CN115389756B - 一种预测房颤发生风险的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体提供了一种预测房颤发生风险的检测试剂盒及其应用，本发明提供的生物标志物或者生物标志物组合物，预测房颤发生风险有良好的敏感性和特异性，具备临床应用前景。

Description

一种预测房颤发生风险的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种预测房颤发生风险的检测试剂盒及其应用。

背景技术

心房颤动（Atrial Fibrillation，AF），简称房颤，是临床上最常见的心律失常，发病率正随着人口老龄化的发展而显著上升，流行病学资料显示，目前全球房颤患者已高达4000万人，且正以每年200万人的速度逐年递增。

房颤与诸多心血管不良事件紧密相关，可导致患者的心室率（律）紊乱，严重时甚至出现室颤或者心脏骤停；促使血栓形成，并发脑卒中；长期房颤可引发和加重心力衰竭等，严重危害患者健康，加重医疗费用负担。而目前国内外有关房颤预测的研究成果，预测效能较低，并且很少应用于临床实践，使得房颤难以被早期预警、早期干预，因此本领域迫切需要开发能够有效预测房颤发病风险的生物标志物。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供用于预测房颤风险的生物标志物，具体提供了一种预测房颤发生风险的检测试剂盒及其应用。

本发明提供了一种生物标志物在制备预测心房颤动发生风险的产品中的用途，所述生物标志物选自鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、精氨酸或者甲硫氨酸。

本发明还提供了一种用于预测心房颤动发生风险的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包括精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸。

进一步地，所述生物标志物组合物包含鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇和精氨酸。

进一步地，所述生物标志物组合物还包含甲硫氨酸。

本发明还提供了任一所述的生物标志物组合物在制备用于预测心房颤动风险的产品中的用途。

进一步地，所述产品为试剂盒。

进一步地，所述试剂盒包括生物标志物的标准品；优选的，优选的，所述试剂盒还包括溶剂1、溶剂2和溶剂3，其中溶剂1为体积百分数15-25%乙腈和75-85%甲醇的混合液，溶剂2为含8-12mM乙酸铵和体积百分数为0.2-0.4%氨水的水溶液，溶剂3为体积百分比为85-95%乙腈和5-15%水的混合液。氨水为浓氨水，例如每100mL含10mM乙酸铵的水溶液中加入0.3mL的浓氨水。

进一步地，所述预测是检测待测受试者血清或血浆中的生物标志物或者生物标志物组合物的水平值，若当受试者血清或血浆中上述任一种生物标准物的水平值或者上述任一所述的生物标志物组合物中的每一种生物标志物的水平值低于参考值下限或高于参考值上限时，则所述受试者具有发生心房颤动的风险。

其中，本发明中的参考值下限和参考值上限分别为对照人群水平的第5百分位数和第95百分位数。

具体地，对于鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、N-乙酰-L-酪氨酸、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇、精氨酸或者甲硫氨酸来说，低于参考值下限时，则所述受试者具有发生心房颤动的风险，对于异胞嘧啶、2'-O-甲基胞苷来说，高于参考值上限时，则所述受试者具有发生心房颤动的风险。

进一步地，通过质谱联用液相色谱法测定生物标志物的水平。

进一步地，所述心房颤动发生风险是指心脏外科手术术后发生心房颤动的风险。

本发明中，心脏外科手术是指主要通过开胸或者胸腔镜完成的手术，包括冠状动脉旁路移植手术、瓣膜修复手术或者瓣膜置换手术，还包括先天性心脏病开胸修补手术等。

本发明还提供了一种预测心房颤动发生风险的试剂盒，包括任一所述的生物标志物组合物。

本发明还提供了所述的生物标志物或者所述的生物标志物组合物在制备用于筛选预防或治疗心房颤动的药物中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1. 本发明研究发现，鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、精氨酸或者甲硫氨酸可作为生物标志物，这些生物标志物预测房颤发生风险有良好的敏感性和特异性，具备临床应用前景。

2. 本发明所述生物标志物，可以包含精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的组合物。尤其是包含鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇和精氨酸的组合物，具有较高的敏感性和特异性。

更加突出的是，上述组合物中还包含甲硫氨酸时，具有更高的敏感性和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是对同一质控样本质谱检测分析的总离子流图（TIC）重叠图；

