CN114280168B - 一种检测血清中伏立康唑浓度的hplc法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高效液相色谱法(HPLC)法测定血清中伏立康唑浓度的方法,涉及医疗技术及体内药物分析领域,包括对照品溶液的制备、内标溶液尼莫地平的配制、色谱条件及标准曲线的确定、伏立康唑最低检测限、定量限、血清中的回收率、稳定性确定、血样的处理方法和测定等步骤。本发明公开的HPLC法操作简便,结果准确,耐用性好,该方法适用于各种合并用药状态下血清中伏立康唑的检测,经临床使用,能帮助患者根据该法监测的血药浓度及时进行剂量调整,避免疗效不佳或不良反应的发生,使用药更加安全有效。该检测血清中伏立康唑浓度的HPLC方法符合生物样品的测定要求,适用于临床治疗药物浓度监测、动物及人体药动学研究。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术及体内药物分析领域,特别涉及一种检测血清中伏立康唑血药浓度的HPLC法。
背景技术
伏立康唑属于第二代三唑类广谱抗真菌药,是临床常用于治疗侵袭性肺曲霉病、念珠菌血症等侵袭性真菌病的一线用药。由于伏立康唑的代谢具有可饱和性,其药代动力学呈非线性特征,伏立康唑的血药浓度与临床疗效和安全性存在极大相关性。患者年龄、体重、肝功能、CYP2C19基因多态性、炎症因子、白蛋白、合并用药等均能影响药物体内过程,使得血药浓度在不同患者体内,甚至同一患者体内高度变异,因此血药浓度的测定对伏立康唑的用药起到关键的指导作用。目前国内外多报道采用HPLC-MS或HPLC的方法,虽然精密度和准确度高,但HPLC-MS仪器昂贵,普及较难,报道的方法中流动相采用缓冲盐体系,进行梯度洗脱,配制和使用均不便,且血样处理复杂。因此,为了使临床能够得到快速有效的伏立康唑用药指导,建立一种伏立康唑快速、简便、准确、能普及的血药浓度测定HPLC方法具有很重要的意义。
发明内容
本发明旨在克服现有技术和方法的不足,提供一种快速、简便、准确、能普及的伏立康唑血药浓度测定HPLC方法,为临床合理用药提供依据。
为达到上述目的,本发明提供的技术方案为:
所述利用HPLC法测定伏立康唑血药浓度方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取伏立康唑对照品,精密称定,加甲醇溶解并制成2mg·mL-1的储备液,置4℃冷藏备用。精密量取储备液,分别加水稀释制成200、20和2μg·mL-1的对照品溶液。
(2)内标溶液的制备:取尼莫地平对照品,精密称定,加甲醇溶解并制成1mg·mL-1的内标储备液。精密量取储备液适量,加甲醇制成200μg·mL-1的内标溶液。
(3)色谱条件:色谱柱:MerckSTARLP RP-18 endcapped(250mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-水(53∶47,V/V);流速1.0mL·min-1;检测波长:256nm;柱温:35℃;进样量:50μL。
(4)血样处理:精密量取血清样品200μL,加入6μL内标溶液,涡旋震荡30秒,加入乙腈400μL,涡旋振荡2min,静置10min,11000r·min-1离心10min,取上清液50μL,按步骤(3)项下色谱条件,进样测定。
(5)标准曲线、最低检测限和定量限确定:取空白血清200μL 7份,分别对应加入20μg·mL-1或200μg·mL-1的对照品溶液及内标溶液6μL,制成0.3、0.6、1.5、3、6、12、20μg·mL-1的系列标准溶液。按步骤(4)处理后,按步骤(3)进样测定峰面积。以伏立康唑的各浓度(C)为横坐标,校正因子f(伏立康唑的峰面积/内标峰面积)为纵坐标,进行线性回归,得回归方程f=0.1251C+0.0076(R2=0.9999,n=7)。按信噪比(S/N)≈10时,伏立康唑最低定量限为0.8ng,当S/N≈3时,最低定量限为0.3ng。
(6)精密度和回收率确定:取上述(5)中制备的3μg·mL-1的测定液,连续进样6次,并于当日0、1、2、4、8h及连续测定3天,计算RSD均<2.0%。取对照溶液一定量,分别加入空白血清各200μL,照步骤(4)制成血药浓度为0.3、3、12μg·mL-1的测定液各3份,按步骤(3)进样测定,以实测浓度与实际浓度之比计算提取回收率,结果低、中、高浓度和内标的提取回收率均>90%。以实测量与加入量之比计算相对回收率,结果均>95%。
