CN109030672A - 同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用 - Google Patents

同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用 Download PDF

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CN109030672A CN201810727286.1A CN201810727286A CN109030672A CN 109030672 A CN109030672 A CN 109030672A CN 201810727286 A CN201810727286 A CN 201810727286A CN 109030672 A CN109030672 A CN 109030672A
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Abstract

本发明公开了一种同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒，包括提取液、稀释液、流动相、标准品和质控品；所述标准品包含酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑；所述提取液由同位素内标、水和有机溶剂组成；所述的有机溶剂为甲醇和/或乙腈；所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇和/或乙腈，所述水相为甲酸铵或乙酸铵‑甲酸或乙酸水溶液。本发明还公开了使用所述试剂盒同时测定干血斑中四种抗真菌药物的方法。本发明适用于同时检测干血斑样品中四种抗真菌药物的含量，对样品的检测专一性强，灵敏度高，稳定性好。

Description

同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及临床检测领域，尤其涉及同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，人类感染真菌的概率大幅升高，主要是由器官移植，免疫抑制疗法以及艾滋人群增加所导致的。目前，临床应用最为广泛的抗真菌药物主要有酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑，这四种抗真菌药物具有抗菌活性强、抗菌谱广、不良反应少等优点，广泛用于浅部及深部真菌病的治疗并有较好疗效。
虽然抗真菌药物的效用有了很大的进展，但是真菌感染的发病率和死亡率依然很高。同时，由于抗真菌药物的药代动力学特征、副作用、药物相互作用和药物基因组学差异显著，所以在治疗过程中，患者体内的血药浓度个体差异很大。由于治疗用剂量低，个体差异大，治疗指数窄，特别对特殊患者(儿童、肝功能不良者)血药浓度监测是非常必要的。
目前，测定抗真菌药物的方法主要有微生物法、HPLC法和LC-MS/MS法等。由于生物分析法测定伊曲康唑的血药浓度特异性差，误差大，而高效液相色谱-紫外或荧光检测存在样品前处理复杂往往需要萃取，衍生化等步骤、分析时间长、灵敏度低等缺点。高效液相色谱与质谱联用技术作为近年来发展起来的分离技术，与传统的液相色谱相比具有更高的分离效率和更快的分离速度。
公开号为CN106018581A的中国专利文献公开了一种测定血浆中氟曲马唑浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒液液萃取剂进行液液萃取，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。
值得注意的是，在一个给药间期内多次采集全血增加了患者，尤其是特殊群体(如儿童、老年人)的生理负担，也增加了门诊患者的单次门诊留院时间。另外，移植患者具有各种不同的原发病，生理、病理状态特殊，常合并其他治疗药物，因此对血药浓度检测的要求是样本量少、便捷、准确、特异性高。
干血滤纸片样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势包括样本的常温稳定性更好、微创、成本更低、易保存和运输、减少潜在的病原体感染风险，目前还没有干血片中免疫抑制剂的检测方法。
发明内容
本发明提供一种同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒，检测专一性强，灵敏度高，稳定性好。
本发明提供了如下技术方案：
一种同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒，包括提取液、稀释液、流动相、标准品和质控品；
所述标准品包含酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑；
所述提取液由同位素内标、水和有机溶剂组成；所述的有机溶剂为甲醇和/或乙腈；
所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇和/或乙腈，所述水相为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸水溶液。
优选的，所述的提取液中，水与有机溶剂的体积比为1∶1～9。
进一步优选的，所述的提取液由同位素内标、水和甲醇组成；水和甲醇的体积比为1∶1～9。
