CN104364658B - 用于诊断慢性瓣膜疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断动物慢性瓣膜疾病的方法。这些方法包括从动物获得生物样品；分析样品中一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；以及如果动物样品中发现的代谢物高于或低于对照动物样品中存在的含量，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病。

Description

用于诊断慢性瓣膜疾病的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年6月5日提交的美国临时申请No.61/655704的优先权，将其公开内容全部按引用并入本文中。
发明背景
发明领域
本发明总地涉及用于诊断慢性瓣膜疾病的方法，并且特别涉及通过测量与慢性瓣膜疾病相关的代谢物来诊断慢性瓣膜疾病的方法。
相关技术的描述
心脏病是一种最常见的动物疾病，包括如狗的动物。大约11％的狗患有心脏病，其中95％具有成年发作。三分之一的年龄为10岁或更大的狗具有慢性瓣膜疾病(CVD)。CVD的特征在于房室瓣的渐进性变性和变形，最常见的是二尖瓣，导致早期二尖瓣闭锁不全。这反过来导致出现由于二尖瓣反流而引起的心脏收缩杂音，其中二尖瓣不适当的闭合引起血液回流至左心房。受影响的狗最终发展成左房室容积超负荷、肺水肿、心房扩张和室上心律失常。
尽管受影响瓣膜的外科手术或药物治疗是可能的，但优选通过动物护理者和健康专家的营养干预。早期检测和治疗是必要的。然而，由于缺乏症状，检测可能是困难的。
当动物呈现出最小症状或无症状时，与特定疾病或病症相关的生物标记物对于检测这样的疾病或病症或用于诊断这样的疾病或病症是有用的。在许多情况中，代谢物是有用的生物标记物。然而，目前不存在已知的用作测量动物慢性瓣膜疾病的诊断剂的生物标记物。因此，对用于诊断动物慢性瓣膜疾病的生物标记物存在需求。这样的生物标记物将能够使动物护理者或健康专家提供最合适且有效水平的治疗，例如，在可能时避免外科手术。这样的治疗将提高动物的生活质量。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于诊断动物慢性瓣膜疾病的方法。
使用涉及以下步骤的用于诊断动物慢性瓣膜疾病的方法实现了这个和其他目的，所述方法涉及从动物获得生物样品；分析样品中一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；以及如果动物样品中发现的代谢物高于或低于对照动物样品中存在的相同代谢物的含量，根据特定的代谢物以及是否已知样品中这样的代谢物的含量在患有慢性瓣膜疾病的动物中是提高的或已知在患有慢性瓣膜疾病的动物中是降低的，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病。
本发明的其他和更多目的、特征和优势将是本领域技术人员显而易见的。
发明详述
定义
术语“动物”表示任何易感染或患有慢性瓣膜疾病的动物。
术语“代谢物”或“生物标记物”表示可以用作标记物来诊断病状的小分子，测量其在生物样品中的水平或强度。
术语“可比较对照动物”表示相同物种和类型的动物或在两个不同时间评价的个体动物。
术语“诊断”表示确定动物是否患有慢性瓣膜疾病或预测是否动物易于产生慢性瓣膜疾病。
如本文中所用的，本文中所用的范围是速记的，以避免必须列出和描述范围内的每个值。视情况而定，可以选择范围内任何合适的值作为上方值，下方值，或范围的端值。
如本文中所用的，词语的单数形式包括复数，并且反之亦然，除非文中明确另外表示。因此，关于“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”通常包含各自术语的复数。例如，提及的“一种方法”包括多种这样的“方法”。相似地，包含性地解释词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising”)，而不是排他性地解释。同样，术语“包括(include)”、“包括(including)”和“或”应当全部解释为包含性的，除非这样的解释从文中明确禁止。
本文公开的方法和组合物和其他进展不限于本文中所述的特定方法、实验方案和试剂，因为如本领域技术人员所知的，它们可以改变。此外，本文中所用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，而不是用来并且没有限制所公开的或所要求的范围。
