JP6763770B2 - 自閉症スペクトラム障害のバイオマーカー - Google Patents

Description

継続性出願のデータ
本出願は、２０１３年７月９日出願の米国仮特許出願第６１／８４４，１２８号明細書および２０１４年５月１４日出願の米国仮特許出願第６１／９９６，８３５号明細書（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。

自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会性障害、言語および非言語コミュニケーション障害、ならびに繰返し動作または限局的興味により特徴付けられる終生神経発達障害である（たとえば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（２０１３）Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ＤＳＭ−５，５ｔｈ ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを参照されたい）。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）の自閉症発達障害モニタリング（ＡＤＤＭ）ネットワークの推定によれば、６８名中約１名の子供は、自閉症スペクトラム障害を有していると同定される（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，２０１４，ＭＭＷＲ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ Ｓｕｍｍ；６３：１−２１）。現在の臨床診断プロセスは、発達歴の確立および行動特性の評価、たとえば、スピーチ能力、言語能力、知的能力、および教育達成または職業達成を含む。患者は、行動テストを介して２歳で確実に診断可能である。しかしながら、さまざまな理由で、診断の平均年齢は４．５歳である。可能なかぎり若い年齢でＡＳＤを検出することは、最適な有効介入を開始するうえで重要であり、かつ患者および家族のより良好なアウトカムをもたらすという認識が高まってきている（Ｐａｙａｋａｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓ；１２：４８５−５０３およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１３，Ｊ Ａｐｐｌ Ｒｅｓ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｄｉｓａｂｉｌ；２６：８１−１０７）。可能なかぎり若い年齢でＡＳＤの子供の個別化治療を確立すれば、より高レベルの認知機能および社会的機能、ならびにコミュニケーションの向上、さらには家族にかかる金銭的負担および情動的負担の減少を含めて、アウトカムが改善される（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ；１２５：ｅ１７−２３およびＧａｎｚ，２００７，Ａｒｃｈ Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｍｅｄ；１６１：３４３−３４９）。したがって、若い年齢でＡＳＤ診断のリスク評価を支援するための生物学ベースの血液テストを開発すれば、できるかぎり若い年齢で集中的行動療法を実現することが容易になり、患者、家族、および医療提供者に有益であろう。

本発明は、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法を含み、本方法は、
ａ）ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｂ）ＧＣＭＳにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｃ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＧＣＭＳによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｄ）１つ以上の非標的化液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析法（ＬＣ／ＨＲＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｅ）１つ以上の非標的化ＬＣ／ＨＲＭＳ法により１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｆ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される１つ以上の非標的化ＬＣ／ＨＲＭＳ法によりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｇ）工程ｃ）および工程ｆ）により同定された複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
ｈ）対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程と、
を含み、
工程ｈ）の低分子のサブセットは、ヒトにおいて自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

本発明に係る方法のいくつかの態様では、１つ以上の非標的化液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析法（ＬＣ／ＨＲＭＳ）によりバイオサンプルをアッセイする工程は、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）によりバイオサンプルをアッセイする工程を含む。

本発明は、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法を含み、本方法は、
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ＧＣ−ＭＳ、Ｃ８ｐｏｓ、Ｃ８ｎｅｇ、ＨＩＬＩＣｐｏｓ、および／またはＨＩＬＩＣｎｅｇから選択される同一の２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
２つ以上の手法のそれぞれについて非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
２つ以上の手法のそれぞれにより同定された非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離されたバイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程と、
を含み、
対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離されたバイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子のサブセットは、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

いくつかの態様では、バイオサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される３つ以上の手法によりアッセイされる。

いくつかの態様では、バイオサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される４つ以上の手法によりアッセイされる。

いくつかの態様では、バイオサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）によりアッセイされる。

本発明は、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法を含み、本方法は、
ａ）ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｂ）ＧＣＭＳにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｃ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＧＣＭＳによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｄ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｅ）Ｃ８ｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｆ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｇ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｈ）Ｃ８ｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｉ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｊ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｋ）ＨＩＬＩＣｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｌ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｍ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｎ）ＨＩＬＩＣｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｏ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｐ）工程ｃ）、工程ｆ）、工程Ｉ）、工程ｌ）、および工程ｏ）により同定された複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
ｑ）対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程と、
を含み、
工程ｑ）の低分子のサブセットは、ヒトにおいて自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

いくつかの態様では、対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットは、単変量解析、多変量解析、機械学習解析、サポートベクターマシン解析（ＳＶＭ）、および／または部分最小二乗解析（ＰＬＳ）によりトレーニングセットから選択される。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、低分子代謝物は、約１０ダルトン〜約３０００ダルトンの分子量を有しうる。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、バイオサンプルは、脳脊髄液、脳組織、羊水、血液、血清、血漿、羊水、または尿でありうる。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、バイオサンプルは血漿でありうる。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、表６に列挙された１７９種の代謝物のうちの１種以上を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、表６に列挙された代謝物のうちの少なくとも４０種を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、表６に列挙された代謝物のうちの約８０〜約１６０種を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパルテート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物を含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症の代謝シグネチャーは、ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加を示しうる。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーはホモシトルリンを含む。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症のメタボロミックシグネチャーはホモシトルリンの減少を含む。

本発明に係る方法のいずれかは、１種または複数種の細胞代謝物の化学的同一性を決定する工程をさらに含みうる。いくつかの態様では、１種または複数種の細胞代謝物の化学的同一性は、代謝物の分子精密質量または代謝物の質量分析フラグメント化パターンを用いて決定される。

本発明に係る方法のいずれかは、２種以上の低分子代謝物の比を決定する工程をさらに含みうる。

本発明に係る方法のいずれかは、２種以上の低分子代謝物の相対存在量の組合せ評価をさらに含みうる。

本発明に係る方法のいずれかを用いた場合、自閉症被験体自閉症被験体のバイオサンプルは、自閉症被験体の表現型サブ集団から取得され、かつ自閉症のメタボロミックシグネチャーは、自閉症被験体の表現型サブ集団のメタボロミックシグネチャーを含む。いくつかの態様では、自閉症被験体の表現型サブ集団は、低機能自閉症（ＬＦＡ）または高機能自閉症（ＨＦＡ）を含む。

本発明は、以上に記載の方法に従って生成される自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

本発明は、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含み、メタボロミックシグネチャーは、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１個以上の特徴、２個以上の特徴、３個以上の特徴、４個以上の特徴、５個以上の特徴、６個以上の特徴、７個以上の特徴、８個以上の特徴、９個以上の特徴、１０個以上の特徴、１１個以上の特徴、１２個以上の特徴、１３個以上の特徴、１４個以上の特徴、１５個以上の特徴、１６個以上の特徴、１７個以上の特徴、１８個以上の特徴、１９個以上の特徴、２０個以上の特徴または２１個の特徴を含む。

本発明は、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含み、メタボロミックシグネチャーは、２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物を含む。

本発明は、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含み、メタボロミックシグネチャーは、表６に示される特徴のうちの１個以上を含む。

本発明は、表６に列挙された代謝物のうちの少なくとも４０種を含む自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

本発明は、表６に列挙された代謝物のうちの約８０〜約１６０種を含む自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

本発明に係る自閉症のメタボロミックシグネチャーのいくつかの態様では、シグネチャーはホモシトルリンを含みうる。代謝シグネチャーのいくつかの態様では、ホモシトルリンは減少する。

本発明に係る自閉症のメタボロミックシグネチャーのいくつかの態様では、代謝シグネチャーは、高機能自閉症（ＨＦＡ）および／または低機能自閉症（ＬＦＡ）の指標となる。

本発明に係る自閉症のメタボロミックシグネチャーのいくつかの態様では、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパレート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物を含む。

本発明に係る自閉症のメタボロミックシグネチャーのいくつかの態様では、自閉症のメタボロミックシグネチャーは、ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加を含む。

本発明は、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法を含み、本方法は、
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、
表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、
を含み、
表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

本発明は、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法を含み、本方法は、１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含み、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。いくつかの態様では、バイオサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法によりアッセイされる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、表６に列挙された代謝物のうちの少なくとも４０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、表６に列挙された代謝物のうちの約８０〜約１６０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパレート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加は、自閉症の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、非自閉症対照と比較して統計的に有意なホモシトルリンの存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、本方法は、２種以上の低分子代謝物の比を決定する工程をさらに含む。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、本方法は、２種以上の低分子代謝物の相対存在量の組合せ評価をさらに含む。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、バイオサンプルは、脳脊髄液、脳組織、羊水、血液、血清、血漿、羊水、または尿でありうる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、バイオサンプルは血漿でありうる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、被験体は２歳未満である。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、代謝シグネチャーは、自閉症被験体の表現型サブ集団の指標となる。

自閉症に対する被験体のリスクを評価する本発明に係る方法のいくつかの態様では、代謝シグネチャーは、高機能自閉症（ＨＦＡ）および／または低機能自閉症（ＬＦＡ）の指標となる。

本明細書で用いられる用語は、一般的には、本発明に関連する範囲内で各用語が用いられる特定の状況において、当技術分野でのそれらの通常の意味を有する。実施者に本発明の説明に関するさらなるガイダンスを提供するために、いくつかの用語をより具体的に以下に定義した。

「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、列挙された要素の１つもしくはすべてまたは列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。

「好ましい（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」および「好ましくは（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」という語は、特定の状況下で特定の利点を与えうる本発明の実施形態を意味する。しかしながら、同一または他の状況下で、他の実施形態が好ましいこともありうる。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを意味するものでもなければ、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図するものでもない。

「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語およびその変化形は、これらの用語が本明細書および特許請求の範囲に現われた場合、限定的な意味を有するものではない。

とくに明記されていないかぎり、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、同義的に用いられて１つまたは２つ以上を意味する。

また、本明細書では、終点による数値範囲の記載は、その範囲内に入るすべての数値を含む（たとえば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

個別の工程を含む本明細書に開示されたいずれかの方法では、工程は、任意の実現可能な順序で行われうる。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組合せを同時に行いうる。

上記の本発明の概要は、本発明のそれぞれの開示された実施形態またはすべての実現形態について記載することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に示している。本出願全体を通していくつか箇所では、具体例のリストによりガイダンスが提供されるが、具体例は、種々の組合せで使用可能である。いずれの場合も、記載のリストは、代表グループとしての役割を果たすにすぎず、排他的リストとして解釈されるべきものではない。

分類モデリングプロセス。ＰＬＳ−ＤＡモデリング法およびＳＶＭモデリング法の両方を用いて三層ネステッド交差検証法を適用し、ＡＳＤ児とＴＤ児とを分類可能な有意な特徴を決定した。記載のリーブワングループアウト（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｇｒｏｕｐ−ｏｕｔ）交差検証ループを用いて、トレーニングセットの１７９個の特徴を解析した。この交差検証プロセスの結果を用いて、モデル性能の推定およびロバスト特徴ＶＩＰスコア指数の生成を行うことにより、１７９個の特徴のそれぞれのＡＳＤ対ＴＤの分類重要性をランク付けした。これらの特徴ランクを用いて独立検証セットにより分子シグネチャーの性能を評価した。 トレーニングセットおよび検証セットに基づく分類モデルのレシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）の曲線性能。ＡＳＤサンプルとＴＤサンプルとを比較した再帰的特徴削減後の最良性能特徴セットに対する分類器の平均１００回の繰返し。ＰＬＳ（灰色細線）およびＳＶＭ（黒色細線）の線は、最良性能検証特徴サブセットのＲＯＣ曲線である。垂直バーは、平均値の標準誤差を表す。 ＳＶＭモデルおよびＰＬＳモデルの性能。異なる個数の特徴を含有するＳＶＭモデル（図３Ａ）およびＰＬＳモデル（図３Ｂ）の平均ＡＵＣおよび確度。棒グラフは、指定個数の特徴から誘導された最適モデルの数を示している。 特徴重要性のランク付け。ＳＶＭモデリング法とＰＬＳモデリング法との間でランクに関して上位１７９個までの特徴を比較した。最低ランクスコアは、最も重要な特徴を表している。 高機能自閉症（ＨＦＡ）集団と低機能自閉症（ＬＦＡ）集団、自閉症（Ａｕｔ）集団とＨＦＡ集団、および自閉症集団とＬＦＡ集団との間の特徴オーバーラップ。^*特徴は、推定同定（ＰＡＭ）を有する。^**ＩＤは、ＭＳ／ＭＳにより確認される。 ＨＦＡ集団とＬＦＡ集団とＡｕｔ集団との間で共通した５個の生体代謝特徴の、自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体での存在量。 ＬＦＡ集団とＡｕｔ集団との間で共通した３９個の生体代謝特徴のうちの１１個の、自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体での存在量。 ＨＦＡ集団とＡｕｔ集団との間で共通した１３個の生体代謝特徴の、自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体での存在量。 高機能自閉症（ＨＦＡ）集団、低機能自閉症（ＬＦＡ）集団、自閉症（Ａｕｔ）集団、および定型集団での追加の生体代謝特徴の存在量。 すべての分析方法に基づく組合せ特徴。 高機能自閉症（ＨＦＡ）集団対定型発達（Ｔｙｐ）集団、低機能自閉症（ＬＦＡ）集団対Ｔｙｐ集団、ＬＦＡ＋ＬＦＡ集団対Ｔｙｐ集団での特徴Ｍ１９０Ｔ５１２（ホモシトルリン）のＨＩＬＩＣ（＋）分布。 高機能自閉症（ＨＦＡ）集団対定型発達（Ｔｙｐ）集団、低機能自閉症（ＬＦＡ）集団対Ｔｙｐ集団、ＬＦＡ＋ＬＦＡ集団対Ｔｙｐ集団での特徴Ｓ１２３のＧＣＭＳ分布。 自閉症特徴カテゴリー。矢印は、変化倍率の方向を表している。イタリック体は、確認された分子を表している。ボールド体は、ミトコンドリア関連を表している。

本発明は、ヒトにおいて自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）に特有の代謝バイオマーカーを同定する方法を含む。メタボロミクスベースの手法を用いて、定型発達個体と対比して自閉症患者で示差的に産生される複数の代謝バイオマーカーを同定した。複数の高分解能質量分析ベースの技術を用いて、非自閉症対照サンプルと対比して自閉症患者サンプルで示差的に産生される広範にわたる低分子量代謝物を直交測定することにより、サンプルを解析する。これらの個別の代謝物またはそのような代謝物群は、自閉症の代謝シグネチャーとして機能する。そのような代謝シグネチャーは、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する個体を正確に同定するための診断方法で使用される。

バイオサンプルで代謝物のすべてを検出可能な１つの汎用的クロマトグラフィー質量分析技術は存在しないため、本発明では、それぞれ非自閉症対照サンプルと対比して自閉症患者サンプルで示差的に産生される広範にわたる低分子量代謝物を測定する複数の高分解能質量分析ベースの技術を使用する。非自閉症対照サンプルと対比して自閉症患者サンプルで示差的に産生される広範にわたる低分子量代謝物を独立して測定するために、いくつかの既知の高分解能質量分析ベースの技術のいずれかを使用しうる。たとえば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの異なる高分解能質量分析ベースの技術を用いて、サンプルをアッセイしうる。