图2是QC样本相关性分析；

图3是各组样本中CV分布图；

图4是鸟氨酸和乙酰谷酰胺用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图5是尿嘧啶和2-甲氧基苯甲酸用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图6是异胞嘧啶和N-乙酰-L-酪氨酸用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图7是2'-O-甲基胞苷和肌醇用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图8是精氨酸和甲硫氨酸用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图9是组合1（即精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的组合）的水平用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图10是组合2（即鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇和精氨酸的组合）的水平用于预测心房颤动的 ROC 曲线；

图11是组合3（即鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇、精氨酸和甲硫氨酸的组合）的水平用于预测心房颤动的 ROC 曲线。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

1、临床样品

在首都医科大学附属北京安贞医院符合心脏外科手术适应症并进行手术的患者纳入本研究，所有研究对象术前没有心房颤动，实验组人群是心脏外科术后（冠状动脉旁路移植手术）经心电图确诊的房颤患者，共101例。参加本研究的所有对照人群在心脏外科术后（冠状动脉旁路移植手术）同一时期中的医学检查中没有出现心电图确诊的房颤，共101例。

房颤诊断标准：完整的12导联心电图记录到房颤特征性心电图表现，或者单导联记录超过30秒，特征心电图表现为：（1）“绝对”不规则R-R间期（无完全房室传导阻滞的基础上）；（2）体表心电图上无明显P波；（3）心房周期长度（可见时）常小于200毫秒。

参考文献：《心房颤动外科治疗中国专家共识2020版》

注意事项：排除标准是既往房颤史，合并瓣膜病、肿瘤或者甲状腺疾病，二次或急诊手术，服用过或正在服用抗心律失常药物，拒绝参与实验的患者。

2、质谱联用液相色谱技术检测化合物水平

主要仪器：LC-MS/MS，型号QTRAP 6500+，品牌SCIEX。

血浆样本采集：采集房颤患者和健康对照人群空腹状态下静脉血1ml，3000 rpm×10min 离心后留取上清于-80℃冻存。

血浆样本的前处理：（1）样本解冻后，涡旋10 s混匀；（2）取样本50 μL（取完样的样本尽快放回-80 ℃冰箱保存）加入到对应的已编号的1.5 mL离心管中，加入250 μL溶剂1（体积百分数20 %乙腈和80%甲醇的混合液）；（3）涡旋3 min后离心，12000 r/min，4 ℃条件下离心10 min；（4）离心完后吸取上清液250 μL到另一个编好号的1.5 mL离心管中，-20℃冰箱中静置30 min；（5）12000 r/min，4 ℃条件下再离心10 min；（6）取180 μL上清液过蛋白沉淀板后用于上机通过HPLC-MS进行代谢谱分析，上机液置于-20℃保存。从每个血浆样本中取出等体积(10μL)样品并混合均匀，将其作为“质量控制”(QC)样本，该样本用于估计一个能够代表在分析过程中所遇到的所有分析物的“平均”谱(profile)。每隔10个检测分析样本插入一个质控样本，以进一步监测系统稳定性。

（1）检测方法：液相色谱采用的是梯度洗脱的方法，色谱柱选择 ACQUITY UPLCBEH Amide 柱（1.7 µm， 100 mm×2.1 mm i.d.），流动相：A相，溶剂2：超纯水（10mM乙酸铵，体积百分数为0.3%氨水）；B相，溶剂3：90%乙腈/10%水（V/V），流速0.40 mL/min；柱温40°C；进样量2 μL ；流动相梯度：0-1.2 min A/B为5:95（V/V），8 min A/B为30:70（V/V），9.0-11min A/B为50:50（V/V），11.1-15 min A/B为5:95（V/V）。质谱条件：电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度550℃，正离子模式下质谱电压 5500 V，负离子模式下质谱电压-4500 V，气帘气（Curtain Gas，CUR）35 psi。在Q-Trap 6500+ 中，每个离子对是根据优化的去簇电压（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）进行扫描检测。