除非另外限定，本文中所用的所有技术和科学术语、专门术语和首字母缩写词具有本发明领域中或术语使用领域中普通技术人员通常理解的含义。
本文中所述或所提及的所有专利、专利申请、出版物、技术和/或学术论文以及其他参考文献全部按引用并入本文中至法律允许的程度。确定那些参考文献的讨论只是用于概述其中形成的主张。并未认可任何这样的专利、专利申请、出版物或参考文献，或其任何部分，是相关的、实质性的或现有的技术。特意保留挑战这些专利、专利申请、出版物和其他参考文献的任何主张作为相关的、实质性的或现有技术的准确性和相关性的权利。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了用于诊断动物慢性瓣膜疾病的方法。所述方法包括从动物获得生物样品；分析样品中一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；以及如果动物样品中发现的代谢物高于或低于对照动物样品中存在的含量，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病。已知这样的样品中一些代谢物的含量或浓度在患有慢性瓣膜疾病的动物中是提高的，同时已知这样的样品中一些代谢物的含量或浓度在患有慢性瓣膜疾病的动物中是降低的。可以只基于如所述的已知含量提高的代谢物、只基于如所述的已知含量降低的代谢物，或其组合物来形成诊断。
在各种实施方案中，所述方法包括从动物获得生物样品；分析样品中两种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；以及如果动物样品中发现的代谢物低于对照动物样品中存在的含量、高于对照动物样品中存在的含量，或其组合，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病。
本发明是基于如下发现：本发明的代谢物存在于动物的生物样品中并且通过表示或预测用于慢性瓣膜疾病的阈值，将样品中代谢物的含量用作用于诊断慢性瓣膜疾病的生化指标。本发明允许护理者和兽医或其他健康护理专家在样品中进行针对这些“生物标记物”的测试，并且确定动物是否易感染或患有慢性瓣膜疾病以及是否存在进一步诊断或治疗的需求。已经确定了进一步诊断或治疗的需求后，判断这样的进一步诊断或治疗的成本和风险。
在多种实施方案中，评价一个或多个可比较对照动物的至少一种代谢物并且将这样的评价结果用作基线，用于与来自评价这样的一种或多种代谢物的动物的结果进行比较，所述对照动物不是针对慢性瓣膜疾病进行评价的动物并且已经确定未患有慢性瓣膜疾病。在优选的实施方案中，通过评价多个可比较对照动物来确定代谢物的基线。
在其他实施方案中，在动物整个生命的不同时间测定动物的至少一种代谢物的含量，并且将结果用于确定动物是否易感染或患有慢性瓣膜疾病，例如，如果这样的至少一种代谢物的含量随着动物年龄提高或降低(在适当的情况中，对于分析的特定生物标记物，取决于是否已知这样的生物标记物的含量随着动物产生慢性瓣膜疾病而提高或降低)，可以将动物诊断为易感染或患有慢性瓣膜疾病。在优选的实施方案中，周期性地评价动物，并且记录所分析的代谢物的结果。然后，如果随后的评价显示自从最后的评价以来一种或多种代谢物的含量提高或降低(在适当的情况中，对于分析的特定生物标记物，取决于是否已知这样的生物标记物的含量随着动物产生慢性瓣膜疾病而提高或降低)，将动物诊断为易感染或患有慢性瓣膜疾病。
任何含有目标代谢物的生物样品在本文中是有用的。实例包括，但不限于，血液(血清/血浆)、脑脊髓液(CSF)、尿液、粪便、呼气、唾液或任何组织的活检样品。在一个实施方案中，样品是血清样品。尽管术语“血清”用于本文中，本领域技术人员将认识到也可以使用血浆或全血或全血的子部分。
使用本领域已知的用于这样的代谢物的任何合适方法来分析生物样品中的特定代谢物。例如，并且不希望以任何方式限制，生物样品的提取物能够接受基本上任何质谱平台上的分析，通过直接注射或色谱分离后。典型的质谱仪由其将样品内的分子离子化的来源和用于检测电离分子或分子片段的检测仪组成。常用来源的非限制性实例包括电子冲击、电子喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)、基质辅助激光解析电离(MALDI)、表面增强激光解析电离(SELDI)，及其衍变。常见的质谱分离和检测系统可以包括四级、四级离子阱、线性离子阱、飞行时间(TOF)、扇形磁场、离子回旋加速器(FTMS)、轨道离子阱，及其衍变和组合。FTMS优于其他基于MS的平台的优势是其高分辨力，允许分离差异只在数百道尔顿的代谢物，许多这样的将被较低分辨的仪器错过。