ある態様では、１つ以上のガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法および／または１つ以上の液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析（ＬＣ−ＨＲＭＳ）法の任意の組合せを使用しうる。いくつかの態様では、ＧＣ−ＭＳ法は標的化されたものでありうる。いくつかの態様では、ＬＣ−ＨＲＭＳ法は標的化されてないものでありうる。続いて、いくつかの実施形態では、代謝物の構造確認のためにタンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）法を利用しうる。ＬＣ−ＨＲＭＳ法は、Ｃ８クロマトグラフィーおよび／または親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを含みうる。Ｃ８クロマトグラフィーまたはＨＩＬＩＣクロマトグラフィーのいずれかは、正イオン極性および負イオン極性の両方でエレクトロスプレーイオン化と組み合わせることにより、１つのサンプルあたり複数のデータを取得しうる。

いくつかの実施形態では、５つの異なるクロマトグラフィー−質量分析ベースの方法、すなわち、ＧＣ−ＭＳ法および４つの非標的化ＬＣ−ＨＲＭＳ法を用いて、サンプルを解析しうる。４つの非標的化ＬＣ−ＨＲＭＳ法は、両方とも正イオン極性および負イオン極性の両方でエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８クロマトグラフィーおよびＨＩＬＩＣクロマトグラフィーを含むことにより、１サンプルあたり４つの個別のデータを取得して血漿で広範にわたる代謝物を直交測定しうる。単変量法、多変量法、および機械学習法を用いて、ＡＳＤ児のサンプルとＴＤ児のサンプルとを識別するバイオマーカーの決定に使用される特徴重要性をランク付けするモデルを開発しうる。単変量解析および多変量解析でサンプルのトレーニングセットを用いて、分類モデルを構築しうる。独立検証セットテストセットとして追加のサンプルを使用しうる。

有意な質量特徴のさまざまな組合せを用いて、統計モデルを生成した。一実施形態では、これらのモデルにより、ＡＳＤサンプルで存在量が変化した１７９個の特徴のセットを発生し、かつこれらの特徴のサブセットにより、８１％の最大確度を有して独立検証セットセットでＡＳＤサンプルとＴＤサンプルとを適正に分類可能であった。

本明細書で用いられる場合、「トレーニングセット」とは、潜在的予測関係を発見するために情報科学の種々の領域で使用されるデータセットのことである。トレーニングセットは、人工知能、機械学習、遺伝的プログラミング、インテリジェントシステム、および統計で使用される。これらすべての分野では、トレーニングセットは、ほぼ同一の役割を有し、多くの場合、テストセットと組み合わせて使用される。

本明細書で用いられる場合、「テストセット」とは、予測関係の強度および有用性を評価するために情報科学の種々の領域で使用されるデータセットのことである。テストセットは、人工知能、機械学習、遺伝的プログラミング、インテリジェントシステム、および統計で使用される。これらすべての分野では、テストセットは、ほぼ同一の役割を有する。

解析時に収集されたデータは、１種または２種以上の代謝物に関して定量されうる。定量データは、サンプル中に存在する特異的代謝物のレベルまたは濃度を測定することにより取得されうる。定量データは、１個または２個以上の参照サンプルの対応するデータと比較されうる。「参照サンプル」とは、特定の疾患状態の任意の好適な参照サンプルのことである。たとえば、参照サンプルは、対照個体、すなわち、ＡＳＤの家族歴を有するまたは有していないＡＳＤ非罹患者（本明細書では「定型発達個体」または「正常」対応個体としても参照される）のサンプルでありうる。参照サンプルはまた、ＡＳＤと臨床診断された患者から取得されたサンプルでありうる。当業者であればわかるであろうが、定量データとの比較のために２個以上の参照サンプルを使用しうる。

本明細書で用いられる場合、「代謝物」または「細胞代謝物」という用語は、サンプル中のレベルまたは濃度が測定されかつ疾患状態を診断するためのマーカーとして使用されうる特異的低分子を意味する。本明細書で用いられる場合、「特徴」という用語は、単一の低分子代謝物または代謝物の断片を意味する。代謝物としては、糖、有機酸、アミノ酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、酸、塩基、脂質、グリコシド、アミン、オキシム、エステル、ジペプチド、トリペプチド、コレステロール、オキシステロール、グリセロール、ステロイド、オリゴペプチド（約１００アミノ酸長未満）、さらにはそれらのイオンフラグメントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様では、代謝物は、約３０００ダルトン未満の分子量である。いくつかの態様では、代謝物は、約１５００ダルトン未満の分子量である。いくつかの態様では、代謝物は、約１０〜約３０００ダルトンの分子量である。いくつかの態様では、代謝物は、約５０〜約３０００ダルトンの分子量である。いくつかの態様では、代謝物は、約１０ダルトン〜約１５００ダルトンの分子量である。いくつかの態様では、代謝物は、約５０ダルトン〜約１５００ダルトンの分子量である。

本明細書で用いられる場合、「バイオマーカー」または「代謝バイオマーカー」という用語は、罹患と対照との間で統計的に有意な変化を呈する代謝物を意味する。

本明細書で用いられる「代謝シグネチャー」および「バイオマーカープロファイル」という用語は、本発明に係る方法により同定される１種または複数種の代謝物を意味する。自閉症の代謝シグネチャーとは、自閉症患者のバイオ流体で有意に変化して自閉症スペクトラム障害の分子フィンガープリントを提供する細胞代謝物の集団のことである。そのような自閉症の代謝シグネチャーは、個体において自閉症を診断するために使用されうる。

本発明は、自閉症個体のバイオ流体中の代謝物を同定する方法を提供する。前記代謝物は、患者の組織またはバイオ流体で示差的に分泌されることが本明細書に記載の方法を用いて見いだされる。これらの代謝物は、非自閉症個体と比較して自閉症個体でより多量またはより少量のいずれかで見いだされうる。したがって、本発明は、ＡＳＤの診断のための血液テストを含む。ＡＳＤは、社会的相互作用障害、コミュニケーション障害、および繰返し行動または常同行動により特徴付けられる終生神経発達障害であり、最近、有病率の劇的増加が見られるようになってきており、推定で学齢児５０名中１名に達する。より初期の診断および治療は、最適治療アウトカムに重要である。本発明に係る血液テストは、より若い年齢で実施可能であるため、ＡＳＤ児でより初期の治療的介入およびより良好なアウトカムに劇的影響を及ぼすであろう。

代謝バイオマーカーは、それら特有の分子質量および濃度により同定されうるため、バイオマーカーに対応する根底にある化合物の実際の同一性は、本発明の実施に必要とされない。バイオマーカーは、たとえば、質量分析を用いて、たとえば、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高性能液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分光測定、タンデム質量分析（たとえば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、および／またはイオン移動度分光測定（たとえば、ＧＣ−ＩＭＳ、ＩＭＳ−ＭＳ、ＬＣ−ＩＭＳ、ＬＣ−ＩＭＳ−ＭＳなど）を用いて、同定されうる。代替として、特定のバイオマーカーは、たとえば、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン解析、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含めて、遺伝子発現解析により同定可能である。

いくつかの態様では、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法は、以下の工程、すなわち、
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ＧＣ−ＭＳ、Ｃ８ｐｏｓ、Ｃ８ｎｅｇ、ＨＩＬＩＣｐｏｓ、および／またはＨＩＬＩＣｎｅｇから選択される同一の２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
２つ以上の手法のそれぞれについて非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
２つ以上の手法のそれぞれにより同定された非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離されたバイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程と、
のうちの１つ以上を含みうるとともに、
対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離されたバイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子のサブセットは、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

いくつかの態様では、バイオサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）の手法のうちの３つ以上、４つ以上、または５つすべてによりアッセイされる。

いくつかの態様では、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法は、以下の工程、すなわち、
ａ）ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｂ）ＧＣＭＳにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｃ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＧＣＭＳによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｄ）１つ以上の非標的化液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析法（ＬＣ／ＨＲＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｅ）１つ以上の非標的化ＬＣ／ＨＲＭＳ法により１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｆ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される１つ以上の非標的化ＬＣ／ＨＲＭＳ法によりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｇ）工程ｃ）および工程ｆ）により同定された複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
ｈ）対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程と、
のうちの１つ以上を含みうるとともに、
工程ｈ）の低分子のサブセットは、ヒトにおいて自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む。

いくつかの態様では、１つ以上の非標的化液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析法（ＬＣ／ＨＲＭＳ）によりバイオサンプルをアッセイする工程は、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）によりバイオサンプルをアッセイする工程を含む。

本発明は、以下の工程、すなわち、
ａ）ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｂ）ＧＣＭＳにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｃ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＧＣＭＳによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｄ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｅ）Ｃ８ｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｆ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｇ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｈ）Ｃ８ｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｉ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｊ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｋ）ＨＩＬＩＣｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｌ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｍ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｎ）ＨＩＬＩＣｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｏ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｐ）工程ｃ）、工程ｆ）、工程Ｉ）、工程ｌ）、および工程ｏ）により同定された複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
ｑ）対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットをトレーニングセットから選択する工程であって、工程ｑ）の低分子のサブセットがヒトにおいて自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む、工程と、
を含む、ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法を含む。

本明細書に明示された代謝物は、本明細書に記載の方法のいずれかに加えて、代替的な分光測定法または当技術分野で公知の他の方法を用いて、検出可能である。

ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する本発明に係る方法のいくつかの態様では、対照の非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離されたバイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットは、単変量解析、多変量解析、機械学習解析、サポートベクターマシン解析（ＳＶＭ）、および／または部分最小二乗解析（ＰＬＳ）によりトレーニングセットから同定されうる。

本発明は、以上に記載の方法に従って生成される自閉症のメタボロミックシグネチャーを提供する。そのようなシグネチャーは、自閉症のバイオマーカーとして、本明細書に記載の代謝物のうちのいずれかを単独で、集団で、または任意の有益な組合せで含みうる。

たとえば、いくつかの態様では、自閉症の代謝シグネチャーは、表６に列挙された１７９種の代謝物のうちの任意の１種以上を含みうる。たとえば、表６に列挙されたうちの、少なくとも約５種以上の代謝物、少なくとも約１０種以上の代謝物、少なくとも約２０種以上の代謝物、少なくとも約３０種以上の代謝物、少なくとも約４０種以上の代謝物、少なくとも約５０種以上の代謝物、少なくとも約６０種以上の代謝物、少なくとも約７０種以上の代謝物、少なくとも約８０種以上の代謝物、少なくとも約９０種以上の代謝物、少なくとも約１００種以上の代謝物、少なくとも約１１０種以上の代謝物、少なくとも約１２０種以上の代謝物、少なくとも約１３０種以上の代謝物、少なくとも約１４０種以上の代謝物、少なくとも約１５０種以上の代謝物、少なくとも約１６０種以上の代謝物、または少なくとも約１７０種以上の代謝物。

いくつかの態様では、たとえば、自閉症の代謝シグネチャーは、表６に列挙されたうちの、約１０種の代謝物、約２０種の代謝物、約３０種の代謝物、約４０種の代謝物、約５０種の代謝物、約６０種の代謝物、約７０種の代謝物、約８０種の代謝物、約９０種の代謝物、約１００種の代謝物、約１１０種の代謝物、約１２０種の代謝物、約１３０種の代謝物、約１４０種の代謝物、約１５０種の代謝物、約１６０種の代謝物、または約１７０種の代謝物を含みうる。

いくつかの態様では、自閉症の代謝シグネチャーは、たとえば、表６に列挙されたうちの、約１０〜約２０種の代謝物、約１０〜約３０種の代謝物、約１０〜約４０種の代謝物、約１０〜約５０種の代謝物、約１０〜約６０種の代謝物、約１０〜約７０種の代謝物、約１０〜約８０種の代謝物、約１０〜約９０種の代謝物、約１０〜約１００種の代謝物、約１０〜約１１０種の代謝物、約１０〜約１２０種の代謝物、約１０〜約１３０種の代謝物、約１０〜約１４０種の代謝物、約１０〜約１５０種の代謝物、約１０〜約１６０種の代謝物、約１０〜約１７０種の代謝物、約２０〜約３０種の代謝物、約２０〜約４０種の代謝物、約２０〜約５０種の代謝物、約２０〜約６０種の代謝物、約２０〜約７０種の代謝物、約２０〜約８０種の代謝物、約２０〜約９０種の代謝物、約２０〜約１００種の代謝物、約２０〜約１１０種の代謝物、約２０〜約１２０種の代謝物、約２０〜約１３０種の代謝物、約２０〜約１４０種の代謝物、約２０〜約１５０種の代謝物、約２０〜約１６０種の代謝物、約２０〜約１７０種の代謝物、約３０〜約４０種の代謝物、約３０〜約５０種の代謝物、約３０〜約６０種の代謝物、約３０〜約７０種の代謝物、約３０〜約８０種の代謝物、約３０〜約９０種の代謝物、約３０〜約１００種の代謝物、約３０〜約１１０種の代謝物、約３０〜約１２０種の代謝物、約３０〜約１３０種の代謝物、約３０〜約１４０種の代謝物、約３０〜約１５０種の代謝物、約３０〜約１６０種の代謝物、約３０〜約１７０種の代謝物、約４０〜約５０種の代謝物、約４０〜約６０種の代謝物、約４０〜約７０種の代謝物、約４０〜約８０種の代謝物、約４０〜約９０種の代謝物、約４０〜約１００種の代謝物、約４０〜約１１０種の代謝物、約４０〜約１２０種の代謝物、約４０〜約１３０種の代謝物、約４０〜約１４０種の代謝物、約４０〜約１５０種の代謝物、約４０〜約１６０種の代謝物、約４０〜約１７０種の代謝物、約５０〜約６０種の代謝物、約５０〜約７０種の代謝物、約５０〜約８０種の代謝物、約５０〜約９０種の代謝物、約５０〜約１００種の代謝物、約５０〜約１１０種の代謝物、約５０〜約１２０種の代謝物、約５０〜約１３０種の代謝物、約５０〜約１４０種の代謝物、約５０〜約１５０種の代謝物、約５０〜約１６０種の代謝物、約５０〜約１７０種の代謝物、約６０〜約６０種の代謝物、約６０〜約７０種の代謝物、約６０〜約８０種の代謝物、約６０〜約９０種の代謝物、約６０〜約１００種の代謝物、約６０〜約１１０種の代謝物、約６０〜約１２０種の代謝物、約６０〜約１３０種の代謝物、約６０〜約１４０種の代謝物、約６０〜約１５０種の代謝物、約６０〜約１６０種の代謝物、約６０〜約１７０種の代謝物、約７０〜約８０種の代謝物、約７０〜約９０種の代謝物、約７０〜約１００種の代謝物、約７０〜約１１０種の代謝物、約７０〜約１２０種の代謝物、約７０〜約１３０種の代謝物、約７０〜約１４０種の代謝物、約７０〜約１５０種の代謝物、約７０〜約１６０種の代謝物、約７０〜約１７０種の代謝物、約８０〜約９０種の代謝物、約８０〜約１００種の代謝物、約８０〜約１１０種の列挙代謝物、約８０〜約１２０種の代謝物、約８０〜約１３０種の代謝物、約８０〜約１４０種の代謝物、約８０〜約１５０種の代謝物、約８０〜約１６０種の代謝物、約８０〜約１７０種の代謝物、約９０〜約１００種の代謝物、約９０〜約１１０種の代謝物、約９０〜約１２０種の代謝物、約９０〜約１３０種の代謝物、約９０〜約１４０種の代謝物、約９０〜約１５０種の代謝物、約９０〜約１６０種の代謝物、約９０〜約１７０種の代謝物、約１００〜約１１０種の代謝物、約１００〜約１２０種の代謝物、約１００〜約１３０種の代謝物、約１００〜約１４０種の代謝物、約１００〜約１５０種の代謝物、約１００〜約１６０種の代謝物、約１００〜約１７０種の代謝物、約１１０〜約１２０種の代謝物、約１１０〜約１３０種の代謝物、約１１０〜約１４０種の代謝物、約１１０〜約１５０種の代謝物、約１１０〜約１６０種の代謝物、約１１０〜約１７０種の代謝物、約１２０〜約１３０種の代謝物、約１２０〜約１４０種の代謝物、約１２０〜約１５０種の代謝物、約１２０〜約１６０種の代謝物、約１２０〜約１７０種の代謝物、約１３０〜約１４０種の代謝物、約１３０〜約１５０種の代謝物、約１３０〜約１６０種の代謝物、約１３０〜約１７０種の代謝物、約１３０〜約１５０種の代謝物、約１３０〜約１６０種の代謝物、約１３０〜約１７０種の代謝物、約１４０〜約１５０種の代謝物、約１４０〜約１６０種の代謝物、約１４０〜約１７０種の代謝物、約１５０〜約１６０種の代謝物、約１５０〜約１７０種の代謝物、または約１６０〜約１７０種の代謝物を含めて、表６に列挙されたうちのある範囲内の代謝物を含みうる。

