CN106814154A - 一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法 - Google Patents

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李秀琴
张庆合
许森
李红梅
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Abstract

本发明公开了一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法，包括：称取待测蜂蜜样品，加入同位素内标平衡后，加入盐酸溶液进行酸解；用氢氧化钠溶液调节PH值至4.5；加入乙腈、二氯甲烷和氯化钠后振荡，离心，移取上层清液至一次性离心管；氮气吹干，乙腈复溶，过GPH滤膜，得到待测样品溶液；使用移液枪定量滴加所述待测样品溶液在DIP‑it管上；采用实时直接分析质谱离子源DART‑MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。本发明实施例的方案，能够实现快速准确的对蜂蜜基质中磺胺类抗生素的筛查检测。

Description

一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法
技术领域
本发明涉及食品中抗生素筛查技术领域，特别涉及一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法。
背景技术
磺胺类(sulfonamides)药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。由于其广谱高效的抗菌性,目前被广泛应用于畜牧和水产养殖生产。用于养蜂业中可以防治蜂病、降低蜜蜂死亡率、提高蜜蜂生产性能,但是由于其在动物体内代谢降解缓慢,如果不遵守休药期规定、超量使用,易造成蜂产品中磺胺类药物残留。常用的磺胺类抗生素的名称见表1。
表1
我国国家安全标准GB14963-2011中要求蜂蜜中兽药残留限量应符合相关标准的规定。相关标准规定包括:1.卫生部在2011年4月发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中指出蜂蜜中可能添加了磺胺类抗生素。2.无公害蜂蜜(NY5134-2008)中对抗生素的安全指标是四环素族抗生素≤0.5mg/kg，磺胺类抗生素类≤0.05mg/kg，其他兽药限量应符合国家有关规定。
目前食品安全问题越来越受到人们的关注,准确、灵敏、高效的检测技术已成为一种发展趋势,文献报道的蜂蜜中磺胺类化合物的检测方法有气相色谱法,酶联免疫法,液相色谱紫外或荧光检测法,液相色谱-质谱联用法等。气相色谱法需要进行样品的衍生化处理,操作比较繁琐；酶联免疫法虽然简便快速,但是往往回收率,准确度有一定的欠缺；液相色谱紫外或荧光检测虽可以达到较好的分离,但是为实现杂质分离,需要较多时间,而且紫外法检测灵敏度低,荧光法一般也需要衍生化处理。液相色谱-质谱联用技术其准确性和灵敏度都比较高，但是对样品预处理的要求较高，样品预处理繁琐，分析时间较长。
发明内容
本发明提供一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法，用以解决现有技术中蜂蜜基质中抗生素残留无法快速、准确筛查的问题。
本发明提供一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法，包括：
(1)称取待测蜂蜜样品5g，加入适量同位素标记物，60℃水浴加热搅拌2小时；
(2)加入2mol/L盐酸酸解溶液，酸解温度为25℃，酸解时间为2小时；
(3)用氢氧化钠溶液调节PH值至4.5；
(4)加入乙腈10mL、二氯甲烷2.5mL和氯化钠0.5g后，振荡10min，以5000rpm的速率离心5min，移取上层清液10mL于15mL一次性离心管。
(5)45℃水浴氮气吹干，用乙腈复溶，过GPH滤膜，得到待测样品溶液；
(6)使用移液枪定量滴加所述待测样品溶液在DIP-it管上；
(7)采用实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。
设置实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS参数：正离子采集，多反应监测(MRM)模式，载气氦气，载气温度350℃，样品传输速度0.6mm/s。
本发明实施例的方案与目前文献和国标方法比，其特点在于：
(1)充分优化了酸解条件，包括酸解溶液、温度、时间，与传统方法比大大提高了酸解效率，使得与蜂蜜中单糖发生结合的磺胺类药物最大效率的解离；
(2)通过同位素标记物内标的加入，进一步提高了方法的准确性。同时提出一种更为科学合理的同位素内标平衡方式，即使同位素标记物能够首先与蜂蜜中葡萄糖结合，有效模拟实际样品中磺胺的存在状态；
(3)改进了DART传统进样方式，有效提高DIP-it进样方式的精密度；
(4)直接进样分析的磺胺类抗生素残留的快速筛查方法，单个样品的仪器分析时间从14min提高到2s，显著提高分析效率。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为葡萄糖与磺胺噻唑的反应原理图；
