TWI553313B - 診斷心臟衰竭之方法 - Google Patents

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Description

診斷心臟衰竭之方法
本發明係有關於個體中診斷心臟衰竭或評估心臟衰竭預後之方法。再者，本發明亦有關於個體中診斷心臟衰竭或評估心臟衰竭預後之生物標誌或套組。
心臟衰竭(heart failure)係多種心血管疾病發展到最後階段所呈現的一個綜合臨床症候群。在過去數十年來，對於基礎病理生理學與血液動力學的瞭解以及新穎藥物與侵入性治療的發展已有大幅的進步。儘管如此，短期及長期與心臟衰竭相關的再住院率與死亡率仍高，且需大量的健康照護資源。現有的治療策略在心臟衰竭晚期之效果有限，迫切需要新的介入性措施以降低在亞臨床(sub-clinical)階段時的不當分子進程，以避免心臟衰竭病程進展到下一階段。
多種用於心臟衰竭之生物標誌已被證實。B型利尿胜肽(B-type natriuretic peptide,BNP)及其N端片段已成為臨床上有用於診斷心臟衰竭及預後的生物標誌。最近的研究顯示，利尿胜肽亦提供無明顯症狀之具有中度風險之心血管疾病個人的預後。不幸的是，此等生物標誌無法對用於 侵入性治療的分子標靶提供額外資訊。此外，單一生物標誌的應用可能不足以用來評估心臟衰竭病患，需透過多種分子的組合以獲得補償。
根據目前對心血管風險因子的認識，大部分心臟衰竭病患的病因仍無法解釋。不論何種異質病因，心臟衰竭的發展與心臟不能滿足身體的代謝需求息息相關。整體代謝作用中伴隨的變化對於心臟衰竭特定性代謝體(metabolome)的臨床應用(診斷與預後之目的)具有暗示性。目前心臟衰竭期別之評估並非根據致病機制，而是根據源自於美國心臟病學會與美國心臟協會(American College of Cardiology and the American Heart Association,ACC/AHA)的共識。ACC/AHA將心臟衰竭分類成四個期別，舉例而言，第A期為尚未發生心臟結構性病變，但具有罹患心臟衰竭之風險者(如具有冠心病但未出現梗塞之糖尿病患者)；第B期為具有心臟結構性病變(亦即心輸出量下降、左心室肥大及心室心房擴張)，但未發生任何心臟衰竭症狀之個人；第C期意指發展出臨床心臟衰竭之病患；第D期意指具有難治性心臟衰竭且需使用進階侵入性治療(例如：雙心室心律調節器、左心室輔助裝置或移植)之病患。
除了ACC/AHA所定義的心臟衰竭期別，亦有依心臟衰竭功能狀態所定義的其他分類方式，其稱之為紐約心臟學會功能分類(級別I至級別IV)，此分類涉及每日活動之症狀與病患之生活品質。級別I：體能活動不受限制，普 通體能活動不會造成過度疲勞、心悸或呼吸困難(呼吸短促)；級別II：體能活動稍受限制，靜止時感到舒適，但普通體能活動會造成過度疲勞、心悸或呼吸困難；級別III：體能活動受到明顯限制，靜止時感到舒適，但少量的普通活動就會造成過度疲勞、心悸或呼吸困難；級別IV：無法進行任何體能活動而不發生不適，靜止時感到心功能不全，若進行任何體能活動則不適感會增加。
發展多種生物標誌的高產出量及潛力所帶來的優勢在於代謝體學係辨識代謝特徵之平台，該代謝特徵與前心臟衰竭階段至進階心臟衰竭階段之亞型(subtype)相關，且獨立於既定的傳統風險因子所形成的限制。徹底瞭解心臟衰竭中波動的代謝作用，並配合營養基因體學的研究進展，將有潛力發展出個人化的預防措施。
美國專利公開第2012/0286157 A1號揭露一種於個體中診斷心臟衰竭之方法，其中，該方法包括從個體的樣本中測定至少一種生物標誌的量，該生物標誌諸如甘露糖(mannose)、次黃嘌呤(hypoxanthine)、麩胺酸鹽(glutamate)、尿酸(uric acid)、天門冬胺酸鹽(aspartate)等。此外，該專利亦揭露該方法可用於辨識個體是否需要治療心臟衰竭，或測定心臟衰竭療程是否成功。
雖然幾種生物標誌(諸如甘露糖、次黃嘌呤、天門冬胺酸鹽)已被用於診斷心臟衰竭，仍有醫療上的需求以找尋更具靈敏性及專一性的生物標誌，以用於診斷心臟衰竭(特別是在心臟衰竭早期階段)及評估心臟衰竭預後。
為了診斷心臟衰竭及評估心臟衰竭預後，本發明係發展用來測定代謝體學分析的臨床應用及重要性，以及探究心臟衰竭病患之複雜的整體代謝波動，且在不同心臟衰竭期別或在侵入性治療後復原階段中提供靈敏評估。
有鑑於前案之缺陷，本發明提供一種活體外偵測個體心臟衰竭之方法，該方法包括：自取自個體之生物樣本獲得至少一種選自於黃嘌呤(xanthine)、亞精胺(spermidine)、丙醯肉鹼(propionylcarnitine)、丁醯肉鹼(butyrylcarnitine)及對硫甲酚(p-cresyl sulfate)所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
於本發明之一具體實施例中，該生物樣本係選自於血液、血漿、血清及尿液所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸的量與該胺基酸之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得次黃嘌呤(hypoxanthine)的量；以及比對該次黃嘌呤的量與該次黃嘌呤之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量 該個體之生物樣本以獲得磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)的量；以及比對該磷脂醯膽鹼的量與該磷脂醯膽鹼之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該磷脂醯膽鹼較佳係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組中至少一者。
本發明進一步提供一種活體外偵測個體心臟衰竭期別之方法，該方法包括：自取自個體之生物樣本獲得至少一種選自於黃嘌呤、亞精胺及丙醯肉鹼所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸 的量與該胺基酸之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得次黃嘌呤的量；以及比對該次黃嘌呤的量與該次黃嘌呤之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得磷脂醯膽鹼的量；以及比對該磷脂醯膽鹼的量與該磷脂醯膽鹼之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該磷脂醯膽鹼較佳係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基 C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組中至少一者。
本發明進一步提供一種活體外評估心臟衰竭預後之方法，該方法包括：自取自個體之之生物樣本獲得至少一種選自於黃嘌呤、亞精胺、丁醯肉鹼及對硫甲酚所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸的量與該胺基酸之參考值。
