KR102530345B1 - 대사체 프로파일링을 이용한 자폐 스펙트럼 장애의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 진단하는 데 필요한 바이오마커를 대사체학 프로파일링 방법을 통해 제공하고, 대사체를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물, 진단 키트 및 진단용 정보제공방법을 제공한다.

Description

대사체 프로파일링을 이용한 자폐 스펙트럼 장애의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단키트{Composition for diagnosis of autism spectrum disorder using metabolomics profiling and diagnostic kit comprising the same}
본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 진단하는 데 사용될 수 있는 바이오마커를 대사체 프로파일링을 통해 제공하고, 이를 통해 자폐 스펙트럼 장애의 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법을 제공한다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD)는 제한적이고 반복적인 행동 패턴과 사회적 의사 소통 및 상호 작용의 결함을 특징으로하는 신경 발달 악화 상태로 알려져 있다. ASD는 출생 후 3 년 이내에 발생하는 심각한 행동 장애이므로 ASD의 조기 식별 및 개입은 ASD에 걸린 개인의 치료 결과를 개선하는 가장 중요한 요소이다. 그러나 ASD의 조기 진단을 위한 방법이 제시되지 않고 있어, 많은 어린이들이 치료를 시작할 최적의 시간을 놓치고 있다. 미국에서는 1992년 이후 자폐 아동 수가 증가하였다. 수십 년 전만해도 ASD의 유병률은 인구 10,000 명당 1 명이었으나, 유병률은 매년 11-17 % 씩 증가하고 있다. 이와 관련하여 2001년 세계 보건기구 (WHO)는 ASD를 주요한 이슈로 선정하였고, ASD에 대한 과학적 관심은 교육학, 심리학, 신경 생물학적 연구와 같은 주요 영역으로 발전하였다.
ASD의 많은 원인이 제안되었지만 ASD의 정확한 인과 메커니즘은 알려져 있지 않다. 또한 단일 유전자 장애, 선천성 대사 오류, 중금속 및 모체 약물 노출은 ASD 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 발프로산 (VPA)과 같은 약물에 대한 노출도 ASD의 원인 중 하나로 제시되고 있으며, 임상 연구에 따르면 임신 중 VPA를 섭취하면 ASD를 포함한 신경관 결손 발생 위험이 증가하는 것으로 나타났다(Williams et al., Fetal valproate syndrome and autism: Additional evidence of an association. Dev. Med. Child. Neurol. 2001, 43, 202-206. 및 Christensen et al., Prenatal Valproate Exposure and Risk of Autism Spectrum Disorders and Childhood Autism. JAMA. 2013, 309, 1696-703). VPA는 간질 및 양극성 장애를 치료하고 감마-아미노 부티르산(GABA) 신경 전달을 조절하고 편두통을 예방하는 데 사용된다. 임신 중 VPA에 노출된 아동을 대상으로 한 후속 연구에서 ASD 비율은 약 8 배 더 증가하고 안구 운동 뉴런의 수는 감소했으며 안면 핵의 꼬리 영역은 단축되었고 푸르킨예 세포의 수는 감소하는 것으로 나타났다(Baker, G.A.; Bromley, R.L.; Briggs, M.; Cheyne, C.P.; Cohen, M.J.; Garc
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ana, M.; Gummery, A.; Kneen, R.; Loring, D.W.; Mawer, G.; Meador, K.J.; Shallcross, R.; Clayton-Smith, J.; Liverpool and Manchester Neurodevelopment Group. IQ at 6 Years After in Utero Exposure to Antiepileptic Drugs: A Controlled Cohort Study. Neurology, 2015, 84, 382-90.). 임신 중 VPA에 노출되면 태아 발프로에이트 증후군 (FVS)이 발생하여 비정상적인 발달 지연, 장기 기형, 사회적 기능 또는 의사 소통 장애를 유발한다. 이러한 증후군을 가진 사람들은 자폐성 행동을 보이기 때문에 FVS와 ASD는 서로 관련이있는 것으로 보이지만, FVS는 주로 척추이분증, 독특한 얼굴 특징, 선천성 심장 결함 및 기타 근골격계 이상을 동반한다. VPA에 의해 유발된 ASD를 연구하기 위해 Rodier등은 단일 용량 VPA로 자극된 쥐 배아를 사용하여 VPA 모델을 만들었다(Rodier et al., Embryological origin for autism: Developmental anomalies of the cranial nerve motor nuclei. J. Comp. Neurol. 1996, 370, 247-61.). 또한 Schneider와 Przewlocki는 임신 12.5 일에 VPA를 한 번 주사한 후 쥐의 ASD 행동을 평가하였다. 실험 후, 그들은 VPA에 노출된 수컷 쥐 새끼가 사교성 감소, 반복적 패턴, 통증에 대한 낮은 민감성, 발달 지연과 같은 자폐 적 행동과 이상을 보이는 것을 관찰하였다(Schneider, T.; and Przewlocki, R. Behavioral Alterations in Rats Prenatally Exposed to Valproic Acid: Animal Model of Autism. Neuropsychopharmacology. 2005, 30, 80-9.).