在优选的实施方案中，当所需的方法是高通量方法时，使用液相色谱质谱(LC-MS)、气相色谱质谱(GC-MS)或液相色谱和线性离子阱质谱，分析生物样品的选定代谢物(生物标记物)。
尽管使用一种代谢物对于诊断慢性瓣膜疾病就足够了，但使用一种或多种，两种或多种，三种或多种，或四种或多种这样的代谢物包括在本发明内，并且在许多情况中，这是优选的。可以分析代谢物，并且以任意组合用于诊断。
在一些实施方案中，诊断是基于确定一种或多种代谢物的含量，所述代谢物选自谷氨酸盐、C-糖基色氨酸、β-羟基异戊酸盐、氧化的谷胱甘肽、赤藓糖酸盐(erythronate)、N-乙酰神经氨酸盐(N-acetylneuraminate)、乳酸盐、顺-乌头酸盐、琥珀酰肉碱、苹果酸盐、戊癸酸盐(15:0)、十七酸盐(17:0)、棕榈酸甲盐(15或2)、12-HEPE、己酰基肉碱(hexanoylcarnitine)、甘油磷酰胆碱、1-硬脂酰甘油-磷酸肌醇、N6-氨基甲酰苏氨酰腺苷、胞苷、泛酸盐、N-羟乙酰神经氨酸盐、X-11400、X-12729、X-13422、X-13543、X-14272、X-16277、12-HETE和凝血噁烷B2、肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、β-羟基丙酮酸盐、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、γ-谷氨酰甲硫氨酸、葡萄糖、2-羟基辛酸酯、脱氧肉碱、1-棕榈油酰基甘油胆碱磷酸、1-油酰基甘油胆碱磷酸、2-油酰基甘油胆碱磷酸、1-亚麻酰基甘油胆碱磷酸(linoleoylglycerophosphocholine)、2-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、1-二十碳二烯酰基甘油胆碱磷酸、1-花生酰基甘油磷酸胆碱、1-docosapentaenoyl甘油磷酸胆碱、4-羟基扁桃酸酯、X-03088、X-04357、X-11793、X-11818、X-12771、X-12786和X-13494。
在其他实施方案中，诊断是基于确定动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量与对照动物样品中存在的含量相比是否提高的，其中所述代谢物是谷氨酸盐、C-糖基色氨酸、β-羟基异戊酸盐、氧化的谷胱甘肽、赤藓糖酸盐、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、顺-乌头酸盐、琥珀酰肉碱、苹果酸盐、戊癸酸盐(15:0)、十七酸盐(17:0)、棕榈酸甲盐(15或2)、12-HEPE、己酰基肉碱、甘油磷酰胆碱、1-硬脂酰甘油-磷酸肌醇、N6-氨基甲酰苏氨酰腺苷、胞苷、泛酸盐、N-羟乙酰神经氨酸盐(N-glycolylneuraminate)、X-11400、X-12729、X-13422、X-13543、X-14272、X-16277、12-HETE和凝血噁烷B2。在优选的实施方案中，诊断是基于确定动物样品中发现的每种这样的代谢物含量与对照动物样品中存在的含量相比是否是提高的，其中代谢物是氧化的谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、琥珀酰肉碱、己酰基肉碱、12-HETE和凝血噁烷B2。
在一个实施方案中，诊断是基于确定动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量与对照动物样品中存在的含量相比是否是降低的，其中所述代谢物是肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、β-羟基丙酮酸盐、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、γ-谷氨酰甲硫氨酸、葡萄糖、2-羟基辛酸酯、脱氧肉碱、1-棕榈油酰基甘油胆碱磷酸、1-油酰基甘油胆碱磷酸、2-油酰基甘油胆碱磷酸、1-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、2-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、1-二十碳二烯酰基甘油胆碱磷酸、1-花生酰基甘油磷酸胆碱、1-docosapentaenoyl甘油磷酸胆碱、4-羟基扁桃酸盐、X-03088、X-04357、X-11793、X-11818、X-12771、X-12786和X-13494。在优选的实施方案中，诊断是基于确定动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量与对照动物样品中存在的含量相比是否是降低的，其中所述代谢物是二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、葡萄糖和脱氧肉碱。