於本發明之一具體實施例中，該胺基酸係必需胺基酸。
於本發明之一具體實施例中，該必需胺基酸係選自於組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該必需胺基酸較佳係選自於白胺酸、蘇胺酸及色胺酸所組成之群組中至少一者。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該生物樣本以獲得二甲基精胺酸(dimethylarginine)、及二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
於本發明之一具體實施例中，該方法進一步包括測量該生物樣本以獲得對稱性二甲基精胺酸、及對稱性二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
本發明進一步提供一種用於診斷心臟衰竭之診斷裝 置，其包括：檢測器，用於檢測選自於黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、對硫甲酚及其組合所組成之群組的生物標誌。
於本發明之若干具體實施例中，代謝體學科技(metabonomics/metabolomics technology)可使用多變數統計技術(multivariate statistical techniques)來分析高度複雜的數據組，該數據組係產生自高產出量光譜，諸如核磁共振(NMR)光譜法及質譜法(MS)。於本發明之若干態樣中，可結合使用不同種類的光譜平台，諸如氣相層析-質譜法(GC-MS)及液相層析-質譜法(LC-MS)，其可帶來補充分析結果之優勢，因此可提供擴大的用以解釋與病理生理條件相關的生物性變異之代謝「窗(window)」。於本發明之某些態樣中，辨識可用以說明具有心臟衰竭之患者及健康者的代謝物譜型(metabolite profile)間差異之代謝物，能夠顯示該疾病之重要基本分子機制。
於本發明之若干具體實施例中，分析方法可包括氣相層析法與質譜法。舉例而言，根據本發明之一具體實施例，該分析方法可包括氣相層析-飛行時間質譜法(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry,GC-TOFMS)及超效液相層析-四偶極-飛行時間質譜法(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOFMS)。於某些具體實施例中，可使用超過一種分析方法以於病患樣本中獲得有關代謝物的數據。於若干具體實施例中，可將一種或 多種分析方法與多變數統計技術(multivariate statistical techniques)一起使用，藉此判定病患樣本中的代謝物譜型。
第1A及1B圖係顯示針對心臟衰竭之全代謝體學之診斷數值。收集來自不同心臟衰竭期別(第A期、第B期及第C期)病患及正常者的血漿樣本，藉由LC-MS/MS測定該樣本之全代謝物濃度。(A)正交投影潛在結構判別分析(OPLS-DA)得分圖(score plot)顯示正常對照組與第A期及第C期之心臟衰竭病患間有明顯的區別。為了區分正常對照組與第C期病患，藉由使用所有全代謝體學數據組並計算出全代謝體學衍生參數，稱之為t[1](如x軸所示)；為了區分正常對照組與第A期病患，藉由使用所有全代謝體學數據組並計算出另一全代謝體學衍生參數，稱之為t[0](如x軸所示)。於t[1]標尺中，第A期病患的集聚區相似於正常對照組，然而相較於正常對照組於t[0]標尺上向上位移。(B)依同樣的全代謝體學衍生參數計算方式，計算出第B期病患的t[1]與t[0]值。第B期病患的得分圖廣布的區域位在第A期、第C期及正常對照組間。
第2圖係顯示心臟衰竭(HF)致病機轉相關的代謝途徑，辨別HF病患中尿素(urea)循環(a)、生物蝶呤(biopterin)循環(b)、甲硫腺苷(methylthioadenosine,MTA)循環(c)、甲硫胺酸循環(d)、鳥胺酸-脯胺酸-麩胺酸(e)、多胺(polyamine)合成(f)、多巴胺(dopamine)合成(g)、甲基化(肌酸酐(creatinine)及磷脂醯膽鹼)(h)、轉硫化反應 (transsulfuration)(牛磺酸(taurine))(i)、對硫甲酚合成(j)及嘌呤(purine)代謝(k)的變異。在HF病患中，代謝物(紅色者)顯著增加、代謝物(藍色者)顯著減少、代謝物(黑色者)不變，而代謝物(灰色者)則未檢測。
第3圖係顯示於急性心臟衰竭後的一系列追蹤。BNP及tPS[1]數值示於32個病患中，該些病患存活超過12個月，且於12個月結束時顯著改善成紐約心臟學會功能分類級別I。N表示正常對照組；M0、M6及M12分別表示出院前及出院後6個月與12個月之數值；tPS[1]：根據四種代謝物(組胺酸、苯丙胺酸、亞精胺及次黃嘌呤)之組合所產生的參數，稱之為tPS[1]。
第4圖係顯示BNP與一些目標代謝物及目標代謝物組合的診斷值。該ROC曲線係藉由B型利尿胜肽(B-type natriuretic peptide、BNP)、t[2]及tPS[2]顯示第C期心臟衰竭之診斷(相較於正常對照組)。t[2]：衍生自計算所有目標代謝物的參數；tPS[2]：根據四種代謝物(組胺酸、苯丙胺酸、亞精胺及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4)之組合所產生的參數，稱之為tPS[2]。
第5A至5C圖係顯示代謝體學的預後值。(A)該ROC曲線係用以比較B型利尿胜肽(BNP)、t[2]、tPS[2]及tPS[3]之預後值。(B及C)分別表示tPS[3]與BNP的卡本-麥爾曲線(Kaplan-Meier curve)，係用以預測所有案例的全因死亡(all-cause death)與心臟衰竭相關的再住院率之組合事件。tPS[3]：根據四種代謝物(二甲基精胺酸/精胺酸之比率、亞 精胺、丁醯肉鹼及必需胺基酸總量)之組合所產生的參數，稱之為tPS[3]。
以下特定的實施例係用以例示本發明，本發明所屬之技術領域人員可以輕易確信本發明之其他優點及效果。本發明能以經制訂的不同特定案例或應用來實施，說明之細節亦能根據不同觀點及應用而做出多種修改或變化，且不悖離本發明之範圍及精神。
尚需注意的是，如本文所使用者，除非特別表示或明確意指為單數者，單數形式之術語「一(a,an)」、「該(the)」須解釋為亦涵蓋複數。除非內文清楚指明，否則術語「或」可與術語「及/或」互相取代。
如本文所使用者，術語「個體」或「個人」可為動物，舉例而言，該個體或個人可為哺乳動物，再者，該個體或個人可為人類。該個體或個人可為男性或女性，該個體或個人亦可為病患，其中，該病患為正進行牙科或醫療照護者，及/或為了失調或疾病而積極尋求醫療照護者。
如本文所使用者，術語「健康」意指不具有心臟衰竭或其他相關失調之個人。
如本文所使用者，術語「代謝作用」意指發生於有機活體內的一套化學反應，用以維持生命。代謝作用通常可分為兩種類別：分解代謝與合成代謝。分解代謝為分解有機物質的一套化學反應(例如從細胞呼吸作用中取得能量)；合成代謝為消耗能量來建構細胞組成物的一套化學反 應(例如蛋白質合成與核苷酸合成)。
如本文所使用者，術語「生物標記」係意指為分子種類，該分子種類係作為過程、事件或狀態(例如：老化、疾病或曝露於有毒物質)之獨特生物性或生物衍生性指標(例如：體內生化代謝物)。
