BR112014030243B1 - Métodos para diagnosticar doença valvular crônica - Google Patents

Métodos para diagnosticar doença valvular crônica Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR DOENÇA VALVULAR CRÔNICA. A presente invenção refere-se a proporção de métodos para o diagnóstico da doença valvular crônica em um animal. Os métodos compreendem a obtenção de uma amostra a partir do animal, analisando a amostra com relação à presença de um ou mais metabólitos associados com a doença valvular crônica; comparando a quantidade de cada um de tais metabólitos identificados na amostra com uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra a partir de um ou mais animais de controle comparáveis que não sofrem da doença valvular crônica, e usando a referida comparação para diagnosticar a doença valvular crônica no animal se os metabólitos encontrados na amostra do animal forem maiores do que ou menores do que a quantidade presente na amostra do animal de controle.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[001] Este pedido de patente reivindica prioridade com relação ao Pedido de Patente Provisório US 61/655,704, depositado em 5 de junho de 2012, a descrição do qual é incorporada aqui, neste pedido de patente por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÂO Campo da Invenção
[002] A invenção se refere de um modo geral a métodos para o diagnóstico de doença valvular crônica e especificamente a métodos para o diagnóstico de doença valvular através da medição de metabólitos associados com a doença valvular crônica.
Descrição da Técnica Relacionada
[003] A doença cardíaca é um dos distúrbios mais comuns em animais, incluindo animais tais como cães. Aproximadamente 11% dos cães sofrem de doença cardíaca, 95% dos quais tem um aparecimento quando adultos. Um terço dos cães de 10 anos de idade ou acima tem a Doença Valvular Crônica (CVD). A CVD é caracterizada através de uma degeneração progressiva e deformação das válvulas átrio ventriculares, mais comumente as válvulas mitrais, o que resulta em uma insuficiência precoce da válvula mitral. Isso, por sua vez, leva ao aparecimento de murmúrio sistólico cardíaco devido à regurgitação mitral, em que o fechamento não adequado da válvula mitral faz com que o sangue flua de volta para o átrio esquerdo. Os cães afetados finalmente desenvolvem uma sobrecarga do volume do átrio ventricular esquerdo, edema pulmonar, dilatação atrial e arritmias supraventriculares.
[004] Embora o tratamento médico ou cirúrgico das válvulas afetadas seja possível, a intervenção nutricional é de preferência para o cuidador do animal e para os profissionais de saúde. A detecção precoce e o tratamento são imperativos. No entanto, a detecção pode ser dificultada devido à falta de sintomas.
[005] Os biomarcadores correlacionados com uma doença ou condição especifica são úteis para a detecção de tal doença ou condição quando um animal está exibindo sintomas mínimos ou assintomáticos para o diagnóstico de tal doença ou condição. Em muitas situações, os metabólitos são biomarcadores úteis. Correntemente, no entanto, não existem biomarcadores conhecidos úteis como agentes de diagnóstico para a medição da doença valvular crônica em animais. Existe, por esse motivo, uma necessidade com relação à biomarcadores que sejam úteis para o diagnóstico da doença valvular crônica em animais. Esses biomarcadores poderão permitir que um cuidador de animais ou um profissional de saúde proveja o nível mais apropriado e efetivo de tratamento, evitando, por exemplo, a cirurgia, quando possível. Esse tratamento poderia melhorar a qualidade de vida do animal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Por esse motivo, é um objetivo da presente invenção o de prover métodos para o diagnóstico da doença valvular crônica em animais.