标准品溶液的制备：配制0.01 ng/mL、0.02 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL、10000 ng/mL、20000 ng/mL不同浓度的标准品溶液。标准品分别是2-羟基十六烷酸、十八烷二酸、没食子酸、十六烷-1,16-二酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水杨酸、高香草酸、3-羟基异戊酸、苯丙酮酸、2-糠酸、2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、尿囊素、辛二酸、黄尿酸/黄嘌呤酸、肌苷、DL-3-苯乳酸、喹啉酸、对羟基苯甲酸、马尿酸、羟基异己酸、alpha-亚麻酸、延胡索酸/富马酸、羟基癸酸、石胆酸、5-甲基尿苷、肌醇、甲基丙二酸/异琥珀酸、猪脱氧胆酸、苯乙醛酸、4-羟苯基丙酮酸、Alpha-酮戊二酸、乙酰丙酸、alpha-羟基异丁酸、二羟基苯基乙酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、肠二醇、3,4-二甲氧基苯乙酸、1,3-二甲基尿酸、DL-泛醇、4-羟基苯甲醛、苯丙氨酰苯丙氨酸、2-羟基-2-甲基丁酸、尿黑酸、甘氨胆酸、1,7-二甲基尿酸、5,6-二羟基吲哚-2-羧酸、6-羟基褪黑素、甘氨石胆酸、3-羟基-5-胆甾烯酸酯、生物蝶呤、己酰甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、3-羟基-3-甲基谷氨酸、反式-乌头酸、乙基丙二酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、环腺苷酸、2,4-二羟基苯甲酸、3-甲基-2-氧代戊酸、咖啡酸、三碘甲状腺原氨酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、6-磷酸葡萄糖酸、泛酸、苯氧乙酸、蓖麻油酸、甘氨酰-L-缬氨酸、N-L-gamma-谷氨酰-L-亮氨酸、对甲酚硫酸盐铵盐、2,6 -二异丙基Β- D -吡喃葡萄糖酸、3-甲基水杨酸、硫酸脱氢表雄酮、衣康酸、异亮氨酰-异亮氨酸、隐绿原酸、3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸、omega-鼠胆酸、甘氨石胆酸-3-硫酸盐、甘氨猪去氧胆酸、3-氧代胆酸、鹅去氧胆酸24-酰基-beta-D-葡糖苷酸、7-酮基脱氧胆酸、去甲胆酸、熊胆酸、5-羟甲基-2-呋喃甲酸、吲哚丙酮酸、12,13-DiHOME、尿嘧啶-5-羧酸、3-甲氧基苯甲酸、3-羟基丁酸、朱砂精酸、鼠尾草酸、吲哚-3-乙酰胺、牛磺猪胆酸、牛磺-beta－鼠胆酸、牛磺熊去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨猪胆酸、牛磺石胆酸、3beta-胆酸、脱氧胸苷酸、3-羟基-2-吡啶甲酸、2-羟基-3-甲基丁酸、N-肉桂基甘氨酸、3,4-二羟基苯丙酸、戊烯二酸、12-羟基十二酸、beta-鼠胆酸、猪胆酸、7-酮基石胆酸、12-酮基石胆酸、7,12-二酮石胆酸、甘氨脱氢胆酸、牛磺脱氢胆酸、23-脱甲脱氧胆酸、别脱氧胆酸、异石胆酸、别异石胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆酸、牛磺脱氧胆酸、脱氢石胆酸、3-氧代-12alpha羟基-24胆酸、3beta-脱氧胆酸、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸、邻羟基苯乙酸、4-甲氧基苯乙酸、4-羟基-3-甲基苯甲酸、(E)-3-吲哚丙烯酸、3-(4-羟基苯基)乳酸、2-氨基-3-甲氧基苯甲酸、苯丁酸、甜蜜素、2-氨基-5-羟基苯甲酸、戊二酸、2-甲基丁酰肉碱、2-甲氧基苯甲酸、酪胺、色胺、3-甲氧酪胺、亚精胺、腺苷、2-氮己环酮、吲哚-2-羧酸、DL-3-甲氧基肾上腺素盐酸盐、1-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、嘌呤、1,5-戊二胺、亮氨酸、苯丙