如本文所使用者，術語「參考值」意指正常健康個體或正常對照組(亦即不具有心臟衰竭風險者)中，其個體生物樣本中生物標誌的含量或經計算之數值。
如本文所使用者，術語「代謝物」係意指代謝作用的中間產物或產物。該術語「代謝物」一般限制為小分子。「初級代謝物」係直接參與正常生長、發育及生殖的代謝物(例如：乙醇)；「次級代謝物」係未直接參與上述過程的代謝物，但其通常具有重要的生態功能(例如：抗生素及色素)。有些抗生素使用初級代謝物作為前驅物，例如自初級代謝物色胺酸所產生之放射菌黴素(actinomycin)。然而，為了本發明之目的，該術語「代謝物」意指參與在代謝途徑中的小分子(<1000道爾吞(Dalton))中間產物及產物，該代謝途徑諸如糖解作用、檸檬酸(TCA)循環、胺基酸合成及脂肪酸代謝作用等等。
如本文所使用者，術語「代謝體學(metabolomics或metabonomics)」意指代謝物譜型之系統研究，該代謝物譜型係於一給定條件下的生物系統之生物過程。「代謝體(metabolome)」意指一組完整的小分子代謝物(諸如代謝中間產物、荷爾蒙及其他訊號分子，以及次級代謝物)，該小 分子代謝物係被發現於生物樣本(諸如生物細胞、組織、器官或有機體)且為細胞過程的最終產物。代謝體學為可提供由上至下、全面性及無偏執(unbiased)資訊的技術平台。現有兩種代謝體學方法：全面性代謝譜型及目標代謝體學。
如本文所使用者，術語「代謝物譜型」或「代謝物生物標誌譜型」意指代謝物概況，其在健康的個體中，相較於不健康的個體(如具有心臟衰竭個體)或在疾病的不同狀態(如疾病的不同階段)，會測定出不同含量(如增加或減少)。
如本文所使用者，術語「心臟衰竭(HF)」意指心臟功能受損的情況，導致心臟無法以足夠的速率或足夠的量輸送血液。心臟衰竭可為收縮期受損，造成心臟輸出血液的量顯著下降，因而降低血流量。因此，收縮期心臟衰竭的特徵為左心室的排出量(LVEF)顯著降低，較佳者，排出量低於50%。或者，心臟衰竭可為舒張期受損，亦即心室未能妥善放鬆，且通常伴隨有心室壁僵硬。舒張期心臟衰竭造成心室之充填不足，因而影響血液流量。因此，舒張期功能失調亦導致舒張末期壓力上升。故心臟衰竭可影響右心(肺循環)及左心(體循環)或兩者。測量心臟衰竭的技術為本領域所習知，包括超音波心動描記儀、電生理學、血管造影，以及血中胜肽生物標誌(例如：B型利尿胜肽(B-type natriuretic peptide,BNP)或其前肽之N端片段)的測定。應理解心臟衰竭可持續發生或僅於某些壓力或活動的情況下發生。典型的心臟衰竭特徵包括呼吸困難、胸痛、頭暈、 意識模糊，以及肺部及/或末梢水腫。根據美國心臟病學會與美國心臟協會之2001指南，心臟衰竭可分為A、B、C及D期，第A期：在未來具有發展成心臟衰竭之高風險，但未有功能或結構性心臟失調之病患；第B期：具有結構性心臟失調，但於任何時期皆無症狀者；第C期：在具有基本結構性心臟問題之情況下，先前或目前有心臟衰竭症狀，但以醫療處理者；第D期：具有難治性心臟衰竭且需進階侵入性治療之病患。
如本文所使用者，術語「全代謝物(global metabolite)」意指獲得全面性且廣泛的代謝物譜型，其在特定條件或在不同條件之數個跨群組中，可用以比較大量的分析物。可藉由分析來自不同處理條件(如藥物處理組與對照組)或不同病理生理情況(如糖尿病組與正常組)的複製樣本而獲得全代謝物。為了此目的，將生物樣品(細胞、血漿、尿液、唾液或病理樣品)進行分析(藉由分析工具，如LC-MS)以產生數據組，隨後進行單變數或多變數統計分析。全代謝體學之目的在於辨別特徵，該特徵可系統性將大量的代謝物分組(種類)。
如本文所使用者，術語「目標代謝物」意指經定義的代謝物組的辨識與量化，該代謝物係結構上已知且經標注者，且係根據經完整建立的生物化學途徑而來。
本發明提供一種活體外偵測個體心臟衰竭之方法，該方法包括：測量該個體之生物樣本以獲得至少一種選自於黃嘌呤(xanthine)、亞精胺(spermidine)、丙醯肉鹼 (propionylcarnitine)、丁醯肉鹼(butyrylcarnitine)及對硫甲酚(p-cresyl sulfate)所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
根據本發明之一具體實施例，該生物樣本係選自於血液、血漿、血清及尿液所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸的量與該胺基酸之參考值。其中，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得次黃嘌呤(hypoxanthine)的量；以及比對該次黃嘌呤的量與該次黃嘌呤之參考值。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)的量；以及比對該磷脂醯膽鹼的量與該磷脂醯膽鹼之參考值。較佳地，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基 C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組中至少一者。較佳地，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，在心臟衰竭第C期之病患中，一些與精胺酸代謝有關的代謝物(諸如：麩醯胺酸及瓜胺酸)的含量在較低；次黃嘌呤、黃嘌呤、尿酸、麩胺酸、脯胺酸、鳥胺酸、精胺與亞精胺的含量則上升；芳香胺基酸(諸如：酪胺酸及苯丙胺酸)的含量較高。此外，數種磷脂醯膽鹼的含量降低，而牛黃酸的含量則增加。
本發明進一步提供一種於個體中判斷心臟衰竭期別之方法，其步驟包括：測量該個體之生物樣本以獲得至少一種選自於黃嘌呤、亞精胺及丙醯肉鹼所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸的量與該胺基酸之參考值。較佳地，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得次黃嘌呤的量；以及比對該次黃 嘌呤的量與該次黃嘌呤之參考值。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得磷脂醯膽鹼的量；以及比對該磷脂醯膽鹼的量與該磷脂醯膽鹼之參考值。較佳地，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組中至少一者。較佳地，該磷脂醯膽鹼較佳係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，在心臟衰竭期別(例如：A期、B期及C期)的判斷上，相較於BNP值，檢驗組合下列所組成群組之至少二種生物標誌的含量以及比對該生物標誌之參考值係較為靈敏：黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、胺基酸、次黃嘌呤及磷脂醯膽鹼。
