JP2015524066A - 慢性弁膜疾患を診断するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法を提供する。本方法は、該動物から試料を得ることと、慢性弁膜疾患に関連する１つ又は複数の代謝産物の有無について該試料を分析することと、該試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較することと、前記比較を用いて、該動物の試料中で認められた該代謝産物が、該対照動物の試料中に存在する該量より多ければ又は少なければ該動物には慢性弁膜疾患ありと診断することとを含む。【選択図】なし

Description

[0002]本発明は、一般的には、慢性弁膜疾患を診断するための方法、詳細には、慢性弁膜疾患に関連する代謝産物を測定することにより慢性弁膜疾患を診断するための方法に関する。

[0003]心疾患は、動物、例えばイヌなどの動物において、最も一般的な障害の１つである。イヌのおよそ１１％が心疾患を患っており、そのうち９５％は、成体になってから発症している。１０歳以上のイヌの３分の１が慢性弁膜疾患（ＣＶＤ：Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｖａｌｖｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）を有している。ＣＶＤは、房室弁、最も一般的には僧帽弁が進行性に変性及び変形して初期の僧帽弁閉鎖不全に至ることが特徴である。僧帽弁閉鎖不全になると、僧帽弁の不適切な閉鎖が原因で血液が左心房に逆流する僧帽弁逆流が生じ、これによる収縮期心雑音が発生するようになる。ＣＶＤに罹患したイヌは、最終的には、左房室の容量過負荷、肺水腫、心房拡張及び上室性不整脈を発症する。

[0004]罹患した弁の外科的又は内科的な処置が可能ではあるが、動物の介護者及び医療専門家による栄養学的介入が好ましい。早期の発見及び処置が不可欠である。しかし、症状が乏しいことから、発見は難しい場合がある。

[0005]特定の疾患若しくは状態と相関しているバイオマーカーは、動物が症状をほとんど示していない若しくは無症候である場合の当該疾患若しくは状態の発見、又は、当該疾患若しくは状態の診断に有用である。多くの場合、代謝産物は有用なバイオマーカーである。しかし、現時点では、動物における慢性弁膜疾患を測定するための診断剤として有用な公知のバイオマーカーは存在しない。したがって、動物における慢性弁膜疾患の診断に有用なバイオマーカーが必要とされている。そのようなバイオマーカーがあれば、動物の介護者又は医療専門家は、例えば外科手術を極力避けるなど、最も適切且つ有効なレベルの処置を行うことが可能になるであろう。そのような処置であれば、動物のクオリティーオブライフは改善されよう。

[0006]したがって、本発明の目的は、動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法を提供することである。

[0007]上記及び他の目的は、動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法であって、該動物から生体試料を得ることと、慢性弁膜疾患に関連する１つ又は複数の代謝産物の有無について該試料を分析することと、該試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較することと、前記比較を用いて、該動物の試料中で認められた該代謝産物が、該対照動物の試料中に存在する該同種の代謝産物の量より多ければ又は少なければ（そのいずれであるかは、特定の代謝産物と、試料中の当該代謝産物の量が、慢性弁膜疾患に罹患している動物においては増加することが既知であるか、それとも慢性弁膜疾患に罹患している動物においては減少することが既知であるか、とによって決まる）該動物には慢性弁膜疾患ありと診断することとを含んでいる方法を用いて達成される。

[0008]本発明の、他の及びさらなる目的、特徴並びに利点は、当業者には容易に明らかとなろう。

定義
[0009]用語「動物」は、慢性弁膜疾患にかかりやすい又は罹患している任意の動物を意味する。

[0010]用語「代謝産物」又は「バイオマーカー」は、疾患状態を診断するためのマーカーとして使用し得る小分子であり、その濃度又は強度が生体試料中で測定されるものを意味する。

[0011]用語「比較対照動物」は、同じ種及び種類の動物、又は、２つの異なる時点で評価される動物個体を意味する。

[0012]用語「診断する（こと）」は、動物が慢性弁膜疾患に罹患しているかどうかを決定すること、又は、動物が慢性弁膜疾患を発症しやすいかどうかを予測することを意味する。

[0013]本明細書において使用する場合、範囲は、当該範囲内のありとあらゆる値を列挙及び記載する必要を回避するために、本明細書においては省略表現で使用する。当該範囲内の任意の適切な値は、適宜、当該範囲の上限値、下限値、又は境界値として選択できる。