[007] Esses e outros objetivos são alcançados com a utilização de métodos para o diagnóstico da doença valvular crônica em um animal, que envolve a obtenção de uma amostra biológica a partir do animal; analisando a amostra com relação à presença de um ou mais metabólitos associados com a doença valvular crônica; comparando a quantidade de cada um de tais metabólitos identificados na amostra a uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra a partir de um ou mais animais de controle que não sofrem da doença valvular crônica; e usando a referida comparação para o diagnóstico da doença valvular crônica no animal se os metabólitos encontrados na amostra do animal são maiores do que ou menores do que a quantidade dos mesmos metabólitos presente na amostra do animal de controle, dependendo do metabólito específico e se a quantidade desse metabólito na amostra é conhecida para aumentar em um animal que esteja sofrendo da doença valvular crônica, ou é conhecida para diminuir em animais que sofrem da doença valvular crônica.
[008] Outros objetivos e objetivos adicionais, características e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes com facilidade para aquelas pessoas versadas na técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[009] O termo "animal" significa qualquer animal suscetível de ou que esta sofrendo da doença valvular crônica.
[010] Os termos "metabólito" ou "biomarcador" significam moléculas pequenas, os níveis ou intensidade das quais são medidos em uma amostra biológica, que podem ser usados como marcadores para o diagnóstico de um estado de doença.
[011] A expressão "animal de controle comparável" significa um animal da mesma espécie e tipo ou um animal individual avaliado em duas ocasiões diferentes.
[012] O termo "diagnosticando" significa determinar se um animal está sofrendo de ou prevendo se o animal está suscetível a desenvolver a doença valvular crônica.
[013] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, as faixas são usadas aqui, neste pedido de patente, em taquigrafia, de modo a evitar ter que relacionar e descrever cada um e cada valor dentro da faixa. Qualquer valor apropriado dentro da faixa pode ser selecionado, quando apropriado, como o valor superior, o valor inferior ou o término do faixa.
[014] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, a forma singular de uma palavra inclui o plural e vice-versa, a não ser que o contexto mostre claramente de outra forma. Desse modo, as referências "um/uma", "um/uma" e "o/a" são em geral inclusivas dos plurais dos respectivos termos. Por exemplo, a referência a "um método" inclui uma pluralidade de tais "métodos". De modo similar, as palavras "compreendem", "compreende" e "compreendendo" são para serem interpretadas de forma inclusiva, ao contrário do que de forma exclusiva. Da mesma forma, os temos "inclui", "incluindo" e "ou" devem ser todos considerados como sendo incluído, a não ser que tal construção seja claramente proibida a partir do contexto.
[015] Os métodos e composições e outros avanços descritos aqui, neste pedido de patente, não estão limitados à metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos aqui, neste pedido de patente, devido a que, na medida em que a pessoa versada na técnica irá apreciar, eles podem variar. Além disso, a terminologia usada aqui, neste pedido de patente, é com a finalidade de descrever modalidades especificas somente, e não está destinada a, e não limita o âmbito do que o que é divulgado ou reivindicado.
[016] A não ser que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos, termos da técnica e acrônimos usados aqui, neste pedido de patente, têm os significados comumente entendidos por uma pessoa de habilidade na técnica, no campo ou campos da invenção nos quais o termo é usado.
[017] Todas as patentes, pedidos de patente, publicações, artigos técnicos e/ou acadêmicos e outras referências citadas ou referidas aqui, neste pedido de patente, são incorporados em suas totalidades aqui, neste pedido de patente, por referência no grau permitido pela lei. A discussão dessas referências é destinada meramente a resumir as asserções feitas aqui, neste pedido de patente. Nenhuma admissão é feita de que qualquer uma de tais patentes, pedidos de patente, publicações ou referências, ou qualquer parte das mesmas sejam material relevante ou técnica precedente. O direito de contestar a precisão e a pertinência de qualquer asserção de tais patentes, pedido de patentes, publicações e outras referências como relevantes, materiais ou técnica precedente é especificamente reservada.