대부분의 ASD 사례의 정확한 원인은 알려지지 않았지만 다양한 대사 이상과 관련이 있는 것으로 제안되고 있다. 대사체학은 근본적인 생화학적 이상을 스크리닝하고 치료를 관리하기위한 유망한 도구이자 장애에 대한 가능한 새로운 바이오 마커를 조사하는 수단으로 등장하였다. 장애 및 통제 그룹의 대사 과정을 모니터링하여 비정상 대사 경로를 모니터링 할 수 있도록 대사체학 프로파일링 방법이 사용된다. 여기에는 약물의 효능이나 독성 또는 인간, 미생물 및 식물과 같은 특정 질병과 관련된 생화학적 경로 조사가 포함된다. 대사 연구에서는 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토 그래피, 질량 분석법 (MS)을 사용하여 대사 산물을 식별하고 그 결과는 다변량 통계 분석을 포함한 다양한 데이터 분석 방법을 통해 제시된다. NMR 분광법을 사용하는 대사 접근법은 생체 내 및 시험관 내에서 대사 변화를 확인하기 위해 가장 널리 사용되는 기술중 하나이다. NMR 분광법은 MS보다 덜 민감하나, NMR 분광법을 사용하면 많은 수의 화합물을 동시에 검출할 수 있고 시료 준비가 간단하며 비 중복 대사 산물에 대한 정량 및 정성 정보를 더 빠르고 경제적으로 더 높은 재현성으로 얻을 수 있다. 대사체학 접근법을 사용한 ASD의 조기진단에서 많은 연구자들은 혈액, 소변 및 뇌에서 ASD 바이오 마커를 보고하였다. 그러나 동물 모델 연구에서 VPA 유도 ASD에 대한 대사체학 접근법은 거의 이루어지지 않고 있었다.
따라서 본 발명자들은 대사체학 접근법을 사용하여 VPA 유도 ASD의 바이오 마커를 식별하였다. 본 발명의 목적은 임신 중 VPA에 노출된 쥐의 수컷 자손에서 얻은 뇌, 혈청 및 소변 샘플의 양성자 핵 자기 공명(1H NMR) 분석을 통해 자폐 스펙트럼 장애를 예측하기 위한 바이오 마커를 제공하는 데 있다.
또한, 상기 바이오마커를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물과 이를 유효성분으로 포함하는 진단용 키트 및 진단용 정보제공방법을 제공한다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 대사체를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트 및 1,3-디하이드록시아세톤은 피험자의 대뇌 전두엽 피질에서 얻어질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 갈락토스, 3-하이드록시부티레이트, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트는 피험자의 소변에서 얻어질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민 및 트레오닌은 피험자의 혈액에서 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 자폐 스펙트럼 장애는 자폐장애, 레트장애, 소아기 붕괴장애, 아스퍼거 증후군, 특정불능의 전반적 발달장애, 언어성 또는 비언어성 의사소통 장애 및 상동성 행동장애 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 피험자의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군 중 적어도 어느 하나의 대사체의 농도를 검출하는 단계; 다변량 통계분석(PLS-DA)을 통하여 상기 대사체와 대조군의 클러스터링을 확인하는 단계; 및 상기 검출된 대사체의 농도를 대조군과 비교하는 단계; 를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단 정보 제공 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 대사체의 농도를 검출하는 단계는 양성자 핵 자기 공명 분광법에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물은 대사체학 프로파일링 방법으로 확인되는 바이오마커를 이용한 것으로써, 환자와 정상대조군의 대사체 농도를 비교하여 자폐 스펙트럼 장애 진단에 사용될 수 있으며, 조기에 높은 정확도로 자폐 스펙트럼 장애를 판별할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 발프로산 투여로 자폐 스펙트럼 장애가 유발된 동물 모델의 행동분석을 사회성지수(SI) 및 사회적 선호도 지수(SPI)로 나타낸 것이다.
도 2는 뇌, 혈청 및 소변 시료를 PCA와 PLS-DA를 이용하여 1H-NMR 분석한 결과이다.