たとえば、自閉症の代謝シグネチャーは、表５に列挙された代謝物のうちの１種以上を含みうる。たとえば、自閉症の代謝シグネチャーは、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸から選択される、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物を含みうる。

たとえば、自閉症の代謝シグネチャーは、たとえば、２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、またはバリンから選択される、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、任意の２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、または２６種の代謝物を含めて、表９に列挙された代謝物のうちの１種以上を含みうる。

たとえば、自閉症の代謝シグネチャーは、たとえば、ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパレート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸から選択される、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、任意の２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物、任意の２７種以上の代謝物、任意の２８種以上の代謝物、または２９種の代謝物を含めて、図１３に列挙された代謝物のうちの１種以上を含みうる。

そのような代謝物のうちの任意の１種以上は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）により定量されうる。いくつかの態様では、そのような代謝物のうちの任意の１種以上は、表５、表６、または表９に示される手法により定量されうる。

本発明に係る方法のいくつかの態様では、自閉症個体と非自閉症個体との間で統計学的有意差を呈する低分子の化学的同一性が確認される。自閉症被験体と非自閉症被験体との間で統計学的有意差があるとして同定された代謝物の化学構造は、それらの発見に用いられたものと同一のクロマトグラフィー条件を用いてＨＲＭＳ法により確認されうる。ＨＲＭＳ−ＭＳ分析は、患者サンプル、参照化合物、および参照化合物でスパイクされたサンプルについてＡｇｉｌｅｎｔ ＱＴＯＦ質量分析計により行われうる。イオン化および衝突のエネルギー条件は、最高品質のＭＳ−ＭＳスペクトルが得られるように最適化されうる。得られたＨＲＭＳまたはＨＲ−ＭＳ−ＭＳイオンフラグメント化スペクトルを比較して各低分子代謝物のアノテート同一性を確認することにより、検証された候補診断バイオマーカー群を確立しうる。データは、公共データベースのデータベースを含めていくつかの場所で利用可能なスペクトルと比較されうる。ＭＳ−ＭＳスペクトルが利用可能なデータベーススペクトルと一致しない場合、参照化合物は、推定アノテート化合物に関して取得されうるとともに、ＭＳ−ＭＳスペクトルは、参照化合物に関して取得され、次いで、サンプルのものと比較されるであろう。

いくつかの態様では、自閉症の代謝シグネチャーは、定型／正常対照と比較したときの存在量の増加または減少により示される。たとえば、正常対照と比較した、ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加を含む。

これは、正常対照と対比した平均存在比として測定されうる。いくつかの態様では、約１以外の平均存在比は、自閉症の指標となりうる。たとえば、約１超（たとえば、限定されるものではないが、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．１１、約１．１２、約１．１３、約１．１４、約１．１５、約１．１６、約１．１７、約１．１８、約１．１９、約１．２、約１．２１、約１．２２、約１．２３、約１．２４、約１．２５、約１．２６、約１．２７、約１．２８、約１．２９、約１．３、約１．３１、約１．３２、約１．３３、約１．３４、約１．３５、約１．３６、約１．３７、約１．３８、約１．３９、約１．４、約１．４１、約１．４２、約１．４３、約１．４４、約１．４５、約１．４６、約１．４７、約１．４８、約１．４９、または約１．５を含めて）の平均存在比は、自閉症の指標となりうる。いくつかの態様では、約１未満（たとえば、限定されるものではないが、約０．９９、約０．９８、約０．９７、約０．９６、約０．９５、約０．９４、約０．９３、約０．９２、約０．９１、約０．９、約０．８９、約０．８８、約０．８７、約０．８６、約０．８５、約０．８４、約０．８３、約０．８２、約０．８１、約０．８、約０．７９、約０．７８、約０．７７、約０．７６、約０．７５、約０．７４、約０．７３、約０．７２の、約０．７１、約０．７、約０．６９、約０．６８、約０．６７、約０．６６、約０．６５、約０．６４、約０．６３、約０．６２、約０．６１、約０．６、約０．５９、約０．５８、約０．５７、約０．５６、約０．５５、約０．５４、約０．５３、約０．５２、約０．５１、または約０．５を含めて）の平均存在比は、自閉症の指標となりうる。

本発明は、自閉症児および定型発達正常児の血漿サンプル間で有意差のある存在量または濃度を有することが見いだされる低分子または代謝物に関する。また、本発明は、自閉症を発症する被験体のリスクを評価する方法および／または自閉症を診断する方法を含む。被験体は、本明細書に記載の方法により同定される代謝シグネチャーの１種以上の低分子代謝物のレベルが、非ＡＳＤ被験体の参照サンプルの対応するデータと対比して統計的に有意（ｐ＜０．０５）に増加または減少することに基づいて、ＡＳＤのリスクがあると決定されうるかまたはＡＳＤであると診断されうる。

いくつかの態様では、自閉症の代謝シグネチャーの１種以上の低分子代謝物の定量は、物理的分離方法、たとえば、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法を用いて、アッセイされうる。いくつかの態様では、代謝物の決定は、物理的分離方法以外の手法、たとえば、比色法、酵素法、免疫法などによるものでありうる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含みうるとともに、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含みうるとともに、表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

いくつかの態様では、表６に列挙された１７９種の代謝物のうちの１種以上は、たとえば、表６に列挙されたうちの、少なくとも約５種以上の代謝物、少なくとも約１０種以上の代謝物、少なくとも約２０種以上の代謝物、少なくとも約３０種以上の代謝物、少なくとも約４０種以上の代謝物、少なくとも約５０種以上の代謝物、少なくとも約６０種以上の代謝物、少なくとも約７０種以上の代謝物、少なくとも約８０種以上の代謝物、少なくとも約９０種以上の代謝物、少なくとも約１００種以上の代謝物、少なくとも約１１０種以上の代謝物、少なくとも約１２０種以上の代謝物、少なくとも約１３０種以上の代謝物、少なくとも約１４０種以上の代謝物、少なくとも約１５０種以上の代謝物、少なくとも約１６０種以上の代謝物、または少なくとも約１７０種以上の代謝物を含みうる。

いくつかの態様では、表６に列挙された１７９種の代謝物のうちの１種以上は、たとえば、表６に列挙されたうちの、約１０種の代謝物、約２０種の代謝物、約３０種の代謝物、約４０種の代謝物、約５０種の代謝物、約６０種の代謝物、約７０種の代謝物、約８０種の代謝物、約９０種の代謝物、約１００種の代謝物、約１１０種の代謝物、約１２０種の代謝物、約１３０種の代謝物、約１４０種の代謝物、約１５０種の代謝物、約１６０種の代謝物、または約１７０種の代謝物を含みうる。

いくつかの態様では、表６に列挙された１７９種の代謝物のうちの１種以上は、たとえば、表６に列挙されたうちの、約１０〜約２０種の代謝物、約１０〜約３０種の代謝物、約１０〜約４０種の代謝物、約１０〜約５０種の代謝物、約１０〜約６０種の代謝物、約１０〜約７０種の代謝物、約１０〜約８０種の代謝物、約１０〜約９０種の代謝物、約１０〜約１００種の代謝物、約１０〜約１１０種の代謝物、約１０〜約１２０種の代謝物、約１０〜約１３０種の代謝物、約１０〜約１４０種の代謝物、約１０〜約１５０種の代謝物、約１０〜約１６０種の代謝物、約１０〜約１７０種の代謝物、約２０〜約３０種の代謝物、約２０〜約４０種の代謝物、約２０〜約５０種の代謝物、約２０〜約６０種の代謝物、約２０〜約７０種の代謝物、約２０〜約８０種の代謝物、約２０〜約９０種の代謝物、約２０〜約１００種の代謝物、約２０〜約１１０種の代謝物、約２０〜約１２０種の代謝物、約２０〜約１３０種の代謝物、約２０〜約１４０種の代謝物、約２０〜約１５０種の代謝物、約２０〜約１６０種の代謝物、約２０〜約１７０種の代謝物、約３０〜約４０種の代謝物、約３０〜約５０種の代謝物、約３０〜約６０種の代謝物、約３０〜約７０種の代謝物、約３０〜約８０種の代謝物、約３０〜約９０種の代謝物、約３０〜約１００種の代謝物、約３０〜約１１０種の代謝物、約３０〜約１２０種の代謝物、約３０〜約１３０種の代謝物、約３０〜約１４０種の代謝物、約３０〜約１５０種の代謝物、約３０〜約１６０種の代謝物、約３０〜約１７０種の代謝物、約４０〜約５０種の代謝物、約４０〜約６０種の代謝物、約４０〜約７０種の代謝物、約４０〜約８０種の代謝物、約４０〜約９０種の代謝物、約４０〜約１００種の代謝物、約４０〜約１１０種の代謝物、約４０〜約１２０種の代謝物、約４０〜約１３０種の代謝物、約４０〜約１４０種の代謝物、約４０〜約１５０種の代謝物、約４０〜約１６０種の代謝物、約４０〜約１７０種の代謝物、約５０〜約６０種の代謝物、約５０〜約７０種の代謝物、約５０〜約８０種の代謝物、約５０〜約９０種の代謝物、約５０〜約１００種の代謝物、約５０〜約１１０種の代謝物、約５０〜約１２０種の代謝物、約５０〜約１３０種の代謝物、約５０〜約１４０種の代謝物、約５０〜約１５０種の代謝物、約５０〜約１６０種の代謝物、約５０〜約１７０種の代謝物、約６０〜約６０種の代謝物、約６０〜約７０種の代謝物、約６０〜約８０種の代謝物、約６０〜約９０種の代謝物、約６０〜約１００種の代謝物、約６０〜約１１０種の代謝物、約６０〜約１２０種の代謝物、約６０〜約１３０種の代謝物、約６０〜約１４０種の代謝物、約６０〜約１５０種の代謝物、約６０〜約１６０種の代謝物、約６０〜約１７０種の代謝物、約７０〜約８０種の代謝物、約７０〜約９０種の代謝物、約７０〜約１００種の代謝物、約７０〜約１１０種の代謝物、約７０〜約１２０種の代謝物、約７０〜約１３０種の代謝物、約７０〜約１４０種の代謝物、約７０〜約１５０種の代謝物、約７０〜約１６０種の代謝物、約７０〜約１７０種の代謝物、約８０〜約９０種の代謝物、約８０〜約１００種の代謝物、約８０〜約１１０種の列挙代謝物、約８０〜約１２０種の代謝物、約８０〜約１３０種の代謝物、約８０〜約１４０種の代謝物、約８０〜約１５０種の代謝物、約８０〜約１６０種の代謝物、約８０〜約１７０種の代謝物、約９０〜約１００種の代謝物、約９０〜約１１０種の代謝物、約９０〜約１２０種の代謝物、約９０〜約１３０種の代謝物、約９０〜約１４０種の代謝物、約９０〜約１５０種の代謝物、約９０〜約１６０種の代謝物、約９０〜約１７０種の代謝物、約１００〜約１１０種の代謝物、約１００〜約１２０種の代謝物、約１００〜約１３０種の代謝物、約１００〜約１４０種の代謝物、約１００〜約１５０種の代謝物、約１００〜約１６０種の代謝物、約１００〜約１７０種の代謝物、約１１０〜約１２０種の代謝物、約１１０〜約１３０種の代謝物、約１１０〜約１４０種の代謝物、約１１０〜約１５０種の代謝物、約１１０〜約１６０種の代謝物、約１１０〜約１７０種の代謝物、約１２０〜約１３０種の代謝物、約１２０〜約１４０種の代謝物、約１２０〜約１５０種の代謝物、約１２０〜約１６０種の代謝物、約１２０〜約１７０種の代謝物、約１３０〜約１４０種の代謝物、約１３０〜約１５０種の代謝物、約１３０〜約１６０種の代謝物、約１３０〜約１７０種の代謝物、約１３０〜約１５０種の代謝物、約１３０〜約１６０種の代謝物、約１３０〜約１７０種の代謝物、約１４０〜約１５０種の代謝物、約１４０〜約１６０種の代謝物、約１４０〜約１７０種の代謝物、約１５０〜約１６０種の代謝物、約１５０〜約１７０種の代謝物、または約１６０〜約１７０種の代謝物を含めて、ある範囲内の代謝物を含みうる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、表５に列挙された２１種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含みうるとともに、表５に列挙された２１種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。たとえば、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、表９に列挙された２６種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含みうるとともに、表９に列挙された２６種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。たとえば、２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、１種または複数種の低分子代謝物に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、図１３に列挙された２９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、を含みうるとともに、図１３に列挙された２９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。たとえば、ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパレート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差は、自閉症のリスク増加の指標となる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程を含みうる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、グリシン、セリン、トレオニン、アラニン、ヒスチジン、グルタミルアミノ酸、タウリン、および／またはカルノシンの減少に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程を含みうる。

いくつかの態様では、自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法および自閉症を診断する方法は、ホモシトルリンの減少に関して被験体のバイオサンプルをアッセイする工程を含みうる。

バイオサンプルは、さまざまな哺乳動物被験体のいずれかに由来しうる。好ましい実施形態では、バイオサンプルは、ヒト被験体に由来する。バイオサンプルは、ＡＳＤと臨床診断された個体に由来しうる。ＡＳＤは、さまざまな周知の臨床基準のいずれかにより診断されうる。たとえば、自閉症スペクトラム障害の診断は、経験を積んだ神経心理学者により決定されたＤＳＭ−ＩＶ基準、ならびに／または自閉症および自閉症スペクトラム障害に対するカットオフを有するアルゴリズムを含めて、子供のコミュニケーション、社会的相互作用、および常同行動についての知見を提供する自閉症診断観察スケジュール−包括版（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ−Ｇｅｎｅｒｉｃ）（ＡＤＯＳ−Ｇ）に基づいて、提供されうる。