A invenção
[018] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para o diagnóstico da doença valvular crônica em um animal. Os métodos compreendem a obtenção de uma amostra a partir do animal, analisando a amostra com relação à presença de um ou mais metabólitos associados com a doença valvular crônica; comparando a quantidade de cada um de tais metabólitos identificados na amostra com uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra a partir de um ou mais animais de controle comparáveis que não sofrem da doença valvular crônica, e com a utilização da referida comparação, diagnosticar a doença valvular crônica no animal se os metabólitos encontrados na amostra do animal são maiores do que ou menores do que a quantidade presente na amostra do animal de controle. A quantidade ou a concentração de alguns metabólitos em tais amostras é conhecida para aumentar em animais que estejam sofrendo da doença valvular crônica, enquanto que a quantidade ou a concentração de alguns metabólitos em tais amostras é conhecida para diminuir em animais que estejam sofrendo da doença valvular crônica. O diagnóstico pode ser feito com base somente nos metabólitos que são conhecidos para aumentar em quantidade como descrito, somente os metabólitos que são conhecidos para diminuir em quantidade como descrito, ou uma combinação dos mesmos.
[019] Em determinadas modalidades, os métodos compreendem a obtenção de uma amostra biológica a partir do animal, analisando a amostra com relação à presença de dois ou mais metabólitos associados com a doença valvular crônica; comparando a quantidade de cada um de tais metabólitos identificados na amostra a uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra a partir de um ou mais animais de controle comparáveis que não sofram da doença valvular crônica; e usando a referida comparação para o diagnóstico da doença valvular crônica no animal se a quantidade de cada um de tais metabólitos encontrados na amostra do animal é menor do que a quantidade presente na amostra do animal de controle, maior do que a quantidade presente na amostra do animal de controle ou uma combinação das mesmas.
[020] A invenção é baseada na constatação de que os metabólitos da presente invenção estão presentes na amostra biológica do animal e que a quantidade dos metabólitos na amostra serve como o indicador bioquímico para diagnosticar a doença valvular crônica através da indicação ou da previsão do limite com relação à doença valvular crônica. A investigação permite que os cuidadores e veterinários ou outros profissionais de cuidados com a saúde executem testes com relação a esses "biomarcadores" em uma amostra e determinem se o animal está suscetível ou está sofrendo da doença valvular crônica e se existe a necessidade de mais diagnósticos ou tratamentos. Tendo estabelecido a necessidade de diagnósticos adicionais ou tratamentos, o custo e o risco de tais diagnósticos ou tratamentos adicionais são justificados.
[021] Em determinadas modalidades, um ou mais animais de controle comparáveis que não seja o animal que está sendo avaliado com relação à doença valvular crônica e que tenha sido determinado como não sofrendo da doença valvular crônica, são avaliados com relação a pelo menos um dos metabólitos, e os resultados de tais avaliações são usados como um valor de linha de base para a comparação com os resultados a partir de um animal que está sendo avaliado com relação a tal um ou mais dos metabólitos. Em modalidades de preferência, o valor da linha de base com relação aos metabólitos é determinado através da avaliação de numerosos animais de controle que possam ser comparados.
[022] Em outras modalidades, a quantidade de pelo menos um dos metabólitos é determinada com relação a um animal em vários tempos através de toda a vida do animal e os resultados são usados para a determinação de se o animal está suscetível ou está sofrendo da doença valvular crônica, como por exemplo, se a quantidade de tal, pelo menos um dos metabólitos, aumenta ou diminui (como apropriado com relação ao biomarcador específico analisado dependendo de se a quantidade de tal biomarcador é conhecida como tanto aumentando ou diminuindo na medida em que um animal desenvolve a doença valvular crônica) na medida em que o animal envelhece, o animal pode ser diagnosticado como suscetível ou como estar sofrendo da doença vascular crônica. Em modalidades de preferência, o animal é avaliado periodicamente e os resultados com relação aos metabólitos analisados são registrados. Em seguida, se uma avaliação subsequente mostrar que a quantidade do ou mais metabólitos tenha aumentado ou diminuído (como apropriado com relação ao biomarcador especifico analisado dependendo de se a quantidade de tal biomarcador tanto aumenta como diminui na medida em que o animal desenvolva a doença vascular crônica) desde a última ou as últimas avaliações, o animal é diagnosticado como suscetível a ou estar sofrendo da doença vascular crônica.