氨酸、犬尿氨酸、酪氨酸、次黄嘌呤、组氨酸、异亮氨酸、鸟嘌呤、色氨酸、1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、5-甲氧基色胺、尿刊酸、顺式-10-十七碳烯酸、N6,N6,2’-O-三甲基腺苷、5-十二碳烯酸、吲哚-3-乙醛酸、维生素B9/叶酸、二氢睾酮、雄酮、5beta-雄甾酮、脱氢表雄酮、对乙酰氨基酚、3-氨基水杨酸、胸苷、腐胺、5,2’-O-甲基胞苷、N4-乙酰基-2’-O-甲基胞苷、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷、1-甲基伪尿苷、N4,2'-O-甲基胞苷、肾上腺素、6-甲基尿苷、2-硫-2'-O-甲基尿苷、雌酮、N-甲基烟酰胺、苯乙胺、蛋氨酸(甲硫氨酸)、多巴(左旋多巴)、甲状腺素、吡啶甲酸、邻苯二甲酸、N-乙酰-L-酪氨酸、氢化可的松、17alpha-炔雌醇、去氧皮质酮、17a-羟孕酮、咖啡因、原儿茶醛、棕榈酰乙醇酰胺(PEA)、3-碘化酪氨酸、左旋肌肽、多巴胺、L-O-磷酸丝氨酸、5-羟基吲哚-3-乙酸、p-氨基马尿酸、吡咯-2-羧酸、DL-2-氨基辛酸、环磷酸鸟苷、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、N-甲基色胺、皮质酮、3-吲哚乳酸、乙酰谷酰胺、4-乙酰氨基丁酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-丁酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、二氢尿嘧啶、二氢胸腺嘧啶、苯乙酰甘氨酸、副黄嘌呤、黄嘌呤核苷、N-乙酰-5-羟色胺、1-甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、N-甲酰基犬尿氨酸、脱氧可的松、骨化二醇、7-羟基-4-胆甾烯-3-酮、20alpha-羟基胆固醇、醛固酮、7-酮胆固醇、烟酰甘氨酸、11-酮本胆烷醇酮、N-甘氨酰-L-亮氨酸、孕烯醇酮、睾酮、17alpha-雌二醇、17beta-雌二醇、雄烯二酮、可的松、黄体酮NA孕酮、二氢黄体酮、5beta-孕烷-3alpha,20alpha-二醇、L-棕榈酰肉碱、3-甲氧基肾上腺素、7alpha,25-二羟基胆固醇、1,3,7-三甲基尿酸、(3beta,24S)-胆甾-5-烯-3,24-二醇、11-去氢皮质甾酮、3-羟基马尿酸、17alpha-羟基妊娠烯醇酮、7a,27-Dihydroxycholesterol、二甲基鸟苷、7-甲基鸟嘌呤、N8-乙酰基亚精胺、5’-脱氧-5’-甲基硫代腺苷、异戊酰肉碱、异丁酰-L-肉碱、月桂酰肉碱/十二烷酰基左旋肉碱、硬脂酰肉毒碱、癸酰氯化肉碱、辛酰氯化肉碱、褪黑素、吲哚-3-羧酸、熊果酸、对-氨基苯甲酸、光色素、1,25-二羟基维生素D2、L-正亮氨酸、山楂酸、蜕皮激素、胡椒碱、对甲氧基苯甲酸、alpha-己基肉桂醛、2-苯基乙酰胺、丙二酸二乙酯、异戊胺、酪氨酸甲酯、环己胺、正丁胺、己胺、二苯胺、对甲氧基苯甲醛、二氢茉莉酮酸甲酯、N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯、1-单棕榈酸、4-戊烯酸、3-硝基酪氨酸、gamma-谷氨酰苯丙氨酸、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、缓激肽、5-碘吡啶胞苷、5'-脱氧腺苷、十六碳酰胺、油酸酰胺、7-甲基鸟苷、4-硫尿苷、3-甲基尿苷、5,2'-O-甲基尿苷、N6,N6-二甲基腺苷、O6-甲基鸟苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、2-硫胞苷、N6-苏氨甲酰氨基腺苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、8-羟基腺苷、N6,2’-O-二甲基腺苷、5-甲酰基胞苷、亚油酰胺、组氨酸-色氨酸、N-环己基甲酰胺、对甲基苯甲酸、苯丙氨酰色氨酸、16alpha羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