葡萄糖溶液。

根据本发明的实施例，所述还原糖溶液的浓度为40-60质量/体积％。

根据本发明的实施例，所述定性检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联高分辨质谱UPLC-Orbitrap/MS，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的母离子[M+H]⁺和质谱特征碎片进行所述定性检测。

根据本发明的实施例，所述定量检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联三重四级杆质谱UPLC-MS/MS。

根据本发明的实施例，所述液相色谱的条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CSH^TMC18色谱柱，参数：100×3mm，1.7μm；进样体积：2μL；色谱柱温度38℃；样品温度10℃；流速0.25mL/min；流动相：B相为乙腈甲醇，浓度：1∶1，v/v，A相为去离子水。

根据本发明的实施例，所述质谱的条件：所述高分辨质谱Orbitrap/MS的条件：正离子采集，平行反应监测PRM扫描模式；电喷雾电压：3.5Kv；载气温度：350℃；载气流速：40L/min；毛细管温度300℃，所述三重四级杆质谱MS/MS条件：正离子采集，多重反应监测MRM扫描模式；去簇电压DP：80.0V；离子源气流量GS1：50L/min；GS2：60L/min；喷雾电压：5500.0V；雾化器温度：650.0℃。

根据本发明的实施例，所述液相色谱的梯度洗脱条件为15％B(0-2分钟)-(15-85)％B(2-6分钟)-85％B(6-9分钟)-(85-100)％B(9-10分钟)-100％B(10-12分钟)-(100-15)％B(12-2.1分钟)-15％B(12.1-14分钟)。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：在所述固相萃取前，将所述样品混合物的pH值调节至酸性，优选地，为pH＝4-6。

根据本发明的实施例，所述固相萃取是利用PRIME HLB固相萃取柱进行的。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的葡萄糖与磺胺噻唑的反应原理示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺嘧啶葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图3显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺吡啶葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图4显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺噻唑葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图5显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺甲基嘧啶葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图6显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺二甲基嘧啶葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图7显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺二甲氧哒嗪葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图8显示了根据本发明一个实施例的质量分数为40％的葡萄糖溶液中磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物的UPLC-Orbitrap/MS检测的二级碎裂图；

图9显示了根据本发明一个实施例的磺胺类药物和其同位素内标加入质量分数为40％的葡萄溶液中后，静置时间与磺胺类药物和其同位素内标的色谱峰面积关系示意图；

图10显示了根据本发明一个实施例的磺胺类药物和其同位素内标加入质量分数为40％的葡萄溶液中后，静置时间与磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物和其同位素内标的色谱峰面积关系示意图；

图11显示了根据本发明一个实施例的蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物UPLC-MS/MS检测谱示意图；

图12显示了根据本发明一个实施例的市售蜂蜜中磺胺甲噁唑和其磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物UPLC-MS/MS检测谱示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法。

根据本发明实施例的检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，针对现在蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行检测，填补了该化合物检测的空白，并且检测方法快速、准确、灵敏度高。此外，磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的准确的定性和定量检测，也克服了现有的蜂蜜中磺胺类抗生素检测因糖结合的磺胺类药物导致磺胺类药物含量检测结果偏低的缺陷，提高了检测的准确度。

目前，蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的检测方法有液相色谱紫外或荧光检测法，其中，液相色谱紫外或荧光检测对分离要求高，糖结合的磺胺类药物极性接近，若要是同时检测多种糖结合的磺胺类药物，需要较长的分离时间，而且紫外和荧光法的检测灵敏度低。液相色谱串联质谱具有较高的准确性，灵敏度和选择性，虽蜂蜜内源成分复杂，但发明人发现，通过水溶液稀释提取和固相萃取柱净化，便能实现蜂蜜中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的高效检测。

为了便于理解该检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100添加内标

根据本发明的实施例，将蜂蜜基质样品与内标物接触，得到样品混合物。由此，通过添加内标物提高液相色谱串联质谱定性/定量检测磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的准确性。