(7)稳定性确定:将质控的血清样品,分别反复冻融3次,并于-20℃保存1月,按步骤(4)和(3)测定,结果RSD均<3.0%。
(8)耐用性确定:取不同血样,同一检测人员更换不同色谱柱及随机3名工作人员按步骤(4)和(3)测定测定,结果3份血样的RSD分别<5.0%。
本发明的有益效果是:
(1)本方法采用的流动相为水-乙腈体系,不损伤仪器和色谱柱,便于配制、保存和使用。
(2)本方法建立的血样处理中采用加乙腈直接沉淀,蛋白处理完全,快速,省时,便于操作。
(3)本方法采用HPLC方法进行伏立康唑血药浓度检测,仪器能够在各个医药院所进行普及,便于开展伏立康唑血药浓度监测工作,线性关系、最低检测限、提取率、回收率、精密度、重复性和稳定性试验均表明该方法测定伏立康唑具有专属性、稳定性、可靠性和准确性,符合生物样品的测定要求。该法适用于临床治疗药物监测及药动学研究,临床医师可以根据血药浓度的高低,个体化指导患者调整伏立康唑的用药剂量,提高药物疗效,避免不良反应的发生,推动精准用药的发展。
附图说明
图1为以KH2PO4(pH=6.0)∶乙腈(55∶45)为流动相的HPLC谱图;
图2为以水∶乙腈(55∶45)为流动相的血样HPLC谱图;
图3为以水∶乙腈(50∶50)为流动相的血样HPLC谱图;
图4为以水∶乙腈(45∶55)为流动相的血样HPLC谱图;
图5为以水∶乙腈(40∶60)为流动相的血样HPLC谱图;
图6为以水∶乙腈(47∶53)为流动相的血样HPLC谱图;
图7为伏立康唑对照品溶液的HPLC谱图;
图8为内标尼莫地平溶液的HPLC谱图;
图9为标准对照血样的伏立康唑HPLC谱图;
图10为阴性对照(空白血清)的HPLC谱图;
图11为伏立康唑的标准曲线图;
图12为临床1号患者伏立康唑检测的HPLC谱图;
图13为临床2号患者伏立康唑检测的HPLC谱图;
图14为临床3号患者伏立康唑检测的HPLC谱图;图1-图10、图12-图14中,1为伏立康唑,2为尼莫地平。
具体实施方式
1仪器与试药
1.1仪器:美国Agilent 1260型高效液相色谱仪,包括G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱和G1314F VWD检测器Agilent紫外检测器;梅特勒托利多TML303E电子分析天平;德国Eppendorf5424R低温高速离心机;美国贝克曼Allegra X-30R高速离心机。
1.2试药:伏立康唑对照品(批号100862-201402,含量99.7%)、尼莫地平对照品(批号100270-200002)均为中国食品药品检定研究院;空白健康人血(3000r·min-1离心,血清置于-80℃保存);乙腈、甲醇(色谱纯,Merck公司);水为miliQ超纯水,其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:MerckSTARLP RP-18 endcapped(250mm×4.6mm,5μm),保护柱:WATCH C18 HPLC Guard column cartridges G101(10mm);流动相:乙腈-水(53∶47,V/V);流速1.0mL·min-1;检测波长:256nm;柱温:35℃;进样量:50μL。
2.2伏立康唑储备液和对照液配制:精密称取伏立康唑对照品10.61mg,置5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成2116μg·mL-1的储备液。精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀释至刻度制成211.6μg·mL-1的溶液(①),精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀释至刻度制成21.16μg·mL-1的溶液(②),精密量取1mL,置10mL量瓶中,加水稀释至刻度制成2.116μg·mL-1的溶液(③)。