、4-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、beta-吲哚-3-乙酸、L-焦谷氨酸、肉桂酸、4-羟基马尿酸、5-甲基-2'-脱氧胞苷、N6-甲基-2'-脱氧腺苷、甲瓦龙酸内酯、别孕烯醇酮、奥昔嘌醇、利他宁酸、苯胺、3-(2-羟苯基)丙酸、2-喹啉羧酸、8-氨基辛酸、L-亮氨酸-L-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、5-羟基色胺/血清素、L-丙氨酰-L-苯丙氨酸、甘氨酰苯基丙氨酸、甘氨酰-色氨酸、吡咯、5alpha-雄甾烷二酮、11-beta-羟基雄酮、2’-O-甲基尿苷、鸟苷、3-吲哚乙醇、醋酸甲羟孕酮、脱硫生物素、L-亮氨酸酰基-L-缬氨酸、谷氨酰基-蛋氨酸、苯丙氨酰蛋氨酸、L-苯丙氨酰-L-亮氨酸、烟酰胺、L-苯丙氨酰基-L-天冬酰胺、冬胺基乙酸-苯丙胺基乙酸、苯丙氨酰缬氨酸、章鱼胺、3-甲基羟基吲哚、5-羟基赖氨酸、左甲状腺素、犬尿喹啉酸/犬尿酸、戊酸、L-甘氨酸-L-异亮氨酸、2’-O-甲基鸟苷、3-氯-L-酪氨酸、2-(3,4-二甲氧基苯基)乙胺、6-二甲基氨基嘌呤、2-苯甘氨酸、苯甲酰胺、5-羟基色氨酸、维A酸、硫胺素焦磷酸、环二腺苷酸、维生素B6(吡哆醛)、腺嘌呤、胞嘧啶、金鸡纳酸、D-木糖醛酸、莽草酸、2-氨基乙烷磺酸/牛磺酸、谷氨酸盐(谷氨酸)、苏氨酸、丝氨酸、L-天冬酰胺、D-木酮糖5-磷酸、腺苷酸、磷酸二羟丙酮、尿苷5-单磷酸、L-瓜氨酸、脱氧胞苷酸、海藻糖、4-磷酸赤藓糖、鸟苷酸、NADP、葡萄糖-6-磷酸、磷酸乙醇胺、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、N-异戊酰氨基乙酸、gama-谷氨酰-丙氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸、尿嘧啶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、肌苷-1-磷酸、3-磷酸甘油、核黄素磷酸钠、生物素、癸二酸、柠檬酸、5-羟甲基尿嘧啶、山梨酸、古洛糖酸内酯、(3R,4R)-D-赤酮酸内酯、D-葡醛内酯、2-羟基-6-氨基嘌呤、1,5-酐-D-山梨糖醇、DL-水苏碱、胆碱、甜菜碱醛氯化物、甜菜碱、D-甘露糖、胸腺嘧啶、5-羧基胞苷、尿素、肌酸酐、2'-脱氧胞苷、胞嘧啶核苷、5-羟甲基-2'-脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷、N,N-二甲基甘氨酸、亚牛磺酸、肌氨酸、丙氨酸、维生素B6(盐酸吡哆胺)、氨基甲酰天冬氨酸、乙酰胆碱、甘氨酸、乙酸胍、肉毒碱、4-氨基丁酸/gamma-氨基丁酸、谷氨酰胺、4-羟基-1-L-脯氨酰-L-脯氨酸、L-天冬氨酸、乙醇胺、磷酸胆碱、胞苷一磷酸(CMP)、胱氨酸、精氨基琥珀酸、组胺、ITP、S-腺苷甲硫氨酸、鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸、高精氨酸、丙氨酰-丙氨酸、眯基牛磺酸、缬氨酸、脯氨酸、哌啶酸、N-乙酰神经氨酸、2-氨基异丁酸、氨基异丁酸、氧化三甲胺、4-羟基-L-脯氨酸、N6-乙酰-L-赖氨酸、肌酸、甘氨酰-L-脯氨酸、同型丝氨酸、蛋氨酸亚砜、β-氨基丙酸、a-氨基已二酸、3-N-甲基-L-组氨酸、高瓜氨酸、5-氨基戊酸、鹅肌肽、高胱氨酸、氧化型谷胱甘肽、胱硫醚、三甲胺、尿苷、N1-甲基肌苷、2’-O-甲基肌苷、乙酰肉碱、假尿苷、2-脱氧尿苷、1-甲基腺苷、核黄素-5-磷酸、N-Α-乙酰-L-精氨酸、2’-O-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、2'-脱氧鸟苷、5-甲基胞苷、2’-O-甲基胞苷、硫胺素单磷酸盐、硫鸟嘌呤、3-甲基腺嘌呤、四氢吡咯、1-甲基组胺、葫芦巴碱、N-乙酰基-D-半乳糖胺、三乙胺、5-甲基胞嘧啶、1-甲基腺嘌呤、L-去氧肾上腺素、异胞嘧啶、L-正缬氨酸、D-甘露糖胺、gama-O-十八烷基-L-alpha-溶血卵磷脂、N-乙酰丁二胺。

