CN110361481A - 一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药检测领域，尤其涉及到一种基于多维在线固相萃取液相色谱分析技术开发的血液中万古霉素治疗药物监测试剂盒，更具体地说是采用在线固相萃取和多维液相色谱分析技术对血液中万古霉素药物浓度进行准确定量检测的方法。试剂盒包括校准品试剂、质控品试剂、处理液、萃取液、清洗液、洗脱液。本发明的治疗药物监测用试剂盒，血样只需要离心处理，重复检测变异性小，准确性和稳定性高，检测成本低，各项方法学指标均可满足血液中万古霉素治疗药物监测的需要，易于推广。

Description

一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及医药检测领域，尤其涉及到一种基于多维在线固相萃取液相色谱分析技术开发的血液中万古霉素治疗药物监测试剂盒，更具体地说是采用在线固相萃取和多维液相色谱分析技术对血液中万古霉素药物浓度进行准确定量监测的方法。
背景技术
万古霉素属于糖肽类抗生素，临床应用其盐酸盐。万古霉素对革兰阳性球菌和部分革兰阳性杆菌(如白喉杆菌，梭状芽胞杆菌)具有强大杀菌作用。万古霉素的抗菌活性作用机制主要是抑制细菌胞壁合成，万古霉素也能改变细菌细胞膜的通透性并影响RNA的合成，这种复合的作用机制使本品具有强大的杀菌作用。万古霉素的有效血药浓度为5.0-10.0mg/L，当血药浓度＞10.0mg/L时，毒副作用增强。不良反应常见“红颈综合征”，表现为红斑，面颈部甚至胸部潮红，药物热，低血压，甚至发生休克样反应；且有肾毒性和耳毒性。由于万古霉素治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，所以对其血液中药物浓度的检测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。目前万古霉素治疗药物检测的常见方法有：紫外分光光度法、均相免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。在众多的方法中，液相色谱法为测定万古霉素的最准确的方法。以往方法存在前处理复杂、定性定量不够准确、成本高、分析时间长、或对实验人员技术要求高等问题。
发明内容
本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种基于多维在线固相萃取液相色谱分析技术开发的血液中万古霉素治疗药物监测试剂盒，以满足血液中万古霉素治疗药物监测的需要。
本发明的另一目的是提供利用所述试剂盒监测万古霉素血液中药物浓度的方法。
本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括校准品试剂、质控品试剂、样品试剂、处理液、萃取液、清洗液、洗脱液。
进一步的，所述校准品试剂为含万古霉素冻干粉、稳定剂与塑型剂的动物血清，所述万古霉素冻干粉在动物血清中的浓度范围为0.6～18.0mg/L,所述稳定剂的浓度为10～30g/L，所述塑型剂的浓度为10～30g/L；
进一步的，所述质控品试剂为含万古霉素冻干粉、稳定剂与塑型剂的动物血清，所述万古霉素冻干粉在动物血清中的浓度范围为0.6～18.0mg/L，所述稳定剂的浓度为10～30g/L，所述塑型剂的浓度为10～30g/L；
优选的，所述稳定剂的浓度为15～25g/L，所述塑型剂的浓度为15～25g/L；
进一步的，所述样本处理液为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰。所述甲醇的含量为5％～15％，所述乙腈的含量为5％～15％。
进一步的，所述萃取液包括萃取液H1和萃取液H2；
进一步的，所述萃取液H1为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为3％～10％，所述乙腈的含量为2％～8％。
进一步的，所述萃取液H2为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.05‰～0.15‰。所述甲醇的含量为30％～50％，所述乙腈的含量为40％～70％。
进一步的，所述的清洗液为甲醇或乙腈或两种混合物的水溶液，所述甲醇的含量为0％～40％，所述异丙醇的含量为0％～20％，所述乙腈的含量为0％～50％。
进一步的，所述的洗脱液包括洗脱液A、洗脱液B和洗脱液C；
进一步的，所述洗脱液A为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.05‰～0.15‰，，所述甲醇的含量为0％～15％，所述乙腈的含量为70％～90％；
进一步的，所述洗脱液B醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为0％～10％，所述乙腈的含量为5％～15％；所述洗脱液B的pH为3～5；
进一步的，所述洗脱液C醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为0％～10％，所述乙腈的含量为5％～15％；所述洗脱液B的pH为6～8。
所述的醋酸缓冲液包括醋酸、醋酸铵、氨水的一种或两种及以上的混合物。
进一步的，所述的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)；所述的塑型剂甘露醇和蔗糖一种或两种的混合物，所述甘露醇与蔗糖的混合物的比例为1：2～5。
进一步的，所述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：血液样品经离心后取上清液进样，通过在线固相萃取柱进行在线净化、富集、解吸及柱前后补偿联用，再通过阀切换方式将血液样品中目标分析物送入分析柱中进行分离，最后通过紫外检测器，或二极管阵列检测器，或质谱检测器等分析检测，采用标准曲线法进行计算，最终获得血液样品中药物浓度值。