[0014]本明細書において使用する場合、文脈によりそうでないことが明確に述べられていない限り、ある単語の単数形には複数形が含まれ、その逆も同様である。したがって、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」と言った場合は、一般に、それぞれの用語の複数形を包含する。例えば、「方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」と言った場合は、複数の当該「方法（ｍｅｔｈｏｄｓ）」が含まれる。同様に、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「〜を含む（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包含的なものと解釈されたい。同じように、用語「〜を含む、〜が含まれる、〜が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を含む（こと）、〜が挙げられる、〜など（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「若しくは、又は、或いは（ｏｒ）」は、すべて、包含的な構造であってはならないことが文脈から明らかでない限り、包含的なものと解釈されるべきである。

[0015]本明細書で開示する方法及び組成物及び他の進歩は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されるものではなく、その理由は、当業者にはよく理解されるであろうが、方法論、プロトコール、及び試薬は変化することがあるからである。さらに、本発明において使用する専門的用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的としたものであり、開示又は特許請求する本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、実際に限定しない。

[0016]別に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語及び科学用語、専門用語、並びに頭字語は、本発明の分野（複数可）、又は当該用語が使用される分野（複数可）の当業者により一般的に理解される意味を有する。

[0017]本明細書において引用又は参照する特許、特許出願、刊行物、技術論文及び／又は学術論文、並びに他の参考文献はすべて、法の認める範囲で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような参考文献についての論考は、当該文献においてなされている主張を要約することを意図したにすぎない。そのような特許、特許出願、刊行物、若しくは参考文献の一切、及び、それらの一切の部分も、関連する、必須の、又は先行する技術であると認めるものではない。そのような特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献の、関連する、必須の、又は先行する技術としての一切の主張の正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利は、明確に留保される。

本発明
[0018]一態様において、本発明は、動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法を提供する。本方法は、該動物から生体試料を得ることと、慢性弁膜疾患に関連する１つ又は複数の代謝産物の有無について該試料を分析することと、該試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較することと、前記比較を用いて、該動物の試料中で認められた該代謝産物が、該対照動物の試料中に存在する該量より多ければ又は少なければ該動物には慢性弁膜疾患ありと診断することとを含む。当該試料中のある代謝産物の量又は濃度は、慢性弁膜疾患に罹患している動物においては増加することが既知であるが、当該試料中のある代謝産物の量又は濃度は、慢性弁膜疾患に罹患している動物においては減少することが既知である。診断は、量が増加することが既知である記載の代謝産物のみ、又は量が減少することが既知である記載の代謝産物のみ、又はそれらの組合せに基づいて行うことができる。

[0019]多様な実施形態において、本方法は、該動物から生体試料を得ることと、慢性弁膜疾患に関連する２つ以上の代謝産物の有無について該試料を分析することと、該試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較することと、前記比較を用いて、該動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、該対照動物の試料中に存在する該量より少なければ該動物には慢性弁膜疾患ありと診断すること、又は該対照動物の試料中に存在する該量より多ければ該動物には慢性弁膜疾患ありと診断すること、又はその組合せとを含む。

[0020]本発明は、本発明の代謝産物が動物の生体試料中に存在し、且つ、試料中の代謝産物の量が、慢性弁膜疾患の閾値を指示又は予測することにより慢性弁膜疾患の診断のための生化学的な指示物質として働くという発見に基づいている。本発明により、介護者及び獣医又は他の医療専門家は、試料中のこのような「バイオマーカー」についての検査を実施して、動物が慢性弁膜疾患にかかりやすい又は罹患しているかどうか、及び、さらなる診断又は処置が必要かどうかを決定することができるようになる。さらなる診断又は処置の必要性が確立されていれば、そのようなさらなる診断又は処置のコスト及びリスクは妥当なものとなる。

[0021]多様な実施形態では、慢性弁膜疾患の評価対象である動物でも慢性弁膜疾患に罹患していないことが確定している動物でもない１個体又は複数の比較対照動物を少なくとも１つの代謝産物について評価し、当該評価の結果を、当該１つ又は複数の代謝産物について評価されている動物から得られた結果との比較用のベースライン値として使用する。好ましい実施形態では、代謝産物のベースライン値は、多数の比較対照動物を評価することにより決定される。