2.3内标(尼莫地平)溶液:精密称取尼莫地平对照品5.35mg,置于5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成1070μg·mL-1的内标储备液。再精密量取储备液2mL,置于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,制成214.0μg·mL-1的内标溶液。
2.4血清样品的预处理抽取伏立康唑用药患者给药前30min外周静脉血2~3mL(达到稳态浓度),置于无抗凝剂的采血管中,3000r·min-1离心10min,精密量取血清样品200μL,加入6μL内标溶液,涡旋震荡30秒,加入乙腈400μL,涡旋振荡2min,静置10min,11000r·min-1离心10min,取上清液50μL,按“2.1”色谱条件,进样测定。
2.5流动相种类及比例的选择
2.5.1 KH2PO4(pH=6.0)∶乙腈(55∶45)为流动相在空白血清中,加入①对照液3μL和214.0μg·mL-1的内标溶液6μL,涡旋混匀,照样品处理方法制成血清样品测定液,按“2.1”色谱条件,采用KH2PO4(pH=6.0)∶乙腈(55∶45)作为流动相,则伏立康唑的tR=8.128min,而尼莫地平出峰时间太长,tR=32.539min,不利于分析进样测定,见图1,表1。
2.5.2水∶乙腈的不同比例为流动相同2.5.1条件测定,分别采用水∶乙腈的比例55∶45、50∶50、45∶55、40∶60为流动相,则结果显示,尼莫地平保留时间太长,不利于分析测定。将水∶乙腈调整为47∶53时,伏立康唑和尼莫地平保留时间适宜,且两物质和各自相邻的内源性杂质均达到有效分离,能够避开临床样品血浆中内源性物质的干扰,20min内分析完成,也避免了使用磷酸盐的麻烦和对仪器的损伤,见图2-6,表1。
表1不同流动相筛选结果
2.6系统适用性试验在空白血清中,加入①对照液3μL和214.0μg·mL-1的内标溶液6μL,涡旋混匀,照样品处理方法制成血清样品测定液,另照“2.2”制成空白血清和伏立康唑用药患者血清样本,按“2.1”色谱条件,伏立康唑和尼莫地平保留时间分别为5.705min和16.251min,理论塔板数分别为5103和10215。伏立康唑和尼莫地平分别与相邻色谱峰分离度均>2.0,血清中内源性杂质对测定无干扰,伏立康唑对照品、尼莫地平对照品、对照血样、空白血清、患者血样色谱图分别见图7-10、12-14。
2.7提取回收率试验取②对照液3μL、①对照液3μL、12μL各3份,分别加入214.0μg·mL-1的尼莫地平内标溶液各6μL,分别加入空白血清各200μL,照“2.4”方法制成伏立康唑血药浓度为0.3174、3.174、12.696μg·mL-1的测定液各3份,按“2.1”进样测定,另取同浓度的伏立康唑和尼莫地平对照品溶液,直接进样测定。计算提取回收率结果低、中、高浓度和内标的提取回收率分别为97.91%±0.96%、96.37%±1.20%、100.2%±1.08%、97.29%±0.81%,能满足测定所需。
2.8标准曲线的制备取空白血清200μL 7份,各对应加入②对照液3、6、15,①对照液3μL、6μL、12μL、20μL,再分别加入214.0μg·mL-1的尼莫地平内标溶液6μL,即对应制成0.3174、0.6348、1.588、3.174、6.348、12.696、21.160μg·mL-1的系列对照溶液。按“2.1”样测定,记录各组分的峰面积。以伏立康唑的血药浓度(C)和校正因子f(伏立康唑的峰面积/内标峰面积)进行线性回归,结果,伏立康唑在0.3174~21.16μg·mL-1的浓度范围内与校正因子f呈良好的线性关系,回归方程为f=0.1251C+0.0076(R2=0.9999,n=7)。线性关系图谱见图11。
2.9方法回收率试验取“2.6”制备的0.3174、3.174、12.696μg·mL-1的测定液各3份,按“2.1”进样测定,用标准曲线计算测得量,回收率=测得量/加入量×100%,结果回收率良好,见表2。
表2回收率试验结果
2.10精密度试验和稳定性试验取“2.6”制备的3.174μg·mL-1的测定液,连续进样6次,结果校正因子f的RSD为1.01%。分别于0、1、2、4、8h进样测定,RSD为1.34%,3天内测定的RSD为1.56%。