计算公式如下：拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距，y为实测峰面积，x为标示浓度，样本结果计算：将样本的万古霉素峰面积代入标准曲线方程，计算样本中的万古霉素浓度；
具体步骤如下：
(1)取待检测样品1～4mL，在离心速度为4000～6000rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆；
(2)取上述血清或血浆，移取1.0ml加入样品瓶中，放入自动进样器中进样100ul进行液相色谱定量检测；
色谱条件：萃取柱：SLCZ柱(30×4.6mm，10μm粒径)；分析柱：C18柱(150×4.6mm，5μm粒径)；流动相：萃取液H1、萃取液H2、洗脱液A、洗脱液B和洗脱液C；柱温：35℃；进样量：100μL；波长：210nm。
(3)根据上述公式计算出样本中的药物浓度。
本发明的优点在于：
1、采用多维在线固相萃取液相色谱分析技术对血液中万古霉素的药物浓度进行准确定量检测，检测结果为万古霉素原型药物浓度，能更准确的说明药物浓度-效疗-不良反应三者之前的关系；
2、血液样品仅经过离心处理，采用血浆或血清直接进样，减少了前处理所带来的误差及人员操作误差，提高了定量结果的准确性、重复性及回收率，大大缩短检测时间，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的药物浓度进行检测。
3、本发明提供的试剂盒，通过检测血液中万古霉素的药物浓度，评估万古霉素的临床药效。即本发明还提供了所述试剂盒在评估抗真菌感染药物临床疗效中的应用。
附图说明
图1为实施例中质控样本中万古霉素色谱图；
图2为实施例中万古霉素典型标准曲线图；
图3为实施例中血清样本中万古霉素色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。
一、万古霉素治疗药物监测试剂盒的制备：
标准曲线试剂：其中万古霉素以含2％稳定剂与2％塑形剂的动物血清配制成一系列浓度，分别为0.6mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、8.0mg/L、13.0mg/L、18.0mg/L，每瓶分装1.0ml。以上组分均冻干于测定瓶底保存。
质控品试剂：其中万古霉素以含2％稳定剂与2％塑形剂的动物血清配制成高中低三个浓度，分别为1.0mg/L、8.0mg/L、16.0mg/L，每瓶分装1.0ml。以上组分均冻干于测定瓶底保存。
样本处理液：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水700ml溶解，加醋酸调节PH值5.0，再加乙腈100ml与甲醇100ml，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
萃取液H1：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水700ml溶解，再加乙腈100mL，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
萃取液H2：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水100ml溶解，再加乙腈800ml，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
清洗液：精密称取甲醇200ml与乙腈400ml，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
洗脱液A：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水250ml溶解，再加乙腈700mL，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
洗脱液B：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水700ml溶解，加醋酸调节PH值至3.0，再加乙腈100ml，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
洗脱液C：精密称取0.12g醋酸铵，置1000mL容量瓶中，加蒸馏水700ml溶解，加10％氨水调节PH值至7.0，再加乙腈100ml，然后加蒸馏水稀释至刻度，即得，分装，贴签标记，完成操作。
二、采用上述监测试剂盒的检测步骤如下：
1、适用仪器
全自动治疗药物检测分析系统(SLC)、高效液相色谱仪(HPLC)、液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)。
2、样本要求
采集静脉全血样本，置于抗凝管中，立即放置于2～8℃冰箱封存备测。
3、检验方法
样本前处理：
取样本处理液，定量移取0.5ml加入样品试剂瓶中；取待检测样品至少4mL，在离心速度为4000rpm下离心10min，移取上清液1.0ml加入样品瓶中，涡流混匀，放入自动进样器中进样，并进行液相色谱定量检测；
色谱条件：
在线萃取柱：SLCZ柱(30×4.6mm，10μm粒径)；
在线分析柱：C18柱(150×4.6mm，5μm粒径)；
流动相：萃取液H1、萃取液H2、洗脱液A、洗脱液B和洗脱液C；
柱温：35℃；进样量：100μL；波长：210nm。
表1梯度洗脱条件
测定法：
取校准品、质控品、待测样本进行样本前处理后，取上清液进样100μL进行色谱定量分析，记录色谱峰面积。
质控要求：
每1分析批样本随行1条标准曲线(6个不同浓度值校准品样本各1个)和6个质控样本(高、中、低浓度各2个)。质控品样本测定结果偏差应小于10％，最多允许1/3的质控品样本结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控品样本中。如质控品样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废，重新检测。