在各种实施方案中，动物是犬科动物，如狗。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，尽管将理解包括这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围，除非另外特意指出。
实施例1
研究设计。从两个代表性组的犬科动物获取血清样品。对照组(11)显示出没有心脏病的体征，而另一组由之前已经诊断为心脏病的患者(18)组成。分析样品，以获得代谢谱并且针对表示心脏病的生物标记物来分析数据。
样品制备。将所有样品维持在-80℃，直至处理。使用自动化MicroLab系统(Hamilton Company，Reno，NV)进行样品制备过程。在提取过程中的第一个步骤之前，添加收集标准，用于质量控制的目的。使用一系列有机溶剂和水提取剂来除去蛋白质级分同时允许小分子的最大收集，从而来进行样品制备。将所得到的提取物分成两部分；一部分用于通过液相色谱(LC)的分析，一部分用于通过气相色谱(GC)的分析。将样品在(Zymark，Claiper Life Science，Hopkinton，MA)上短暂放置，以除去有机溶剂。然后将每种样品在真空下冷冻并干燥。然后制备样品，用于合适的仪器，LC/MS或GC/MS。
液相色谱/质谱(LC/MS，LC/MS2)：平台的LC/MS部分是基于Waters ACQUITY UPLC和Thermo-Finnigan LTQ质谱仪(Thermo Fisher Corporation，Waltham，MA)，其由电喷雾电离(ESI)源和内离子阱(LIT)质谱分析仪组成。将样品提取物分成两个等份，干燥，然后在酸性或碱性LC-相容溶剂中重构，所述溶剂各自含有11或更多种固定浓度的注射标准品。使用分开的专门柱，在两个独立的注射中，使用酸性正离子优化条件分析了一个等份，使用碱性负离子优化条件分析了另一个等份。使用都含有0.1％甲酸的水和甲醇梯度洗脱酸性条件中重构的提取物，而碱性提取物，其也使用含有6.5mM碳酸氢铵的水/甲醇洗脱。使用动态排除，在MS和数据依赖性MS2扫描之间交替MS分析。
气相色谱/质谱(GC/MS)：将计划用于GC/MS分析的样品在真空干燥下重新干燥最少24小时，然后使用双三甲基-甲硅烷基-三氟乙酰胺(BSTFA)在干燥的氮下衍化。GC柱是5％苯基，并且温度在16分钟的时间段内从40℃升至300℃。使用电子冲击电离，在Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四级质谱仪(Thermo Fisher Corporation，Waltham，MA)上分析了样品。为了质谱分辨率和质谱准确性，每天将仪器微调并校准。按照以下所述的，自动提取来自原始数据文件的信息输出。
准确的质谱测定和MS/MS分段(LC/MS)、(LC/MS/MS)：平台的LC/MS部分是基于Waters ACQUITY UPLC和Thermo-Finnigan LTQ-FT质谱仪(Thermo Fisher Corporation，Waltham，MA)，其具有线性离子阱(LIT)前端和傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪后端。对于计数高于2百万的离子，可以进行精确的质量测量。可以对母离子以及片段进行精确的质量测量。典型的质量误差小于5ppm。计数小于两百万的离子需要更大的努力来表征。分段谱(MS/MS)通常以数据依赖性方式产生，但如果需要，可以使用靶向的MS/MS，如在较低水平信号的情况中。
生物信息学：信息学系统由四个主要组成部分组成，实验室信息管理系统(LIMS)、数据提取和峰鉴定软件，用于QC和化合物鉴定的数据加工工具，以及数据分析家使用的信息解释和观察的工具集合。用于这些信息学组成部分的硬件和软件基础是LAN中枢，以及运行Oracle10.2.0.1Enterprise版本的数据库服务器。
LIMS：LIMS系统的目的是能够通过安全、易于使用和高度专门化的系统使得全面可审查的实验室自动化。LIMS系统的范围包括样品添加、样品制备以及仪器分析和报告，和高级数据分析。所有的后续软件系统都接入(grounded)LIMS数据结构。已经进行了改进来影响和连接内部信息提取和数据观察系统以及第三方使用仪器和数据分析软件。