根据本发明的实施例，该内标物为稳定¹³C同位素内标。

根据本发明的实施例，该内标物的浓度与基质样品中所述磺胺类药物浓度相同。

进一步地，根据本发明的实施例，还包括将样品混合物进行稀释处理，降低蜂蜜基质的黏度，可以用水稀释，稀释的比例为1g样品混合物20ml水。由此，便于后续的固相萃取和液相色谱串联质谱检测。

S200固相萃取

根据本发明的实施例，将所述样品混合物进行稀释提取和固相萃取，得到提取液。由此，通过稀释处理降低蜂蜜基质的黏度，此外，由于样品混合物中常含有大量的单糖，黏度大，容易堵塞质谱系统，尤其损害色谱柱和电喷雾针，需要对样品进行净化处理，去除单糖杂质，而基于乙腈、二氯甲烷等常规有机溶剂无法有效提取糖磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物，发明人省去液液萃取步骤，直接采用固相萃取技术提取净化蜂蜜中磺胺类药物，净化效果好，有效延长仪器使用寿命，并且，检测的灵敏度、选择性及准确度得到极大提高。

根据本发明的实施例，该稀释处理可以用水稀释，稀释的比例为1g样品混合物20ml水。由此，便于后续的固相萃取和液相色谱串联质谱检测。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：在所述固相萃取前，将所述样品混合物的pH值调节至酸性，使样品混合物均处于分子状态，优选地，为pH＝4-6。由此，提高样品混合物的提取效率。

根据本发明的实施例，所述固相萃取是利用PRIME HLB固相萃取柱进行的。由此，根据PRIME HLB固相萃的亲脂亲水性填料，在去除基质中干扰物的同时，可有效提取中等极性的磺胺类药物和极性较强的磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物。

进一步地，根据本发明的一些实施例，可以将提取液氮气吹干后，用初始流动相复溶，过GHP滤膜，从而得到预定体积的更纯净的提取液。

S300分析检测

根据本发明的实施例，采用液相色谱串联质谱对所述提取液进行检测，对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测。

根据本发明的实施例，采用液相色谱串联质谱，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品和提取液的检测结果，对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测。

并且，发明人对该质控品的制备进行了摸索，由于蜂蜜中糖结合的磺胺类药物的比例难以确定，并且无相应的检测其纯度的方法，故磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物无现有的市售标准品，发明人通过大量的实验摸索，研究磺胺类药物与葡萄糖结合规律，发现短时间内，磺胺类药物与还原糖的结合反应在室温静置条件下不能达到动态平衡，一般情况下，要静置13天后才能达到平衡，从而得到了制备高纯度磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品的方法。根据本发明的实施例，该磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品的制备方法包括：将所述磺胺类抗生素与还原糖溶液混合，得到预备液；将所述预备液静置不少于13天，以便得到所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品。

基于蜂蜜中还原糖主要为葡萄糖和果糖，该两种糖化学式均为C₆H₁₂O₆，含有相同质量数，即蜂蜜中每种磺胺类药物的葡萄糖醛酸结合物的质量数一定。因此，为深入了解磺胺药物在蜂蜜中的反应过程及其产物，研究准确定量分析蜂蜜中磺胺类药物的样品制备与测量方法，本实施例以质量分数为40％的葡萄糖溶液为基质，加入磺胺类药物和其同位素内标，制备质控品，混匀后静置24h，得磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物及其同位素内标混合溶液。经PRIME HLB柱净化，氮气氮吹，初始流动相复溶后，采用UPLC-Orbitrap/MS对磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物定性识别。根据磺胺类药物与还原糖结合原理(附图1)，可推出还原单糖结合的磺胺类药物的精确质量数(相应质量数可见表3)。通过UPLC-Orbitrap/MS对磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物及其同位素内标进行母离子扫描和二级离子扫描，磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物及其同位素内标的二级碎裂图和相应磺胺类药物及其同位素内标的二级碎裂图如附图2至图8所示。对比二者特征碎片离子及其同位素标记化合物的特征碎片离子，充分证明所检测到葡萄糖醛酸结合物为磺胺类物质与还原单糖发生脱水反应生成。