[023] Qualquer amostra biológica que contenha o metabólito ou os metabólitos de interesse é útil na invenção. Os exemplos incluem, porém não estão limitados a, sangue (soro/plasma), fluido cérebro espinhal (CFS), urina, fezes, hálito, saliva ou biópsia de qualquer tecido. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra de soro. Embora o termo "soro" seja usado aqui, neste pedido de patente, aquelas pessoas versadas na técnica irão reconhecer que ou o plasma ou o sangue total ou uma subfração de sangue total também podem ser usados.
[024] As amostras biológicas são analisadas com relação a um metabólito específico, com a utilização de qualquer método adequado conhecido na técnica com relação a tal metabólito. Por exemplo, e sem desejar ficar limitado de qualquer maneira, os extratos de amostras biológicas são possíveis de serem analisados sobre essencialmente qualquer plataforma de espectrometria de massa, tanto através de injeção direta ou seguindo a separação cromatográfica. Os espectrômetros de massa típicos são compostos por uma fonte que ioniza as moléculas dentro da amostra, e um detector para detectar as moléculas ionizadas ou os fragmentos de moléculas. Os exemplos não limitativos de fontes comuns incluem impacto de elétron, ionização através de eletropulverização (ESI),ionização química em pressão atmosférica (APCI), fotoionização em pressão atmosférica (APPI), ionização de desadsorção de laser auxiliada com matriz (MALDI), ionização de desadsorção de laser em superfície melhorada (SLDI), e as derivações das mesmas. Os sistemas comuns de separação e de detecção de massa podem incluir quadrupólo, armadilha de íon quadrupolar, armadilha de íon linear, tempo de vôo (TOF), setor magnético, ciclotron de íon (FTMS) e as derivações e combinações dos mesmos. A vantagem do FTMS sobre as outras plataformas com base em MF é a sua alta capacidade de resolução que permite para a separação dos metabólitos que sejam diferentes por somente centenas de um Dalton, muitos dos quais poderiam ser perdidos através de instrumentos de resolução mais baixa.
[025] Em modalidades de preferência, as amostras biológicas são analisadas com relação a um metabólito selecionado (biomarcador), com a utilização de espectrometria de massa em cromatografia líquida (LC-MS), espectrometria de massa em cromatografia gasosa (GC-MS), ou espectrometria de cromatografia líquida e armadilha de íon linear quando o método exigido é um método de alto rendimento.
[026] Embora o uso de um dos metabólitos seja suficiente para o diagnóstico da doença valvular crônica, o uso de um ou mais, dois ou mais, ou quatro ou mais de tais metabólitos está englobado dentro da invenção e pode ser de preferência em muitas circunstâncias. Os metabólitos podem ser analisados e usados para um diagnóstico em qualquer combinação.
[027] Em algumas modalidades, o diagnóstico é baseado na determinação da quantidade de um ou mais metabólitos, selecionados a partir de glutamato, C-glicosiltriptofano, beta-hidroxi-isovalerato, glutaciona oxidada, eritronato, N-acetilneuraminato, lactato, cis- aconitato, succinilcarnitina, malato, pentadecanoato (15:0), margarato (17:0), metil palmitato (15 ou 2), 12-HEPE, hexanoilcarnitina, glicero- fosforilcolina, 1-estearoilglicerofosfoinositol, N6-carbamoil- treoniladenosina, citidina, pantotenato, N-glicolilneuraminato, X - 11400, X - 12729, X - 13422, X - 13543, X - 14272, X - 16277, 12-HETE, tromboxane B2, sarcosina (N-Metilglicina), beta-hidroxipiruvato, serina, treonina, valina, metionina, dimetilarginina (SDMA + ADMA), gama- glutamilmetionina, glicose, 2-hidroxioctanoato, deoxicarnitina, 1- palmitoleoilglicerolfosfocolina, 1-oleoilglicerofosfocolina, 2- oleoilglicerofosfocolina, 1-linoleoilglicerofosfocolina, 2-linoleoilglicerofosfocolina, 1-eicosadienoilglicerofosfocolina, 1- aracidonoilglicerofosfocolina, 1-docosapentaenoilglicerofosfocolina, 4- hidroximandelato, X - 03088, X - 04357, X - 11793, X - 11818, X - 12771, X - 12786, e X - 13494.