도 3은 VPA처리군과 대조군의 뇌, 혈청 및 소변 시료를 1H-NMR의 PLS-DA 분석하여 대사체의 VIP 점수를 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 명세서에서 사용된 용어 '대사체'는 대사 과정에서 생성되는 모든 생성물을 지칭하는 것으로 사용되며, 내인성 또는 외인성 요소에 의해 생성되고 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 대사체를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물이 제공된다.
하기 실시예 3을 참조하면, 상기 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트는 임신 중 VPA처리에 의해 ASD가 유발된 새끼 쥐의 체내에서 대사체학 프로파일링을 통해 대조군과 비교해 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정한 것이다.
상기 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물은, 상기 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트 중 어느 하나 이상을 포함하여, 피험자의 생체 시료에서 얻어진 대사체와 농도를 비교함으로써 자폐 스펙트럼 장애를 진단하는 데 이용될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 1,3-디하이드록시아세톤은 피험자의 대뇌 전두엽 피질에서 얻어지는 것일 수 있다. 피험자의 대뇌 전두엽 피질에서 시료를 얻는 방법은 당 업계에 알려진 모든 방법을 이용할 수 있으며, 하기 실시예에서 수행하는 방법으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 상기 자폐 스펙트럼 장애 진단용 조성물을 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트가 제공된다.
상기 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트는 피험자의 상기 대사체들의 농도를 분석하는 구성과 이를 대조군의 농도와 비교하는 구성을 필수적 구성으로 포함할 수 있으며, 어떠한 크기나 무게 등의 물리적인 규격으로 제한되지 않는다.
일 측에 따르면, 상기 자폐 스펙트럼 장애는 자폐장애, 레트장애, 소아기 붕괴장애, 아스퍼거 증후군, 특정불능의 전반적 발달장애, 언어성 또는 비언어성 의사소통 장애 및 상동성 행동장애 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 피험자의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 발린, 타우린, 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 글루코스, 크레아틴 포스페이트, 락테이트, 글루타민, 트레오닌, 갈락토스, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군 중 적어도 어느 하나의 대사체의 농도를 검출하는 단계; 다변량 통계분석을 통하여 상기 대사체와 대조군의 클러스터링을 확인하는 단계; 및 상기 검출된 대사체의 농도를 대조군과 비교하는 단계; 를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단 정보 제공 방법이 제공된다.
상기 다변량 통계분석은 바람직하게는 부분최소제곱회귀 분석법을 이용할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대사체의 농도를 검출하는 단계는 양성자 핵 자기 공명 분광법에 의해 이루어지는 것일 수 있다. 상기 양성자 핵 자기 공명 분광법은 시료의 종류에 따라 수행방법이 달라질 수 있으며, 바람직한 예시는 하기 실시예 3에서 제공되나 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : VPA유도 ASD 발현군의 제공
임신한 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐(n=10)는 OrientBio(한국)에서 구입하였다. VPA로 유도된 ASD의 동물 모델을 확립하기 위해 임신한 쥐에게 VPA의 나트륨염(Sigma-Aldrich사에서 구입)을 0.9% 식염수에 100mg/mL, pH 7.3의 농도로 용해하여 주사하였다. 임신한 쥐의 체중에 따라 투여량을 조절하였다. 임신 한 쥐는 임신 12 일째에 400mg/kg VPA의 단일 피하 주사를 받았다. 대조군 쥐는 식염수로 처리하였다. 젖 분비 어미개체들(Lactating dams)은 12시간의 명암 주기로 온도(22±2°C) 및 습도(55±5%) 제어 환경에서 새끼와 함께 사육되었다. 이 연구에서는 수컷새끼만 사용하였다. 동물실험은 실험동물관리원리(NIH 공보 제85-23호, 1985 년 개정)와 건국대학교 동물 관리 및 사용 지침 (KU19180)에 따라 수행하였다.
실시예 2 : ASD 발현 쥐의 행동분석
Kim et al.이 Male-specific alteration in excitatory post-synaptic development and social interaction in pre-natal valproic acid exposure model of autism spectrum disorder. J. Neurochem. 2013에 보고한 바와 같이 3챔버 방법을 통해 4주령 새끼를 대상으로 사회적 상호 작용 테스트를 수행하였다. 행동 실험은 전용 시험실에서 10:00 ~ 16:00 사이에 수행되었다. 첫 번째 세션에서 와이어 케이지에 갇힌 특정 동물과 함께 보낸 시간과 중립 또는 빈 케이지 위치에 있는 시간에 대해 조사하였다. 사교성 테스트에 이어, 다른 낯선 개체를 빈 우리에 배치하고 각 위치에서 보낸 시간을 측정하여 사회적 선호도 테스트를 수행하였다. 실험 중 움직임의 흔적은 EthoVision 소프트웨어(네덜란드 Wageningen사)를 사용하여 자동으로 기록하였다. 사교성(SI) 및 사회적 선호도 지수(SPI)는 각각 특정 동물과 함께 보낸 시간 대 빈 공간에서 보낸 시간의 비율, 그리고 새로운 동물과 함께 보낸 시간 대 친숙한 동물과 함께 보낸 시간의 비율로 계산되었다.