本發明進一步提供一種活體外評估心臟衰竭預後之方法，該方法包括：自取自個體之之生物樣本獲得至少一 種選自於黃嘌呤、亞精胺、丁醯肉鹼及對硫甲酚所組成之群組之生物標誌的量；以及比對該至少一種生物標誌的量與參考值。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該個體之生物樣本以獲得胺基酸的量；以及比對該胺基酸的量與該胺基酸之參考值。較佳地，該胺基酸係必需胺基酸。較佳地，該必需胺基酸係選自於組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸所組成之群組中至少一者。較佳地，該必需胺基酸較佳係選自於白胺酸、蘇胺酸及色胺酸所組成之群組中至少一者。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該生物樣本以獲得二甲基精胺酸(dimethylarginine)及二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
根據本發明之一具體實施例，該方法進一步包括測量該生物樣本以獲得對稱性二甲基精胺酸及對稱性二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
根據本發明之一具體實施例，在急性心臟衰竭後預後的狀態預估中，以檢驗組合四種代謝物(例如：組胺酸、苯丙胺酸、亞精胺及次黃嘌呤)的診斷值，相較於BNP，該診斷值係較為靈敏。
根據本發明之一具體實施例，在心臟衰竭預後的判斷上，相較於BNP值，檢驗組合下列所組成群組之至少二種生物標誌的含量以及比對該生物標誌之參考值係較為靈 敏：黃嘌呤、亞精胺、丁醯肉鹼、胺基酸、次黃嘌呤及磷脂醯膽鹼。
本發明進一步提供一種用於診斷心臟衰竭之診斷裝置，其包括：檢測器，用於檢測選自於黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、對硫甲酚及其組合所組成之群組的生物標誌。
多數實施例係用以例示本發明，以下所述之實施例不應作為限制本發明之範圍。
實施例 代謝體學分析之材料與方法 一、病患與研究設計：
本研究於2005年1月至2009年12月期間內招收具有第B期及第C期心臟衰竭病患，於2008年5月至2009年12月，招收第A期心臟衰竭病患與正常對照組。第C期之病患因急性心因性肺水腫而住院者，其年齡為20至85歲，具有收縮期及舒張期心臟衰竭之病患皆包括其中。第B期之病患，與其左心室的排出量(LVEF)無關，其具有後期急性心肌梗塞，且具有任何的嚴重結構異常或<40%的LVEF，但第B期之病患係無症狀。第A期之病患為(1)具有冠狀動脈疾病之血管造影圖像、<50%的LVEF且無症狀；或(2)具有風險因子，但無症狀，亦無冠心病之血管造影圖像。正常對照組為年齡20-85歲者，且無顯著的全身性疾病，諸如高血壓、糖尿病或冠狀動脈疾病，其未進行任何藥物治療，且LVEF>60%。
排除條件包括：(1)具有全身性疾病，諸如甲狀腺機能減退、失償性肝硬化(decompensated liver cirrhosis)及全身性紅斑性狼瘡；(2)具有非心臟衰竭之失調，且已妥協存活6個月；(3)臥床不起>3個月及/或無法獨自站立之病患；(4)血清肌酸酐>3毫克/分升(mg/dl)之病患；以及(5)患有嚴重冠狀動脈疾病但未進行血管再造之病患。從所有病患中皆獲得知情同意。本研究設計及實行皆符合赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)之原則，且經長庚紀念醫院人體試驗倫理委員會批准。
二、血液樣本與試驗
於出院前及出院後6個月與12個月，將血液樣本收集於含有EDTA之管中。藉由於後續章節所描述之代謝體學工作流程分析血漿。以分級BNP試驗(Triage BNP Test)(Biosite,San Diego,CA)三重覆測量BNP，該試驗係以螢光免疫分析法進行血漿BNP的定量。其它測量，包括腎功能、血紅素及C反應蛋白，係於核心實驗室中進行。
三、疾病管理計畫
第C期病患係由HF小組進行照護，該小組係由三位專門從事HF照護之心臟病專家、一位心理學家、一位膳食助理及兩位個案經理所組成。
四、後續追蹤之計畫
預期每個月來自醫院紀錄、與病患的醫生進行的個人溝通、電話訪談，以及病患例行探訪的醫生門診以獲得後續數據。「再住院率」係定義為與心臟衰竭相關的再住院率。三位心臟病專家組成的委員會不考量病患的臨床可變值而對所有的住院率進行裁定，決定何者為與心臟衰竭惡化相關的事件。將「全因死亡(all-cause)」選擇作為終點(endpoint)的原因為在病患分群中HF與其他併發症的相互關係。最嚴重的事件被認為於後續的期間的終點。為了預後之目的，僅分析與HF相關的再住院率與全因死亡的複合事件。
五、血漿代謝體分析 (1)藉由LC-TOFMS分析血漿全代謝物
於50微升(μl)血漿中添加200μl乙腈(ACN)，將該混合物震盪30秒，超音波震盪15分鐘，接著以10,000×g 25離心分鐘，收集上清液且放入分離式玻璃管，該沉澱物以200μl 50%甲醇重新萃取。將甲醇上清液與乙腈上清液兩種水溶液收集在一起並於氮氣蒸發器中乾燥，將殘留物保留並儲存於-80℃。為了代謝體學分析，將該殘留物溶於100μl 95：5水/乙腈，並以14,000×g離心5分鐘。收集該澄清的上清液以進行LC-MS分析。
使用ACQUITY TM UPLC系統(Waters Corp.,Milford,USA)且於100毫米(mm)×2.1mm Acquity 1.7微米(μm)之C8管柱上完成液相層析分離，將該管柱維持於45℃以及 流速0.5毫升/分鐘(ml/min)。使用線性梯度：0至2.5分鐘：1至48% B；2.5至3分鐘：48至98% B；3至4.2分鐘：98% B；4.3至6分鐘：1% B，將樣本自LC管柱中洗提(elute)，並用以重新平衡。移動相為0.1%甲酸於水中(溶劑A)以及0.1%甲酸於乙腈中(溶劑B)。
將該洗提液(eluent)導入TOG MS系統(SYNAPT G1高解析質譜儀，Waters Corp.,Milford,USA)，並於ESI正離子模式下操作，其條件如下：去溶氣體(desolvation gas)設定為700公升/小時(l/h)，溫度300℃；錐孔氣體(cone gas)設定為25l/h，且來源溫度設定為80℃；毛細管電壓與錐孔電壓分別設定為3,000V與35V；MCP檢測器電壓設定為1,650伏特(V)；數據取得率設定為0.1秒且內掃描延遲為0.02秒，該數據於質心模式(centroid mode)下自20至990m/z下收集。為了取得準確的質量，磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)的鎖定質量(lock-mass)為濃度60奈克(ng)/毫升(ng/ml)而流速為6μl/min(ESI正離子模式下，[M+H]+離子為311.0814Da)。
原始質譜數據係使用MassLynx V4.1及MarkerLynx軟體(Waters Corp.,Milford,USA)處理。各質量離子的強度係關於總離子數，其經標準化以產生數據矩陣(data matrix)，該數據矩陣包括滯留時間、m/z值及經標準化的鋒面積。多變數數據矩陣係藉由SIMCA-P軟體(版本13.0,Umetrics AB,Umea，瑞典)分析，於使用帕雷托標度化(Pareto scaling)前先進行OPLS-DA模式。將SIMCA-P用於多變數數據分 析與表現。