[028] Em outras modalidades, o diagnóstico é baseado na determinação de se a quantidade de cada um de tais metabólitos encontrados na amostra do animal é maior quando comparado com a quantidade presente na amostra do animal de controle, em que os metabólitos são glutamato, C-glicosiltriptofan, beta-hidroxi-isovalerato, glutaciona oxidada, eritronato, N-acetilneuraminato, lactato, cis- aconitato, succinilcarnitina, malato, pentadecanoato (15:0), margarato (17:0), metil palmitato (15 ou 2), 12-HEPE, hexanoilcarnitina, glicero- fosforilcolina, 1-estearoilglicerofosfoinositol, N6-carbamoil- treoniladenosina, citidina, pantotenato, N-glicolilneuraminato, X - 11400, X - 12729, X - 13422, X - 13543, X - 14272, X - 16277, 12-HETE, tromboxane B2. Em uma modalidade de preferência, o diagnóstico é baseado na determinação de se a quantidade de cada um de tais metabólitos encontrados na amostra do animal é maior quando comparada com a quantidade presente na amostra do animal de controle, em que os metabólitos são glutaciona, N-acetilneuraminato, lactato, succinilcarnitina, hexanoilcarnitina, 12-HETE e tromboxane B2.
[029] Em uma modalidade, o diagnóstico é baseado quando determinando se a quantidade de cada um de tais metabólitos encontrados na amostra do animal é menor do que quando comparada com a quantidade presente na amostra do animal de controle, em que os metabólitos são sarcosina (N-Metilglicina), beta-hidroxipiruvato, serina, treonina, valina, metionina, dimetilarginina (SDMA + ADMA), gama-glutamilmetionina, glicose, 2-hidroxioctanoato, deoxicarnitina, 1- palmitoleoilglicerofosfocolina, 1-oleoilglicerofosfocolina, 2- oleoilglicerofosfocolina, 1-linoleoilglicerofosfocolina, 2-linoleoilglicerofosfocolina, 1-eicosadienoilglicerofosfocolina, 1- aracidonoilglicerofosfocolina, 1-docosapentaenoilglicerofosfocolina, 4- hidroximandelato, X - 03088, X - 04357, X - 11793, X - 11818, X - 12771, X - 12786, e X - 13494. Em uma modalidade de preferência, o diagnóstico é baseado quando determinando se a quantidade de cada um de tais metabólitos encontrados na amostra do animal é menor do que quando comparada com a quantidade presente na amostra do animal de controle, em que os metabólitos são dimetilarginina, (SDMA + ADMA), glicose e deoxicartitina.
[030] Em várias modalidades, o animal é um canino tal como um cão.
EXEMPLOS
[031] A invenção também pode ser ilustrada através dos exemplos que se seguem, embora seja entendido que esses exemplos são incluídos meramente com a finalidade de ilustração e não estão destinados a limitar o âmbito da invenção, a não ser que especificamente indicado.
Exemplo 1
[032] Projeto do estudo. Amostras de soro foram tomadas a partir de grupos representativos de caninos. O grupo de controle (11) não mostrou sinais de doença cardíaca e o outro grupo consistiu em sujeitos (18) que tinham sido previamente diagnosticados com doença cardíaca. As amostras foram analisadas para serem obtidos perfis dos metabólitos e os dados da análise com relação aos biomarcadores indicativos de doença cardíaca.