进一步优选的，所述的提取液由同位素内标、水、甲醇和乙腈组成；水、甲醇和乙腈的体积比为1∶2∶2。
所述的同位素内标为氘代伏立康唑、氘代伊曲康唑和氘代泊沙康唑；提取液中，同位素内标的浓度为1～100ng/mL。
酮康唑不需要内标物，其基本没有基质效应。
所述的稀释剂由水和有机溶剂组成；所述的有机溶剂为甲醇和/或乙腈；水与有机溶剂的体积比为1∶1～9。
在稀释剂中和提取液中，有机溶剂的种类和含量相同。
优选的，所述的水相中，甲酸铵或乙酸铵的浓度为2～20mmol/L，甲酸或乙酸浓度为0.1～1％。
在生化检查领域，各种试剂的配用需要精心筛选，往往细微地改变试剂用量都可能导致检查的失败或精密度和准确度的降低。
进一步优选的，所述的提取液由同位素内标、水和甲醇组成，水和甲醇的体积比为1∶1～9；所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇，所述水相为乙酸铵-甲酸水溶液，乙酸铵浓度为20mmol/L，甲酸浓度为0.1～1％；
或所述的提取液由同位素内标、水、甲醇和乙腈组成，水、甲醇和乙腈的体积比为1∶2∶2；所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇和乙腈，甲醇和乙腈的体积比为1∶1～9，所述水相为甲酸铵或乙酸铵-甲酸水溶液，甲酸铵乙酸铵浓度为5mmol/L，甲酸浓度为0.1～0.2％。
采用上述特定配用的提取液和流动相时，检测信号较强，检测结果的精密度和准确度较高。
所述的标准品为含有酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的干血斑样品；标准品的制备方法为：
将酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑溶于利用健康全血，配制成若干个血药浓度呈梯度分布的血样；
取10～50uL所述血样滴在滤纸上，避光干燥，用打孔器从血斑中央打出直径为2～10mm的血斑即可。
标准品中，酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的浓度各自分别为：10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、9000ng/mL、10000ng/mL。
所述的质控品为含有酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的干血斑样品；其制备方法同标准品。
质控品中，酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的浓度各自分别为：10ng/mL、25ng/mL、300ng/mL、900ng/mL、8000ng/mL。
本发明的试剂盒的干血斑血药浓度线性检测范围为10～10000ng/mL。
本发明还公开了使用所述试剂盒同时测定干血斑中四种抗真菌药物的方法，包括以下步骤：
(1)将标准品和待测样本的干血斑打入孔板孔中；
(2)向所有标准品和待测样本孔中各加100～1000μL提取液，震荡提取；
(3)震荡提取后离心，取上清液，加入稀释剂，震荡混匀，采用液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应同位素内标物的峰面积用于定量。
优选的，液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温为25～45℃，流动相流速为0.1～1mL/min，采用梯度洗脱。
进一步优选的，流动相流速为0.3mL/min，流动相洗脱梯度为：0～3min，水相50～10％，有机相50～90％；3～4.5min，水相10％，有机相90％；4.5～4.6min，水相10～50％，有机相90～50％；4.6～6min，水相50％，有机相50％。
优选的，质谱条件为：采用ESI离子源，正离子模式，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。
进一步优选的，采用MRM模式进行检测，各化合物的LC-MS参数见表3。
表3多反应监测MRM参数
化合物名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)
伏立康唑 350.04 281.02 25 18
酮康唑 531.08 489.02 13 32
泊沙康唑 701.28 683.25 45 32
伊曲康唑 705.16 392.07 5 38
伏立康唑-D3内标 353.06 284.06 21 16
泊沙康唑-D5内标 706.40 688.19 49 32
伊曲康唑-D9内标 714.31 401.23 22 38
本发明检测方法的回收率在80％～120％之间，符合检测要求，多次测量的RSD小于5％，符合分析测试要求。
对30个预先收集并使用不记名过量全血样品来组织相关性研究，检测结果与医院检验科血药浓度检测结果一致。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用的干血斑样品，避免了繁琐的血液取样，运输和存储过程，有效的降低了过程中可能带来的生物安全风险；
本发明适用于同时检测干血斑样品中四种抗真菌药物的含量，对样品的检测专一性强，灵敏度高，稳定性好，可方便、可靠地满足实际检测需要，应用范围广泛。
附图说明
图1为四种抗真菌类药物的干血斑标准品的色谱检测谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
一、检测试剂盒组成如表1所示：
表1试剂盒组成
二、干血斑标准样品和质控样品制备：
分别准确移取酮康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑储备液(1.0mg/mL)各200μL于2mL小瓶中，再加入200μL甲醇，混匀，得到康唑混标溶液B(200μg/mL)。首先配置最高浓度的标准品(定量上限)，准确移取混标溶液B50μL于1.5mL离心管内，加入950μL全血，混匀并静置平衡5min，得血药浓度为10000ng/mL的康唑全血溶液。再依次以全血稀释该溶液，分别配制血药浓度为9000ng/mL，5000ng/mL，1000ng/mL，500ng/mL，100ng/mL，20ng/mL，10ng/mL的标准品。由此，共得到10～10000ng/mL共8个血药浓度的标准品。
质控样品配制与标准品配制类似，采用从高到低逐级稀释的方法，以空白全血分别配制血药浓度水平分别为10、25、300、900、8000ng/mL的全血质控样品(Q1-Q5)。
移取配制好的标准品和质控品血样40μL，缓慢逐滴滴在whatman 903滤纸上，移液枪的枪头避免接触滤纸，避免产生气泡，待滴加完毕血样晕染完全后置于避光处自然干燥2小时，用打孔器从血斑中央打6mm血斑，即得到干血斑标准样品和质控样品。
三、使用试剂盒同时检测干血斑中四种抗真菌药物的方法，包括以下步骤：
(1)将待测干血斑样品按照与干血斑标准品相等的大小打入96孔提取板的孔中；
(2)向所有标准品、质控品和样本孔中各加400μL提取液，贴膜覆盖后放入震荡器中，震荡30分钟，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；
(3)揭去贴膜，每孔移出40μL上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加入稀释剂160μL，贴膜密封后震荡混匀供液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应内标的峰面积用于定量。
液相色谱所用色谱柱为C18柱，柱温为20～50℃，流动相流速为0.1～1mL/min，洗脱梯度见表2。
表2流动相洗脱梯度
时间(min) 流速(mL/min) A相(％) B相(％)
0.00 0.30 50 50
3.00 0.30 10 90
4.50 0.30 10 90
4.60 0.30 50 50
6.00 0.30 50 50
质谱条件为：ESI离子源，正离子模式，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为450℃，锥孔气流量为150L/h，脱溶剂气流量为1000L/h，喷雾器压力为7bar，毛细管电压为3kV。
采用MRM模式进行检测，各化合物的LC-MS参数见表3。
表3多反应监测MRM参数
化合物名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)
伏立康唑 350.04 281.02 25 18
酮康唑 531.08 489.02 13 32
泊沙康唑 701.28 683.25 45 32
伊曲康唑 705.16 392.07 5 38
伏立康唑-D3内标 353.06 284.06 21 16
泊沙康唑-D5内标 706.40 688.19 49 32
伊曲康唑-D9内标 714.31 401.23 22 38
四、提取液配方的选择：
取同一质控样，分别采取表4所示提取液配方，按照上述试剂盒使用方法，加400μL提取液，贴膜覆盖后放入震荡器中，震荡30分钟，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出40μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入稀释剂160μL，贴膜密封后震荡混匀供液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应内标的峰面积用于定量。
表4不同提取液配方
提取液 水(mL) 甲醇(mL) 乙腈(mL) 氘代内标(ng/mL)
配方1 10 90 0 1
配方2 50 50 0 10
配方3 10 0 90 20
配方4 50 0 50 40
配方5 20 40 40 50
配方6 20 80 0 100
配方1～6的提取液均可获得理想的检测效果，回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。超出配方1～6的范围后，准确度下降，回收率会下降或者升高。
五、稀释液配方的选择：
取同一质控样，分别采取表5所示提取液配方，按照上述试剂盒使用方法，加400μL提取液，贴膜覆盖后放入震荡器中，震荡30分钟，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出40μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入稀释剂160μL，贴膜密封后震荡混匀供液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应内标的峰面积用于定量。
表5不同稀释剂配方
稀释剂 水(mL) 甲醇(mL) 乙腈(mL)
配方1 10 90 0
配方2 50 50 0
配方3 10 0 90
配方4 50 0 50
配方5 20 40 40
配方6 20 80 0
配方1～6的稀释液均可获得理想的检测效果，准确度和回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。超出配方1～6的范围后，准确度下降，回收率会下降或者升高。
六、流动相的选择
取同一质控样，分别采用表6所示配方的流动相，按照上述高效液相串联质谱检测方法检测四种抗真菌药物，配方1～6的流动相均可获得理想的检测效果，回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。超出配方1～6的范围后，信号强度变低，准确度下降，回收率会下降或者升高。
表6不同流动相配方
流动相 有机相 水相
配方1 乙腈 5mmol/L乙酸铵-0.1％乙酸
配方2 甲醇 20mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸
配方3 乙腈 2mmol/L甲酸铵-0.5％乙酸
配方4 甲醇 20mmol/L乙酸铵-1％甲酸
配方5 甲醇∶乙腈＝1∶1 5mmol/L甲酸铵-0.2％甲酸
配方6 甲醇∶乙腈＝1∶9 5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸
流动相的选择有六种配方，这六种不同配方对最后的检测结果的准确性和精密度没有影响。六种流动相配方可分别与六种提取液配方交叉组合，稀释液的配方根据提取液的配方进行选择，最好与提取液的组成相一致。
实施例1
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为3mm；提取液由氘代内标、水、甲醇组成，各氘代内标含量为1ng/mL，水10mL，甲醇90mL；稀释剂由甲醇和水组成，水10mL，甲醇90mL；有机相为乙腈，水相为5mmol/L乙酸铵-0.1％乙酸。
实施例2
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为6mm；提取液由氘代内标、水、乙腈组成，各氘代内标含量为20ng/mL，水10mL，乙腈90mL；稀释剂由乙腈和水组成，水10mL，乙腈90mL；有机相为乙腈，水相为2mmol/L甲酸铵-0.5％乙酸。
实施例3
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为6mm；提取液由氘代内标、水、甲醇、乙腈组成，各氘代内标含量为50ng/mL，水20mL，甲醇40mL，乙腈40mL；稀释剂由甲醇、乙腈和水组成，水20mL，甲醇40mL，乙腈40mL；有机相为甲醇∶乙腈＝1∶1，水相为5mmol/L甲酸铵-0.2％甲酸。
实施例4
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为6mm；提取液由氘代内标、水、乙腈组成，各氘代内标含量为10ng/mL，水50mL，乙腈50mL；稀释剂由乙腈和水组成，水50mL，乙腈50mL；有机相为甲醇∶乙腈＝1∶9，水相为5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸。
实施例5
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为6mm；提取液由氘代内标、水、乙腈组成，各氘代内标含量为100ng/mL，水20mL，甲醇80mL；稀释剂由乙腈和水组成，水20mL，甲醇80mL；有机相为乙腈，水相为2mmol/L甲酸铵-0.5％乙酸。
实施例6
试剂盒中：标准样品和质控样品的干血斑直径大小为6mm，提取液由氘代内标、水、乙腈组成，各氘代内标含量为100ng/mL，水20mL，甲醇80mL；稀释剂由乙腈和水组成，水20mL，甲醇80mL；有机相为甲醇，水相为20mmol/L乙酸铵-1％甲酸。
实施例7
使用实施例1的试剂盒检测干血斑样本：
(1)将待测干血斑样本按照与干血斑标准品相等的大小(3mm)打入孔板孔中；
(2)向所有标准品、质控品和待测样本孔中各加400μL提取液，贴膜覆盖后放入震荡器中，震荡30分钟，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；
(3)揭去贴膜，每孔移出40μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入稀释剂160μL，贴膜密封后震荡混匀供液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应内标的峰面积用于定量。
液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，规格为1.7um，2.1×50mm，柱温为35℃，流动相流速为0.3mL/min，流动相洗脱梯度参照表2。其中，有机相为乙腈，水相为5mmol/L乙酸铵-0.1％乙酸。
质谱条件为ESI离子源，正离子模式，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。
四种抗真菌类药物的干血斑标准品的色谱检测谱图如图1所示。
所得结果分别以干血斑标准品A～H中的伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑和酮康唑全血血药浓度为横坐标，以所得伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑和酮康唑与内标物峰面积比值为纵坐标，以加权(W＝1/X)最小二乘法进行回归运算，求得的线性回归方程，如表7所示。
根据标准曲线，伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑和酮康唑的线性范围为10～10000ng/mL。
表7四种抗直菌药物的标准曲线
标准品名称 线性方程 R2
酮康唑 Y＝7.33×103X-6400 0.9970
伏立康唑 Y＝1.78×10-3X+0.000388 0.9965
泊沙康唑 Y＝1.87×10-3X+0.00161 0.9966
伊曲康唑 Y＝1.57×10-3X+0.000794 0.9986
该检测方法的回收率在80％～120％之间，符合检测要求，多次测量的RSD小于5％，符合分析测试要求。
对30个预先收集并使用不记名过量全血样品来组织相关性研究，其中空白血样3个，酮康唑血样5个，伏立康唑血样8个，伊曲康唑血样9个，泊沙康唑血样5个，将样品点渍于whatman903滤纸上，干燥，并运用本发明所述的方法进行检测，检测结果见表8，本方法所得结果与医院检验科血药浓度检测结果一致。
表8实际样品检测
实施例8
与实施例7相比，液相色谱条件不同，实施例8的液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，规格为1.7um，2.1×50mm，柱温为25℃，流动相流速为0.2mL/min，洗脱梯度见表2。
实施例9
与实施例7相比，液相色谱条件不同，实施例9的液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，规格为1.7um，4.6×100mm，柱温为45℃，流动相流速为1mL/min，洗脱梯度见表2。
实施例8和实施例9的检测结果与实施例7相似，样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒，其特征在于，包括提取液、稀释液、流动相、标准品和质控品；
所述标准品包含酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑；
所述提取液由同位素内标、水和有机溶剂组成；所述的有机溶剂为甲醇和/或乙腈；
所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇和/或乙腈，所述水相为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的提取液中，水与有机溶剂的体积比为1∶1～9。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的同位素内标为氘代伏立康唑、氘代伊曲康唑和氘代泊沙康唑提取液中，同位素内标的浓度为1～100ng/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的水相中，甲酸铵或乙酸铵的浓度为2～20mmol/L，甲酸或乙酸浓度为0.1～1％。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的提取液由同位素内标、水和甲醇组成，水和甲醇的体积比为1∶1～9；所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇，所述水相为乙酸铵-甲酸水溶液，乙酸铵浓度为20mmol/L，甲酸浓度为0.1～1％；
或所述的提取液由同位素内标、水、甲醇和乙腈组成，水、甲醇和乙腈的体积比为1∶2∶2；所述流动相包括有机相和水相，所述有机相为甲醇和乙腈，甲醇和乙腈的体积比为1∶1～9，所述水相为甲酸铵或乙酸铵-甲酸水溶液，甲酸铵乙酸铵浓度为5mmol/L，甲酸浓度为0.1～0.2％。
6.使用权利要求1～5任一项所述试剂盒同时测定干血斑中四种抗真菌药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将标准品和待测样本的干血斑打入孔板孔中；
(2)向所有标准品和待测样本孔中各加100～1000μL提取液，震荡提取；
(3)震荡提取后离心，取上清液，加入稀释剂，震荡混匀，采用液相色谱串联质谱检测，记录四种抗真菌药物及相应同位素内标物的峰面积用于定量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温为25～45℃，流动相流速为0.1～1mL/min，采用梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，流动相流速为0.3mL/min，流动相洗脱梯度为：0～3min，水相50～10％，有机相50～90％；3～4.5min，水相10％，有机相90％；4.5～4.6min，水相10～50％，有机相90～50％；4.6～6min，水相50％，有机相50％。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱条件为：采用ESI离子源，正离子模式，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。
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