임신 중 VPA에 노출된 쥐 새끼의 사회적 상호 작용 행동을 3챔버 분석을 사용하여 조사한 결과, VPA처리군에서는 대조군에 비해 동일 랫트 주변의 체류시간이 감소하고 빈 공간에서의 체류시간이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 사회성 지수(SI)로 정의된 낯선 개체나 빈 공간에서의 체류 기간 비율은 VPA처리군이 대조군보다 유의하게 낮았다. 또한, 임신 중 VPA에 노출된 쥐 새끼는 익숙한 쥐(사회적 선호도 지수, SPI)보다 낯선 쥐에 대한 관심이 낮아 사회적 참신함을 추구하는 행동에 장애가 있음을 보여준다. 이러한 행동 특성은 자폐증 증상이 있는 아동의 사회적 적응장애 및 사회적 상호작용 부족의 특성과 유사하여 VPA유발 ASD 동물 모델에서 자폐 행동이 성공적으로 재현되었음을 보여준다(도 1).
실시예 3 : ASD발현 쥐의 뇌, 혈청 및 소변 시료의 대사체학 프로파일링
행동 테스트 후 쥐를 졸레틸-럼푼(Zoletil-Rompun)혼합물(3:1, v/v)로 마취하고 혈액, 소변 및 뇌(전두엽 피질)를 포함한 생물학적 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플은 1 mL 주사기를 사용하여 심장 천자를 통해 심장에서 수집하였다. 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 보관한 후 샘플을 900 x g에서 10분동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액만 새 에펜도르프 튜브에 보관하고 -80 °C에서 보관하였다. 뇌 전체를 추출하는 동안 또는 전에 소변 샘플을 200μl 피펫을 사용하여 수집하고 -80 °C 냉동고에 보관하였다. 두개골에서 뇌 전체를 제거한 후, 전두엽 피질을 조심스럽게 제거하고 50ml 원뿔형 튜브에서 액체 질소로 빠르게 냉동시켰다. 뇌 샘플은 추가 분석까지 -80 °C에서 보관되었다.
VPA (400 mg/kg)를 처리하거나 처리하지 않은 쥐의 뇌, 혈청 및 소변 샘플을 1H NMR로 분석하였다. 뇌 샘플은 400MHz HR-MAS NMR 분광계에서 분석하였고, 혈청 및 소변 샘플은 600MHz NMR 분광계(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 분석하였다.
혈청 샘플은 4 °C에서 해동하고 350 μL 분취량을 4 mM TSP-d4와 함께 350 μL의 D2O 용액이 들어있는 미세 원심분리 튜브에 첨가했하였다. 소변 샘플은 4 °C에서 해동한 다음 900 x g에서 5분 동안 원심분리하여 고체를 제거하였다. 소변에 대한 화학적 이동 척도의 정성표준인 100mM이미다졸과 5mM DSS(2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-술폰산)가 포함된 D2O용액 70μL가 들어있는 미세 원심분리기 튜브에 소변 샘플 600μl 분취량을 추가하였다. 또한, 0.42 % 아지드화나트륨 30μL를 첨가하였다. 볼텍싱 후, pH를 6.8로 조정하였다. 혈청 및 소변의 스펙트럼은 600MHz NMR 액체 프로브를 사용하여 26 °C에서 48시간 이내에 획득하였다. CPMG펄스는 다음 수집 매개변수와 함께 사용되었다. s 획득 시간 및 혈청에 대한 총 획득 시간은 13 분 9 초였다. 또한 2D NMR 분석을 수행하여 내인성 대사 산물이 식별됨을 검증하였다.
NMR 데이터는 FID 파일 형식으로 얻은 다음 스펙트럼은 푸리에 변환에 의해 수집되었다. 획득한 모든 스펙트럼을 단계적으로 조정하고 기준선을 수정하고 VnmrJ 4.2 소프트웨어(Aligent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 TSP-d4 피크(0ppm의 화학적 이동)를 참조하였다. 대사 산물의 식별 및 정량화는 Chenomx의 라이브러리 데이터베이스와 함께 Chenomx NMR Suite 8.3 Professional 소프트웨어 (Chenomx, Inc., Edmonton, Alberta, Canada)를 사용하여 수행하였다. 화학적 이동 및 정량화를 위한 내부 표준은 뇌 및 혈청의 경우 TSP-d4, 소변의 경우 DSS였다. 소변 샘플의 경우, 대사 산물의 농도는 크레아티닌 배설의 일정한 백분율을 가정하여 크레아티닌 농도에 의해 표준화된 상대 비율 값으로 나타내었다.