[0022]他の実施形態では、ある動物について少なくとも１つの代謝産物の量をその動物の生涯にわたり多様な時点で決定し、その結果を用いて、その動物が慢性弁膜疾患にかかりやすい又は罹患しているかどうかを決定する。例えば、ある動物が高齢化するに従って当該少なくとも１つの代謝産物の量が増加又は減少（分析される特定のバイオマーカーについて適宜。その動物が慢性弁膜疾患を発症すると当該バイオマーカーの量が増加することが既知であるか減少することが既知であるかによって決まる）すれば、その動物が慢性弁膜疾患にかかりやすい又は罹患していると診断することができる。好ましい実施形態では、動物は定期的に評価され、分析される代謝産物の結果が記録される。そして、後続の評価により、前回の評価（複数可）以降、１つ又は複数の代謝産物の量が増加又は減少（分析される特定のバイオマーカーについて適宜。その動物が慢性弁膜疾患を発症すると当該バイオマーカーの量が増加することが既知であるか減少することが既知であるかによって決まる）していることが示されれば、その動物は慢性弁膜疾患にかかりやすい又は罹患していると診断される。

[0023]所望の代謝産物（複数可）を含有する任意の生体試料は、本発明において有用である。例としては、限定されるものではないが、血液（血清／血漿）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、大便、呼気、唾液、又は、任意の組織の生検試料が挙げられる。一実施形態において、試料は、血清試料である。本明細書では「血清」という用語を使用しているが、当業者であれば、血漿若しくは全血、又は全血の副画分を使用することもできるということは認識するであろう。

[0024]生体試料は、特定の代謝産物について、当該代謝産物に適した当技術分野で公知の任意の方法を用いて分析される。例であり、いかなる形でも限定的であることを望むものではないが、生体試料の抽出物は、本質的に任意の質量分析（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）のプラットフォームにおいて、直接注入又は次に挙げるクロマトグラフ分離のいずれによっても分析しやすい。典型的な質量分析計は、試料内の分子をイオン化するイオン化源、及び、イオン化された分子又は分子のフラグメントを検出するための検出器で構成される。一般的なイオン化源の非限定的な例としては、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、及びそれらの派生形態が挙げられる。一般的な質量分離及び検出システムとしては、四重極型、四重極イオントラップ型、線形イオントラップ型、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場型、イオンサイクロトロン型（ＦＴＭＳ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ型、並びにそれらの派生形態及び組合せを挙げることができる。ＦＴＭＳが他のＭＳベースのプラットフォームに優る点は、これより低分解能の機器ではその多く（ｍａｎｙ ｗｈｉｃｈ）が見逃されるであろうわずか数１００分の１ダルトンしか違わない代謝産物の分離を可能にする高い分解能力を有することである。

[0025]好ましい実施形態において、生体試料は、選択した代謝産物（バイオマーカー）について、液体クロマトグラフィー（ＬＣ：ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ：ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、又は、必要な方法がハイスループット法である場合は液体クロマトグラフィー及び線形イオントラップ質量分析を用いて、分析する。

[0026]慢性弁膜疾患の診断には代謝産物のうち１つの使用で十分ではあるが、当該代謝産物のうち１つ又は複数、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の使用が本発明内に包含され、多くの場合、このような使用が好ましいと考えられる。代謝産物は、任意の組合せで分析して診断に使用することができる。

[0027]いくつかの実施形態では、診断は、グルタミン酸、Ｃ−グリコシルトリプトファン、β−ヒドロキシイソバレラート、酸化型グルタチオン、エリトロナート、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、ｃｉｓ−アコニタート、スクシニルカルニチン、マラート、ペンタデカノアート（１５：０）、マルガラート（１７：０）、パルミチン酸メチル（１５又は２）、１２−ＨＥＰＥ、ヘキサノイルカルニチン、グリセロホスホリルコリン、１−ステアロイルグリセロホスホイノシトール、Ｎ６−カルバモイルトレオニルアデノシン、シチジン、パントテナート、Ｎ−グリコリルノイラミナート、Ｘ−１１４００、Ｘ−１２７２９、Ｘ−１３４２２、Ｘ−１３５４３、Ｘ−１４２７２、Ｘ−１６２７７、１２−ＨＥＴＥ、トロンボキサンＢ２、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、β−ヒドロキシピルバート、セリン、トレオニン、バリン、メチオニン、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、γ−グルタミルメチオニン、グルコース、２−ヒドロキシオクタノアート、デオキシカルニチン、１−パルミトレオイルグリセロールホスホコリン、１−オレオイルグリセロホスホコリン、２−オレオイルグリセロホスホコリン、１−リノレオイルグリセロホスホコリン、２−リノレオイルグリセロホスホコリン、１−エイコサジエノイルグリセロホスホコリン、１−アラキドノイルグリセロホスホコリン、１−ドコサペンタエノイルグリセロホスホコリン、４−ヒドロキシマンデラート、Ｘ−０３０８８、Ｘ−０４３５７、Ｘ−１１７９３、Ｘ−１１８１８、Ｘ−１２７７１、Ｘ−１２７８６、及びＸ−１３４９４から選択される１つ又は複数の代謝産物の量を決定することに基づいて行われる。