测试：取标准品溶液、处理后的待测血样本各2微升上机检测。获取254个代谢物的各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以外标与内标浓度比或外标浓度（Concentration Ratio or Concentration）为横坐标，外标与内标峰面积比或外标峰面积（Area Ratio or Area）为纵坐标，绘制如下共254种代谢物的标准曲线，代谢物包括：氨基异丁酸、1,3,7-三甲基尿酸、1,3-二甲基尿酸、1,5-酐-D-山梨糖醇、1,7-二甲基尿酸、顺式-10-十七碳烯酸、12,13-DiHOME、蓖麻油酸、17alpha-雌二醇、17a-羟孕酮、溶血磷脂酰乙醇胺、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、1-甲基伪尿苷、1-甲基黄嘌呤、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、gama-O-十八烷基-L-alpha-溶血卵磷脂、1-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、2,5-二羟基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、2-氨基异丁酸、DL-2-氨基辛酸、羟基癸酸、2-羟基十六烷酸、2-羟基-3-甲基丁酸、吲哚-2-羧酸、2-甲氧基苯甲酸、2-甲基丁酰肉碱、alpha-羟基异丁酸、2’-O-甲基胞苷、2’-O-甲基鸟苷、吡啶甲酸、2-氮己环酮、3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸、三碘甲状腺原氨酸、3beta-胆酸、3beta-脱氧胆酸、3-羟基-5-胆甾烯酸酯、3-羟基丁酸、3-羟基马尿酸、3-羟基异戊酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、多巴胺、吲哚-3-丁酸、3-甲氧酪胺、3-甲基羟基吲哚、3-甲基水杨酸、3-N-甲基-L-组氨酸、3-氧代胆酸、3-氧代-12alpha羟基-24胆酸、DL-3-苯乳酸、4-乙酰氨基丁酸、4-羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、5’-脱氧-5’-甲基硫代腺苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基赖氨酸、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲基尿苷、7,12-二酮石胆酸、7-羟基-4-胆甾烯-3-酮、7-酮基脱氧胆酸、7-甲基黄嘌呤、8-氨基辛酸、乙酰谷酰胺、对乙酰氨基酚、乙酰肉碱、L-丙氨酰-L-苯丙氨酸、尿囊素、a-氨基已二酸、alpha-己基肉桂醛、alpha-亚麻酸、5alpha-雄甾烷二酮、精氨酸、精氨基琥珀酸、苯甲酸、β-氨基丙酸、beta-吲哚-3-乙酸、甜菜碱、生物素、缓激肽、正丁胺、咖啡酸、咖啡因、环磷酸鸟苷、鹅脱氧胆酸、鹅去氧胆酸24-酰基-beta-D-葡糖苷酸、胆酸、磷酸胆碱、朱砂精酸、脱氧可的松、皮质酮、氢化可的松、可的松、肌酸、肌酸酐、甜蜜素、环己胺、胞嘧啶核苷、丙氨酰-丙氨酸、癸酰氯化肉碱、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、去氧皮质酮、(3R,4R)-D-赤酮酸内酯、丙二酸二乙酯、二氢胸腺嘧啶、N,N-二甲基甘氨酸、肉毒碱、月桂酰肉碱/十二烷酰基左旋肉碱、雌酮、乙基丙二酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、延胡索酸/富马酸、gama-谷氨酰-丙氨酸、谷氨酰基-蛋氨酸、gamma-谷氨酰苯丙氨酸、谷氨酰胺、戊二酸、3-磷酸甘油、甘氨酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氢胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨石胆酸、甘氨酰苯基丙氨酸、甘氨酰-色氨酸、甘氨酰-L-缬氨酸、鸟苷酸、乙酸胍、鸟嘌呤、鸟苷、十六碳酰胺、十六烷-1,16-二酸、己酰甘氨酸、N-L-gamma-谷氨酰-L-亮氨酸、组氨酸-色氨酸、马尿酸、组氨酸、尿黑酸、高香草酸、苯丙氨酰色氨酸、猪脱氧胆酸、亚牛磺酸、次黄嘌呤、吲哚丙酮酸、(E)-3-吲哚丙烯酸、3-吲哚乳酸、肌苷、别异石胆酸、异丁酰-L-肉碱、异胞嘧啶、异石胆酸、异戊酰肉碱、犬尿氨酸、丙氨酸、冬胺基乙酸-苯丙胺基乙酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、胱氨酸、L-亮氨酸酰基-L-缬氨酸、L-亮氨酸-L-丙氨酸、乙酰丙酸、谷氨酸盐(谷氨酸)、高瓜氨酸、高胱氨酸、亚油酰胺、异亮氨酸、羟基异己酸、亮氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)、L-正亮氨酸、L-棕榈酰肉碱、脯氨酸、L-焦谷氨酸、光色素、缬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸亚砜、肌醇、二甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N6,2’-O-二甲基腺苷、N6-乙酰-L-赖氨酸、N6-苏氨甲酰氨基腺苷、N-Α-乙酰-L-精氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸、N-甲酰基犬尿氨酸、烟酰胺、烟酰甘氨酸、23-脱甲脱氧胆酸、十八烷二酸、辛酰氯化肉碱、油酸酰胺、鸟氨酸、棕榈酰乙醇酰胺(PEA)、泛酸、副黄嘌呤、L-苯丙氨酰-L-亮氨酸、苯丙氨酰蛋氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、苯丙氨酰缬氨酸、苯乙酰甘氨酸、苯氧乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、邻苯二甲酸、胡椒碱、4-羟基-1-L-脯氨酰-L-脯氨酸、2,6 -二异丙基Β- D -吡喃葡萄糖酸、原儿茶酸、假尿苷、吡咯-2-羧酸、金鸡纳酸、2-喹啉羧酸、维A酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、水杨酸、丝氨酸、5-羟基色胺/血清素、莽草酸、亚精胺、DL-水苏碱、硬脂酰肉毒碱、辛二酸、2-氨基乙烷磺酸/牛磺酸、牛磺-beta－鼠胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氢胆酸、牛磺脱氧胆酸、睾酮、苏氨酸、甲状腺素、4-羟基-L-脯氨酸、反式-乌头酸、海藻糖、葫芦巴碱、氧化三甲胺、色氨酸、酪氨酸、尿苷5-单磷酸、尿嘧啶、尿素、尿苷、尿刊酸、熊胆酸、黄尿酸/黄嘌呤酸、D-木糖醛酸。