[033] Preparação da amostra. Todas as amostras foram mantidas a -80°C até serem processadas. O processo de preparação da amostra foi executado com a utilização do sistema automático MicroLab STAR® (Ohamilton Company, Reno, NV). Os padrões de recuperação foram adicionados antes da primeira etapa no processo de extração com relação às finalidades de controle de qualidade. A preparação da amostra foi executada com a utilização de uma série de extrações orgânicas e aquosas para a remoção da fração de proteína enquanto permitindo a recuperação máxima das moléculas pequenas. O extrato que resultou foi dividido em duas frações; uma para análise através de cromatografia líquida (LC) e uma para análise através de cromatografia gasosa (GC). As amostras foram colocadas rapidamente em um TurboVap® (Zymark, Claiper Life Science, Hopkinton, MA) para a remoção do solvente orgânico. Cada amostra foi em seguida congelada e secada sob vácuo. As amostras foram em seguida preparadas para o instrumento apropriado, tanto LC/MS como GC/MS.
[034] Cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/ MS, LC/ MS2): a parte da LC/ MS da plataforma foi baseada em um Waters ACQUITY UPLC e um Thermo-Finnigan LQT espectrômetro de massa (Thermo Fisher Corporation, Waltham, MA), que consistiu em uma fonte de ionização de eletro pulverização (ESI) e um analisador de massa de armadilha de íon linear (LIT). O extrato da amostra foi dividido em duas alíquotas, secado, em seguida reconstituído em solventes ácidos ou básicos compatíveis com LC, cada uma das quais continham 11 ou mais padrões de injeção em concentrações fixas. Uma alíquota foi analisada com a utilização de condições ácidas de íon positivo otimizadas e outra com a utilização de condições básicas de íon negativo otimizadas em duas injeções independentes com a utilização de colunas dedicadas separadas. Os extratos reconstituídos em condições ácidas foram eluídos em gradiente com a utilização de água e metanol, ambos contendo 0,1% de ácido fórmico, enquanto que os extratos básicos também usaram água/metano, contendo 6,5 mM de bicarbonato de amônio. A análise MS se alternou entre MS e varredura MS2 dependente de dados com a utilização de exclusão dinâmica.
[035] Cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC/MS): as amostras destinadas para a analise em GC/MS foram ressecadas em desidratação sob vácuo durante um mínimo de 24 horas antes de serem derivatizadas com a utilização de nitrogênio seco usando bistrimetil-silil trifluor acetamida (BSTFA). A coluna de GS foi de 5% fenila e a rampa de temperatura foi a partir de 40° até 300°C em um período de 16 minutos. As amostras foram analisadas em um espectrômetro de massa simples-quádruplo de varredura rápida (Thermo Fisher Corporation, Waltham, MA), com a utilização de ionização de impacto de elétron. O instrumento foi afinado e calibrado com relação à resolução de massa e precisão de massa em uma base diária. A produção de informação a partir dos documentos de dados em bruto foi extraída de forma automática como discutido abaixo.
[036] Determinação Precisa de Massa e fragmentação MS/ MS (LC/MS), (LC/MS/MS): a parte LC/MS da plataforma foi baseada em um espectrômetro de massa Waters ACQUITY UPLC and a ThermoFinnigan LTQ-FT (Thermo Fisher Corporation, Waltham, MA), que tinha uma armadilha de íon linear (LIT) na frente e um espectrômetro de massa ciclotron de ressonância de transformação de íon Fourier (FT- ICR) por trás. Com relação a íons com contagem maior do que 2 milhões, uma medição de massa precisa pode ser executada. As medições precisas de massa puderam ser feitas no íon de origem bem como em fragmentos. O erro típico de massa foi de menos do que 5 ppm. Os íons com menos do que dois milhões de contagens exigiram uma quantidade maior de esforço para serem caracterizados. O espectros de fragmentação (MS/MS) foram tipicamente gerados de uma maneira dependente dos dados, porém, se necessário, os MS/MS objetivados puderam ser empregados tal como no caso de sinais de nível mais baixo.