[0028]他の実施形態では、診断は、動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、対照動物の試料中に存在する量に比して大きいかどうかを決定することに基づいて行われ、この場合の代謝産物は、グルタミン酸、Ｃ−グリコシルトリプトファン、β−ヒドロキシイソバレラート、酸化型グルタチオン、エリトロナート、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、ｃｉｓ−アコニタート、スクシニルカルニチン、マラート、ペンタデカノアート（１５：０）、マルガラート（１７：０）、パルミチン酸メチル（１５又は２）、１２−ＨＥＰＥ、ヘキサノイルカルニチン、グリセロホスホリルコリン、１−ステアロイルグリセロホスホイノシトール、Ｎ６−カルバモイルトレオニルアデノシン、シチジン、パントテナート、Ｎ−グリコリルノイラミナート、Ｘ−１１４００、Ｘ−１２７２９、Ｘ−１３４２２、Ｘ−１３５４３、Ｘ−１４２７２、Ｘ−１６２７７、１２−ＨＥＴＥ、及びトロンボキサンＢ２である。好ましい一実施形態では、診断は、動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、対照動物の試料中に存在する量に比して大きいかどうかを決定することに基づいて行われ、この場合の代謝産物は、酸化型グルタチオン、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、スクシニルカルニチン、ヘキサノイルカルニチン、１２−ＨＥＴＥ、及びトロンボキサンＢ２である。

[0029]一実施形態では、診断は、動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、対照動物の試料中に存在する量に比して小さいかどうかを決定することに基づいて行われ、この場合の代謝産物は、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、β−ヒドロキシピルバート、セリン、トレオニン、バリン、メチオニン、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、γ−グルタミルメチオニン、グルコース、２−ヒドロキシオクタノアート、デオキシカルニチン、１−パルミトレオイルグリセロホスホコリン、１−オレオイルグリセロホスホコリン、２−オレオイルグリセロホスホコリン、１−リノレオイルグリセロホスホコリン、２−リノレオイルグリセロホスホコリン、１−エイコサジエノイルグリセロホスホコリン、１−アラキドノイルグリセロホスホコリン、１−ドコサペンタエノイルグリセロホスホコリン、４−ヒドロキシマンデラート、Ｘ−０３０８８、Ｘ−０４３５７、Ｘ−１１７９３、Ｘ−１１８１８、Ｘ−１２７７１、Ｘ−１２７８６、及びＸ−１３４９４である。好ましい一実施形態では、診断は、動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、対照動物の試料中に存在する量に比して小さいかどうかを決定することに基づいて行われ、この場合の代謝産物は、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、グルコース、及びデオキシカルニチンである。

[0030]多様な実施形態において、動物は、イヌ科の動物、例えばイヌである。

[0031]本発明は、下記の実施例によりさらに例証することができるが、本実施例は、単に例証の目的で含めてあるものであり、別に具体的に示されていない限り、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことは理解されよう。

実施例１
[0032]試験デザイン。血清試料は、イヌ科の動物の２つの代表群から採取した。対照群（１１）は、心疾患の徴候を示さなかった動物であり、他方の群は、心疾患ありと過去に診断されたことがある被験動物（１８）で構成された。試料を分析して代謝プロファイルを得、心疾患を示すバイオマーカーのデータを分析した。