本项目所检测的部分代谢物的标准曲线现行方程及相关系数见下表。

注：Index：物质简称；Equation为线性方程；r为相关系数（Coefficient ofCorrelation）；Weighting为权重；LLOQ(ng/mL)和ULOQ(ng/mL)分别是定量下限和定量上限，两者范围内可准确定量。

将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算，进一步代入计算公式计算后，最终得到实际样本中该物质的含量数据。注意：计算公式已进行单位换算，直接将对应数值代入即可得到样本含量。

样本中各物质的含量（ng/mL）= c×V1/1000/V2

公式中各字母含义：

c：样本中积分峰面积代入标准曲线得到的浓度值（ng/mL）；

V1：提取液总体积（μL）；

V2：移取的样本量（mL）。

3、筛选可用于预测房颤风险的标志物

（1）样本质控分析

以混合溶液作为QC样本，在仪器分析过程中，每隔10个检测分析样本插入一个质控样本，通过对同一质控样本质谱检测分析的总离子流图（TIC）进行重叠展示分析，如图1所示，代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好。

对QC样本进行皮尔逊（Pearson）相关性分析，如图2所示，对角线方格代表QC样本名称；对角线左下角方格为对应QC样本相关性散点图，横纵坐标分别为代谢物含量，图中每个点代表一个代谢物；对角线右上角方格为对应QC样本相关性系数。QC样本相关性高（ | r| 接近于 1 ），说明整个检测过程稳定性好，数据质量高。

CV值即变异系数（Coefficient of Variation），是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数（Empirical CumulativeDistribution Function, ECDF）分析对照组（SN）、实验组（SAF）和QC样本（QC）小于参考值的物质CV出现的频率，QC样本的CV值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：QC样本CV值小于0.3的物质占比高于80%，表明实验数据稳定；QC样本CV值小于0.2的物质占比高于80%，表明实验数据非常稳定。结果见图3所示，横坐标代表CV值，纵坐标表示小于对应CV值的物质数目占总物质数的比例，不同颜色代表不同的分组样本，QC为质控样本，其中与X轴垂直的两条参考线对应的CV值为0.2和0.3，与X轴平行的参考线对应物质数目占总物质数的80%。结果显示，QC样本CV值小于0.2的物质占比高于80%，表明实验数据非常稳定。

（2）数据统计分析

对实验组数据、对照组数据和QC样本数据进行主成分分析（Principal ComponentAnalysis，PCA）以便初步了解各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以便寻找差异代谢物，OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理（Mean Centering），然后利用R软件中的MetaboAnalystR 包 OPLSR.Anal 函数进行分析，根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，绘制各分组的得分图，进一步展示各个分组之间的差异(Thévenot et al., 2015)。基于OPLS-DA模型的变量投影重要性(VIP)可以初步筛选出不同品种或组织间差异的代谢物。VIP值表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP ≥ 1的代谢物则为差异显著。同时结合单变量分析的P-value来进一步筛选出差异代谢物，获得造成患者和对照受试者的代谢谱扫描差异的代谢物。

结果显示，肌醇、油酸酰胺、1,3-二甲基尿酸、赖氨酸、4-羟基苯甲醛、3-羟基-5-胆甾烯酸酯、尿嘧啶、尿刊酸、邻苯二甲酸、原儿茶酸、鸟氨酸、乙酰谷酰胺、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇、精氨酸、甲硫氨酸的VIP ≥1，为差异代谢产物。