数据提取和质量保证：原始质谱数据文件的数据提取产生了可以存入相关数据库和操作的信息，没有采取BLOB操作。一旦在数据库中，检查信息并且强加合适的QC限制。使用峰整合软件鉴定峰，并且在分开和特意设计的复杂数据结构中储存组成部分。
化合物鉴定：通过与纯化标准品的文库实体或重复出现的未知实体的比较来鉴定化合物。已知化学实体的鉴定是基于与纯化标准品的代谢文库实体的比较。色谱性能和质谱的组合产生了与特定化合物或同量异序的实体匹配的指示。可以通过重复出现的性质来鉴定其他实体(色谱和质谱)。这些化合物具有通过将来获取匹配纯化的标准品或通过传统结构分析来得到鉴定的潜能。
结果。研究中检测的代谢物的总数是506。存在320个命名的化合物和186个未命名的化合物。未命名的化合物表示分立的分子式和结构的单个分子，但不能与目前命名的生物化学分子匹配。在鉴定的506个代谢物中，发现54个是统计学显著的(p≤0.05)。表1中鉴定了统计学显著的代谢物。
表1
在说明书中，已经公开了本发明的典型优选实施方案。尽管使用了特定的术语，只是以一般和描述性含义来使用，并且不是为了限制的目的。本发明的范围列于权利要求中。显然，根据以上教导，本发明的许多改变和变化是可能的。因此，将理解在所附权利要求的范围内，可以以特意描述以外的其他方式来实施本发明。

Claims (18)

1.检测一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂在诊断易感染或患有慢性瓣膜疾病的动物的慢性瓣膜疾病的方法中使用，其中所述方法包括：
从易感染或患有慢性瓣膜疾病的动物获得血液、尿液、粪便或唾液样品；
分析样品中一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；
将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；和
如果动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量高于对照动物样品中存在的含量，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病，
其中代谢物是谷氨酸盐、C-糖基色氨酸、β-羟基异戊酸盐、氧化的谷胱甘肽、赤藓糖酸盐、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、顺-乌头酸盐、琥珀酰肉碱、苹果酸盐、戊癸酸盐(15:0)、十七酸盐(17:0)、棕榈酸甲盐(15或2)、12-HEPE、己酰基肉碱、甘油磷酰胆碱、1-硬脂酰甘油磷酸肌醇、N6-氨基甲酰苏氨酰腺苷、胞苷、泛酸盐、N-羟乙酰神经氨酸盐、X-11400、X-12729、X-13422、X-13543、X-14272、X-16277、12-HETE和凝血噁烷B2。
2.权利要求1的用途，其中样品是血清样品。
3.权利要求1的用途，其中诊断是基于确定两种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
4.权利要求1的用途，其中诊断是基于三种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
5.权利要求1的用途，其中诊断是基于四种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
6.权利要求1的用途，其中代谢物是氧化的谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、琥珀酰肉碱、己酰基肉碱、12-HETE和凝血噁烷B2。
7.权利要求1的用途，其中动物是犬科动物。
8.权利要求1的用途，其中动物是狗。
9.检测一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂在诊断易感染或患有慢性瓣膜疾病的动物的慢性瓣膜疾病的方法中使用，其中所述方法包括：
从易感染或患有慢性瓣膜疾病的动物获得血液、尿液、粪便或唾液样品；
分析样品中一种或多种与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；
将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；和
如果动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量低于对照动物样品中存在的含量，使用所述比较来诊断动物的慢性瓣膜疾病，