[0033]試料調製。すべての試料は、加工するまで−８０℃で維持した。試料調製プロセスは、自動化されたマイクロラブ スター（ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ）（登録商標）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を用いて実施した。抽出プロセスにおける第１のステップに先立ち、品質管理を目的として回収標準液（ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ）を添加した。試料調製は、一連の有機溶媒抽出及び水抽出を用いて実施することで、タンパク質画分を除去しつつ小分子を最大に回収できるようにした。その結果得られた抽出物を２つの画分に分け、１つは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による分析用、１つはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析用とした。試料をターボバップ（ＴｕｒｂｏＶａｐ）（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ、Ｃｌａｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）に短時間載せて、有機溶媒を除去した。次いで、各試料を凍結させ、真空下で乾燥させた。次いで、ＬＣ／ＭＳ又はＧＣ／ＭＳいずれかの適切な機器に合わせて試料を調製した。

[0034]液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ^２）：プラットフォームのＬＣ／ＭＳ部は、ウォーターズ アクイティ（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ）ＵＰＬＣ及びサーモフィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をベースに、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源及び線形イオントラップ（ＬＩＴ）質量分析器から構成されたものであった。試料抽出物を２つのアリコートに分け、乾燥させ、次いで、それぞれ１１種以上の注入標準物質を一定の濃度で含有する酸性又は塩基性のＬＣ適合性の溶媒中で再構成した。別々の専用のカラムを使用した２つの独立的な注入において、一方のアリコートは酸性陽イオン最適化条件を用いて、他方は塩基性陰イオン最適化条件を用いて、分析した。酸性条件下で再構成した抽出物は、水及びメタノール（どちらも０．１％ギ酸を含有する）を使用してグラジエント溶出し、塩基性抽出物の場合は、同じく水／メタノールではあるが６．５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含有するものを使用した。ＭＳ分析は、動的排除を用いて、ＭＳとデータ依存ＭＳ^２スキャンとを交互に行った。

[0035]ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）：ＧＣ／ＭＳ分析用とした試料は、真空乾燥下で最低２４時間にわたり繰り返し乾燥させた後、ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）を用いて乾燥窒素下で誘導体化した。ＧＣカラムは５％フェニルであり、温度傾斜は１６分間で４０°から３００℃になるようにする。試料は、電子衝撃イオン化を用いて、高速スキャンを行うシングル四重極質量分析計であるサーモフィニガン トレース（Ｔｒａｃｅ）ＤＳＱ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で分析した。装置は、質量分解能及び質量精度について毎日調整及び較正した。生データファイルからの情報出力は、以下に述べるように自動的に抽出された。

[0036]正確な質量の決定及びＭＳ／ＭＳフラグメント化（ＬＣ／ＭＳ）、（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）：プラットフォームのＬＣ／ＭＳ部は、ウォーターズ アクイティＵＰＬＣ及びサーモフィニガンＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をベースに、フロントエンドに線形イオントラップ（ＬＩＴ）を、バックエンドにフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計を有するものであった。カウントが２００万を超えるイオンについては、正確な質量測定を実施することができた。正確な質量測定は、親イオンだけでなくフラグメントについても行うことができた。典型的な質量誤差は、５ｐｐｍ未満であった。２００万カウント未満のイオンの場合は、特徴付けのために、より多大な労力を必要とする。フラグメント化スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）は、典型的にはデータ依存方式で生成されたが、必要に応じて、例えばシグナルのレベルが低い場合などは、ターゲットＭＳ／ＭＳを用いることができた。

[0037]バイオインフォマティクス：インフォマティクスシステムは、４つの主要な構成要素、すなわち、実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）、データ抽出及びピーク同定ソフトウェア、ＱＣ及び化合物同定のためのデータ処理ツール、並びに、データ分析者が使用するための情報解釈集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）及び可視化ツールから構成されたものであった。これらのインフォマティクス構成要素を支えるハードウェア及びソフトウェアは、ＬＡＮ幹線、及び、オラクル（Ｏｒａｃｌｅ）１０．２．０．１ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｅｄｉｔｉｏｎを動作させるデータベースサーバーであった。

[0038]ＬＩＭＳ：ＬＩＭＳシステムの目的は、安全性が高く簡単に使えて高度に特殊化されたシステムを通じて、完全に監査可能な実験室自動化ができるようにすることであった。ＬＩＭＳシステムの範囲には、試料の利用（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｉｎｇ）、試料調製及び機器分析及びレポート及び高度なデータ解析が包含される。後続のソフトウェアシステムはすべて、ＬＩＭＳデータ構造を土台としている。ＬＩＭＳは、組織内の情報抽出及びデータ可視化システム、並びにサードパーティーの機器類及びデータ解析ソフトウェアと共に活用されインターフェースが構築されるように、改変してある。