接著將於兩群組間顯示顯著差異之確切分子質量數據提交至資料庫中搜尋，使用內部資料庫或線上資料庫HMDB(http：//www.hmdb.ca/)及KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)。為了鑑定特定的代謝物，在與進行譜型實驗相同的條件下，將標準品進行UPLC-MS/MS分析。於每秒0.1質譜及大約4m/z的中型隔離視窗下收集MS/MS質譜。碰撞能設定為自5至35V。
有潛力之生物標誌的建構、相互作用及途徑分析係根據包括KEGG與HMDB之資料庫以MetaboAnalyst軟體進行，藉此辨識受影響的代謝途徑並將之視覺化。藉由大量的分析來評估可能的生物性要角。
(2)血漿目標代謝物的定量(濃度測定)
目標代謝物分析係以AbsoluteIDQ® p180套組(Biocrates Life Science AG，Innsbruck，澳洲)來實施。該套組係用以辨識及定量184種代謝物，此等代謝物涵蓋五種代謝物種類，包括90種甘油磷脂(glycerophospholipid)與15種鞘脂(sphingolipid)(76種磷脂醯膽鹼、14種溶血磷脂醯膽鹼(lysophosphatidylcholine)及15種神經鞘磷脂(sphingomyelin))、19種生物胺、40種醯基肉鹼(acyl carnitine)、19種胺基酸及六碳糖。於96孔盤中將每10μL的血漿樣本與經同位素標定之內標準品混合，並在氮氣流中乾燥。以5%異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate,PITC) 將胺基酸與生物胺衍生化20分鐘，隨後於氮氣中乾燥。加入300μL的萃取溶液(5mM乙酸胺於甲醇中)，反應30分鐘後將混合物以100×g離心2分鐘。隨後將濾液以150μL等分轉移至微孔盤中，再以150μL水稀釋，藉此使用LC-MS/MS進行胺基酸與生物胺分析。將殘留的濾液與套組之MS流動溶劑400μL混合，並進行流動注射分析法暨串聯式質譜儀分析法(flow injection analysis coupled with tandem mass spectrometric analysis,FIA-MS/MS)。該分析係以正極及負極電噴灑離子化模式來進行。藉由多反應監視(multiple reaction monitoring,MRM)完成辨識與定量，並藉由訂定經同位素標定之標準品而將之標準化。於LC-MS分析中，MS係配合UPLC(Waters Corp，Milford，USA)一起使用，而代謝物係於反相管柱(2.1mm×50mm，BEH C18，Waters Corp，Milford，USA)中分離。移動相係由溶劑A(0.2%甲酸於水中)與溶劑B(0.2%甲酸於乙腈中)的梯度混合物所組成(0分鐘0% B，3.5分鐘60% B，3.8分鐘0% B，3.9分鐘0% B)。以流速900μL/min進行洗脫。該管柱之溫度維持在50℃。FIA係使用等強度法(isocratic method)，以套組之MS流動溶劑作為移動相，其具有不同的流動條件(0min，30μL/min；1.6min 30μL/min；2.4min，200μL/min；2.8min，200μL/min；3min 30μL/min)。所對應之MS係如以下設定：暫留時間0.019-0.25秒；3.92KV正電壓模式；1.5KV負電壓模式；氮氣作為碰撞氣體介質；來源溫度為150℃。用於LC-MS 之參數為：暫留時間0.006至0.128秒；來源溫度為150℃；電壓為3.20KV；氮氣作為碰撞氣體介質。用於目標MS數據分析之數據輸入與前處理步驟係使用TargetLynx(Waters，MA，USA)完成。藉由自動化的代謝產物濃度計算將整合的MetIDQ軟體(Biocrates，Innsbruck，澳洲)係應用於流線型(streamline)數據分析。
(3)血漿之對硫甲酚與硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)的定量
血漿樣本之製備係使用500μL甲醇(以40ng/ml d4-硫酸吲哚酚作為內標準品)將蛋白質沈澱，接著於4℃以12,00×g離心10分鐘。收集上清液用於對硫甲酚與硫酸吲哚酚分析。於Xevo TQ MS Acquity UPLC系統(Waters Corp，Milford，USA)中實施LC-MS/MS。於反相Acquity UPLC BEH C18管柱(1.7μm，100mm×2.1mm)中完成分離。該管柱維持於40℃，流速為0.5ml/min。將樣本自LC管柱中洗提係使用線性梯度：0至0.5分鐘：10-20% B；0.5至3分鐘：20至70% B；3至3.5分鐘：98% B；5.1至7分鐘：10% B用於再平衡。移動相為水(溶劑A)及甲醇(溶劑B)。串聯式四極質譜法中之質譜離子化、分裂及獲得條件之優化係使用負極模式的電噴灑離子化(electrospray ionization,ESI)。該條件如下：去溶氣體設定為1000l/h，溫度500℃；錐孔氣體設定為30l/h，且來源溫度設定為150℃。毛細管電壓與錐孔電壓分別設定為800V與30V。質譜法係操作於多反應監測(MRM)模式，暫留時間及內掃描延遲時間分別為 0.2秒及0.1秒。數據之收集與處理係使用Masslynx軟體(版本4.0)。
(4)統計分析
該結果係表示為連續變數之平均值±SD以及分類變數之數目(百分比)。藉由適當之兩樣品之t-tests、ANOVA及卡方檢定(Chi-square)比較數據。使用指定之軟體來進行代謝物體學分析。為了最大化各組間的代謝譜型之辨識差異，係利用正交投影潛在結構判別分析(OPLS-DA)模式，並以SIMCA-P(版本13.0,Umetrics AB,Umea，瑞典)來進行。計算該模式中各變數之投影值中變數投影重要性(variable importance in the projection,VIP)之值，以該值表示對該類別的貢獻。較高的VIP值表示對各組間之區分有較強的貢獻。該等變數之VIP值大於1.0時被認為具有顯著性差異。代謝物體學以及HF之BNP的診斷值係藉由接受者操作特徵(receiver operating characteristic,ROC)曲線的曲線下面積(area under the curve,AUC)表示。
依進度表或最後一個可取得之探訪來收集後續數據。ROC曲線以及Kaplan-Meier分析係被用來測定第一個經定義之事件(死亡、或與HF相關之再住院率)的預測器(predictor)。為了Kaplan-Meier分析，該截斷值(cutoff value)設定為各變數的平均值來獲得對數等級(Log rank)的數據。該AUC及對數等級之值係被用來顯示具有HF病患之代謝物體學的預後及BNP。所有的統計分析係以雙尾及使 用SPSS軟體進行(版本15.0,SPSS,Chicago,IL,USA)。小於0.05的P值被認為具顯著性。
實施例1：用以診斷及判斷心臟衰竭期別的全代謝體學分析 1.各組病人之基本特性
