CN112379029A - 一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 - Google Patents
一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112379029A CN112379029A CN202011244847.6A CN202011244847A CN112379029A CN 112379029 A CN112379029 A CN 112379029A CN 202011244847 A CN202011244847 A CN 202011244847A CN 112379029 A CN112379029 A CN 112379029A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- working solution
- concentration
- internal standard
- mixed
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种检测血液中抗病毒药物浓度的方法,利用在线固相萃取和多维液相色谱分析技术对血液中奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦和达卢那韦药物浓度进行准确定量检测。本发明方法对待测样品不需预处理,操作简单快速,重复检测变异性小,准确性和稳定性高,检测成本低,可应用于临床工作对抗病毒药物进行治疗药物监测。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域,具体涉及一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度 的方法及试剂盒。
背景技术
国家卫生健康委员会组织专家发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》 (简称《国家方案》)试行第1-7版,制定抗病毒药物治疗方案、中医中药治疗 方案及抗菌药物、激素、微生态制剂使用原则等。中国药师协会治疗药物监测 药师分会、中国药理学会治疗药物监测研究专业委员会、中国药师协会居家药 学服务药师分会等十一大学会联合编撰了《新型冠状病毒肺炎及常见合并症药 物治疗与药学监护指引》,重点解读了《国家方案》试行第6版中推荐的治疗 药物,包括抗病毒药物、抗菌药物、激素等等。重点指引了如何依据患者的病 理、生理状况和药物的药理特性选择药物以及治疗中需要监测哪些指标,并对疗效及毒副作用个体化差异较大的抗病毒、抗细菌药物,建议根据血药浓度监 测结果调整用药。
血药浓度监测,是治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,简称TDM) 的重要手段。TDM研究个体化药物治疗机制、技术、方法和临床标准,并将研 究结果转化应用于临床治疗以达到最大化合理用药。通过测定患者体内的药物 暴露、药理标志物或药效指标,利用定量药理模型,以药物治疗窗为基准,制 订适合患者的个体化给药方案。其核心是个体化药物治疗。TDM的临床意义在 于能够优化药物治疗方案,提高药物疗效、降低毒副作用,同时通过合理用药 最大化节省药物治疗费用。
因此,设计一种能准确、便捷、快速测定血液中抗病毒药物浓度的方式, 是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种检测血液中抗病毒药物浓 度的方法,其检测方法准确、便捷、快速,成本低,适用于常规血药浓度的检 测。
本发明的技术方案是:一种检测血液中抗病毒药物浓度的方法,包括以下 步骤:
1)制备内标工作液
称量卡马西平作为内标物,甲醇作为溶剂,制备得到内标储备液,加动物 血清,制备得到浓度为1.0-20μg//mL的内标工作液;
2)制备混合工作液
称量奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、达卢那韦作 为标准品,用甲醇溶解、加水稀释、加动物血清稀释,得到梯度浓度的混合工 作液;
3)预处理
取待检测的血液样品,与步骤1)制备的内标工作液混匀,经离心取上清液, 得到待测样品,血液样品和内标工作液的体积比为100:0.5-4,取步骤2)得到 的各混合工作液,与步骤1)制备的内标工作液混合,得到混合标准品工作液, 且各混合工作液与内标工作液的体积比与血液样品和内标工作液的体积比相 同;
4)制备标准曲线方程
将各混合标准品工作液分别经过在线固相萃取后,由流动相反冲入色谱柱 进行液相色谱分析,得到各混合标准品工作液中各标准品、内标物的含量,以 各标准品和内标物峰面积为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),用加权进行曲 线回归运算,制备得到标准曲线,回归方程为:y=ax+b,其中a为斜率,b为截 距;
5)检测计算
将步骤3)制备得到的待测样品,经在线固相萃取后,由流动相反冲入色谱 柱进行色谱分析,在线固相萃取、色谱分析的条件与步骤4)相同,将各待测物 和内标物的峰面积代入标准曲线方程,计算得到待测样品中各待测物的浓度。
进一步的,步骤2)得到的梯度浓度的混合工作液各标准品的浓度如下表所 示:
优选的,步骤3)血液样品和内标工作液的体积比为100:1。