3、为了评估上述差异代谢物作为生物标志物的潜能，将获取的101例实验组人群数据及101例对照人群数据通过软件进行编辑，获得ROC(receiver operatorcharacteristic curve)曲线。

ROC曲线的绘制可以使用现有技术领域的软件或系统，比如SPSS 9.0、R0CP0WER.SAS、DESIGNR0C.FOR、R- studio等等。本实施例中绘制ROC曲线使用的软件R-studio。

ROC 曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。是以灵敏度为纵坐标、特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。

其中，对照人群和房颤人群的水平值均取中位数（第25百分位数，第75百分位数），以及单变量分析的p值，见下表所示。

参考值范围是对照人群通过大量人群实验检测后所得水平值取5-95%区间，见下表所示。

其中，表格显示参考值范围是第5百分位数（参考值下限）-第95百分位数（参考值上限）。

结果显示，10种代谢物均显示大于0.80的AUC，如图4-8所示，鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、N-乙酰-L-酪氨酸、肌醇、精氨酸、甲硫氨酸的水平在房颤患者中显著下降，AUC分别是0.951、0.913、0.953、0.899、0.822、0.8、0.896、0.815。异胞嘧啶和2'-O-甲基胞苷在房颤患者中显著上升，AUC分别是0.813和0.832。

组合1（即精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的组合）的水平用于诊断心房颤动的准确性明显提高，AUC高达至0.96；

组合2（即鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇和精氨酸的组合）以及组合3（即鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇、精氨酸和甲硫氨酸的组合）的水平用于诊断心房颤动的准确性明显提高，AUC高达0.996和0.994（CL0.986-1.000）。

而其余代谢物单独预测的AUC均小于0.8，均未显示良好的预测能力。

实施例2 采用生物标志物预测心房颤动

心脏外科术后（冠状动脉旁路移植手术）病人3例，在术前按照实施例1的方法分别采集患者空腹状态下静脉血1ml，3000 rpm×10min 离心后留取上清于-80℃冻存，然后测试血清中精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸、甲硫氨酸、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸和1,5-酐-D-山梨糖醇的水平。术前病例1提前进行药物干预，干预方法为：口服200mg制剂的胺碘酮(可达龙)一天两次，一次一片。病例2和3未进行药物干预。

其中，对于病例2来说，血清中鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、N-乙酰-L-酪氨酸、肌醇、异胞嘧啶、2'-O-甲基胞苷、精氨酸和甲硫氨酸等的水平均在对照人群的参考值范围内，预测不具有发生心房颤动的风险。经证实该病例心脏术后未发生房颤，预测结果与实际结果相一致。

病例3经检测鸟氨酸的水平低于参考值下限，预测具有发生心房颤动的风险，术前未进行药物干预，术后房颤持续时间较长，为36小时。

病例1经检测血清中精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷氨酸、甲硫氨酸和肌醇的水平均低于参考值下限，预测具有发生心房颤动的风险，术前进行药物干预，术后房颤持续时间较短，为6小时。

由此说明，通过检测本发明所限定的生物标志物为心房颤动发生风险和预防提供有效信息，有利于实现对心脏外科术后心房颤动患者的预防性治疗，从而改善患者生存质量。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种生物标志物组合物在制备用于预测心房颤动发生风险的产品中的用途，其特征在于，所述生物标志物组合物包含精氨酸、鸟氨酸、乙酰谷酰胺和甲硫氨酸。

2.一种生物标志物组合物在制备用于预测心房颤动发生风险的产品中的用途，其特征在于，所述生物标志物组合物包含鸟氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、异胞嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、2'-O-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、L-亮氨酸、1,5-酐-D-山梨糖醇和精氨酸。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述生物标志物组合物还包含甲硫氨酸。

4.根据权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述产品为试剂盒。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括生物标志物的标准品。

6.根据权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述预测是检测待测受试者血清或血浆中的生物标志物或者生物标志物组合物的水平值，若当受试者血清或血浆中权利要求1-3中任一所述的生物标志物组合物中的每一种生物标志物的水平值低于参考值下限或高于参考值上限时，则所述受试者具有发生心房颤动的风险。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，通过质谱联用液相色谱法测定生物标志物的水平。

8.根据权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述心房颤动发生风险是指心脏外科手术术后发生心房颤动的风险。

9.权利要求1-3中任一所述的生物标志物组合物在筛选用于预防或治疗心房颤动的药物中的用途。

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