进而，根据本发明的实施例，该还原糖溶液为还原单糖溶液，优选地，为葡萄糖溶液。蜂蜜中的主要还原糖为葡萄糖和果糖，且二者均为单糖，即蜂蜜基质样品中主要为单磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物。因此，选择葡萄糖，可最大化模拟蜂蜜基质样品中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物存在形态。

根据本发明的实施例，该还原单糖溶液的浓度为40-60质量/体积％。由于葡萄糖在蜂蜜中的平均含量为23-41％。发明人选择葡萄糖在蜂蜜中的最高平均含量，进而最大化模拟磺胺类药物与蜂蜜中还原单糖的反应程度，发明人应用质谱技术检测磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物，研究磺胺药物与还原单糖在室温条件下静置不同时间的反应情况。将磺胺类药物及其同位素内标加入40％葡萄糖溶液，混匀后静置不同时间(0h、2h、2day、8day、13day、14day、20day)。经PRIME HLB柱净化，氮气氮吹，用含有一定浓度磺胺异噁唑的初始流动相复溶，应用UPLC-MS/MS检测。磺胺异噁唑为质控样品，以消除仪器对分析结果的影响。磺胺类药物和磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物同磺胺异噁唑的色谱峰面积比随静置时间变化如附图9所示。室温静置13天后，磺胺类药物与葡萄糖的峰面积不再发生明显变化，表明磺胺类药物与葡萄糖的结合反应达到动态平衡，此时，该磺胺类药物和磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物可以作为磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的质控品，对磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物定量检测的结果进行校正。静置时间与磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物和其同位素内标的色谱峰面积关系的变化结果(详见图10)进一步表明若采用添加回收率评价检测蜂蜜样品中磺胺类药物方法有效性时，磺胺类药物加入空白蜂蜜基质后的平衡方式直接影响测试结果的准确性。

根据本发明的实施例，该定性检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联高分辨质谱UPLC-Orbitrap/MS，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的母离子[M+H]⁺和质谱特征碎片进行所述定性检测。由此，检测的灵敏度、准确度高，定性识别结果假阳性低。

具体地，根据本发明的实施例，磺胺嘧啶葡萄糖醛酸结合物的母离子为413.113Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011和318.066Da；磺胺吡啶葡萄糖醛酸结合物的母离子为412.115Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011和318.065Da；磺胺噻唑葡萄糖醛酸结合物的母离子为418.037Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011和318.065Da；磺胺甲基嘧啶葡萄糖醛酸结合物的母离子为427.123Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011、190.028和318.065Da；磺胺二甲嘧啶葡萄糖醛酸结合物的母离子为441.140Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011、204.045和318.065Da；磺胺二甲氧哒嗪葡萄糖醛酸结合物的母离子为473.138Da，特征子离子为108.045、124.039、156.011、218.022和353.091Da；磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物的母离子为416.112Da，特征子离子为108.045、135.068、156.011和254.060Da。

根据本发明的实施例，该定量检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联三重四级杆质谱UPLC-MS/MS。

根据本发明的实施例，该液相色谱的条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CSH^TMC18色谱柱，参数：100×3mm，1.7μm；进样体积：2μL；色谱柱温度38℃；样品温度10℃；流速0.25mL/min；流动相：B相为乙腈甲醇，浓度：1∶1，v/v，A相为去离子水。由此，各化合物的分离效果好，质谱响应高，出峰时间适宜。

根据本发明的实施例，该质谱的条件：高分辨质谱Orbitrap/MS的条件：正离子采集，平行反应监测PRM扫描模式；电喷雾电压：3.5Kv；载气温度：350℃；载气流速：40L/min；毛细管温度300℃，三重四级杆质谱MS/MS条件：正离子采集，多重反应监测MRM扫描模式；去簇电压DP：80.0V；离子源气流量GS1：50L/min；GS2：60L/min；喷雾电压：5500.0V；雾化器温度：650.0℃。由此，检测的灵敏度准确度高。