バイオサンプルは、現在はＡＳＤの症状がほとんどまたはまったくないがＡＳＤのリスクが多少あると判断された（たとえば家族歴により）個体に由来しうる。バイオサンプルは、ＡＳＤの家族歴を有するまたは有していないＡＳＤ非罹患個体に由来する好適な参照サンプルまたは対照サンプルでありうる。いくつかの態様では、集団から、たとえば、ＡＳＤ個体、ＡＳＤリスク個体、または正常定型発達個体の集団から、複数のサンプルが取得される。バイオサンプルは成体被験体でありうる。バイオサンプルは、子供、たとえば、約６歳未満、約４歳未満、約２歳未満、または約１歳未満、約１〜約６歳、約１〜約５歳、約１〜約４歳、約１〜約２歳、約２〜約６歳、約２〜約４歳、または約４〜６歳の子供に由来しうる。バイオサンプルは、たとえば、高機能自閉症（ＨＦＡ）や低機能自閉症（ＬＦＡ）などの自閉症の被験体の表現型サブ集団に由来しうる。

本明細書に開示された方法によれば、被験体の体内のいずれかに由来する任意のタイプの生物学的サンプルをテストしうる。たとえば、限定されるものではないが、血液（限定されるものではないが、血清または血漿を含む）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胸水、尿、糞便、汗、涙、息、唾液、組織サンプル、羊水、絨毛膜絨毛サンプル、脳組織、任意の固体組織、たとえば、腫瘍、近接正常部、平滑筋および骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、毛髪、脳、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃など、の生検物を使用しうる。血液サンプルは、たとえば、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、または他の血液成分、たとえば、全血のサブ画分などを含みうる。サンプルは生存被験体に由来しうる。いくつかの用途では、サンプルは、死後に採取されうる。

血液サンプルが被験体から採取される場合、それは、多くの公知の方法のいずれかで処理可能である。一連の処理は、あまり複雑でないものもあればまったく複雑でないものもあり（たとえば、凍結全血など）、特定の細胞型の単離と同程度に複雑なものもある。通常手順およびルーチン手順は、全血由来の血清または血漿のいずれかの調製物を含む。血液サンプルの処理方法はすべて、濾紙や他の不動材料などの固相支持体への血液サンプルのスポッティングを含めて、本発明により想定される。

分析のためにサンプルを調製する場合、定量分析化学で典型的に使用される抽出／精製手順を任意の数だけ用いて、その生物源から代謝物を抽出しうる。

統計解析のためにコンピューターを使用しうる。統計解析用データは、当技術分野で公知の統計的方法のソフトウェアを用いてクロマトグラム（物質シグナルのスペクトル）から抽出可能である。「統計」とは、個体グループまたは実験グループに関する数値データを効果的に使用する科学のことである。統計解析方法は当技術分野で周知である。一実施形態では、統計解析のためにコンピューターが使用される。一実施形態では、統計解析のためにＡｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアまたはＭａｓｓＰｒｏｆｉｌｅｒＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェアが使用される。他の実施形態では、統計解析のためにＡｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアのＱｕａｌソフトウェアが使用される。他の実施形態では、代替的な統計解析方法を使用可能である。そのような他の統計的方法としては、分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、χ²検定、相関検定、因子分析検定、マン・ホイットニーのＵ検定、平均二乗加重導出（ＭＳＷＤ）、ピアソンの積率相関係数、回帰分析、スピアマンの順位相関係数、スチューデントのｔ検定、ウェルチのＴ検定、テューキーの検定、および時系列分析が挙げられる。さまざまな実施形態では、質量分析のシグナルをさまざまな方法で変換して本方法の性能を改善することが可能である。個別のシグナルまたはシグナルの分布の概要（たとえば、平均、メジアン、もしくは分散）のいずれかをそのように変換することが可能である。可能な変換としては、対数をとること、いくつかの正もしくは負の累乗（たとえば、平方根もしくは逆数）をとること、または逆正弦をとることが挙げられる。さまざまな実施形態では、自閉症および非自閉症を予測するために、統計的分類アルゴリズムを用いて分類モデルを生成する。機械学習ベースの分類器は、機械知覚、医学診断、バイオインフォマティクス、ブレイン−マシンインターフェース、ＤＮＡ配列分類、コンピュータービジョンの物体認識などの種々の分野で適用されてきた。学習ベースの分類器は、いくつかの生物学的問題の解決にきわめて効率的であることが明らかにされてきた。

「感度」および「特異度」は、二元分類テストの性能の統計的尺度である。感度とは、適正に同定された実陽性の割合の尺度（たとえば、その病態を有すると適正に同定された病人のパーセント）のことである。特異度とは、適正に同定された陰性の割合の尺度（たとえば、その病態を有していないと適正に同定された健常人のパーセント）のことである。これらの２つの尺度は、第１種および第２種の過誤の概念に密接に関連付けられる。理論的最適予測では、１００％の感度（すなわち、病気グループの人はすべて病気であると予測される）および１００％の特異度（すなわち、健常グループの人は誰も病気であると予測されない）を達成可能である。１００％の特異度とは、テストによりすべての実陰性が認識されることを意味し、たとえば、特定の疾患のテストでは、無病の人はすべて、無病であると認識されよう。１００％の感度とは、テストによりすべての実陽性が認識されることを意味し、たとえば、病人はすべて、病気であると認識される。したがって、高特異度テストとは対照的に、高感度テストの陰性結果を用いて、その疾患が除外される。高特異度テストの陽性結果により、疾患の存在を確認可能である。しかしながら、理論的観点から、１００％の特異度のテスト標準でも、テストが常に単に陰性を示す「偽」テストキットが原因である可能性もある。したがって、特異度だけでは、テストにより陽性症例がどの程度良好に認識されるは分からない。感度についての知識もまた、必要とされる。いかなるのテストでも、通常、尺度間にトレードオフが存在する。たとえば、特定の病態を有する人をテストする診断アッセイでは、その病態を有していないと適正に同定される健常人のパーセントを損なうリスクを低減するために（高感度）、アッセイは、その病態を有すると適正に同定される病人の特定のパーセントを見過ごすように（低特異度）、設定されるおそれがある。系統誤差の排除により確度は改善するが、精度は変化しない。このトレードオフは、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてグラフで表すことが可能である。

測定システムの「確度」とは、量の測定値とその実（真）値との近似の度合いのことである。測定システムの「精度」とは、再現性または繰返し性とも呼ばれるものであり、不変条件下での繰返し測定値が同一の結果を示す度合いのことである。２つの語は、口語的用法では同義的でありうるが、科学的方法との関連では意図的に対比される。測定システムは、確度は高いが精度は高くないか、精度は高いが確度は高くないか、そのどちらでもないか、またはその両方でありうる。たとえば、実験が系統誤差を含有する場合、サンプルサイズを増加させると、精度は増加するが、確度は向上しない。

「予測度」という用語（バナリティー（ｂａｎａｌｉｔｙ）とも呼ばれる）は、システムの状態の適正な予測または予想を定性的または定量的に行える度合いのことである。完全な予測度は、厳密な決定を示唆するものではなく、予測度の欠如は、必ずしも決定の欠如を示唆するとはかぎらない。予測度の制約は、情報の欠如や過度な複雑性などの因子により引き起こされる可能性がある。

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも約８０％の確度、少なくとも約８１％の確度、少なくとも約８２％の確度、少なくとも約８３％の確度、少なくとも約８４％の確度、少なくとも約８５％の確度、少なくとも約８６％の確度、少なくとも約８７％の確度、少なくとも約８８％の確度、少なくとも約８９％の確度、少なくとも約９０％の確度、少なくとも約９１％の確度、少なくとも約９２％の確度、少なくとも約９３％の確度、少なくとも約９４％の確度、少なくとも約９５％の確度、少なくとも約９６％の確度、少なくとも約９７％の確度、少なくとも約９８％の確度、または少なくとも約９９％の確度で自閉症を診断する方法を開示する。

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも約８０％の感度、少なくとも約８１％の感度、少なくとも約８２％の感度、少なくとも約８３％の感度、少なくとも約８４％の感度、少なくとも約８５％の感度、少なくとも約８６％の感度、少なくとも約８７％の感度、少なくとも約８８％の感度、少なくとも約８９％の感度、少なくとも約９０％の感度、少なくとも約９１％の感度、少なくとも約９２％の感度、少なくとも約９３％の感度、少なくとも約９４％の感度、少なくとも約９５％の感度、少なくとも約９６％の感度、少なくとも約９７％の感度、少なくとも約９８％の感度、または少なくとも約９９％の感度で自閉症を診断する方法を開示する。

いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも約７５％の特異度、少なくとも約８０％の特異度、少なくとも約８１％の特異度、少なくとも約８２％の特異度、少なくとも約８３％の特異度、少なくとも約８４％の特異度、少なくとも約８５％の特異度、少なくとも約８６％の特異度、少なくとも約８７％の特異度、少なくとも約８８％の特異度、少なくとも約８９％の特異度、少なくとも約９０％の特異度、少なくとも約９１％の特異度、少なくとも約９２％の特異度、少なくとも約９３％の特異度、少なくとも約９４％の特異度、少なくとも約９５％の特異度、少なくとも約９６％の特異度、少なくとも約９７％の特異度、少なくとも約９８％の特異度、または少なくとも約９９％の特異度で自閉症を診断する方法を開示する。

いくつかの実施形態では、本発明は、以上に記載のものから選択される確度、感度、および特異度の任意の組合せで自閉症を診断する方法を開示する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に含まれる実施例に記載の確度、感度、および／または特異度で自閉症を診断する方法を開示する。

いくつかの態様では、定型発達サンプルと比較して自閉症サンプルで自閉症の指標となるシグネチャー代謝物の濃度の平均存在比が決定されうる。そのような平均存在比は、自閉症の診断に利用されうる。さらに、そのような平均存在比は、自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。自閉症の指標となる任意の数のシグネチャー代謝物の平均存在比は、自閉症および／または自閉症の表現型サブ集団の決定に利用されうる。たとえば、平均存在比は、本明細書で先に記載したように、表５、表６、および／または表９に記載の代謝物のうちの任意の１種または任意の複数種に関して決定されうる。いくつかの態様では、約１以外の平均存在比は、自閉症および／または自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。たとえば、約１超（たとえば、限定されるものではないが、約１．０１、約１．０２、約１．０３、約１．０４、約１．０５、約１．０６、約１．０７、約１．０８、約１．０９、約１．１、約１．１１、約１．１２、約１．１３、約１．１４、約１．１５、約１．１６、約１．１７、約１．１８、約１．１９、約１．２、約１．２１、約１．２２、約１．２３、約１．２４、約１．２５、約１．２６、約１．２７、約１．２８、約１．２９、約１．３、約１．３１、約１．３２、約１．３３、約１．３４、約１．３５、約１．３６、約１．３７、約１．３８、約１．３９、約１．４、約１．４１、約１．４２、約１．４３、約１．４４、約１．４５、約１．４６、約１．４７、約１．４８、約１．４９、または約１．５を含めて）の変化倍率比は、自閉症および／または自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。たとえば、約１未満（たとえば、限定されるものではないが、約０．９９、約０．９８、約０．９７、約０．９６、約０．９５、約０．９４、約０．９３、約０．９２、約０．９１、約０．９、約０．８９、約０．８８、約０．８７、約０．８６、約０．８５、約０．８４、約０．８３、約０．８２、約０．８１、約０．８、約０．７９、約０．７８、約０．７７、約０．７６、約０．７５、約０．７４、約０．７３、約０．７２、約０．７１、約０．７、約０．６９、約０．６８、約０．６７、約０．６６、約０．６５、約０．６４、約０．６３、約０．６２、約０．６１、約０．６、約０．５９、約０．５８、約０．５７、約０．５６、約０．５５、約０．５４、約０．５３、約０．５２、約０．５１、または約０．５を含めて）の変化倍率比は、自閉症および／または自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。

いくつかの態様では、自閉症の指標となる１種のシグネチャー代謝物の濃度と自閉症の指標となる第２のシグネチャー代謝物の濃度との同一サンプルでの比が決定されうる。そのような比は、自閉症の診断に利用されうる。さらに、そのような比は、自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。自閉症および／または自閉症の表現型サブ集団の指標となるように、本明細書に記載の任意の１種のシグネチャー代謝物と本明細書に記載の任意の第２のシグネチャー代謝物との比が決定されうる。本明細書に記載のそのようなシグネチャー代謝物は、表５、表６、および／または表９に記載のもののうちのいずれかを含みうるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの態様では、本明細書に記載の自閉症の指標となるシグネチャー代謝物の濃度と他の代謝物の濃度との同一サンプルでの比が決定されうる。そのような比は、自閉症の診断に利用されうる。さらに、そのような比は、自閉症の表現型サブ集団の指標となりうる。本明細書に記載のそのようなシグネチャー代謝物は、表５、表６、および／または表９に記載のもののうちのいずれかを含みうるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの態様では、本明細書に記載の自閉症の指標となる１種以上のシグネチャー代謝物の同定および／または定量に基づいて自閉症を診断する方法は、１種以上の追加の公知の自閉症マーカーの同定および／または定量をさらに含みうる。たとえば、米国特許出願公開第２０１２０１９００５５号明細書（「Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ａｕｔｉｓｍ（自閉症の分子バイオマーカー）」）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるそれらの同定および／または定量のための１種以上のマーカーおよび／または手法が使用されうる。米国特許第８，２７３，５７５号明細書（「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（自閉症スペクトラム障害の診断、リスク評価、およびモニタリングの方法）」）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるそれらの同定および／または定量のための１種以上のマーカーおよび／または手法が使用されうる。いくつかの態様では、自閉症に関連付けられるまたは関係する遺伝子型および／または遺伝子の発現を決定するために、生物学的サンプルの核酸が解析されうる。

本明細書に記載の代謝マーカーおよび代謝シグネチャーは、継続評価、モニタリング、罹病性評価、保有者テスト、および出生前診断を含めて、ＡＳＤを診断、予測、調節、またはモニターするためのテスト、アッセイ、方法、キットで利用されうる。

本発明は、ＡＳＤのリスクの評価に関連付けられる１種以上の代謝物を同定および／または測定するためのキットを含む。いくつかの態様では、キットは、物理的分離方法による代謝物の決定に供されうる。いくつかの態様では、キットは、物理的分離方法以外の手法、たとえば、比色法、酵素法、免疫法による代謝物の決定に供されうる。いくつかの態様では、アッセイキットはまた、１種以上の適切な陰性対照および／または陽性対照を含みうる。本発明に係るキットは、他の試薬を含みうる。たとえば、本発明を実施するのに必要とされる緩衝剤および溶液が含まれうる。任意選択で、そのような容器には、注意書きまたは説明書の印刷物が付随しうる。本明細書で用いられる場合、「パッケージング材料」という語句は、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理構造物を意味する。パッケージング材料は、好ましくは、汚染物質を含まない無菌環境を提供するために、周知の方法により作製される。本明細書で用いられる場合、「パッケージ」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、フォイルなどの固体のマトリックスまたは材料を意味する。本発明に係るキットはまた、使用説明書を含みうる。使用説明書は、典型的には、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ法パラメーター、たとえば、混合される試薬とサンプルとの相対量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝剤条件などを記述する明瞭な表現を含む。いくつかの態様では、キットは、固体形態で本明細書に記載の１種以上の精製代謝物の特定のセットを含む第１の容器と、精製代謝物の特定のサブセットを再懸濁するための生理学的に好適な緩衝剤を含む第２の容器と、の基本要素を含む組合せパッケージでありうる。そのようなキットは、被験体にＡＳＤのリスクがあるか否かを決定するために専門医により使用されうる。ＡＳＤのリスクが決定された後、適切な治療的介入が指示または開始されうる。本明細書に記載の１種以上の代謝物は、キット中に存在しうる。