进一步的,还包括制备质控工作液,称量奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、 利托那韦、阿扎那韦、达卢那韦作为质控品,用稀释液逐级稀释,加入动物血 清制备成高浓度、中浓度、低浓度质控工作液,各质控工作液中质控品的浓度 如下表所示:
优选的,步骤3)所述离心,离心转速为4000-6000rpm,离心时间为10min。
进一步的,步骤4)、步骤5)萃取使用的萃取液为0.01‰~0.03‰甲酸水溶 液,所述流动相为0.1%~0.5%乙酸铵水溶液-乙腈混合液,pH为3.0-5.0。
进一步的,步骤4)、步骤5)所述色谱分析,柱温为35℃,采用梯度洗脱 进样,流动相流速为1.0ml/min,0-3分钟乙酸铵水溶液与乙腈体积比为80:20, 3-9分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积比由80:20线性变化为20:80,9-10分钟 乙酸铵水溶液与乙腈体积比为20:80,10-10.5分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积 比由20:80线性变化为80:20,10.5-12分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积比为 80:20。
优选的,所述替诺福韦、安泼那韦、阿扎那韦、洛匹那韦的检测波长为254nm, 所述奥司他韦、利托那韦的检测波长为239nm。
本发明还请求保护一种试剂盒,包括上述的各梯度浓度的混合工作液,各 浓度的质控工作液、萃取液和流动相。
采用上述技术方案具有以下有益效果:
1、本发明检测方法所用时间短,为12分钟,是一种便捷、快速的检测方 法。
2、本发明检测方法使用的血液样品不需要经过前处理,能有效减少前处理 所带来的误差及人员操作误差,保证血液样品中待检测物浓度的准确性。
3、本发明使用卡马西平作为内标物,信号强度适中,能被准确检测到且信 号不会远超被检测物质。若内标工作液的添加比例不足或过多,则分析结果的 精密度和线性会受到显著影响。不适当的内标物浓度可能导致在分析未知样品 时出现显著的系统误差。制备得到的内标工作液添加至各混合工作液,以及血 液样品中,且保证各混合工作液、血液样品中内标物的含量一致,可避免因供 试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。
4、本发明制备的混合标准品工作液,制备为六个阶梯浓度,制备得到的标 准曲线,可保证大部分临床样品浓度都能在线性之内,保证检测精度。
5、本发明的萃取液为0.01‰~0.03‰甲酸水溶液,实现目标化合物的在线萃 取。使用的流动相为0.1%~0.5%乙酸铵水溶液-乙腈混合液,可以使样品中(血 液样品、混合标准品工作液)中的物质根据极性不同,在色谱柱上保留的同时, 逐一分离,奥司他韦6.1min;替诺福韦6.9min;卡马西平7.6min;达卢那韦 8.1min;阿扎那韦8.6min;利托那韦9.0min、洛匹那韦9.6min。
6、本发明还制备质控工作液,用于在检测血液样本前,进样测试标准曲线 的准确性,保证血液样品中各待检测物质的准确性。
下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。
附图说明
图1a为空白血浆图谱,图1b为加标样品图谱;
图2-图7分别为为奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦 和达卢那韦的标准曲线;
具体实施方式
本发明中,使用的各材料:甲酸的纯度为99.0%,乙酸铵的纯度为99.0%, 乙腈的纯度为99.9%,均购自阿拉丁;纯化水为怡宝纯净水。使用的仪器为赛默 飞高效液相色谱仪U3000,检测器为DAD检测器。
实施例一制备内标工作液
准确称量卡马西平标准品10mg,用10mL的甲醇溶液配制为1.0mg/mL的 内标储备液,再以1:50的比例加入动物血清,制备得到内标工作液,卡马西 平的浓度为20μg/mL。将制备得到的内标工作液分装于5mL冻存管中,于-20℃ 储存备用。
实施例二制备混合工作液
分别准确称量奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、达 卢那韦标准品各10.0mg、5.0mg、5.0mg、10.0mg、10.0mg、10.0mg,混合,用 10mL的甲醇配置为高浓度的标准品储备液,然后用水作为稀释剂,将高浓度的 标准品储备液稀释为低浓度的标准品储备液,然后加入动物血清,分别配置为 六个梯度浓度的混合工作液。将各梯度的混合工作液分别置于不同的容器中, 分装于5mL的冻存管中,于-20℃储存备用。
实施例三制备质控工作液
准确称量奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、达卢那 韦标准品各10.0mg、5.0mg、5.0mg、10.0mg、10.0mg、10.0mg,用纯水逐级稀 释,最后用动物血清配置为高浓度、中浓度、低浓度三个浓度梯度的质控工作 液,将各梯度的质控工作液分别置于不同的容器中,然后将各质控工作液分装 于1.5mL的棕色小瓶中,于-20℃储存备用。
实施例四制备标准曲线方程
取各梯度浓度的混合工作液1000μl,加入进样小瓶中,加入10μl内标工作液(100:1),上下颠倒混合,进样,按照梯度洗脱,其中,
在线色谱萃取柱:SLCZ柱(30CZ柱:后进,10CZ粒径);
在线分析柱:C18柱(150柱:后进样入,515粒径);