本實施例總共招收234名個體，其包括51名正常個體以及183名處於第A期(n=43)、第B期(n=67)及第C期(n=73)之病患，其基線特性與實驗室數據係如表1所示。在大部份的變數中，可注意到自正常對照組至第A、B及C期之病患間有顯著的改變趨勢。相較於正常對照組，處於第C期之病患的BNP含量明顯較高，QRS波群則較寬，但總膽固醇、低及高密度脂蛋白膽固醇(low and high density lipoprotein cholesterol)、鈉、血紅素、白蛋白(albumin)及預估之腎小球過濾率(estimated glomerular filtration rate)則較低。就年齡而言，各組病人之間雖然沒有顯著的差異，但其年齡皆大於正常對照組。此外，病患中的男性比例也較高。冠狀動脈疾病係HF病患的主要病因。
ACEI：血管收縮素轉化酵素抑制劑；ARB：血管收縮素受器阻斷劑；BMI：身體質量指數；COPD：慢性阻塞性肺病；慢性腎病：預估腎小球過濾率(eGFR)為<60ml/min/1.73m2；LVEF：左心室排出量；MDP：多學科疾病管理組(multidisciplinary disease management group)。
2.心臟衰竭組與正常對照組中的全代謝物分析
於本實施例中所進行的全代謝物分析係用以區分第A、B及C期之病患與正常對照組。
在全代謝物分析中，OPLS-DA明顯地區分了正常對照組與第A、B及C期之病患(第1A圖)。比較正常對照組與第A、B及C期之病患，表2顯示VIP得分>1.0的代謝物。為了區分正常對照組與第C期病患，使用所有全代謝體學數據組並計算出全代謝體學衍生參數，稱之為t[1](如x軸所示)；為了區分正常對照組與第A期病患，使用所有全代謝體學數據組並計算出全代謝體學衍生參數，稱之為t[0](如y軸所示)。於t[1]標尺中，第A期病患的得分圖集聚區相似於正常對照組，然而相較於正常對照組於t[0]標尺中往上位移(第1A圖)。
依同樣的全代謝體學衍生參數計算方式，計算出第B期病患的t[1]與t[0]值。第B期病患的得分圖廣布的區域位在第A期、第C期及正常對照組間(第1B圖)。
必需AA：必需胺基酸；P值1：第C期與正常對照組間的差異；P值2：第A期與正常對照組間的差異；P值3：第B期與正常對照組間的差異。
3.辨識心臟衰竭中異常的代謝途徑
不同種類的代謝物在心臟衰竭的不同期別會有所變化(表2)。該等代謝物包括嘌呤、胺基酸、生物胺及磷脂質。相較於對照組，第C期之病患中的精胺酸代謝、尿素循環、嘌呤代謝及一氧化氮合成途徑顯著地受到影響。一些與精胺酸代謝有關的代謝物(諸如：麩醯胺酸及瓜胺酸)的含量在第C期之病患中較低；次黃嘌呤、黃嘌呤、尿酸、麩胺酸、脯胺酸、鳥胺酸、精胺與亞精胺的含量在第C期之病患中則上升；芳香胺基酸(諸如：酪胺酸及苯丙胺酸)的含量在第C期之病患中較高。此外，數種磷脂醯膽鹼的含量降低，而牛黃酸的含量則增加。透過KEGG及HMDB資料庫，將從第C期之病患的全代謝物變化中所得的研究結果繪製成生物化學途徑(第2圖)。此研究結果可以顯示尚未出現於HF臨床表現時的代謝物變化異常，並且提供更多有關疾病機制的資訊。
4.用以區分不同期別之HF病患與正常對照組的不同全代謝物組合
為了區分第A期之病患與正常個體，發現了一些良好的代謝物組合，係如表3所示。藉由接受者操作特徵(ROC)曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值係優於BNP。
BNP：B型利尿胜肽；Met：甲硫胺酸；必需AA：必需胺基酸；PCaeC34：3：磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3；C5：1：甲基巴豆醯肉鹼(Tiglylcarnitine)；C3OH：羥基丙醯肉鹼；His：組胺酸；Pro：脯胺酸；Gln：麩胺酸；PCaeC34：2：磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2；C3：丙醯肉鹼；Tyr：酪胺酸；Phe：苯丙胺酸；Ile：異白胺酸；C18：2：十八二烯基肉鹼(Octadecadienylcarnitine)。
為了區分第A期之病患與第C期之病患，發現了一些良好的代謝物組合，係如表4所示。藉由ROC曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值係優於BNP。
BNP：B型利尿胜肽；費雪比率：支鏈胺基酸與芳香胺基酸之比率；PCaeC34：3：磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3；His：組胺酸；Phe：苯丙胺酸。
為了區分第C期之病患與正常個體，發現了一些良好的代謝物組合，係如表5所示。藉由ROC曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值與BNP相似。
BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34：4：磷脂醯膽鹼二醯基C34：4；His：組胺酸；Phe：苯丙胺酸。
為了區分第B期之病患與正常個體，發現了一些良好的代謝物組合，係如表6所示。藉由ROC曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值係優於BNP。
BNP：B型利尿胜肽；必需AA：必需胺基酸；PCaeC34：2：磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2；C3：丙醯肉鹼；His：組胺酸；Pro：脯胺酸；Glu：麩胺酸鹽；Tyr：酪胺酸；Phe：苯丙胺酸；C0：肉鹼；總ACOH：總羥基乙醯肉鹼；總PCae：總磷脂醯膽鹼；費雪比率：(白胺酸+異白胺酸+纈胺酸)/(苯丙胺酸+色胺酸+酪胺酸)；總AC：總乙醯肉鹼。
為了區分第B期之病患與第A期之病患，發現了一些 良好的代謝物組合，係如表7所示。藉由ROC曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值係優於BNP。
BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34：4：磷脂醯膽鹼二醯基C34：4；Ala：丙胺酸；SDMA：對稱性二甲基精胺酸；C5：1：甲基巴豆醯肉鹼(Tiglylcarnitine)；C3：丙醯肉鹼。
為了區分第B期之病患與第C期之病患，發現了一些良好的代謝物組合，係如表8所示。藉由ROC曲線分析該等組合的診斷值，並以曲線下面積(AUC)呈現。該等代謝體學衍生參數之診斷值係優於BNP。
BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34：4：磷脂醯膽鹼二醯基C34：4；PCaeC34：2：磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2；His：組胺酸；SM C16：0：神經鞘磷脂；C14：2：十四二烯醯基肉鹼(Tetradecadienoylcarnitine)；費雪比率：支鏈胺基酸與芳香胺基酸之比率。
5.在連續性評估中，用於急性HF狀態到穩定狀態之病患的代謝體學