以下の実施例により本発明を例示する。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に明示される本発明の範囲および趣旨に従って広義に解釈されると理解すべきである。

実施例１
子供の血漿中の自閉症スペクトラム障害のバイオマーカー
可能なかぎり若い年齢で自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断することが、最適な有効介入の開始に重要である。患者は、行動テストを介して約２齢で確実に診断可能である。しかしながら、米国では、診断の平均年齢は約４齢である。ＡＳＤは、多くの原因およびさまざまな遺伝的リスク因子を有することが、増大する証拠から示唆される。血液サンプルからＡＳＤの代謝バイオマーカーシグネチャーを同定することにより、早期の診断テストを開発する機会が提供される。

本実施例で、ＡＳＤ児と定型発達（ＴＤ）児とを識別可能でありうる代謝特徴を血漿サンプルから発見する研究を行った。この研究の最終的目標は、血液ベースのＡＳＤバイオマーカーを開発することである。

ＡＳＤの症例の大多数の病因は不明であり、それらの遺伝的特性は信じられないほど複雑であることが明らかにされてきた（Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｓｅｓｔａｎ，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３７：１３０１−１３０３、およびＢｅｒｇ ａｎｄ Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，２０１２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ；１３：２４７）遺伝的および環境的なリスク因子のさまざまな組合せが作用してＡＳＤの多くの原因が存在するであろうとの認識が、現在、広く行き渡っている。トランスクリプトミクスおよびゲノミクスの研究により障害の原因を同定しようと多くの研究が試みられ、ＡＳＤに関連付けられる複数の遺伝子が同定されるに至った（Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，２０１２，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ；１３：２４７、およびＨｕｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ；１４：１９１−２１３）。現在、自閉症の症例の約２０％を占める何百もの観測可能な遺伝子変異体が存在する。これらのデータは、現在、自閉症の家族内遺伝的特性の理解に最も有用である。このため、ゲノム測定に基づく臨床テストは、多くの場合、家族内の疾患の発生または再発の可能性を評価する遺伝カウンセリングを含む（Ｂｕｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ；５：ｅ１０００５３６、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ；４５９：５２８−５３３）。ゲノム手法に基づくＡＳＤのリスクの予測確度は、評価される患者の集団に大きく依存して５６％〜７０％の範囲内である。Ｓｋａｆｉｄａｓらによるゲノム研究の少なくとも１つの個別の分析では、祖先の起源に基づく偏りにより結果が交絡するかを質問した（Ｂｅｌｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１９（４）：４０５−７、およびＳｋａｆｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１９（４）：５０４−１０）。ゲノム研究のさらなる制約は、子供および／または母親に及ぼす環境の影響の結果が識別できないことである。メタボロミクスは、たとえわずかな環境の影響により引き起こされる生化学的変化にもより敏感であるため、表現型に近いこれらの因子のいくつかに対処するにより、ゲノム手法を補完することが可能である。

ＡＳＤの遺伝的環境の複雑性を考えると、メタボロミックプロファイリングは、早期の診断テストを開発する代替経路を提供しうる。ＡＳＤに関する従来の代謝研究では、細胞、オルガネラ、尿、血液などの生物学的マトリックスが使用され、脂肪酸、ステロール、中間代謝物、リン脂質、および酸化ストレスに関連付けられる分子を含めて、広範にわたる数多くの代謝物が関連付けられてきた（Ｅｌ−Ａｎｓａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ；１０：６２、Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ；８９：４２５−４３０、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｔｉｅｒｎｅｙ，２０１１，Ａｕｔｉｓｍ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ；２０１１：６５３５７０、Ｄａｍｏｄａｒａｎ ａｎｄ Ａｒｕｍｕｇａｍ，２０１１，Ｒｅｄｏｘ Ｒｅｐ；１６：２１６−２２２、およびＹａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；９：２９９６−３００４）。最近の２つの報告では、ＡＳＤのシグネチャーを同定するための尿のメタボロミック分析の使用の可能性に注目している。一研究では、１Ｈ−ＮＭＲ法を用いて、トリプトファン／ニコチン酸代謝経路、硫黄経路、およびアミノ酸経路に関連付けられる代謝物、さらにはＡＳＤの病因への微生物代謝の関与を示唆する微生物代謝物の変化が示された（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；９：２９９６−３００４）。Ｍｉｎｇらは、液体クロマトグラフィーとガスクロマトグラフィーとの組合せに基づく質量分析法を用いて、多数のアミノ酸および抗酸化剤、たとえば、カルノシンの変化を同定し、さらには、消化管マイクロバイオームの変化に関連付けられる変化を確認した（Ｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；１１：５８５６−５８６２）。

代謝物の測定は、ＡＳＤのいくつかの形態を特徴付ける能力を有しうる低分子存在量の差を同定する優れた機会を提供する。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、低分子代謝物に対する非常に高感度の検出方法であるだけでなく、分子式決定を介して代謝物同定を支援する精密質量データも提供する（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎａｌｙｓｔ；１３０：６０６−６２５）。ＨＲＭＳは、同一ノミナル質量を有する化合物（アイソバリック化合物）を識別する能力に関して追加の顕著な利点を提供し、化学式および化学構造の情報の向上を提供する（Ｇｒｏｓｓ，１９９４，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ；５：５７）。

残念ながら、血液中の代謝物のすべてを検出可能な汎用的クロマトグラフィー質量分析技術は１つも存在しない。ＡＳＤに関連付けられる新規な可能性のあるバイオマーカーを同定するために、広範にわたる代謝物検出対象範囲が容易に得られることが必要である。この目標に向かって、本発明者らは、クロマトグラフィー分離、質量スペクトルのイオン化および検出に対して直交法を適用した（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；３７２：２３７−２４９）。本研究では、ＴＤ個体とＡＳＤ個体とを識別可能な血漿サンプル中の広範にわたる代謝物を発見するために、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）および液体クロマトグラフィー−高分解能質量分析（ＬＣ−ＨＲＭＳ）を含めて、複数のクロマトグラフィー質量分析メタボロミック法を利用した。続いて、ＬＣ−ＨＲＭＳにより発見された代謝物の構造確認を支援するために、タンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）実験を利用した。

この実施例では、ＡＳＤに関連付けられるバイオマーカーをもたらしうる代謝物を発見するために、血漿中の低分子の広範な評価を行った。統計的に有意な存在量差を呈する代謝物または代謝産物グループがＡＳＤ児とＴＤ個体とを識別するバイオマーカーとして使用可能であるかを決定するために、単変量法、多変量法、および機械学習法を利用した。

方法
被験体サンプル
最初に、カリフォルニア大学デービス校神経発達障害医学研究所クリニック地域センター（ＵＣ Ｄａｖｉｓ Ｍ．Ｉ．Ｎ．Ｄ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒｓ）、臨床医からの紹介、地域学校区、およびコミュニティー支援グループ、たとえば、早期自閉症治療を求める家族の会（Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ａｕｔｉｓｍ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（ＦＥＡＴ）を介して、実験被験体を募集し、４齢〜６齢の狭い年齢範囲に限定した（表１参照）。定型発達参加者（Ｎ＝３０）は、地域学校区およびコミュニティーセンターから募集した。最初の研究の側面はすべて、カリフォルニア大学デービス校施設内審査委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｄａｖｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により承認された。各参加者の親または保護者から書面によるインフォームドコンセントを取得し、個人情報識別子なしでデータを解析した。インフォームドコンセント後、被験体の診断測定および心理測定を終了した。経験を積んだ神経心理学者（ＢＡＣ）により決定されたＤＳＭ−ＩＶ基準に基づく自閉症スペクトラム障害の診断からなる選択基準の下で、ＡＳＤの研究参加者（Ｎ＝５２）を登録し、研究に信頼性のある臨床医による次の測定によりさらに確証した。自閉症診断観察スケジュール−包括版（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ−Ｇｅｎｅｒｉｃ）（ＡＤＯＳ−Ｇ）は、自閉症および自閉症スペクトラム障害に対するカットオフを有するアルゴリズムを含めて、子供のコミュニケーション、社会的相互作用、および常同行動についての知見を提供する。

自閉症診断面接研究（Ａｕｔｉｓｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＡＤＩ−Ｒ）は、子供の発達歴およびＡＳＤに特有の関連挙動を評価し、ＡＳＤ児に対する診断アルゴリズムを生成する網羅的半構造化親面接である。ＤＳＭ−ＩＶ基準（ＤＳＭ−５，５ｔｈ ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎから抜粋した米国精神医学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（２０１３）診断基準卓上参考書（Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｒｉｔｅｒｉａ））に基づいて、厳密に定義された自閉症障害の子供のみを登録し、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）やアスペルガー症候群の子供を研究から除外した。ＴＤ対照児でＡＳＤ症状の不在を保証するために、スクリーニングツールとして社会的コミュニケーションアンケート（Ｓｏｃｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＳＣＱ）を使用した。この研究のために募集された患者は、主に、コーカサス人であり、年齢は、グループ間で類似していた。しかしながら、自閉症の参加者は、定型発達被験体よりも低いＩＱスコアを有していた（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１２：２９２−３０６、およびＡｓｈｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；６：ｅ１９２９９）。

すべての被験体に対する除外基準には、脆弱Ｘ病態または他の重篤な神経学的病態（たとえば発作）、精神医学的病態（たとえば双極性障害）、もしくは既知の医学的病態、たとえば、自己免疫疾患および炎症性腸疾患／セリアック病の存在が含まれていた。現在および過去の身体的疾病に関して親面接を介して、すべての被験体をスクリーニングした。既知のエンドクリン疾患、心血管疾患、肺疾患、および肝疾患または腎疾患を有する子供を研究の登録から除外した。研究に参加するための食事制限は、一晩の絶食を除いて必要としなかった。研究に参加するには、行動評価および採血のための２回の臨床訪問を必要とした。

患者への投薬に関して、この研究では、５２名中１８名のＡＳＤ被験体は、リスペリドン（５名の被験体）、セルトラリン（３名の被験体）、アリピプラゾール（２名の被験体）、抗ヒスタミン剤（２名の被験体）、抗ウイルス剤（２名の被験体）、抗菌類剤（２名の被験体）、および種々の他のそれほど高頻度でない薬剤を含む投薬を受けた。３０名の定型被験体のうちの３名は、メチルフェニデート（１名の被験体）、アルブテロール（１名の被験体）、およびロラタジン（１名の被験体）を含む投薬を受けた。５２名のＡＳＤ被験体のうちの１０名は、グルテンおよび／またはカゼインを含まない（ＧＦＣＦ）食事をとった。重要なこととして、いずれの午前の投薬を行う前にも、採血を行った。

１３ヶ月にわたり神経発達障害医学研究所（Ｍ．Ｉ．Ｎ．Ｄ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）への木曜午前の訪問の際にサンプルを採取した。一晩絶食した後、８〜１０ＡＭに経験を積んだ小児科瀉血医により９．６ｍＬ ＥＤＴＡバキュテナーチューブ中に血液を採取した。ただちに、チューブを６〜８回反転させて抗凝固剤との混合を確保し、氷上に配置した。血清分離および分注の直後、採血の朝、パラフィルムのストリップでチューブキャップをラップし、次いで、クーラントパック間のキャリヤー内に配置されたバイオハザードバッグ内にバブルラップして、バーコードラベル付きの宅配便でサンプルを送った。サンプルは−８０℃で貯蔵した。この最初のサンプルセットは、８７名の子供に由来するものであった。レビュー時、明白な溶血の目視検査および観測の後、５個のサンプルを除去した。これらの研究で使用した最終的に８２個のサンプルは、５２名のＡＳＤ児およびＴＤグループの３０名の子供に由来するものであった。年齢および性別の分布がグループ間で類似するように、子供を選択した。本研究では、ＡＳＤ症例と定型発達児との間に年齢の統計的な差は存在しなかった（ウェルチのｔ検定ｐ＝０．２５）。

８２個のサンプルのうちの６１個のトレーニングセットを単変量解析および多変量解析に使用して分類モデルを構築した。残りの２１個のサンプルを独立検証セットテストセットとして指定した。これらの２１個のサンプルは、特徴の選択にも分類モデルの開発にも利用されず、分類モデルのロバスト性を評価するための独立したサンプルセットに対応する。

ＬＣ−ＭＳのためのサンプル調製
血漿サンプルを５０μｌアリコートに分割し、代謝物抽出前、−８０℃で貯蔵した。これらの手順の間、サンプルを氷上に保持した。診断、ＩＱ、年齢、および民族性が各バッチ内で均等に分布するように、ＬＣ−ＨＲＭＳ分析のためにサンプルを３つのバッチにランダム化した。−２０℃で４５０μＬの８：１メタノール：水の溶液を用いて、５０μＬ血漿アリコートから低分子を抽出した（Ｊｉｙｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ；７７：８０８６−８０９４）。抽出溶液はまた、内部標準を含有していた。サンプルを２〜８℃で１０分間撹拌し、次いで、４℃、１８，４００×ｇで２０分間遠心分離し、沈殿物を除去した。上清を新鮮なチューブに移し、遠心分離工程を繰り返し、いずれの残留沈殿物も除去した。最終遠心分離後、４５０μＬの上清を新鮮なチューブに移し、次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃ内で蒸発乾固させ、次いで、内部標準をも含有するアセトニトリル：０．１％ギ酸中の０．１％ギ酸の４５μＬの５０：５０混合物に再溶解させた。次いで、この溶液をＬＣ−ＨＲＭＳ分析のための高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）オートサンプラー注入バイアルに移した。

質量分析
より良好なメタボローム対象範囲を得るために、標的化ＧＣ−ＭＳと、さらには非標的化ＬＣ−ＨＲＭＳとの両方を利用した。正イオン極性および負イオン極性の両方でエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８またはＨＩＬＩＣクロマトグラフィーを含めて、４つの非標的化ＬＣ−ＨＲＭＳ法を用いて、１個のサンプルあたり４つの個別のデータ取得を行った。低分子代謝物の対象範囲の幅を最適化するために、臨床患者サンプルの評価前に、ＬＣ−ＨＲＭＳ法の開発およびテストを行った。