4、结果计算
如图1-3所示；
标准曲线绘制：
以6个不同标示浓度的校准品浓度(0.6、2.5、5.0、8.0、13.0、18.0mg/L)为横坐标(x)，以6个校准品样本的实测峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
标准曲线方程的拟合：
以6个校准品样本的实测峰面积(y)对标示浓度(x)采用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：Y＝0.0264+1.1972X，其中0.0264为斜率，1.1972为截距，并计算相关系数(r)，r应不低于0.9900。r为0.9970。回收率的计算：
将质控品样本测定的万古霉素峰面积代入上述标准曲线方程，计算质控品样本的万古霉素测定浓度。质控品样本回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在100±15％范围内。回收率为102.5％。
样本结果计算：
将样本的万古霉素峰面积代入标准曲线方程，计算样本的万古霉素药物浓度。计算得出万古霉素药物浓度为4.17ug/mL。
总结，在该方法条件下，万古霉素的标准曲线相关系数和质控品回收率均符合规定，可保证该方法所测样品结果的准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括校准品试剂、质控品试剂、处理液、萃取液、清洗液、洗脱液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品试剂为含万古霉素冻干粉、稳定剂与塑型剂的动物血清，所述万古霉素冻干粉在动物血清中的浓度范围为0.6～18.0mg/L，浓度梯度为0.6～18.0mg/L；所述稳定剂的浓度为10～30g/L，所述塑型剂的浓度为10～30g/L；
所述质控品试剂为含万古霉素冻干粉、稳定剂与塑型剂的动物血清，所述万古霉素冻干粉在动物血清中的浓度范围为0.6～18.0mg/L，所述稳定剂的浓度为10～30g/L，所述塑型剂的浓度为10～30g/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂的浓度为15～25g/L，所述塑型剂的浓度为15～25g/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样本处理液为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为5％～15％，所述乙腈的含量为5％～15％。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述萃取液包括萃取液H1和萃取液H2；
所述萃取液H1为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为3％～10％，所述乙腈的含量为2％～8％。
所述萃取液H2为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.05‰～0.15‰，所述甲醇的含量为30％～50％，所述乙腈的含量为40％～70％。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的清洗液为甲醇或乙腈或两种混合物的水溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的洗脱液包括洗脱液A、洗脱液B和洗脱液C；
所述洗脱液A为醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.05‰～0.15‰，所述甲醇的含量为0％～15％，所述乙腈的含量为70％～90％；
所述洗脱液B醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为0％～10％，所述乙腈的含量为5％～15％；所述洗脱液B的pH为3～5；
所述洗脱液C醋酸盐缓冲溶液、乙腈和甲醇中的一种或两种以上的混合物的水溶液，所述醋酸盐缓冲溶液中醋酸铵的含量为0.1‰～0.3‰，所述甲醇的含量为0％～10％，所述乙腈的含量为5％～15％；所述洗脱液B的pH为6～8。
8.根据权利要求4～7任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的醋酸缓冲液包括醋酸、醋酸铵、氨水的一种或两种及以上的混合物。
9.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)；所述的塑型剂甘露醇和蔗糖一种或两种的混合物，所述甘露醇与蔗糖的混合物的比例为1：2～5。
10.一种权利要求1所述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：血液样品经离心后取上清液进样，通过在线固相萃取柱进行在线净化、富集、解吸及柱前后补偿联用，再通过阀切换方式将血液样品中目标分析物送入分析柱中进行分离，最后通过紫外检测器，或二极管阵列检测器，或质谱检测器等分析检测，采用标准曲线法进行计算，最终获得血液样品中药物浓度值；
计算公式如下：拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距，y为实测峰面积，x为标示浓度，样本结果计算：将样本的万古霉素峰面积代入标准曲线方程，计算样本中的万古霉素浓度；
具体步骤如下：
(1)取待检测样品1～4mL，在离心速度为3000～5000rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆；
(2)取上述血清或血浆，移取1.0ml加入样品瓶中，放入自动进样器中进样100ul进行液相色谱定量检测；
(3)根据上述公式计算出样本中的药物浓度。
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