根據表5所描述之數據，試著檢驗組合四種代謝物(組 胺酸、苯丙胺酸、亞精胺及次黃嘌呤)的診斷值。計算該四種代謝物所衍生的參數稱為tPS[1]。為了此目的，進一步於32名(22名男性與10名女性，年齡為54±11歲)處於第C期之病患一起進行代謝體分析與BNP測量。該等病患最初係因急性心因性肺水腫而住院，而後改善成NTHA功能分類級別I，且存活長達1年以上。於出院前及出院後6個月與12個月時進行血漿分析，呈現連續性變化之tPS[1]值。如第3圖所示，在32名病患中之出院前的tPS[1]值顯著高於正常對照組。雖然6個月時tPS[1]值明顯降低，但於12個月時，注意到在部分病患中tPS[1]值上升。相較於出院前，於6個月時的BNP含量明顯下降，而於12個月時之含量仍維持穩定。該等研究結果表示在急性HF後的HF狀態預估中，相較於BNP，代謝體學分析係較為靈敏的工具。
實施例2：用以診斷及判斷心臟衰竭期別的目標代謝體學分析 1.病患
本實施例總共招收145名個體，其中包括62名正常個體以及83名處於第C期之病患。
2. HF與正常對照組中的目標代謝體學分析
為了定量代謝物的濃度，本實施例使用Biocrates套組，根據目標代謝體學工作流程，進行血漿代謝體學分析， 並且使用OPLS-DA模式進行生物訊息數據組分析。為了測試目標代謝物譜型是否能夠區分第C期HF之病患與正常對照組，此分析總共使用201個變數。足以區分兩群組之間的代謝物係如表9所列(該等代謝物具有VIP得分>1.0)。
係以平均值±標準差呈現數據；DMA：DMA表示總二甲基精胺酸。
3.區分第C期之病患與正常對照組
為了區分第C期之病患與正常對照組(診斷值)，繪製BNP與t[2]兩者的ROC曲線(藉由使用主成物分析，將所有的目標代謝物列入計算)(第4圖)，兩者的曲線下面積分別為0.998與1.0。在目標代謝體學數據組中，發現對於HF的代謝體學診斷值有顯著貢獻之四種重要的代謝物，包括組胺酸、苯丙胺酸、亞精胺及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4(表 10)。該四種代謝物的組合之曲線下面積達到0.995，其優於該四種代謝物單一之數值(第4圖)。根據該四種代謝物的組合而產生之參數，稱之為tPS[2]。用以辨別第C期之HF(與正常對照組比較)的BNP與tPS[2]值之診斷值係如表10所示。
BNP：B型利尿胜肽含量；PC aa：磷脂醯膽鹼二醯基；t[2]為從所有目標代謝物數據組所衍生的參數；tPS[2]為從四種代謝物(組胺酸、苯丙胺酸、PC aa C34：4(磷脂醯膽鹼二醯基C34：4)及亞精胺)所衍生的參數。
實施例3：用以評估心臟衰竭預後的目標代謝體學分析 1.代謝體學特徵之預後值
為了評估代謝體學與BNP之預後值，以下的分析法係針對第B及C期之病患。為了在全因死亡與HF相關的再住院率的複合事件中尋找有預測潛力的代謝物(predictor)，於目標代謝物數據組中的廣泛分析顯示，四種代謝物(二甲基精胺酸/精胺酸之比率、亞精胺、丁醯肉鹼及必需胺基酸總量)之組合產生明顯優於BNP之理想的預後價值。藉由組合該等四種代謝物所產生之參數，稱為tPS[3]。tPS[3]、tPS[2](衍生自所有目標代謝物數據組)及BNP含量之ROC曲線的AUC係分別為0.853、0.792及0.744(第5A圖)。表11顯示該等參數對於預後之AUC數據(以ROC曲線)及對數等級(以Kaplan-Meire分析法)。
tPS[3]的平均值(2.9，範圍0.04-5.63)被設定為預後預測的截斷值(cutoff value)。在第5B圖中，Kaplan-Meire曲線表示出院前之tPS[3]係2.9，其與HF相關之再住院率與全因致死的複合事件率有關(對數等級=17.5,p<0.0001)。相較之下，如第5C圖所示，BNP之預後值係350皮克/毫升(pg/ml)(對數等級=9.9,p=0.002)。
BNP呈現B型利尿胜肽含量；t[2]為從所有目標代謝體學分析衍生出的參數；tPS[2]為從四種代謝物(組胺酸、苯丙胺酸、PC aa C34：4(磷脂醯膽鹼二醯基C34：4)及亞精胺)衍生出的參數；DMA呈現總二甲基精胺酸；必需胺基酸包含苯丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、色胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸及組胺酸。
實施例4：用於心臟衰竭病患之全代謝體學分析的預後值
本實施例進行全代謝體學分析，總共招收157名處於 第B期(n=81)及第C期(n=76)之病患。使用全代謝體學分析以辨別不同的代謝物組合，該代謝物組合對於預測死亡與心臟衰竭相關之再住院的複合事件具有良好之數值。
對於代謝體學與BNP之預後值，係根據AUC(衍生自ROC曲線)及對數等級值(衍生自Kaplan- Meire分析)來預估，該等數據係如表12所示。
1.比較BNP與不同的全代謝物組合之預後值： (1).藉由AUC(衍生自ROC曲線)：
最初發現結合四種代謝物之代謝體學的預後值優於BNP，該等代謝物包括二甲基精胺酸/精胺酸、亞精胺、丁醯肉鹼及必需胺基酸總量。
根據表12，二甲基精胺酸/精胺酸與丁醯肉鹼之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、丁醯肉鹼及亞精胺之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、丁醯肉鹼及黃嘌呤之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、黃嘌呤及色胺酸之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、黃嘌呤及亞精胺/精胺之組合已優於BNP；單獨黃嘌呤已優於BNP；SDMA(對稱性二甲基精胺酸)/精胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸、黃嘌呤及色胺酸之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸、黃嘌呤及亞精胺/精胺之組合已優於BNP；單獨SDMA已優於BNP；單獨SDMA/精胺酸已優於BNP；單獨對硫甲酚已優於BNP；SDMA及對硫甲酚之組合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及磷脂醯膽鹼二醯基C38：6之組 合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及亞精胺之組合已優於BNP；DMA/精胺酸及對硫甲酚之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及磷脂醯膽鹼二醯基C38：6之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及亞精胺之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；色胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；色胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；色胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；白胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；白胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；白胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；蘇胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；蘇胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；蘇胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP。