[037] Bioinformática: os sistemas de informática consistiram em quatro componentes principais, o Laboratory Information Management System (LIMS), o software de extração de dados e de identificação de picos, as ferramentas de processamento de dados para a identificação de OC e compostos, e uma coleção de ferramentas de interpretação de informações e de visualização para serem utilizados pelos analistas de dados. As fundações do hardware e do software com relação a esses componentes de informática foram o esqueleto LAN e um servidor de dados de operando o Oracle 10.2.1 Enterprise Edition.
[038] LIMS: a finalidade do sistema LIMS foi a de permitir informação de laboratório totalmente auditável através de um sistema seguro, fácil de ser usado, e altamente especializado. O âmbito do sistema LIMS engloba o acesso à amostra, preparação da amostra e análise instrumental e registro e análise avançada de dados. Todos dos sistemas de software subsequentes estão aterrados nas estruturas de dados LIMS. Ele foi modificado com relação à alavancagem e a interface com a extração de informação internas e os sistemas de visualização de dados, bem como a instrumentação de terceira pessoa e software de análise de dados.
[039] Extração de Dados e Segurança da Qualidade: a extração de dados dos arquivos de dados da espectrometria de massa em bruto produziu informações que poderiam ser carregadas em um banco de dados relacionados e manipulados sem recorrer à manipulação BLOB. Uma vez na base de dados, a informação foi examinada e os limites QC apropriados foram impostos. Os picos foram identificados com a utilização do software de integração de pico, e as partes componentes foram armazenadas em uma estrutura de dados complexa separada e especificamente projetada.
[040] Identificação de compostos: os compostos foram identificados através de comparação a entradas em conjuntos de padrões purificados ou entidades recorrentes não conhecidas. A identificação de entidades químicas conhecidas foi baseada em comparação às entradas em conjuntos metabolômicos de padrões purificados. A combinação de propriedades da cromatografia e dos espectros de massa deu uma indicação de uma igualdade ao composto especifico em uma entidade isobárica. Entidades adicionais puderam ser identificadas em virtude da natureza recorrente das mesmas (tantos nos espectros cromatográficos como nos espectros de massa). Esses compostos tiveram o potencial de serem identificados através da aquisição futura de um padrão igualado purificado ou através de análise de estrutura clássica.
[041] Resultados. O número total de metabólitos detectado no estudo foi de 506. Esses metabólitos foram 320 compostos nomeados e 186 compostos não nomeados. Os compostos não nomeados representam uma única molécula de uma fórmula e de estrutura molecular separada, porém não puderam ser igualados com um bioquímico correntemente nomeado. Entre os 506 metabólitos identificados, 54 foram encontrados como sendo estatisticamente significativos (p < 0,05). Os metabólitos estatisticamente significativos estão identificados na Tabela 1.Tabela 1
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[042] No relatório, foram descritas modalidades típicas de preferência da invenção. Embora termos específicos tenham sido empregados, eles são usados somente em um sentido genérico e descritivo, e não com a finalidade de limitação. O âmbito da invenção é descrito nas reivindicações. Obviamente, muitas modificações e variações da invenção são possíveis na luz dos ensinamentos acima. Por esse motivo, fica entendido que dentro do âmbito das reivindicações em anexo, a invenção pode ser praticada de outra forma do que a especificamente descrita.