流动相为0.1%~0.5%乙酸铵水溶液(PH 3.0~5.0)-乙腈混合液;萃取液为0.01~0.05%甲酸水溶液;梯度洗脱如表3所示。柱温:35℃;进样量:100μl;波 长:替诺福韦、安泼那韦、阿扎那韦、洛匹那韦(254nm);奥司他韦、利托那 韦(239nm)。
梯度洗脱条件
得到的梯度浓度的峰谱图分别如图1b所示,奥司他韦6.1min;替诺福韦6.9min;卡马西平7.6min;达卢那韦8.1min;阿扎那韦8.6min;利托那韦9.0min、 洛匹那韦9.6min。图2-图7为各目标化合物的线性图。
采用色谱软件采集数据,对色谱峰进行积分、计算、处理,以标准品和内 标品峰面积比为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),用加权进行曲线回归运算, 回归方程为:y=ax+b,制备得到标准曲线方程。
实施例五空白对照
取空白血浆加入进样小瓶,加入内标工作液(比例1a为100:1),混匀后, 进样,按照实施例四的色谱方法得到峰谱图,如图1a所示。表明空白基质及内 标对目标化合物没有影响。
实施例六待测样品检测
精密量取血浆或血液样品500μL,于进样小瓶中,再加入5μL内标工作 液,上下颠倒摇匀即可进样,按照实施例四的色谱方法得到峰谱图。将将对应 待测物和内标物峰面积代入实施例四的标准曲线方程,计算血浆或血液样品中 各物质的浓度。
经申请人连续检测3批待测样品(每批测3次),精密度(precision)和准确度(accuracy)数据较好,精密度控制在15%以内,准确度控制在100%±15%以内, 本发明检测方法比较稳定。
6种待测物质的线性范围,回归方程,线性系数,检出限,定量限、准确度 和精密度如下表所示。
6种待测物质的计算结果
Claims (9)
1.一种检测血液中抗病毒药物浓度的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备内标工作液
称量卡马西平作为内标物,甲醇作为溶剂,制备得到内标储备液,加动物血清,制备得到浓度为1.0-20μg//mL的内标工作液;
2)制备混合工作液
称量奥司他韦、替诺福韦、洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、达卢那韦作为标准品,用甲醇溶解、加水稀释、加动物血清稀释,得到梯度浓度的混合工作液;
3)预处理
取待检测的血液样品,与步骤1)制备的内标工作液混匀,经离心取上清液,得到待测样品,血液样品和内标工作液的体积比为100:0.5-4,取步骤2)得到的各混合工作液,与步骤1)制备的内标工作液混合,得到混合标准品工作液,且各混合工作液与内标工作液的体积比与血液样品和内标工作液的体积比相同;
4)制备标准曲线方程
将各混合标准品工作液分别经过在线固相萃取后,由流动相反冲入色谱柱进行液相色谱分析,得到各混合标准品工作液中各标准品、内标物的含量,以各标准品和内标物峰面积之比为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),用加权进行曲线回归运算,制备得到标准曲线方程,回归方程为:y=ax+b,其中a为斜率,b为截距;
5)检测计算
将步骤3)制备得到的待测样品,经在线固相萃取后,由流动相反冲入色谱柱进行色谱分析,在线萃取、色谱分析的条件与步骤4)相同,将各待测物和内标物的峰面积代入标准曲线方程,计算得到待测样品中各待测物的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)血液样品和内标工作液的体积比为100:1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述离心,离心转速为4000-6000rpm,离心时间为10min。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)、步骤5)萃取使用的萃取液为0.01‰~0.03‰甲酸水溶液,所述流动相为0.1%~0.5%乙酸铵水溶液-乙腈混合液,pH为3.0-5.0。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤4)、步骤5)所述色谱分析,柱温为35℃,采用梯度洗脱进样,流动相流速为1.0ml/min,0-3分钟乙酸铵水溶液与乙腈体积比为80:20,3-9分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积比由80:20线性变化为20:80,9-10分钟乙酸铵水溶液与乙腈体积比为20:80,10-10.5分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积比由20:80线性变化为80:20,10.5-12分钟,乙酸铵水溶液与乙腈体积比为80:20。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述替诺福韦、安泼那韦、阿扎那韦、洛匹那韦的检测波长为254nm,所述奥司他韦、利托那韦的检测波长为239nm。
9.一种试剂盒,包括权利要求2所述的各梯度浓度的混合工作液,权利要求4所述各浓度的质控工作液、权利要求6所述的萃取液和流动相。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011244847.6A CN112379029B (zh) | 2020-11-10 | 2020-11-10 | 一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011244847.6A CN112379029B (zh) | 2020-11-10 | 2020-11-10 | 一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112379029A true CN112379029A (zh) | 2021-02-19 |