液体クロマトグラフィー高分解能質量分析
高分解能（ＱＴＯＦ）質量分析計と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ＨＰＬＣからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ６５４０四重極飛行時間（ＱＴＯＦ）ＬＣ−ＨＲＭＳシステムを用いて、ＬＣ−ＨＲＭＳを行った。高分解能精密質量条件下で二重ＥＳＩイオン源を用いて、正イオンおよび負イオンモードの両方でエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を利用した。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）では、２．１×１５０ｍｍの寸法、１．７μＭの粒子サイズを有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）ＢＥＨアミドカラムを使用し、４０℃に維持した。水中０．１％ギ酸およびアセトニトリル中０．１％ギ酸を有する溶媒グラジエントを用いて、０．５ｍＬ／分の流量で、各サンプルについてデータを２９分間取得した。サンプルの２μＬアリコートを注入した。Ｃ８クロマトグラフィーでは、水中０．１％ギ酸およびアセトニトリル中０．１％ギ酸を有するグラジエントを用いて、０．５ｍＬ／分の流量で、各サンプルについてデータを５０分間取得した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ８ ２．１×１００ｍｍ、１．８μＭ粒子サイズのカラムを使用し、４０℃に維持した。サンプルの２μＬアリコートを注入した。

ガスクロマトグラフィー−質量分析
Ｆｉｅｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｆｉｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｊ；５３：６９１−７０４）に記載されるように、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。ＬＥＣＯ Ｐｅｇａｓｕｓ ＩＶ ＴＯＦ質量分析計と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフを用いて、ＧＣ−ＭＳデータを取得した。サンプルデータと、質量スペクトル、保持指数、構造、外部代謝データベースとのリンクを含むＧＣ−ＭＳにより同定された１，０００種超の化合物のデータベースと、を比較することにより、代謝物の同定を行った。

ＬＣ−ＨＲＭＳ−ＭＳによる代謝物化学構造の確認
主要な代謝物の化学構造を、それらの発見に用いたのと同一のクロマトグラフィー条件でタンデム質量分析（ＬＣ−ＨＲＭＳ−ＭＳ）法により、さらに確認した。最高品質の生成物イオンスペクトルが得られるように最適化された衝突のエネルギー条件を用いて、患者サンプルおよび／または参照血液サンプルについて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＴＯＦ質量分析計によりＬＣ−ＨＲＭＳ−ＭＳ分析を行った。次いで、得られた生成物イオンスペクトルと、公共スペクトルデータベース、たとえば、ＭＥＴＬＩＮ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ；２７：７４７−７５１）、ＭａｓｓＢａｎｋ（Ｈｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ；４５：７０３−７１４）、Ｓｔｅｍｉｎａの自社ＳｔｅｍｉｎａＭｅｔＤＢデータベースで利用可能なＭＳ−ＭＳスペクトルと、を比較した。

データ解析
ＬＣ−ＨＲＭＳデータの前処理
最初に、方法開発時に確立された品質基準、たとえば、存在量閾値、保持時間ピーク形状整合性に関して、生の質量スペクトルデータ全イオンクロマトグラムおよび内部標準抽出イオンクロマトグラムを調べた。外れ値基準を満たしたクロマトグラムを呈するデータファイルをさらなる分析から除去した。生データをオープンソースｍｚＤａｔａファイル（Ｏｒｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；７：３４３６−３４４０）に変換した。オープンソースソフトウェアライブラリーＸＣＭＳ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ；７８：７７９−７８７）を用いてピーク選択および特徴生成を行い、次いで、非線形クラスタリング法に基づくｏｂｉｗａｒｐアルゴリズム（Ｐｒｉｎｃｅ ａｎｄ Ｍａｒｃｏｔｔｅ，２００６，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ；７８：６１４０−６１５２）を用いて保持時間の偏差を補正し、ＬＣ−ＨＲＭＳデータを整合させた。ＸＣＭＳ密度ベースのグループ化アルゴリズムを用いて質量特徴を生成し、次いで、繰返しピーク充填を用いて特徴ビンの保持時間および質量範囲に基づいて欠測特徴を組み込んだ。「質量特徴」（本明細書では「特徴」としても略記される）とは、１）検出された質量電荷比（ｍ／ｚ）および２）クロマトグラフィー保持時間の２つの性質により定義された質量分析計により検出された部分のことである。

次いで、一連のデータフィルターを利用して、低存在量レベルを呈する特徴、ならびにバックグラウンドノイズ、後続データ分析に由来するフラグメントおよび汚染物質から生じる特徴を除去した。次いで、特徴検出でのＬＣ−ＨＲＭＳバッチ間変動を低減するために、内部スパイクされた内部参照標準の実験全体のメジアン領域にサンプルごとに存在量値を規格化した。ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＨＲＭＳのプラットフォームからの規格化質量特徴の積分面積を単一のデータセットに組み合わせた。前処理フィルターを通過したサンプルのトレーニングセットには４５７２個の特徴がある。

トレーニングセットおよび独立検証セット
８２個の患者サンプル（５２個のＡＳＤサンプルおよび３０個のＴＤサンプル）を、２つのセット、すなわち、（１）統計的に有意な特徴の同定および分類モデリングのための６１個のサンプル（３９個のＡＳＤおよび２２個のＴＤ）のトレーニングセットと、（２）分類モデルの性能を評価するために使用される２１個のサンプルの独立検証セット（１３個のＡＳＤおよび８個のＴＤ）と、に分割した。これは、各セットがランダム化に使用される因子を類似の比率で含有するように、これらのトレーニングセットおよび検証セットで診断、患者ＩＱ、および性別を用いてサンプルをランダム化することにより達成された。検証サンプルセットを単変量フィルタリングプロセスおよびモデル開発プロセスから差し引いて、モデル性能を評価する独立外部サンプルセットとして機能させた。

質量特徴の単変量フィルタリング
全特徴セット、過適合可能性を低減し、かつ予測シグネチャーの生物学的解釈可能性を増加させるために、ｔ検定を使用した（Ｈａｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；６：ｅ２８２１０）。ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＨＲＭＳのプラットフォームからの内部標準（ＩＳ）に規格化された質量特徴の積分面積を単一のデータセットに組み合わせた。質量特徴の平均積分面積の差が実験クラス間に存在しないという帰無仮説と、示差的特徴を同定するＡＳＤトレーニングセットサンプルとＴＤトレーニングセットサンプルとの間に平均積分面積の差が存在しないという対立仮説と、の下でウェルチのｔ検定を用いて、サンプルのトレーニングセットで前処理フィルターを通過した４５７２個の特徴をさらにフィルタリングした。未補正ｐ値＜０．０５を有して統計的に有意な変化を示した各特徴について、その抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を、サンプル間の積分の整合性、ピーク形状、および＞３０００の最小ピーク高さ要件に関して、レビューした。次いで、このＥＩＣ品質レビュープロセスを通過した特徴を分類モデリングに利用した。ｐ値補正のベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて、偽発見率（ＦＤＲ）を計算した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５，Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｓｅｒ Ｂ；５７：２８９−３００）。

分類モデリング
２つの主目的で、すなわち、ＶＩＰ（投影における変数重要性）スコア指数を用いてＡＳＤを識別する際に代謝物の重要性をロバストにランク付けするために、およびＡＳＤおよびＴＤの実験クラスの最高レベルの識別を達成するのに必要とされる予測代謝物の最小セットを同定するために、モデル開発を行った。全体で６１個のサンプルのトレーニングセットを用いて、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ）の分類器をトレーニングすることにより、モデルを生成した。複数の手法を用いて分子シグネチャーが予測性でありうることを実証するために、モデリング技法ＰＬＳ−ＤＡと、さらには線形カーネルを用いたＳＶＭと、の両方を利用した（Ｗｏｌｄ，１９８５，“Ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ，”Ｉｎ：Ｋｏｔｚ Ｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＮＬ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，Ｖｏｌ．６．ｐｐ．５８１−５９１、およびＣｏｒｔｅｓ ａｎｄ Ｖａｐｎｉｋ，１９９５，Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ；２０：２７３−２９７）。Ｒパッケージの分類および回帰トレーニング「ｃａｒｅｔ」バージョン５．１７−７（Ｋｕｈｎ，２００８，Ｊ Ｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗ；２８：１−２６）を用いて、部分最小二乗（ＰＬＳ）およびＳＶＭの分類モデルを生成した。ＲパッケージＲＯＣＲバージョン１．０−５（Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；２１：３９４０−３９４１）を用いて、レシーバーオペレーター曲線（ＲＯＣ）分析を行った。

モデル開発の第１の目的 − 特徴ＶＩＰスコアのロバストな尺度 − を満たすために、ネステッド交差検証（ＣＶ）法（図１）を使用した。４９個のサンプルのＣＶトレーニングセットおよび１２個のサンプルのＣＶテストセットへの８０：２０分割を用いて、トレーニングセットを１００回リサンプリングすることにより、特徴ロバスト性を測定した。１００個のリサンプルのそれぞれについてＶＩＰスコアを計算し、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて逆方向再帰的特徴削減（２０回の特徴工程で）により、各リサンプルで最も情報価値のある特徴を同定した。次いで、最も情報価値のある特徴セットを用いて、各ＣＶテストセットを予測した。１００個のリサンプルにわたりＶＩＰスコアを平均して、各特徴に対するＶＩＰ指数を生成した。潜在的将来性能を理解するために、ＣＶテストセットの分類性能メトリックをリサンプルにわたり平均した。

分類モデリング法の第２の目的は、最高レベルの分類確度を有する特徴の最小限の数を同定することであった。この目的は、ＶＩＰスコア指数に基づく特徴サブセットを用いて、サンプルの検証テストセットでサブセットの性能を評価することにより、達成された。６１個のサンプルのトレーニングセット全体を用いて、特徴全体にわたりステッピングすることにより、分類モデルを生成した。特徴ステッピングプロセスでは、上位２０個のＶＩＰ特徴を利用し、次いで、全部で１７９個の特徴が評価されるまで、次の上位２０個の加重特徴を追加した。性能メトリック（確度、感度、特異度、およびＲＯＣ分析）は、各特徴サブセットビンサイズで分子シグネチャーを評価するための２１個のサンプルの独立検証セットの予測に基づいた（表４参照）。

モデルで最も良好な性能を発揮した特徴セットに含有される特徴のそれぞれについて、特徴アノテーション（推定化学構造の帰属）を行った。アノテーションは、各質量特徴のｍ／ｚ値と、公共の化学データベースおよび／またはＳｔｅｍｉｎａの社内代謝物データベースに含まれる共通のＥＳＩ付加物のｍ／ｚ値と、を比較することにより、達成された。次いで、推定アノテーションを有する質量特徴の分子式を、所与の特徴の質量スペクトルが提案された式と適正に一致するものであるかをテストするＡｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェア中の「Ｆｉｎｄ ｂｙ Ｆｏｒｍｕｌａ」（ＦＢＦ）アルゴリズムに入力した。ほとんどの場合、７０未満のメジアンＦＢＦスコア、３５秒超の保持時間差を有する、またはデータファイルの５０％未満で存在する、いずれの特徴のアノテーションも、アノテーションの信頼度の欠如により、さらなる分析に含めなかった。

測定精密質量が１種以上の化学構造と一致した（２０ｐｐｍ相対質量誤差内で）質量特徴はすべて、化学的同一性があるとしてアノテートされた。これらのアノテーションは、特徴の化学構造がＬＣ−ＨＲＭＳｍＳによりさらに確認されるまで、推定であるとみなされた。

ＧＣ−ＭＳ分析からの特徴は、（Ｆｉｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｌａｎｔ Ｊ；５３：６９１−７０４）に記載されるように同定した。この手順では、サンプルデータと、それと同一のＧＣ−ＭＳ法によりあらかじめ取得された代謝物参照標準のスペクトルと、の比較が使用される。したがって、取得された患者サンプルデータとデータベースとの単純比較により、データ解析および代謝物化学構造の確認を行った。ＧＣ−ＭＳデータはまた、サンプルクラスに依存して統計的に有意な変化を示した未同定のピークをも含有していた。

結果
複数の分析方法の使用は、メタボロームの広範な対象範囲を提供し、各方法は、ＡＳＤ児とＴＤ対照との分類モデルに質量特徴を付与した。各方法は、提供された特有の特徴に関して評価された。最初に、５つの分析プラットフォーム全体で１０１８７個の質量特徴が検出された。ＨＩＬＩＣ ＬＣ−ＨＲＭＳ法は、モデル中で最も多くの個別の質量特徴をもたらし、その次は、Ｃ８ ＬＣ−ＨＲＭＳ、次いで、ＧＣ−ＭＳであった。前のフィルターを通過した４５７２個の特徴について、単変量解析フィルタリングを行った。ＬＣ−ＨＲＭＳ特徴の約６０％は、化学構造が推定上アノテートされ、アノテートされた特徴の８％（５０３個）は、ＦＢＦ手順の基準を通過した。標的化ＧＣ−ＭＳ特徴の約３６％（１４２個）は、代謝物であることが確認された。これらの結果の内訳は、表２に含有されている。

表２．分子式に基づくフィルタリングおよびアノテーションのプロセスから生じた特徴の数の内訳。この表はまた、５つの分析プラットフォームのそれぞれの直交性および寄与を例示するのに役立つ。任意の所与の分子式は、複数の化学構造に関連付けられうるため、分子式は、ここでは、方法の直交性を近似的に示すためにのみ使用されている。＊これらのアノテーションは、ＧＣＭＳプラットフォームで確認され、かつ式は、４つのＬＣＭＳプラットフォームで使用されたＦＢＦ手順の代わりにＫＥＧＧデータベースを用いて確認された。

すべての分析プラットフォームからの６１個のサンプルのトレーニングセットにわたるデータを用いて、ＡＳＤ児の血漿サンプルと定型発達（ＴＤ）児のサンプルとの識別に利用可能な特徴を同定しロバストにランク付けした。単変量解析フィルタリングは、以上に記載したように、３８９個の統計的に有意な特徴をもたらした。ＥＩＣレビュー後の分析からさらに２１０個の特徴を除去して１７９個の特徴を残し、これらを分類モデリングへの組込みに供した。１７９個の特徴は、特徴のＬＣ−ＨＲＭＳ前処理セットの３％およびＧＣ−ＭＳ前処理セットの８％を含有していた。これらは、表６に示される。

トレーニングセットのモデル性能
１７９個の選択された特徴を変数として用いてＳＶＭおよびＰＬＳの分類方法によりＡＳＤ児のサンプルとＴＤ児のサンプルとを識別し、将来的なバイオマーカー開発への取組みのために分類への各特徴の寄与を評価した。各モデリング法（ＣＶトレーニングセット）で行われたモデリングの１００回の繰返しのすべてからの最適スコアを用いて、トレーニングセットおよび独立検証テストセットの両方からＲＯＣプロットを作成し、モデル性能を理解した。生成された１００個のモデルを平均し、真応答率対偽陽性率の関数としてプロットした。ＡＳＤ児とＴＤ個体とを分類可能な代謝シグネチャーを検出可能であることが、ＳＶＭモデリング法およびＰＬＳモデリング法の両方から示唆された。ＳＶＭモデルは、０．９５のＡＵＣ値（９５％信頼区間（ＣＩ）０．９４〜０．９６）を提供し、ＰＬＳモデルは、０．９２のＡＵＣ値（９５％ＣＩ ０．９１〜０．９４）を与えた。モデルの分類確度がランダムな結果ではないことを確認するために、グループ診断クラスラベルのランダム置換を用いて特徴をモデリングした。これらの結果は、ＳＶＭおよびＰＬＳに対してそれぞれ０．５２（９５％ＣＩ ０．４８〜０．５７）および０．５２（９５％ＣＩ ０．４９〜０．５６）のＡＵＣ値を有して、ほぼランダムな分類を示したことから、特徴は、ランダム化データセットを用いてクラスを識別できないことが示唆される（図２）。