NMR 스펙트럼의 전처리를 위해 δ 0.0-10.0 스펙트럼 영역을 0.04ppm 너비의 영역으로 분할하여 각 NMR 스펙트럼에 250 개의 통합 영역을 설정하였다. 물 억제 효율의 변동을 방지하기 위해 모든 그룹에 대한 분석에서 물의 스펙트럼 영역 (δ 4.8-5.4)을 제거했다.
Chenomx NMR 소프트웨어의 패턴 분석을 통해 우리는 뇌, 혈청 및 소변 샘플에서 각각 42, 36 및 46 개의 대사 산물을 확인하였다. 다변량 분석은 수집된 NMR 데이터를 해석하는 데 사용되며 데이터는 주성분 분석 (PCA) 및 부분 최소 제곱 판별 분석 (PLS-DA)을 사용하여 시각화된다.
결과 데이터는 PCA와 PLS-DA에 적용되었고 두 그룹이 분리되는 것을 도2에 나타내었다. 뇌의 타우린, 락테이트, 미오이노시톨, 글루타메이트, 세린, 4-아미노 부티레이트, 1,3- 디하이드록시아세톤, 크레아틴, 류신, 발린, 2-옥소발레레이트, 라이신, 3-하이드록시부티레이트, 글리신, 에틸말로네이트 및 부타논 농도는 변수중요도척도(variable importance in projection, VIP)가 0.7 초과인 대사체로 선택된 것이었으며, VPA 처리 그룹에서 대조군에 비해 감소하였다(도3(A)). 이 중 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세, 아세토인, 미오이노시톨 및 타우린은 2군 내에서 유의한 차이가 있었다(p <0.05).
혈청에서 글루코스, 3-하이드록시부티레이트, 락테이트, 글리신, 크레아틴포스페이트, 트레오닌, 알라닌, 글루타민, 티로신, 3-하이드록시이소부티레이트, 아세테이트 및 2-하이드록시-3-메틸발레레이트 농도는 VPA 처리군과 대조군이 상이했고(VIP> 0.7), 글루코스, 락테이트, 크레아틴포스페이트, 글루타민 및 2-하이드록시-3-메틸발레레이트의 p값은 t-테스트에서 0.05 미만이었다 (도 3(B)).
소변에서 포름산염, 갈락토스, 크레아틴, 3-하이드록시부티레이트, 락테이트, 트레오닌, 미오이노시톨, 숙시네이트, 피멜레이트, 아라비니톨, 갈락토네이트, 3-히드 록시이소발레레이트, 발레레이트 및 콜린은 VIP점수가 0.7 초과였고, 갈락토스, 3-하이드록시부티레이트, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트는 VPA 처리군과 대조군간에 유의하게 달랐다(p <0.05, t-test)(도 3(C)).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (8)

  1. 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 대사체를 포함하는, VPA(Valproic acid)유도 자폐 스펙트럼 장애 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트 및 1,3-디하이드록시아세톤은 피험자의 대뇌 전두엽 피질에서 얻어지는 것인,
    VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3-하이드록시부티레이트, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트는 피험자의 소변에서 얻어지는 것인,
    VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VPA유도 자폐 스펙트럼 장애는 자폐장애, 레트장애, 소아기 붕괴장애, 아스퍼거 증후군, 특정불능의 전반적 발달장애, 언어성 또는 비언어성 의사소통 장애 및 상동성 행동장애 중 선택되는 어느 하나인,
    VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단용 바이오마커 조성물.
  7. 피험자의 시료를 제공하는 단계;
    상기 시료에서 미오이노시톨, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-디하이드록시아세톤, 피멜레이트, 갈락토네이트, 3-하이드록시이소발레레이트 및 발레레이트로 구성된 군 중 적어도 어느 하나의 대사체의 농도를 검출하는 단계;
    다변량 통계분석(PLS-DA)을 통하여 상기 대사체와 대조군의 클러스터링을 확인하는 단계; 및
    상기 검출된 대사체의 농도를 대조군과 비교하는 단계;
    를 포함하는, VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 대사체의 농도를 검출하는 단계는 양성자 핵 자기 공명 분광법에 의해 이루어지는 것인, VPA유도 자폐 스펙트럼 장애 진단 정보 제공 방법.
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