[0039]データ抽出及び品質保証：質量分析の生データファイルのデータ抽出により、リレーショナルデータベースに読み込みＢＬＯＢ操作に頼らずに操作することができる情報が得られた。一度データベースで情報が調べられると、適切なＱＣ制限が課された。ピークは、ピーク積分ソフトウェアを用いて同定し、成分部分は、別の特別に設計された複合データ構造に格納された。

[0040]化合物同定：化合物は、精製された標準品のライブラリー登録項目又は繰り返し現れる未知の実在物との比較により同定した。既知の化学的実在物の同定は、精製された標準品のメタボロミクスライブラリー登録項目との比較に基づいて行った。クロマトグラフィーの特性と質量スペクトルとの組合せにより、特定の化合物との、又は同重体である実在物とのマッチが示された。それ以外の実在物は、繰り返し現れるその性質（クロマトグラフィー的性質及び質量スペクトル的性質の両方）により、同定することができた。このような化合物は、精製された標準品とのマッチングの将来的な獲得により、又は古典的な構造解析により、同定される可能性がある。

[0041]結果。本試験において検出された代謝産物の総数は、５０６種であった。命名されている化合物が３２０種、及び、無名の化合物が１８６種あった。無名の化合物とは、別々の分子式及び構造を有するが現時点で命名されている生化学物質とマッチさせることができなかった単一分子を表す。同定された５０６種の代謝産物のうち５４種は、統計学的に有意である（ｐ≦０．０５）ことが見出された。統計学的に有意な代謝産物を表１において同定する。

[0042]本明細書において、本発明の典型的な好ましい実施形態を開示してきた。特定の用語を用いてはいるが、そのような用語は、限定の目的ではなく、一般的且つ説明的な意味合いのみにおいて使用している。本発明の範囲は、特許請求の範囲に記載する。言うまでもなく、前述の教示に照らせば、本発明の多くの改変形及び変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に記載されている以外の形で実行し得ることを理解されたい。
［関連出願の相互参照］

[0001]本出願は、２０１２年６月５日に出願された米国特許仮出願第６１／６５５７０４号の優先権を主張するものであり、同文献の開示内容は、本参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (20)