其中代谢物是肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、β-羟基丙酮酸盐、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、γ-谷氨酰甲硫氨酸、葡萄糖、2-羟基辛酸酯、脱氧肉碱、1-棕榈油酰基甘油胆碱磷酸、1-油酰基甘油胆碱磷酸、2-油酰基甘油胆碱磷酸、1-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、2-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、1-二十碳二烯酰基甘油胆碱磷酸、1-花生酰基甘油磷酸胆碱、1-docosapentaenoyl甘油磷酸胆碱、4-羟基扁桃酸盐、X-03088、X-04357、X-11793、X-11818、X-12771、X-12786和X-13494。
10.权利要求9的用途，其中样品是血清样品。
11.权利要求9的用途，其中诊断是基于确定两种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
12.权利要求9的用途，其中诊断是基于三种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
13.权利要求9的用途，其中诊断是基于四种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的含量。
14.权利要求9的用途，其中代谢物是二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、葡萄糖和脱氧肉碱。
15.权利要求9的用途，其中动物是犬科动物。
16.权利要求9的用途，其中动物是狗。
17.检测两种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的试剂在制备用于诊断犬科动物慢性瓣膜疾病的方法的诊断剂中的用途，其中所述方法包括：
从犬科动物获得血液、尿液、粪便或唾液样品；
分析样品中两种以上与慢性瓣膜疾病相关的代谢物的存在；
将样品中鉴定的每种这样的代谢物的含量与来自未患慢性瓣膜疾病的一个或多个可比较对照犬科动物的样品中存在的相同代谢物的相应含量进行比较；和
如果犬科动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量低于对照犬科动物样品中存在的含量则使用所述比较来诊断犬科动物的慢性瓣膜疾病，其中代谢物是肌氨酸(N-甲基甘氨酸)、β-羟基丙酮酸盐、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、γ-谷氨酰甲硫氨酸、葡萄糖、2-羟基辛酸酯、脱氧肉碱、1-棕榈油酰基甘油胆碱磷酸、1-油酰基甘油胆碱磷酸、2-油酰基甘油胆碱磷酸、1-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、2-亚麻酰基甘油胆碱磷酸、1-二十碳二烯酰基甘油胆碱磷酸、1-花生酰基甘油磷酸胆碱、1-docosapentaenoyl甘油磷酸胆碱、4-羟基扁桃酸盐、X-03088、X-04357、X-11793、X-11818、X-12771、X-12786和X-13494；如果犬科动物样品中发现的每种这样的代谢物的含量高于对照犬科动物样品中存在的含量则使用所述比较来诊断犬科动物的慢性瓣膜疾病，其中代谢物是谷氨酸盐、C-糖基色氨酸、β-羟基异戊酸盐、氧化的谷胱甘肽、赤藓糖酸盐、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、顺-乌头酸盐、琥珀酰肉碱、苹果酸盐、戊癸酸盐(15:0)、十七酸盐(17:0)、棕榈酸甲盐(15或2)、12-HEPE、己酰基肉碱、甘油磷酰胆碱、1-硬脂酰甘油磷酸肌醇、N6-氨基甲酰苏氨酰腺苷、胞苷、泛酸盐、N-羟乙酰神经氨酸盐、X-11400、X-12729、X-13422、X-13543、X-14272、X-16277、12-HETE和凝血噁烷B2或其组合。
18.权利要求17的用途，其中所述代谢物是二甲基精氨酸(SDMA+ADMA)、葡萄糖、脱氧肉碱、氧化的谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸盐、乳酸盐、琥珀酰肉碱、己酰基肉碱、12-HETE、凝血噁烷B2或其组合。
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