CN112379029B CN112379029B (zh) | 2022-03-08 |
Family
ID=74579402
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011244847.6A Active CN112379029B (zh) | 2020-11-10 | 2020-11-10 | 一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112379029B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102253129A (zh) * | 2010-05-21 | 2011-11-23 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种同时测定多种抗hiv药物血浆浓度方法 |
US10052026B1 (en) * | 2017-03-06 | 2018-08-21 | Bao Tran | Smart mirror |
CN108811499A (zh) * | 2015-07-04 | 2018-11-13 | 苏州美康加生物科技有限公司 | 细胞结合分子的特异性偶联 |
CN109154610A (zh) * | 2016-05-24 | 2019-01-04 | 切除生物治疗公司 | 代谢物组学和病毒诊断套件 |
CN109900819A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-06-18 | 南京海纳医药科技股份有限公司 | 一种uplc/ms-ms联用检测人血清中替诺福韦的方法 |
CN110361481A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-22 | 苏州艾迪迈医疗科技有限公司 | 一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法 |
WO2020139291A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Istanbul Medipol Universitesi | Naphthalimide derivatives as anti-parasitic agents for the treatment of leishmaniasis as well as viral, bacterial and neoplastic diseases |
CN111812226A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-10-23 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中抗病毒药物浓度的方法 |
-
2020
- 2020-11-10 CN CN202011244847.6A patent/CN112379029B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102253129A (zh) * | 2010-05-21 | 2011-11-23 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种同时测定多种抗hiv药物血浆浓度方法 |
CN108811499A (zh) * | 2015-07-04 | 2018-11-13 | 苏州美康加生物科技有限公司 | 细胞结合分子的特异性偶联 |
CN109154610A (zh) * | 2016-05-24 | 2019-01-04 | 切除生物治疗公司 | 代谢物组学和病毒诊断套件 |
US10052026B1 (en) * | 2017-03-06 | 2018-08-21 | Bao Tran | Smart mirror |
WO2020139291A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Istanbul Medipol Universitesi | Naphthalimide derivatives as anti-parasitic agents for the treatment of leishmaniasis as well as viral, bacterial and neoplastic diseases |
CN109900819A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-06-18 | 南京海纳医药科技股份有限公司 | 一种uplc/ms-ms联用检测人血清中替诺福韦的方法 |
CN110361481A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-10-22 | 苏州艾迪迈医疗科技有限公司 | 一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法 |