Claims (8)

1. Método para diagnosticar doença valvular crônica em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende: analisar a amostra obtida do animal quanto à presença do metabólito glutamato, e, opcionalmente, um metabólito adicional associado à doença valvular crônica; e comparar a quantidade de cada um desses metabólitos identificados na amostra com uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra de um ou mais animais de controle comparáveis que não sofrem de doença valvular crônica; e utilizar a referida comparação para diagnosticar doença valvular crônica no animal se a quantidade de cada metabólito encontrado na amostra do animal for maior que a quantidade presente na amostra do animal de controle, sendo que a amostra é uma amostra de soro.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico é baseado na determinação da quantidade de dois ou mais metabólitos associados à doença valvular crônica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico é baseado na determinação da quantidade de três ou mais metabólitos associados à doença valvular crônica.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico é baseado na determinação da quantidade de quatro ou mais metabólitos associados à doença valvular crônica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o metabólito adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em C-glicosiltritofano, beta-hidroxiisovalerato, glutationa oxidada, eritronato, N-acetilneuraminato, lactato, cisacito, succinilcarnitina, malato, pentadecanoato (15:0), margarato (17:0), palmitato de metila (15 ou 2), 12-HEPE, hexanoilcarnitina, glicerofosforilcolina, 1-estearoilglicerofosfoquinositol, N6-carbamoil- tronil-adenosina, citidina, pantotenato, N-glicolil-neuraminato, 12-HETE, tromboxano B2, sarcosina (N-Metilglicina), beta-hidroxipiruvato, serina, treonina, valina, metionina, dimetilarginina (SDMA + ADMA), gama- glutamilmetionina glicose, 2-hidroxioctanoato, desoxicarnitina, 1- palmitoleoilglicerofosfocolololina, 1-oleoleolilglicerofosfocolololina, 1- oleoleolilglicerofosfocolololina, 2-linoleoilglicerofosfocololina, 1- eicosadienolilglicerofosfolina, 1-araquidonoilglicerofosfocololina, 1- docosapentaenoilglicerofosfocololina, 4-hidroximandelato.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o animal é um canino.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o animal é um cão.
8. Método para diagnosticar doença valvular crônica em um canino, caracterizado pelo fato de que compreende: analisar uma amostra biológica obtida do canino para presença de dois ou mais metabólitos associados à doença valvular crônica, onde um dos metabólitos é o glutamato; e comparar a quantidade de cada um desses metabólitos identificados na amostra com uma quantidade correspondente do mesmo metabólito presente em uma amostra de um ou mais caninos de controle comparáveis que não sofrem de doença valvular crônica; e utilizar essa comparação para diagnosticar doença valvular crônica no canino se a quantidade de cada um desses metabólitos encontrada na amostra do canino é menor que a quantidade presente na amostra do canino controle, sendo que a amostra é uma amostra de soro, sendo que os metabólitos são sarcosina (N-metilglicina), beta- hidroxipiruvato, serina, treonina, valina, metionina, dimetilarginina (SDMA + ADMA), gama-glutamilmetionina glicose, 2-hidroxioctanoato, desoxicarnitina, 1-palmitoleoilglicerofosfocolina, 1- oleoilglicerofosfocolina, 2-oleoilglicerofosfocolina, 1- linoleoilglicerofosfocolina, 2-linoleoilglicerofosfocolina, 1- eicosadienoilglicerophosfocholina, 1-arachidonoilglicerophosfocholina, 1-docosapentaenoilglicerofosfocolina, 4-hidroximeandelato; e utilizar essa comparação para diagnosticar doença valvular crônica no canino se a quantidade de cada metabólito encontrado na amostra do canino for maior do que a quantidade presente na amostra do canino de controle, sendo que os metabólitos são glutamato, C-glicosiltriptofano, beta-hidroxiisovalerate, glutationa oxidada, eritronato, N- acetilneuraminato, lactato, cis-aconita, succinilcarnitina, malato, pentadecanoato (15:0), margarato (17:0), palmitato de metila (15 ou 2), 12-HEPE, hexanoilcarnitina, glicerofosforilcolina, 1- estearoilglicerofosfoinositol, N6-carbamoiltreoniladenosina, ctidina, pantotenato, N-glicolneuraminato, 12 -HETE, e tromboxano B2 ou uma combinação desses.
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