最適なより少数の代謝物を測定すれば、ＡＳＤの血液テストは、効率がより高くかつ経費がより低くなりうると予想されることから、分類モデリングのパラダイムはまた、得られる最大のＡＵＣに基づいて、各モデルで特徴の数の最適化を含んでいた。最高予測モデルへの寄与に基づく個々の特徴のＶＩＰスコアを用いて、特徴セットを評価した（表４）。これらのデータをまとめると、特徴のすべてが必ずしも等しくモデルに寄付するとはかぎらないこと、およびそれほど寄与しない特徴を除去することにより特徴の数を低減可能であり、それでもモデルの確度およびロバスト性が維持されること、が示唆される。結果として、モデリング法のいずれかでは、１７９種の特徴群のすべてが最適モデル性能に必要とされるわけではなかった（図３）。８０個の特徴のセットを用いてトレーニングされたＳＶＭモデルは、９０％の平均確度、９２％の平均感度、８７％の平均特異度、および０．９５の平均ＡＵＣを有して最良の組合せ分類性能メトリックを呈した（ＰＬＳおよび他のＳＶＭの結果と比較したとき）（表３）。

表３．最高分類確度を有する特徴セットを示す交差検証（ＣＶ）トレーニングセットからの結果。Ｎは、対応する数の特徴を有するトレーニングセットでビンサイズが最良の性能を発揮した回数である。確度、感度、特異度、およびＡＵＣは特徴ビンサイズの平均値である。追加の表Ｓ２は、すべての特徴セットの結果を示している。

表４．最高確度を有する特徴セットを示す、２１個のサンプルの独立検証セットに対する予測に基づく分類器性能メトリック。特徴の数は、順にランク付けされたＶＩＰの特徴の評価された数に対応する。追加の表Ｓ３は、すべての特徴セットの結果を示している。

検証セットのモデル性能
２１個のサンプルの独立検証セットを用いて、加重ＶＩＰスコアに基づいて生成されたさまざまな特徴サブセットを外側交差検証ループに依存せずに評価した。以上に記載の８０個の特徴のＳＶＭモデルは、８１％の分類予測確度、８５％の感度、７５％の特異度および０．８４のＡＵＣを有していた（図２、黒色細線）。１４０個の変数を含む最良性能ＰＬＳモデルは、８１％の確度、８５％の感度、７５％の特異度、および０．７９のＡＵＣを有していた（図２、灰色細線、表４）。７０％の確度を達成するために少なくとも４０個の特徴が必要であり、かつ８０〜１６０個の範囲内の特徴が、この独立検証データセットで良好な性能を発揮することが、結果から示唆される。

代謝物化学構造の確認
ＬＣ−ＨＲＭＳ−ＭＳにより確認された７個のＬＣ−ＭＳ質量特徴の化学的同一性を表５に示す。ＬＣ−ＨＲＭＳ−ＭＳまたは標的化ＧＣ−ＭＳにより確認された代謝物に含まれるのは、ホモシトルリンであり、これは、この研究で最大の統計的有意性ならびにＳＶＭおよびＰＬＳの分類モデルの両方ですべての特徴の中で最高のランクを有していた。有意なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す他の代謝物は、アスパルテート、グルタメート、デヒドロエピアンドロステロン硫酸（ＤＨＥＡＳ）、クエン酸、コハク酸、メチルヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ヘプタデカン酸、イソロイシン、グルタル酸、３アミノイソ酪酸、およびクレアチニンを含む。これらは、表５に列挙されており、アミノ酸、有機酸、ステロール、および脂肪酸を含めて、さまざまな分子クラスを表す。

表６は、１７９個すべてのモデル特徴の追加情報を示している。

表７は、交差検証（ＣＶ）トレーニングセットからの結果の表である。Ｎは、対応する数の特徴を有するトレーニングセットでビンサイズが最良の性能を発揮した回数である。確度、感度、特異度、およびＡＵＣは、特徴ビンサイズの平均値である。

表８は、２１個のサンプルの独立検証セットに対する予測に基づく分類器性能メトリックを示す表である。２１個のサンプルの独立検証セットに対する予測に基づく分類器性能メトリック。特徴の数は、順にランク付けされたＶＩＰの特徴の評価された数に対応する。

考察
この実施例に記載の非標的化メタボロミック法は、使用した分析方法の分離限界および検出限界以外で可能な経路への偏りを有していなかった。この手法は、ＡＳＤのリスクがある個体を識別するのに役立ちうる生化学的に多様な代謝物セットの発見をもたらした。

ＡＳＤに既に関連付けられた代謝物の同定
自閉症に既に関連付けられてきた本発明者らの研究で有意なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す代謝物の例は、以下のものを含む。
クエン酸（減少）およびコハク酸（増加）を含むトリカルボン酸回路関連分子は、ＡＳＤ参加者で有意に変化することが見いだされた。自閉症児での尿スクシネートの上昇（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；９：２９９６−３００４、およびＭｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；１１：５８５６−５８６２）および尿シトレートの減少（Ｆｒｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；３：ｅ２２０）が、他のものにより報告されてきた。
メチルヘキサ−、テトラ−、およびヘプタ−デカン酸での本発明者らの観測に類似して、ＡＳＤ児の血漿で脂肪酸が減少することが、既に観測されてきた（Ｅｌ−Ａｎｓａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ；１０：６２）。飽和脂肪酸代謝と酸化ストレスとの関連は、ＡＳＤ児の赤血球で報告されてきた（Ｇｈｅｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；８：ｅ６６４１８）。
３アミノイソ酪酸は、ＡＳＤの参加者のサンプルで増加した。これはまた、以前の知見に一致する（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ（Ｌｏｎｄ）；８：３４）。
また、クレアチニンは、ＡＳＤ児で減少した。これは、ＰＤＤと診断された子供の尿クレアチニンで類似の変化を観測しているＷｈｉｔｅｌｙらの知見と一致している（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｔ；４８：２９２−２９７）。

ＡＳＤでのミトコンドリア機能不全の役割に関する証拠
確認された代謝物の多くは、ＡＳＤおよびミトコンドリア生物学の側面の両方に直接関連付けられる。ミトコンドリア疾患または機能不全は、潜在的に自閉症に関与すると提案されてきた（Ｍａｒａｚｚｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｕｒ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ；１６：２７０−２７５）。それに加えて、いくつかの代謝物は、酸化ストレスを含めてＡＳＤに関与すると既に提案されてきた他のプロセスに関連付けられる（Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌ ａｎｄ Ｆｒｙｅ，２０１２，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１７：３８９−４０１）およびエネルギー生産（Ｂｌａｙｌｏｃｋ，２００９，Ａｌｔｅｒｎ Ｔｈｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｅｄ；１５：６０−６７）。

従来のＡＳＤ研究で観測されてきたように、血液中のアスパルテートおよびグルタメートのレベルは、有意に上昇した（Ｓｈｉｎｏｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；３０：１４７２−１４７７、およびＭｏｒｅｎｏ−Ｆｕｅｎｍａｙｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔ Ｃｌｉｎ；３７：１１３−１２８）。アスパルテート／グルタメートミトコンドリアトランスポーター（ＳＬＣ２５Ａ１２）の突然変異は、既にＡＳＤに関連付けられてきた。このトランスポーターは、マレート／アスパルテートシャトル、酸化的リン酸化を支援するきわめて重要なシステム、アデノシン三リン酸産生の重要な成分、および尿素回路の主要な代謝物である（Ｎａｐｏｌｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ；４４：８３−９２）。

優位な血漿ステロールであるＤＨＥＡＳは、ＡＳＤ児で増加することが見いだされた。ＤＨＥＡは、呼吸鎖に関連付けられる酵素の阻害を介してミトコンドリアエネルギー生産に影響を及ぼすことが知られており（Ｓｔｒｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｕｒ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ；１５：３０５−３０９、およびＴｏｒｄｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ；２５：２９５−３０４）、ＡＳＤ児でさまざまな知見が選られている（Ｓａｆｉｕｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ；９３：３４８−３５６）。

分岐鎖状アミノ酸のイソロイシンは、ＴＤ児と対比してＡＳＤ児のサンプルで低減した。これはまた、他の者により観測されてきた（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ａｕｔｉｓｍ Ｄｅｖ Ｄｉｓｏｒｄ；３３：４４９−４５４）。可能な分子機序は、分岐鎖状アミノ酸キナーゼデヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤキナーゼ）、ミトコンドリア酵素（Ｎｏｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３８：３９４−３９７）の突然変異、さらにはエネルギー代謝でのこれらのアミノ酸の役割（Ｖａｌｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｇｉｎｇ（Ａｌｂａｎｙ ＮＹ）；３：４６４−４７８）を含むであろう。

グルタル酸レベルは上昇した。尿グルタル酸の増加は、グルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＣＤＨ）欠損などのさまざまなニューロン欠損で起こる。グルタル酸代謝の有意部分は、ミトコンドリアで起こる（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｌｋｅｒ，２００４，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ；２７：９０３−９１０）。

消化管マイクロバイオームとＡＳＤとの潜在的関係
消化管マイクロバイオームとＡＳＤとの間のこの潜在的関係はまた、かなりの関心を受けている（Ｍｕｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｕｒｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｐ；１５：３３７）。ＡＳＤ個体の尿に関するメタボロミック研究では、マイクロバイオームに関連付けられてきたジメチルアミン、ヒプレート、フェニルアセチルグルタミンなどの分子が同定されてきた（Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；９：２９９６−３００４、およびＭｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；１１：５８５６−５８６２）。この研究では、ｐ−ヒドロキシフェニルラクテートの血漿中レベルの減少が観測された。ｐ−ヒドロキシフェニルラクテートは、血流および組織の両方で抗酸化剤として機能することが知られているビフィズス菌および乳酸桿菌に関連付けられる代謝物である（Ｂｅｌｏｂｏｒｏｄｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ；１９：８９）。

それに加えて、アスパルテート、シトレート、クレアチニン、ＤＨＥＡ−Ｓ、ヒドロキシフェニルラクテート、インドールアセテート、イソロイシングルタメート、およびグルタレートのレベルはすべて、ＡＳＤ個体とＴＤ個体とを識別する有意な変化を有することが見いだされてきたが、尿代謝物のこれまでの研究では、これらの化合物の変化は有意ではなかった（Ｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ；１１：５８５６−５８６２）。

ＡＳＤでこれまで未同定の代謝変化の同定
この研究ではまた、ホモシトルリンなどの新しいこれまで記載されてこなかった潜在的ＡＳＤバイオマーカーを同定した。これは、ＳＶＭおよびＰＬＳの両方の分類モデルですべての特徴のうちで最大の統計的有意性および最高のランクを有していた。ホモシトルリンは、ミトコンドリア内でリシンおよびカルバモイルリン酸から生成されることが知られているよく理解されていない分子である。オルニチントランスロカーゼ（ＳＬＣ２５Ａ１５）欠損に関連付けられる尿素回路欠損を有するホモシトルリン尿症（ＨＨＨ）症候群患者は、より高い尿ホモシトルリンレベルを有し、発達遅延、運動失調症、痙縮、学習障害、認知障害、および／または原因不明発作などのＡＳＤに類似した行動異常を呈しうる（Ｐａｌｍｉｅｒｉ，２００４，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ；４４７：６８９−７０９）。これらのデータから、尿素回路機能の変化は、本発明者らが血漿で観測したホモシトルリンの減少に関連付けられうることが示唆されうる。

専門トレーニングを受けた医師および臨床医は、現在、行動特性を用いて２歳のＡＳＤ児を診断可能である。しかしながら、より若い年齢でのＡＳＤの検出は、患者および家族のより良好なアウトカムをもたらすという認識が高まってきている（Ｐａｙａｋａｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓ；１２：４８５−５０３、およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１３，Ｊ Ａｐｐｌ Ｒｅｓ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｄｉｓａｂｉｌ；２６：８１−１０７）。したがって、若い年齢で行えるＡＳＤの生物学ベースの血液テストは、患者、家族、および医療提供者にきわめて有益であろう。本研究では、同定された代謝物の存在量の差が、ＡＳＤを発症するリスクが高い個体を識別するのに有用であることが明らかにされうるシグネチャーを提供しうる可能性を評価するために、血漿中の代謝物のプロファイルを調べた。この研究に登録された被験者コホートは、厳密な研究基準によるＡＳＤの診断を反映するように注意深く集められた。注意深い臨床診断以外では、すべての研究参加者について同時に空腹時血液採取を達成し、かつ疾病などの複雑な因子を最小限にすることを保証するために、かなりの労力を払った。

メタボロミクスでは、内因性生化学プロセスの反応物および生成物である低分子代謝物、さらには食事、消化管マイクロバイオーム、および環境との接触に由来する低分子の変化が決定される。それらの存在量の撹乱は、ゲノムおよびプロテオミクスの影響からだけでなく、環境およびエピジェネティクスの影響からも生じうる。したがって、メタボロミック法は、特定のゲノムまたはプロテオミクスの決定因子ではなく、共通する最終段階の代謝物を入力することにより、予測結果の向上を提供しうる。単一の分析方法ですべての代謝物を評価することはできないため、本発明者らは、さまざまな化学的性質に基づいて分子を分離および検出する複数の質量分析イオン化法に関連付けられたクロマトグラフィー法を最適化して利用した。これらの各方法は、本発明者らの研究では分類モデルにより使用される特徴を提供した。

２つの独立した統計的分類方法（ＰＬＳおよびＳＶＭ）を利用して、ＡＳＤ個体とＴＤ個体とを識別するために使用可能な最も影響力のある代謝物および質量特徴を決定した。分類モデリング方法は両方とも、独立検証サンプルセットにより評価したとき約８１％の最大予測確度であったことに基づいて比較的類似の結果をもたらした。予測分類モデルを取得可能であることを確認した後、本発明者らは、再帰的特徴削減法を用いて、予測モデルに必要とされた特徴の最小限の数を確認した。興味深いことに、分類に重要な特徴のいくつかは、２つの方法間で共通していたことから、将来的な血液ベースの診断の開発でのそれらの重要性が示唆される。

結論
この実施例では、いくつかのＭＳベースのメタボロミック分析の組合せにより子供の血漿中の代謝物の変化のプロファイルを検出可能であることを明らかにする。導出された代謝データから開発された統計モデルは、８０％よりも良好な確度でＡＳＤ児とＴＤ個体とを識別した。研究では、臨床診断された４〜６歳のＡＳＤ児および定型発達個体の良好に管理されたサンプルセットを使用した。発見された代謝物のより多くの化学構造を確認するために、およびより多くのかつより若い患者集団で評価することにより、ＡＳＤのリスクを決定するのにどれが最もロバストであるかを決定するために、さらなる研究を行っている。

実施例２
確認された追加の代謝物
実施例１でより詳細に記載された手順を用いて、第２のＡＳＤサンプルセット（ＭＩＮＤ２研究）をアッセイした。この研究集団は、１８０名の定型被験体（男性６９％、平均年齢３．１歳、発達状態１０６）および９３名の自閉症被験体（男性８３％、平均年齢３歳、発達状態６２）に由来するサンプルを含んでいた。サンプルが採取された時、すべての被験体の食事状態は、摂食状態であった。抗凝固剤としてシトレートを使用した。