1. 動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法であって、
   前記動物から生体試料を得るステップと、
   慢性弁膜疾患に関連する１つ又は複数の代謝産物の有無について前記試料を分析するステップと、
   前記試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較するステップと、
   前記比較を用いて、前記動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、前記対照動物の試料中に存在する前記量より多ければ前記動物には慢性弁膜疾患ありと診断するステップと
   を含む方法。
2. 前記試料が血清試料である、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
3. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する２つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
4. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する３つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
5. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する４つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
6. 前記代謝産物が、グルタミン酸、Ｃ−グリコシルトリプトファン、β−ヒドロキシイソバレラート、酸化型グルタチオン、エリトロナート、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、ｃｉｓ−アコニタート、スクシニルカルニチン、マラート、ペンタデカノアート（１５：０）、マルガラート（１７：０）、パルミチン酸メチル（１５又は２）、１２−ＨＥＰＥ、ヘキサノイルカルニチン、グリセロホスホリルコリン、１−ステアロイルグリセロホスホイノシトール、Ｎ６−カルバモイルトレオニルアデノシン、シチジン、パントテナート、Ｎ−グリコリルノイラミナート、Ｘ−１１４００、Ｘ−１２７２９、Ｘ−１３４２２、Ｘ−１３５４３、Ｘ−１４２７２、Ｘ−１６２７７、１２−ＨＥＴＥ、及びトロンボキサンＢ２である、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
7. 前記代謝産物が、酸化型グルタチオン、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、スクシニルカルニチン、ヘキサノイルカルニチン、１２−ＨＥＴＥ、及びトロンボキサンＢ２である、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
8. 前記動物がイヌ科の動物である、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
9. 前記動物がイヌである、請求項１に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
10. 動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法であって、
    前記動物から生体試料を得るステップと、
    慢性弁膜疾患に関連する１つ又は複数の代謝産物の有無について前記試料を分析するステップと、
    前記試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較するステップと、
    前記比較を用いて、前記動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、前記対照動物の試料中に存在する前記量より少なければ前記動物には慢性弁膜疾患ありと診断するステップと
    を含む方法。
11. 前記試料が血清試料である、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
12. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する２つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
13. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する３つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
14. 前記診断が、慢性弁膜疾患に関連する４つ以上の代謝産物の量を決定するステップに基づいて行われる、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
15. 前記代謝産物が、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、β−ヒドロキシピルバート、セリン、トレオニン、バリン、メチオニン、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、γ−グルタミルメチオニン、グルコース、２−ヒドロキシオクタノアート、デオキシカルニチン、１−パルミトレオイルグリセロホスホコリン、１−オレオイルグリセロホスホコリン、２−オレオイルグリセロホスホコリン、１−リノレオイルグリセロホスホコリン、２−リノレオイルグリセロホスホコリン、１−エイコサジエノイルグリセロホスホコリン、１−アラキドノイルグリセロホスホコリン、１−ドコサペンタエノイルグリセロホスホコリン、４−ヒドロキシマンデラート、Ｘ−０３０８８、Ｘ−０４３５７、Ｘ−１１７９３、Ｘ−１１８１８、Ｘ−１２７７１、Ｘ−１２７８６、及びＸ−１３４９４である、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
16. 前記代謝産物が、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、グルコース、及びデオキシカルニチンである、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
17. 前記動物がイヌ科の動物である、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
18. 前記動物がイヌである、請求項１０に記載の動物における慢性弁膜疾患を診断するための方法。
19. イヌ科の動物において慢性弁膜疾患を診断するための方法であって、
    前記イヌ科の動物から生体試料を得るステップと、
    慢性弁膜疾患に関連する２つ以上の代謝産物の有無について前記試料を分析するステップと、
    前記試料中で同定された当該代謝産物それぞれの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体又は複数のイヌ科の比較対照動物由来の試料中に存在する同種の代謝産物の対応する量と比較するステップと、
    前記比較を用いて、前記イヌ科の動物の試料中で認められた当該代謝産物それぞれの量が、前記イヌ科の対照動物の試料中に存在する前記量より少なければ前記イヌ科の動物には慢性弁膜疾患ありと診断するステップであり、前記代謝産物が、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、β−ヒドロキシピルバート、セリン、トレオニン、バリン、メチオニン、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、γ−グルタミルメチオニン、グルコース、２−ヒドロキシオクタノアート、デオキシカルニチン、１−パルミトレオイルグリセロホスホコリン、１−オレオイルグリセロホスホコリン、２−オレオイルグリセロホスホコリン、１−リノレオイルグリセロホスホコリン、２−リノレオイルグリセロホスホコリン、１−エイコサジエノイルグリセロホスホコリン、１−アラキドノイルグリセロホスホコリン、１−ドコサペンタエノイルグリセロホスホコリン、４−ヒドロキシマンデラート、Ｘ−０３０８８、Ｘ−０４３５７、Ｘ−１１７９３、Ｘ−１１８１８、Ｘ−１２７７１、Ｘ−１２７８６、及びＸ−１３４９４であるステップ、又は前記イヌ科の対照動物の試料中に存在する前記量より多ければ前記イヌ科の動物には慢性弁膜疾患ありと診断するステップであり、前記代謝産物が、グルタミン酸、Ｃ−グリコシルトリプトファン、β−ヒドロキシイソバレラート、酸化型グルタチオン、エリトロナート、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、ｃｉｓ−アコニタート、スクシニルカルニチン、マラート、ペンタデカノアート（１５：０）、マルガラート（１７：０）、パルミチン酸メチル（１５又は２）、１２−ＨＥＰＥ、ヘキサノイルカルニチン、グリセロホスホリルコリン、１−ステアロイルグリセロホスホイノシトール、Ｎ６−カルバモイルトレオニルアデノシン、シチジン、パントテナート、Ｎ−グリコリルノイラミナート、Ｘ−１１４００、Ｘ−１２７２９、Ｘ−１３４２２、Ｘ−１３５４３、Ｘ−１４２７２、Ｘ−１６２７７、１２−ＨＥＴＥ、及びトロンボキサンＢ２であるステップ、或いはその組合せであるステップと
    を含む方法。
20. 前記代謝産物が、ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ＋ＡＤＭＡ）、グルコース、デオキシカルニチン、酸化型グルタチオン、Ｎ−アセチルノイラミナート、ラクタート、スクシニルカルニチン、ヘキサノイルカルニチン、１２−ＨＥＴＥ、トロンボキサンＢ２、又はそれらの組合せである、請求項１９に記載のイヌ科の動物において慢性弁膜疾患を診断するための方法。