根据本发明的实施例，液相色谱的梯度洗脱条件为15％B(0-2分钟)-(15-85)％B(2-6分钟)-85％B(6-9分钟)-(85-100)％B(9-10分钟)-100％B(10-12分钟)-(100-15)％B(12-2.1分钟)-15％B(12.1-14分钟)。由此，各化合物的分离效果好，出峰时间适宜，基质干扰少。

具体地，本发明实施例的检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法的一般流程可以包括：

(1)称取待测蜂蜜样品2g，加入适量同位素标记物；

(2)加入40mL去离子水稀释蜂蜜样品，振荡10min至蜂蜜完全溶解；

(3)用氨水溶液将pH值调至5.0，过PIRME HLB固相萃取柱；

(4)5mL甲醇和5mL去离子水先后活化萃取柱，上样，25mL去离子水淋洗萃取柱，6mL乙腈洗脱；

(5)45℃水浴氮气吹干，初始流动相复溶，过GHP滤膜，得到待测样品溶液；

(6)采用UPLC-MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，利用本发明实施例的方法，对市售蜂蜜中的磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的含量进行检测，具体如下：

1、实验仪器

赛默飞超高效液相色谱串联Orbitrap质谱(QE plus系列)，岛津高效液相色谱串联三重四级杆质谱(Qtrap 5500)；ME614S天平；Vortex-Genie 2型涡旋混合器；PRIME HLB固相萃取柱。

2、质控品的制备方法：

将适量磺胺类药物及其同位素内标加入40％葡萄溶液中，混合均匀后静置24h；称取上述混合溶液1g，加入20mL去离子水稀释，涡旋60s；过PRIME HLB固相萃取柱；5mL甲醇和5mL去离子水先后活化萃取柱，上样，25mL去离子水淋洗萃取柱，6mL乙腈洗脱。在45℃水浴下氮气吹干，用初始流动相复溶，过0.22μm GHP滤膜，供UPLC-Orbitrap/MS和UPLC-MS/MS检测。

3、市售蜂蜜样品预处理，方法如下：

(1)称取待测蜂蜜样品2g，加入适量同位素标记物；

(2)加入40mL去离子水稀释蜂蜜样品，涡旋振荡10min至蜂蜜完全溶解；

(3)用氨水溶液调节pH值至5.0，过PRIME HLB固相萃取柱；

(4)5mL甲醇和5mL去离子水先后活化萃取柱，上样，25mL去离子水淋洗萃取柱，6mL乙腈洗脱；

(5)在45℃水浴下氮气吹干，用1mL初始流动相复溶，过0.22μm GHP滤膜，供UPLC-MS/MS检测。

4、UPLC-MS/MS检测

(1)液相色谱参数：色谱柱Waters ACQUITY UPLC CSH^TM C18 Column(100×3mm，1.7μm)；进样体积为2μL；色谱柱温度38℃；样品温度10℃；流速0.25mL/min；流动相B相为乙腈甲醇(1∶1，v/v)，A相为去离子水，洗脱梯度见表2。

表2梯度洗脱程序

时间	B流动相占比
		2.00	15％
6.00	85％
		9.00	85％
10.00	100％
		12.00	100％
12.1	15％
		14.00	停止

(2)MS/MS参数：正离子采集，多重反应监测(MRM)扫描模式，去簇电压(DP)：80.0V；离子源气流量GS1：50L/min；GS2：60L/min；喷雾电压：5500.0V；雾化器温度：650.0℃。