CN111812226A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-10-23 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中抗病毒药物浓度的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ANTONIO D’AVOLIO 等: "An HPLC-PDA Method for the Simultaneous Quantification of the HIV Integrase Inhibitor Raltegravir, the New Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor Etravirine, and 11 Other Antiretroviral Agents in the Plasma of HIV-Infected Patients", 《THER DRUG MONIT》 * |
MASAAKI TAKAHASHI 等: "The Validation of Plasma Darunavir Concentrations Determined by the HPLC Method for Protease Inhibitors", 《BIOL. PHARM. BULL》 * |
寇惠娟 等: "高效液相色谱法同时测定人血浆中洛匹那韦和利托那韦浓度", 《中国科学》 * |
时美慧 等: "快速测定人血浆中洛匹那韦/利托那韦浓度的LC-MS/MS方法建立", 《国际药学研究杂志》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112379029B (zh) | 2022-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111337589B (zh) | 桔贝合剂hplc指纹图谱的建立方法 | |
CN104764820A (zh) | 测定半夏糖浆中活性成分盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量的方法 | |
US20240044851A1 (en) | Method for detecting content of active ingredients of compound sophorae flavescentis radix injection and fingerprint spectrum thereof | |
CN110780007A (zh) | 一种hplc法一测多评测定芒果止咳片6种成分含量的方法 | |
CN114200040A (zh) | 一种儿童型开喉剑喷雾剂一测多评的含量测定方法 | |
CN112379029B (zh) | 一种检测血液中抗新型冠状病毒药物浓度的方法 | |
CN112684031B (zh) | 聚维酮k30含量的hplc测定方法 | |
CN114910583A (zh) | 一种桔贝合剂的检测方法 | |
CN104849381A (zh) | 基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定7种黄芪皂苷类成分的方法 | |
CN111896637B (zh) | 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法 | |
CN107884496B (zh) | 一种琥珀酸曲格列汀中琥珀酸的含量测定方法 | |
CN109828040B (zh) | 墨旱莲药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法 | |
CN114577918A (zh) | 一种复方苦参注射液的活性成分含量及指纹图谱的超高效液相色谱检测方法 | |
CN114280168B (zh) | 一种检测血清中伏立康唑浓度的hplc法 | |
CN112595793B (zh) | 一种基于苯酚测定的地龙注射液检测方法 | |
CN111830150B (zh) | 一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法及其应用 | |
CN115166081B (zh) | 一种阳春口服液多组分含量测定方法 | |
CN117347532B (zh) | 归知糖疽颗粒制剂的hplc特征图谱的检测方法 | |
CN113866320B (zh) | 一种用超高效液相色谱检测延胡索生物碱含量的方法 | |
CN107632075A (zh) | 金柴抗感胶囊三种成分含量同时测定方法及其hplc指纹图谱构建方法 | |
CN107966502A (zh) | 测定丹参多糖水解产物-半乳糖醛酸的方法 | |
CN112816609B (zh) | 一种在制剂生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法 | |
CN114280168A (zh) | 一种检测血清中伏立康唑浓度的hplc法 | |
CN116124942A (zh) | 一种硫辛酸中光学异构体含量检测方法 | |
CN116148378A (zh) | B族维生素片的两种成分含量联合测定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |