CN115112776B - 联合标志物及在诊断心房颤动中应用及诊断试剂或试剂盒 - Google Patents

联合标志物及在诊断心房颤动中应用及诊断试剂或试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及血浆样品中脂质代谢物脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1作为联合标志物在制备用于诊断心房颤动疾病的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测心律失常受试者中的心房颤动的试剂盒，通过检测来自受试者的血浆样品中上述联合标志物的各自浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量Prob以及判断截点值(cut‑off值)，判断受试者是否患有心房颤动。所述试剂盒可实现对心房颤动疾病高灵敏、高效检测。本发明涉及的三种脂质代谢物具有检测成本低、稳定性好的特点。上述几种脂质代谢物联合使用，可在心房颤动的辅助诊断中得到应用。

Description

联合标志物及在诊断心房颤动中应用及诊断试剂或试剂盒
技术领域
本发明涉及分析化学及临床医学领域。具体地，本发明涉及以脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1作为联合标志物判别心房颤动的试剂盒。
背景技术
心房颤动作为心血管疾病的主要病因，大大增加了心血管疾病的医疗成本和死亡率。近年来，心房颤动的发生率和死亡率不断上升，特别是在老年人中。心房颤动是一种最常见的室上性心律失常，其特征是心房的不协调电激活和一种不规则的、快速的心室反应，导致血流动力学损害。心房颤动没有得到充分的诊断和治疗，会对心肌病、心力衰竭和卒中的发生发展有促进作用(文献1：Cecilia,Gutierrez,Daniel G,et al.Diagnosis andTreatment of Atrial Fibrillation.[J].American family physician,2016,94(6):442-452.)。鉴于可携带的智能设备发展，将专业算法植入其中也可实现对心房颤动诊断及检测，但是这种技术成本高昂且需要无噪音追踪才能获得最佳的性能。因此当设备提供给病人或者社区使用时，这可能是困难的。脉率虽然对心房颤动的诊断敏感，但是并不特异，最终都需要心电图来确认疑似心房颤动。目前12导联心电图和单导联心电图记录p波被用于心房颤动的确诊，但是这种外部设备长期持续的心率监测受到费用的限制(文献2：Freedman B,Camm J,Calkins H,et al.Screening for Atrial Fibrillation AReportof the AF-SCREEN International Collaboration[J].Circulation,2017,135(19):1851-1861.)。因此，识别更可靠的血浆生物标志物对心房颤动临床诊断具有重要意义。
代谢组学是通过考察生物体受到刺激或扰动后，来描述其代谢产物的变化或随时间改变的专业学科。已有研究表明，心房颤动的发生发展与多种小分子代谢物紊乱密切相关，例如嘌呤代谢，脂质代谢，d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢等。本发明通过液相色谱-质谱联用的代谢组学方法检测血浆中的脂质代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，有望在心房颤动疾病的诊断中得到应用。而且，色谱-质谱联用技术为小分子代谢物的检测提供了快速灵敏、稳定且成本低的检测方法。轩秋慧等人基于多平台的代谢组学研究定义了12-羟基二十碳四烯酸(12-HETE)和2-哌啶酮血清组合标志物，该组合标志物可以很好的判别糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病，尤其是在早期DR检测中具有较高的灵敏度(文献3：XuanQ,Ouyang,Y,et al.Multiplatform Metabolomics Reveals Novel Serum MetaboliteBiomarkers in Diabetic Retinopathy Subjects[J].Advanced Science,2020,7(22):2001714.)。目前已有多种分析技术应用于代谢组学检测，如核磁共振、气相色谱-质谱、液相色谱-质谱、毛细管电泳色谱-质谱等，其中液相色谱-质谱的应用日益成熟且广泛。
本发明利用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)技术，对一批室性早搏患者、室上性心动过速患者和心房颤动患者的血浆进行检测分析，将样品分为心房颤动组和非心房颤动组(包括室性早搏患者和室上性心动过速患者)。经多次优选，确定了脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1一组联合标志物用于一次性诊断心律失常受试者中心房颤动患者。脂肪酸(FA)作为一类重要的能量底物参与心肌细胞的能量代谢(文献4：Harada M,Melka J,Sobue Y.Metabolic Considerations in AtrialFibrillation-Mechanistic Insights and Therapeutic Opportunities.[J].Circulation Journal,2017,81(12):1749-1757.)。溶血磷脂酰胆碱(LPC)在机体抗炎反应和代谢疾病进展中发挥保护作用(文献5：Taylor L A,Arends J,Hodina A K,etal.Plasma lyso-phosphatidylcholine concentration is decreased in cancerpatients with weight loss and activated inflammatory status[J].Lipids inHealth and Disease,2007,6(1):17-34.)。磷脂酰肌醇(PI)是参与细胞信号传递和花生四烯酸合成的一类重要化合物，而花生四烯酸通过环加氧酶转化为前列腺素和血栓素来加速炎症发展(文献6：Samuelsson B.Leukotrienes:mediators of immediatehypersensitivity reactions and inflammation[J].Science,1983,220(4597):568-575.)。目前尚无将上述联合标志物用于心房颤动诊断的报道。
发明内容
本发明的目的是针对心律失常人群中心房颤动诊断困难，而提出了一种新的血浆脂质联合标志物能够应用于心律失常患者中心房颤动的诊断，并提供可用于上述联合标志物的分析检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)利用高效液相色谱-质谱联用的代谢组学技术，对室性早搏患者、室上性心动过速患者和心房颤动患者血浆进行了代谢组学指纹分析；
(2)使用MEV软件对可定量代谢物进行非参数检验，计算得出所有代谢物的假阳性率(FDR)值和p值，FDR值<0.2和p值<0.05的代谢物具备显著性差异，由此发现45种代谢物在非心房颤动(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动患者中存在显著性差异；
(3)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，通过向前：条件方法筛选45种差异代谢物，回归为联合标志物变量，然后用ROC(receiver operatingcharacteristic)曲线来评价联合标志物的灵敏度和特异性。灵敏度和特异性均较高，同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的组合可以作为联合标志物，选取脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1可作为辅助诊断心房颤动疾病的联合标志物；
(4)应用另外一批室性早搏患者、室上性心动过速患者和心房颤动患者血浆样本对联合标志物进行验证，确定脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1可作为辅助诊断心房颤动疾病的联合标志物；
(5)联合标志物的使用：相对于非心房颤动患者(室性早搏患者和室上性心动过速患者)，在心房颤动患者血浆中脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的浓度降低。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归的方法，将上述代谢物回归为一种联合标志物变量p，二元逻辑回归方程如下：
p＝1/[1+e-(-161.307*a-2.319*b-18.907*c+6.716)]
其中，a为血浆样品中脂肪酸(FA)23:0的浓度，b为血浆样品中溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5的浓度，c为血浆样品中磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的浓度。所得变量p在心房颤动患者中升高，该变量值可用于辅助判断心房颤动。本发明确定的该联合标志物对心房颤动判断的截点值设为0.453，高于该截点值的则可能为心房颤动。
(6)诊断系统包括的装置：色谱柱为Waters BEH C8柱(100mm×2.1mm,1.7μm)(Waters,Milford,MA),分离系统为Agilent 1290Infinity II LC，检测系统为Agilent6546Q-TOF质谱，使用正离子模式和负离子模式检测；
(7)确定试剂盒的最佳组成：
a.标准化学品：脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1。所述标准品分别用于对应血浆中小分子代谢物脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的定性。将浓度为5～20μg/mL的三种物质标准品进行液相色谱-质谱分析，确定三种标准品的色谱保留时间以及三种离子的实测质荷比，与在受试者样本中实测的三种物质相比较；
b.用于血浆样本预处理的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血浆样本，为包含0.56μg/mL D3-脂肪酸(FA)18:0和0.28μg/mL溶血磷脂酰胆碱(LPC)19:0的两种内标的异丙醇溶液。内标D3-脂肪酸(FA)18:0用于校正脂肪酸(FA)23:0和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1，溶血磷脂酰胆碱(LPC)19:0用于校正溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5。对每一受试者样本中经定性后的三种物质的离子峰强度分别与提取液中的内标物比较，通过内标校正获得脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的相对浓度；
c.洗脱液：流动相A为包含10mM乙酸铵的60％(v/v)乙腈水溶液；流动相B为包含10mM乙酸铵的90％(v/v)异丙醇乙腈溶液；
本发明还涉及检测心律失常受试者中的心房颤动的试剂盒，通过检测来自受试者的血浆样品中上述联合标志物的各自浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量Prob以及判断截点值(cut-off值)，判断受试者是否患有心房颤动。所述试剂盒可实现对心房颤动疾病高灵敏、高效检测。本发明涉及的三种脂质代谢物具有检测成本低、稳定性好的特点。上述几种脂质代谢物联合使用，可在心房颤动的辅助诊断中得到应用。
本发明具有如下效果：
血浆中的联合标志物变量p，能够对心房颤动具有很好的诊断。本发明涉及的检测试剂盒，对上述脂质代谢物组合的检测，具有简便、快速、重复性好的优点，适于辅助心房颤动的临床诊断。灵敏度和特异性及曲线下面积(AUC)见下表1。
表1.联合标志物的使用结果
Figure BDA0002982462500000041
附图说明
图1.在发现集和验证集中，脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1在非心房颤动患者(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动患者中的相对含量变化(均值±标准偏差表示)。
图2.(A)联合标志物在发现集中用于诊断心房颤动的ROC曲线图，AUC＝0.831；(B)联合标志物在验证集中用于诊断心房颤动的ROC曲线图，AUC＝0.745。
具体实施方式
实施例1
1.血浆样品收集
所有纳入研究的志愿者在血浆样品采集前均签署了知情同意书。在相同条件下于抗凝管中收集49例心房颤动患者，23例室性早搏患者和23例室上性心动过速患者的血样，采集后4500rpm/min离心5分钟后，然后分别取血浆，分别储存于-80℃的冰箱中保存备用。
2.分析方法
2.1血浆样本预处理
首先将96孔蛋白沉淀板置于96孔接收板上方。向96孔蛋白沉淀板中加入360μL含内标的异丙醇(含2种内标：0.56μg/mL D3-脂肪酸(FA)18:0和0.28μg/mL溶血磷脂酰胆碱(LPC)19:0)，再加入40μL血浆。将蛋白沉淀板和接收板震荡10分钟，然后在500g离心10分钟。滤液受到离心作用位于下方的接收板中，从而与上方沉淀板中蛋白质分开。上方含有沉淀的沉淀板丢弃，于下方接收板中取40μL样品加入80μL体积比为65/30/5的乙腈/异丙醇/水溶液进行稀释，震荡5分钟后，进行正离子模式检测。剩余的样品直接进行负离子模式检测。
2.2仪器条件
液相色谱分析系统采用Agilent 1290Infinity II LC(Agilent TechnologiesInc,California,USA)。色谱柱：Waters BEH C8柱(100mm×2.1mm,1.7μm)(Waters,Milford,MA)，柱温：60℃，流速：0.3ml/min。流动相：10mM乙酸铵的60％(v/v)乙腈水溶液(A相)和10mM乙酸铵的90％(v/v)异丙醇乙腈溶液(B相)。梯度：起始梯度为50％B，维持1.5min，随后在7.5min内线性增加至85％B，然后流动相B在0.1min内增至100％并维持1.9min。接着在0.1min内降低到50％B，并维持1.9min。
检测系统为Agilent 6546Q-TOF质谱(Agilent Technologies Inc,California,USA)，正离子模式和负离子模式。TOF全扫描范围m/z 100-1200；气体温度320℃，干燥气流速8L/min，雾化气39psig，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min，正离子模式电压4000V，负离子模式电压3000V，混合碰撞能15eV和30eV，MS2扫描范围m/z 100-1200，二级数据采集采用迭代采集模式。
3.血浆测试结果及辅助诊断方法
分别提取联合标志物脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1及内标化合物的峰面积，对代谢物的峰面积进行内标校正得到相应的相对强度，脂肪酸(FA)23:0和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1采用D3-脂肪酸(FA)18:0校正，溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5采用溶血磷脂酰胆碱(LPC)19:0校正。定量分析脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1。上述代谢物在非心房颤动组(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动组中的相对含量(即上述相对强度)如图1(发现集)和表2。
表2.非心房颤动组(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动中脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的相对含量
Figure BDA0002982462500000051
Figure BDA0002982462500000061
Figure BDA0002982462500000071
Figure BDA0002982462500000081
Figure BDA0002982462500000091
Figure BDA0002982462500000101
相对于非心房颤动患者(室性早搏患者和室上性心动过速患者)，在心房颤动患者血浆中脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的含量下调。同时将各代谢物的相对含量代入SPSS软件进行二元逻辑建模分析，所建模型的回归方程如下：
p＝1/[1+e-(-161.307*a-2.319*b-18.907*c+6.716)]
本回归方程构建了一个以e为底的模型，e为自然常数(欧拉数)，a为血浆样品中脂肪酸(FA)23:0的浓度，b为血浆样品中溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5的浓度，c为血浆样品中磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的浓度。所得变量p在心房颤动患者中升高，该变量值可用于辅助判断心房颤动。本发明确定的该联合标志物对心房颤动判断的截点值设为0.453，高于该截点值的则可能为心房颤动。对于非心房颤动疾病(室性早搏患者和室上性心动过速患者)与心房颤动疾病，该小分子脂质组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.831，灵敏度为83.7％，特异性为71.7％(见表2和图2)。
表3.
Figure BDA0002982462500000102
实施例2
1.血浆样本收集
所有纳入研究的志愿者在血浆样品采集前均签署了知情同意书。在相同条件下于抗凝管中收集36例心房颤动患者，10例室性早搏患者和18例室上性心动过速患者的血样，采集后4500rpm/min离心5分钟后，然后取血浆，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
2.分析方法
同实施例1
3.血浆测试结果及辅助诊断方法
脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1在非心房颤动组(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动组中的相对含量如图1(验证集)和表4。
表4.非心房颤动组(室性早搏患者和室上性心动过速患者)和心房颤动中脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1的相对含量
Figure BDA0002982462500000111
/>
Figure BDA0002982462500000121
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Figure BDA0002982462500000131
/>
Figure BDA0002982462500000141
将代谢物的相对浓度分别代入实施例1中所得二元逻辑回归方程并采用实施例1中所得截止值进行诊断效果判别。对于非心房颤动疾病(室性早搏和室上性心动过速)与心房颤动疾病，该小分子脂质组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。AUC＝0.745，灵敏度为77.8％，特异性为67.9％(见表3和图2)。
表5.
Figure BDA0002982462500000142
第二批验证结果与第一批发现的结果基本吻合。脂肪酸(FA)23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC)20:5和磷脂酰肌醇(PI)16:0_18:1作为联合标志物用于诊断受试者中的心房颤动疾病，其灵敏度和特异性均较好。本发明所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点，具有较好的开发应用的价值。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (6)

1.一种用于诊断心律失常受试者中心房颤动患者的联合标志物，所述联合标志物由脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI) 16:0_18:1组成。
2.一种诊断心律失常受试者中心房颤动患者的诊断试剂盒，
（1）标准化学品：脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI)16:0_18:1，所述标准化学品分别用于对应的血浆中小分子脂质代谢物脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI) 16:0_18:1的定性，浓度为5~20 μg/mL；
（2）含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血浆样品，为包含0.42~0.7 μg/mLD3-脂肪酸 (FA) 18:0和0.16~0.4 μg/mL溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 19:0的两种内标的异丙醇溶液。
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，还包括洗脱液，为：流动相A为包含8.5~11.5 mM乙酸铵的55%~65%乙腈水溶液；流动相B为包含8.5~11.5 mM乙酸铵的85%~95%异丙醇乙腈溶液。
4. 一种权利要求1所述的联合标志物在制备用于诊断心律失常受试者中心房颤动患者的诊断试剂或试剂盒中的应用，所述联合标志物由脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱(LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI) 16:0_18:1组成。
5. 根据权利要求4所述的应用，所述的诊断试剂或试剂盒为包括采用液相色谱-质谱联用仪检测受试者血浆中脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇(PI) 16:0_18:1的相对浓度的试剂的组合。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述的采用液相色谱-质谱联用仪检测受试者血浆中脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI) 16:0_18:1的相对浓度的试剂包括：
（1）标准化学品：脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI)16:0_18:1，所述标准化学品分别用于对应的血浆中小分子脂质代谢物脂肪酸 (FA) 23:0、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 20:5和磷脂酰肌醇 (PI) 16:0_18:1的定性，浓度为5~20 μg/mL；
（2）含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血浆样品，为包含0.42~0.7 μg/mL D3-脂肪酸 (FA) 18:0和0.16~0.4 μg/mL溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 19:0的两种内标的异丙醇溶液；
（3）洗脱液：流动相A为包含10 mM乙酸铵的60% v/v 乙腈水溶液；流动相B为包含10 mM乙酸铵的90% v/v 异丙醇乙腈溶液。
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