2.11最低检测限和最低定量限试验取“2.7”制备的0.3174μg·mL-1的溶液,分别依次用甲醇进行稀释,当S/N≈10时,最低定量限为0.8ng,当S/N≈3时,最低检测限为0.3ng。
2.12重复性和冻融试验取同一患者血清样品,按“2.4”制备5份测定液,“2.1”方法测定,结果血药浓度的RSD为1.47%。将血清样品,分别反复冻融3次,并于-20℃冰箱保存1月,分别于0、3、5、7、14、30天取样,按“2.4”和“2.1”制备测定,结果血药浓度的RSD分别为1.92%和1.89%。
2.13耐用性实验取3份患者的血样,同一检测人员更换不同色谱柱对3份血样进行检测,同时实验室随机抽取3个人对其血样按“2.4”处理,按“2.1”进样测定,结果3份血样的RSD分别<5.0%,实验方法的耐用性好。
表3耐用性实验结果比较表1(色谱柱:MerckSTARLP RP-18endcapped,250mm×4.6mm,5μm)
表4耐用性实验结果比较表2(同一检测人员A采用不同色谱柱)
2.14治疗药物监测临床应用对临床应用伏立康唑的296例患者进行血药浓度测定,结果296份血清样品中伏立康唑峰均能与相邻峰获得良好的分离,峰形对称,塔板数高,测定结果准确可靠,说明该检测条件能满足血样测定所需。其中3例患者的伏立康唑血药浓度检测HPLC图谱见图12-14。
Claims (2)
1.一种利用HPLC技术测定血清中伏立康唑浓度的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取伏立康唑对照品,精密称定,加甲醇溶解并制成2mg·mL-1的储备液,置4℃冷藏备用,精密量取储备液,分别加水稀释制成200、20和2μg·mL-1的对照品溶液;
(2)内标溶液的制备:取尼莫地平对照品,精密称定,加甲醇溶解并制成1mg·mL-1的内标储备液,精密量取储备液适量,加甲醇制成200μg·mL-1的内标溶液;
(3)色谱条件:色谱柱:MerckSTARLP RP-18 endcapped,250mm×4.6mm,5um,流动相:乙腈-水,体积比为53∶47;流速1.0mL·min-1;检测波长:256nm;柱温:35℃;进样量:50μL;
(4)血样处理:精密量取血清样品200,加入6μL内标溶液,涡旋震荡30秒,加入乙腈400μL,涡旋振荡2min,静置10min,11000r·min-1离心10min,取上清液50μL,按步骤(3),进样测定;
(5)标准曲线、最低检测限和定量限确定:取空白血清200μL 7份,分别对应加入20μg·mL-1或200μg·mL-1的对照品溶液一定量及内标溶液6μL,制成0.3、0.6、1.5、3、6、12、20μg·mL-1的系列标准溶液,按步骤(4)处理后,按步骤(3)进样测定峰面积,以伏立康唑的浓度C为横坐标,校正因子f为纵坐标,f为伏立康唑的峰面积/内标峰面积,进行线性回归,得回归方程f=0.1251C+0.0076,R2=0.9999,n=7,按信噪比S/N≈10时,伏立康唑最低定量限为0.8ng,当S/N≈3时,最低定量限为0.3ng;
(6)精密度和回收率确定:取(5)中制备的3μg·mL-1的测定液,连续进样6次,并于当日0、1、2、4、8h及连续测定3天,计算RSD均<2.0%;取对照溶液,分别加入空白血清各200μL,按照步骤(4)制成血药浓度为0.3、3、12μg·mL-1的测定液各3份,按步骤(3)进样测定,以实测浓度与实际浓度之比计算提取回收率,结果低、中、高浓度和内标的提取回收率均>90%,以实测量与加入量之比计算相对回收率,结果均>95%;
(7)稳定性确定:将质控的血清样品,分别反复冻融3次,并于-20℃保存1月,按步骤(4)和(3)测定,结果RSD均<3.0%;
(8)耐用性确定:取不同血样,同一检测人员更换不同色谱柱及随机3名工作人员按步骤(4)和(3)测定,结果3份血样的RSD分别<5.0%。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,测定对照品溶液和内标溶液时,理论塔板数按伏立康唑和尼莫地平计算,应不低于4000。
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