图2为蜂蜜中磺胺类抗生素DART-MS-MS检测谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实时直接分析(Direct Analysis in Real Time)简称DART，是一种热解析和离子化技术。DART操作简单，样品置放于DART源出口和一台LC-MS质谱仪的离子采样口，便可进行分析。
本实施例所采用的仪器包括：
DART实时直接分析离子源，Qtrap 5500质谱；ME614S天平；CF16RXⅡ离心机；Vortex-Genie 2型涡旋混合器；MCX固相萃取柱。
具体的，DART-MS/MS预处理方法：
称取待测蜂蜜样品5g，加入适量同位素标记物，60℃水浴加热搅拌2小时；加入2mol/L盐酸酸解溶液，酸解温度为25℃，酸解时间为2小时；用氢氧化钠溶液调节PH值至4.5；加入乙腈10mL、二氯甲烷2.5mL和氯化钠0.5g后，振荡10min，以5000rpm的速率离心5min，移取上层清液10mL于15mL一次性离心管。在45℃水浴下氮气吹干，用2mL乙腈复溶，过0.22μm GPH滤膜，供DART-MS/MS检测。
DART-MS/MS检测方法：
离子源参数：正离子采集，多反应监测(MRM)模式，载气氦气，载气温度350℃，样品传输速度0.6mm/s。
其它质谱采集参数见表2。
表2
样品预处理条件的优化
以空白蜂蜜为基质，模拟实际样品，添加6种常见磺胺类抗生素，制得阳性蜂蜜样品。开展酸解溶液、酸解时间、酸解温度、提取方式等样品预处理条件对磺胺类抗生素回收率的影响。实验表明使用2mol/L盐酸溶液在25℃条件下酸解1h，振荡提取30min，6种磺胺类抗生素综合回收率较高。在液液萃取后DART-MS/MS检测的快速方法下6种磺胺类抗生素检出限为0.1～0.5μg/kg。
首次发现采用同位素标记内标法检测蜂蜜样品中的磺胺类抗生素时，同位素标记物加入后的平衡方式直接影响测试结果的准确性。根据本研究结果，建议测定蜂蜜中磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧哒嗪6种磺胺类抗生素时，同位素内标加入后，60℃水浴搅拌2小时后，再进行测定。
实验从样品预处理时间、分析时间、检出限等方面综合比较了DART-MS/MS与传统的LC-MS/MS两种分析方法在分析蜂蜜中磺胺类抗生素的优劣，结果见表3。检测限的测定采用在空白蜂蜜中添加6种磺胺类抗生素，以信噪比＞3计算方法检出限。DART方法检出限为0.1μg/kg-0.5μg/kg；液质联用方法检出限为0.05～0.15μg/kg。总体来说，DART-MS/MS方法的灵敏度比传统的LC-MS/MS低，但是完全满足快速筛查和目前国际上的限量筛查要求。而样品预处理和分析时间则是DART-MS/MS明显优于LC-MS/MS。
表3
本发明实施例的方案，充分优化了酸解条件，包括酸解溶液、温度、时间，与传统方法比大大提高了酸解效率，使得与蜂蜜中单糖发生结合的磺胺类药物最大效率的解离；通过同位素标记物内标的加入，进一步提高了方法的准确性。同时提出一种更为科学合理的同位素内标平衡方式，即使同位素标记物能够首先与蜂蜜中葡萄糖结合，有效模拟实际样品中磺胺的存在状态；改进了DART传统进样方式，有效提高DIP-it进样方式的精密度；直接进样分析的磺胺类抗生素残留的快速筛查方法，单个样品的仪器分析时间从10min提高到2s，显著提高分析效率。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种蜂蜜基质中磺胺类抗生素的快速筛查方法，其特征在于，包括：
(1)称取待测蜂蜜样品适量，加入适量同位素标记物，60℃水浴加热搅拌；
(2)加入盐酸酸解溶液，涡旋至蜂蜜完全溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调节PH值至4.5；
(4)加入乙腈、二氯甲烷和氯化钠后振荡，离心，移取上层清液至一次性离心管；
(5)45℃水浴氮气吹干，用乙腈复溶，过GPH滤膜，得到待测样品溶液；
(6)定量滴加所述待测样品溶液在DIP-it管上；
(7)采用实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
加入同位素内标后，60℃水浴加热搅拌2小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
加入盐酸酸解溶液，浓度为2mol/L，酸解温度为25℃，酸解时间为2小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入乙腈、二氯甲烷和氯化钠后振荡，离心，移取上层清液至一次性离心管，还包括：
加入10mL乙腈，2.5mL二氯甲烷和0.5g氯化钠后振荡10min，以5000rpm的速率离心5min，移取上层清液10mL于15mL一次性离心管。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
使用移液器定量滴加5μL所述待测样品溶液在DIP-it管上。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括:
设置实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS参数：正离子采集，多反应监测(MRM)模式，载气为氦气，载气温度350℃，样品传输速度0.6mm/s。
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