以下の表９に列挙された追加の代謝物は、自閉症個体と非自閉症個体との間で統計学的有意差が確認されたことを示している。簡潔に述べると、サンプル調製および質量分析のために、−２０℃で８：１メタノール：水の溶液を用いて低分子を抽出し、サンプルを遠心分離して沈殿物を除去し、蒸発乾固し、次いで、ＬＣ−ＨＲＭＳ分析のための可溶化し、標的化ＧＣ−ＭＳおよび非標的化ＬＣ−ＨＲＭＳ（Ｃ８またはＨＩＬＩＣクロマトグラフィー）の方法をメタボローム対象範囲に対して最適化した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ６５４０ ＱＴＯＦ ＬＣ−ＨＲＭＳシステムと、高分解能精密質量条件下で正イオンモードおよび負イオンモードの両方のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と、を用いて、ＬＣ−ＨＲＭＳを行い、ＬＥＣＯ Ｐｅｇａｓｕｓ ＩＶ ＴＯＦ ＭＳと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ガスクロマトグラフを用いて、ＧＣ−ＭＳデータを取得した。

本実施例で同定された代謝特徴と、実施例１で同定されたものと、の比較から、両方の研究でＡＳＤに関連付けられるＤＨＥＡＳ、リゾリン脂質、酸化脂肪酸、イソロイシン、コハク酸、およびシステインの同定が示される。

血漿の非標的化ＭＳベースのメタボロミック分析を用いて、実施例１でより詳細に記載されるように、より大きい患者セットを調べて、ＡＳＤをより早期に検出しかつ患者のアウトカムを改善する診断テストのためのバイオマーカーを同定および検証する。バイオマーカーを用いて、ＡＳＤの代謝サブタイプに関与する生化学的機序の新しい知見を獲得する。

本明細書に記載のバイオマーカーは、新しい治療モードを同定するためのバイオ分子標的として使用されるであろう。また、個別化治療推奨の知見を得るために使用されるであろう。

実施例３
高機能自閉症および低機能自閉症の代謝シグネチャー
実施例１でより詳細に記載されるように、多数の教師ありおよび教師なしの統計的方法を用いて、ＡＳＤの予測性の高い代謝シグネチャーを同定した。７０名のＡＳＤ患者および年齢の一致する３０名の定型発達対照の集団からのサンプルで、サンプルモデル確度感度特異度を４〜６歳の年齢範囲（平均５．４歳）の高機能自閉症（ＨＦＡ）児（ＩＱ＞７０、ｎ＝３３）、低機能自閉症（ＬＦＡ）児（ＩＱ＜７０、ｎ＝３６）、および定型発達（ＴＤ）児（ｎ＝３４）に分割した。

簡潔に述べると、本発明者らのこの分析のために、モデルトレーニングセットとしてサンプルの８０％を含み、残りの２０％を盲検化テストセットのために残した。最終的に代謝物およびバイオマーカーに関連付けられる広範にわたる低分子を直交測定するように設計された５つの異なるクロマトグラフィー−質量分析ベースの方法を用いて、サンプルを分析した。統計的に有意な上位２６６個のユニークな代謝特徴を用いて、テストセットについて評価された分類モデルを開発した。モデルは、自閉症個体と定型個体、ＬＦＡ個体と定型個体、およびＨＦＡ個体と定型個体とを識別する代謝シグネチャーの予測能力を評価する（表１０）。

図５は、高機能自閉症（ＨＦＡ）集団と低機能自閉症（ＬＦＡ）集団、自閉症（Ａｕｔ）集団とＨＦＡ集団、および自閉症集団とＬＦＡ集団との間の生体代謝シグネチャーのオーバーラップを示している。

図５に示されるＬＦＡとＡｕｔとのオーバーラップの３９個の特徴のうちの１１個については、以下のように追加の推定同定（ＰＡＭ）を含む。
ＨＩＬＩＣｎｅｇ＿Ｍ５２６Ｔ３０３：ＬｙｓｏＰＥ（１８：０／０：０）、ＧＰＥｔｎ（１８：０／０：０）、およびＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：０）。

ＨＩＬＩＣｎｅｇ＿Ｍ１５１Ｔ６５：２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ＨＥＭＡ ３−オキソヘキサン酸、３−オキソヘキサノエート、３−オキソヘキサン酸、２−ケトヘキサン酸、３−ケト−ｎ−カプロン酸、（Ｒ）−３−メチル−２−オキソ−ペンタン酸、２−オキソヘキサン酸、２−オキソヘキサノエート、２−メチル−３−ケト吉草酸、アジペートセミアルデヒド、ヘキサン−１−オン−６−カルボキシレート、６−オキソヘキサノエート、ケトロイシン、２−オキソ−３−メチル吉草酸、５−オキソヘキサン酸、５−オキソヘキサノエート、４−アセチル酪酸、３−メチル−２−オキソ吉草酸、６−ヒドロキシヘキサン−６−オリド、６−ヒドロキシ６−ヘキサノラクトン、１−オキサ−２−オキソ−３−ヒドロキシシクロヘプタン、５−ケト−ｎ−カプロン酸、３−オキソ−４−メチルペンタン酸、４−ケト−ｎ−カプロン酸、エチル３−オキソブタノエート、エチルアセトアセテート、メバロノラクトン、２オキソ−３Ｒ−メチルペンタン酸、（Ｒ）−パントラクトン、（Ｒ）−パントイルラクトン、（３Ｒ）−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−２（３Ｈ）−フラノン、および２−オキソイソカプロン酸。

Ｃ８ｎｅｇ＿Ｍ１１７Ｔ１２７：ブタノン、ブタナール、テトラヒドロフラン、β−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ吉草酸、ｂ−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシ−２−メチル−［Ｒ−（Ｒ，Ｒ）］−ブタン酸、３−ヒドロキシ−２−メチル−［Ｒ−（Ｒ，Ｓ）］−ブタン酸、ＤＬ−ａヒドロキシ吉草酸、Ｌ−α−ヒドロキシイソ吉草酸、（Ｓ）−２−エチル−３−ヒドロキシプロピオン酸、ヒドロキシイソバレレート、２−エチルヒドロアクリル酸、２−メチル３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシペンタノエート、および５−ヒドロキシ吉草酸。

ＨＩＬＩＣｎｅｇ＿Ｍ１１７Ｔ６１：テトラヒドロフラン、ブタノン、ブタナール、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシペンタノアート、２−メチル−３−ヒドロキシ酪酸、２−エチルヒドロアクリル酸、２−ヒドロキシ吉草酸、ＤＬ−ａ−ヒドロキシ吉草酸、Ｌ−α−ヒドロキシイソ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸、ｂ−ヒドロキシイソ吉草酸、β−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル−［Ｒ−（Ｒ，Ｓ）］−ブタン酸、ヒドロキシイソバレレート、３−ヒドロキシ−２−メチル−［Ｒ−（Ｒ，Ｒ）］ブタン酸、および（Ｓ）−２−エチル−３−ヒドロキシプロピオン酸。

ＨＩＬＩＣｎｅｇ＿Ｍ１１７Ｔ６７：ピルブアルデヒド、アクリル酸、マロンジアルデヒド、プロペノエート、アクリル酸、アクリレート、２−プロペン酸、ビニルギ酸、エリトロノ−１，４−ラクトン、メチルオキサレート、メチルマロン酸、２（３Ｈ）−フラノン，ジヒドロ−３，４−ジヒドロキシ、トレオノラクトン、およびコハク酸。

図６は、自閉症の診断に使用するためのＨＦＡ集団、ＬＦＡ集団、およびＡｕｔ集団の間で共通した５個の生体代謝特徴について自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体の両方での存在量を示している。

図７は、自閉症の診断に使用するためのＬＦＡ集団およびＡｕｔ集団の間で共通した３９個の生体代謝特徴のうちの１１個について自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体での存在量を示している。

図８は、自閉症の診断に使用するためのＨＦＡ集団およびＡｕｔ集団との間で共通した１３個の生体代謝特徴について自閉症（Ａ）被験体および定型（Ｔ）被験体での存在量を示している。図９は、高機能自閉症（ＨＦＡ）集団、低機能自閉症（ＬＦＡ）集団、自閉症（Ａｕｔ）集団、および定型集団での追加の生体代謝特徴の存在量を示している。また、図１０は、すべての分析方法からの組合せ特徴を示している。図１１は、ＨＦＡ集団対定型集団、ＬＦＡ集団対定型集団、ＬＦＡ＋ＬＦＡ集団対定型集団でのシトルリン（ＨＩＬＩＣ（＋）特徴Ｍ１９０Ｔ５１２）の分布を示している。図１２は、ＨＦＡ集団対定型集団、ＬＦＡ集団対定型集団、ＬＦＡ＋ＬＦＡ集団対定型集団での特徴Ｓ１２３のＧＣＭＳ分布を示している。

ＬＦＡ対ＴＤで観測された分類確度の増加が、ＨＦＡ対ＴＤモデルよりも１６％大きかったことから、より重度の形態の障害が、代謝に顕著な影響を及ぼすことが示唆される。全体的分類確度は、確度が高い臨床診断に向かうモデルの性能のグローバル尺度である。感度は、ＡＳＤと診断されて適正に分類される個体のパーセントであり、より高い値は、ＡＳＤの個体が適正に診断されてより少ない偽陰性診断をもたらす可能性の指標となる。特異度の尺度は、定型個体がＡＳＤを有しておらず定型と適正に分類される可能性の指標となる。質量特徴の推定アノテーションは、脂肪酸、リン脂質、アミノ酸、中間体などを含めて、広範にわたるさまざまな代謝物がモデル内に現れることを示している。たとえば、イソロイシンは、ＡＳＤ患者では有意により低いレベルで観測され、ＬＦＡ／ＴＤでは０．５５およびＨＦＡ／ＴＤでは０．７０の平均存在比を示す。これは、分岐鎖状アミノ酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＢＣＫＤＫ）をコードする遺伝子の点突然変異の同定と一致しており、これは、分岐鎖状アミノ酸のロイシン、イソロイシン、およびバリンの分解および枯渇を引き起こして、癲癇を伴う自閉症の形態をもたらす（Ｎｏｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３３８：３９４−３９７）。

この実施例では、網羅的なメタボロミック分析を介して高機能自閉症個体および／または低機能自閉症個体と定型個体とを分類可能な血漿中の代謝シグネチャーを同定した。

自閉症フェノームプロジェクト（Ａｕｔｉｓｍ Ｐｈｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＡＰＰ）の一部として取得された２９５名の追加の患者からの追加の血液サンプルが評価されよう（２／３はＡＳＤと診断されて、残りの１／３は定型発達児である）。これらのサンプルは、２〜３．５歳の子供に由来する。これらのより若い子供に由来する患者サンプルを評価すれば、より若い年齢で患者を診断するバイオマーカーの同定が可能になり、潜在的に患者のアウトカムにより大きい影響を与えるであろう。ＡＰＰは縦断的研究であり、５歳を達成した時から血漿サンプルがこれらの子供から採取されてきた。これらのサンプルは、幼児期にわたりＡＳＤのメタボロミクスシグネチャーの安定性を調べる将来的研究に価値ある資源を提供するであろう。ＡＰＰ被験体の選択基準は、歩行可能であること、視覚や聴覚の問題が疑われないこと、運動マイルストーンの有意な遅延がないこと、および体重が２０ポンド超であることである。除外基準には、評価への妥当な参加を妨害する虚弱健康状態の存在、比較グループを複雑にするなんらかの家族性障害または疾患（たとえば、双極性疾患の親、自閉症の従兄弟姉妹または兄弟姉妹）、および異常ＭＳＥＬスコアの定型発達児が含まれた。

実施例４
追加のコホート
この実施例では、８０％超の確度を有してＡＳＤの患者を同定可能な血液中の１７９種の代謝物（または代謝産物グルーブ）を成功裏に発見した前の実施例の研究が継続されよう。患者の血液で測定可能なバイオマーカーは、障害の代謝面での理解、および現在の主要の診断方法である行動分析よりも早期の診断を可能にしうる。この実施例では、ＡＳＤの個体の血漿中の何百〜何千もの代謝物が直接測定され、これらの測定結果と類似の年齢の非自閉症個体から得られたものとが比較されよう。非標的化メタボロミック解析法では、カリフォルニア大学デービス校（ＵＣ−Ｄａｖｉｓ）の神経発達障害医学研究所（ＭＩＮＤ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で非常に良好に特徴付けられたサンプルセットからの研究保存血サンプルが使用されよう。最終的に、この実施例では、定型患者と比較してＡＳＤの個体の血漿中に異常レベルのいくつかの代謝物が存在することが通知されよう。代謝物が同定され、代謝経路にマッピングされよう。このことは、ＡＳＤの機序の理解を深めるのに役立つと同時に、将来的な療法開発の潜在的目標を提供するのに役立つであろう。最終的に、同定された代謝物は、臨床診断キットなどの他のタイプのプラットフォームへ移行可能である。

前の実施例に示されるように、血漿サンプルに見いだされる代謝物の組合せが、ＡＳＤの個体を同定可能なシグネチャーを形成することを、これらのコホートからのサンプルで実証した。この実施例では、ＡＳＤを有する十分に特徴付けられた被験者および年齢の一致する定型発達対照児のいくつかのコホートからの追加のサンプルがアッセイされよう。

本明細書で引用された特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料はすべて（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにあるヌクレオチド配列提出物、およびたとえば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにあるアミノ酸配列提出物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにあるアノテートされたコード領域からの翻訳を含めて）、それらの完全な開示が参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文献の開示との間になんらかの不一致が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。上記の詳細な説明および実施例は、明確に理解されることを期して与えられてきたものにすぎない。それから不要な限定がなされると理解すべきではない。本発明は、表示および説明された厳密な詳細事項に限定されるものではなく、当業者に自明な変形形態は、特許請求の範囲により規定された本発明の範囲内に含まれるものとする。見出しはすべて、読者の便宜を図るためのものであり、とくに指定がないかぎり、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。

Claims (11)

1. 自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法であって、
   表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上に関して前記被験体のバイオサンプルをアッセイする工程であって、ここで、前記アッセイは、複数のクロマトグラフィー質量分析技術を利用する工程と、および
   表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、
   を含み、
   ここで、表６に列挙された前記代謝物のうちの少なくとも４０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり、または
   表６に列挙された前記代謝物のうちの８０〜１６０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となる、方法。
2. 前記バイオサンプルが、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法によりアッセイされる、請求項１に記載の方法。
3. ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり；または
   ２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり；または
   ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパルテート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となる、請求項１または２に記載の方法。
4. ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および３−アミノイソ酪酸の増加からなる群から選択される少なくとも１つを示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 非自閉症対照と比較して統計的に有意なホモシトルリンの存在量差が自閉症のリスク増加の指標となる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ２種以上の低分子代謝物の比を決定する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記バイオサンプルが、脳脊髄液、脳組織、羊水、血液、血清、血漿、羊水、または尿である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記バイオサンプルが血漿である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記被験体が２歳未満である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 代謝シグネチャーが自閉症被験体の表現型サブ集団の指標となる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 代謝シグネチャーが高機能自閉症（ＨＦＡ）および／または低機能自閉症（ＬＦＡ）の指標となる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

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