(3)其它质谱采集参数见表3和表4。

表3磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物及其同位素内标质谱参数

表4磺胺类药物及其同位素内标质谱参数

(4)利用UPLC-MS/MS对样品进行检测，具体如下：

a、称取空白蜂蜜基质样品2g，加入0.2g所述磺胺类药物及其同位素内标200μg/kg；

b、室温静置13天；

c、加入40mL去离子水稀释蜂蜜样品，涡旋振荡10min至蜂蜜完全溶解；

d、用氨水溶液调节PH值至5.0，过PRIME HLB固相萃取柱；

e、5mL甲醇和5mL去离子水先后活化萃取柱，上样，25mL去离子水淋洗萃取柱，6mL乙腈洗脱；

f、在45℃水浴下氮气吹干，用1mL初始流动相复溶，过0.22μm GHP滤膜；

g、过滤后的待测物进行UPLC-MS/MS检测。7种质控品的检测结果如图11所示，结果表明UPLC-MS/MS能准确检测磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物，市售蜂蜜的检测结果如图12所示，结果显示，只有磺胺甲噁唑和磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物存在检出，表明该市售蜂蜜样品中磺胺甲噁唑存在检出，且以两种形态(磺胺甲噁唑游离态和磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合态)存在蜂蜜中。

(5)根据质控品对市售蜂蜜中磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物进行定量计算：

a、通过标准溶液对质控品和市售蜂蜜中磺胺甲噁唑定量，根据质控品中磺胺甲噁唑总量，反推质控品中磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物含量，结果见表5。

b、根据标准曲线法定量，通过质控品中磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物含量和峰面积比值计算市售蜂蜜样品中磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物的含量，结果见表5。

表5市售蜂蜜中磺胺甲噁唑和磺胺甲噁唑葡萄糖醛酸结合物的含量(n＝4)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种检测蜂蜜基质中磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的方法，其特征在于，包括：

将蜂蜜基质样品与内标物接触，以便得到样品混合物；

将所述样品混合物进行稀释提取和固相萃取净化，以便得到提取液，其中，所述固相萃取是利用PRIME HLB固相萃取柱进行的；以及

采用液相色谱串联质谱，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品和所述提取液的检测结果，对所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物进行定性/定量检测其中，所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品的制备方法包括：

将所述磺胺类药物与还原糖溶液混合，得到预备液；

将所述预备液静置不少于13天，以便得到所述磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物质控品，

其中，所述还原糖溶液为葡萄糖溶液，

其中，所述液相色谱的条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CSHTM C18色谱柱，参数：100×3mm，1.7μm；

进样体积：2μL；

色谱柱温度：38℃；

样品温度：10℃；

流速：0.25mL/min；

流动相：B相为乙腈甲醇，浓度：1:1,v/v，A相为去离子水，

其中，所述液相色谱的梯度洗脱条件为15％B，0-2分钟；15％-85％B，2-6分钟；85％B，6-9分钟；85％-100％B，9-10分钟；100％B，10-12分钟；100％-15％B，12-2.1分钟；15％B，12.1-14分钟；

所述质谱的条件：

高分辨质谱Orbitrap/MS的条件：

正离子采集，平行反应监测PRM扫描模式；

电喷雾电压：3.5Kv；

载气温度：350℃；

载气流速：40L/min；

毛细管温度：300℃，

三重四级杆质谱MS/MS条件：

正离子采集，多重反应监测MRM扫描模式；

去簇电压DP：80.0V；

离子源气流量GS1：50L/min；

GS2：60L/min；

喷雾电压：5500.0V；

雾化器温度：650.0℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原糖溶液的浓度为40-60质量/体积％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定性检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联高分辨质谱UPLC-Orbitrap/MS，基于磺胺类药物葡萄糖醛酸结合物的母离子[M+H]⁺和质谱特征碎片进行所述定性检测。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量检测采用的液相色谱串联质谱为高效液相色谱串联三重四级杆质谱UPLC-MS/MS。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

在所述固相萃取前，将所述样品混合物的pH值调节至酸性。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述固相萃取前，将所述样品混合物的pH值调节至pH＝4-6。

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