然而，注意到僅有二甲基精胺酸/精胺酸比BNP差。
(2).藉由對數等級值(衍生自Kaplan- Meire分析)：(截斷值係設定為各參數的平均值)
最初發現結合四種代謝物之代謝體學的預後值優於BNP，該等代謝物包括二甲基精胺酸/精胺酸、亞精胺、丁醯肉鹼及必需胺基酸總量。
二甲基精胺酸/精胺酸與丁醯肉鹼之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、丁醯肉鹼及亞精胺之組合已 優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、丁醯肉鹼及黃嘌呤之組合已優於BNP；單獨二甲基精胺酸/精胺酸仍然優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、黃嘌呤及色胺酸之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸、黃嘌呤及亞精胺/精胺之組合已優於BNP；單獨黃嘌呤已優於BNP；SDMA(對稱性二甲基精胺酸)/精胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸、黃嘌呤及色胺酸之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸、黃嘌呤及亞精胺/精胺之組合已優於BNP；單獨SDMA已優於BNP；單獨SDMA/精胺酸已優於BNP；單獨對硫甲酚已優於BNP；SDMA及對硫甲酚之組合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及磷脂醯膽鹼二醯基C38：6之組合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；SDMA、對硫甲酚及亞精胺之組合已優於BNP；DMA/精胺酸及對硫甲酚之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及磷脂醯膽鹼二醯基C38：6之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；DMA/精胺酸、對硫甲酚及亞精胺之組合已優於BNP；二甲基精胺酸/精胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；SDMA/精胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；色胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；色胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；色胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；白胺酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；白胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；白胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP；蘇胺 酸及黃嘌呤之組合已優於BNP；蘇胺酸及亞精胺之組合已優於BNP；蘇胺酸及丁醯肉鹼之組合已優於BNP。
(3).以2或3個必需胺基酸取代總必需胺基酸
為了評估心臟衰竭的預後，當總必需胺基酸用於如上所述之代謝物組合時，需注意總必需胺基酸(9種胺基酸)可藉由使用3種具有相似預後值的胺基酸(白胺酸、蘇胺酸及色胺酸)來取代。再者，需注意總必需胺基酸(9種胺基酸)可藉由使用具有相似預後值的2種胺基酸(白胺酸及蘇胺酸，或白胺酸及色胺酸)來取代(參見表12)。
DMA：總二甲基精胺酸；SDMA：對稱性二甲基精胺酸；PCaaC38：6：磷脂醯膽鹼二醯基C38：6。
實施例5：用於診斷心臟衰竭之套組 1.樣本萃取 (1).用於全代謝物分析之血漿樣本的製備
於100μl血漿中添加400μl乙腈(ACN)，將該混合物震盪30秒，超音波震盪15分鐘，接著以10,000×g離心 25分鐘，收集上清液並放入分離管，再一次萃取該小粒(pellets)，將等量體積的甲醇水溶液(1：1甲醇/水，體積比體積)加入該殘留小粒中，將上清液震盪30秒，超音波震盪15分鐘，再次離心以去除沉澱物。將甲醇上清液與乙腈上清液兩種水溶液收集在一起並於氮氣蒸發器中乾燥，將該殘留物保存並儲存於-80℃。將該殘留物回溶於100μl 95：5水/乙腈，並以14,000×g離心5分鐘，收集澄清的上清液以進行LC-MS分析。
(2).用於脂質分析之血漿樣本的製備
為了萃取脂質，使用修飾過的Folch’s方法。簡言之，將100μl血漿移至玻璃管，加入6毫升的氯仿/甲醇(2：1，v/v)溶液及1.5ml的水。將該樣品震盪30秒4次，隨後於4℃下以700×g離心30分鐘。盡可能完全移除上層相，下層相則超音波震盪10分鐘。將樣品於4℃下以700×g離心10分鐘，盡可能完全移除上層相，下層相則靜置於4℃。取3毫升該樣本於氮氣中乾燥，接著儲存於-80℃。於分析前，將樣品溶於200μl 40%甲醇。
2.藉由診斷裝置進行代謝物辨識 (1).MS/MS分析
為了辨識目標代謝物的結構，於與譜型實驗相同的層析條件下操作該標準品。MS及MS/MS分析係以相同條件進行。於每秒0.1質譜及大約4m/z的中型隔離視窗下收集 MS及MS/MS質譜。碰撞能設定為5至35V。於相似的層析條件下，藉由離子遷移質譜儀進一步驗證數種代謝物。
(2).螢光光譜儀測定組胺酸(或其他代謝物，諸如黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、對硫甲酚及其組合)在血漿中的濃度的方法為：將組胺酸(或其他代謝物，諸如黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、對硫甲酚及其組合)與鄰苯二甲醛在鹼中反應以形成螢光產物，將該螢光產物使用螢光光譜儀測量。在使用的範圍中，該方法係線性。
用於本文的診斷裝置並不限於上述實施例。根據代謝物的本性，亦可使用其他診斷裝置，諸如生物晶片、ELISA、LC-MS等，來測量本文欲辨識的代謝物。
代謝體學分析探究心臟衰竭病患中之全代謝物的異常。藉由代謝體學分析，本發明係提供優於BNP及傳統標誌所能提供與心臟衰竭有關的資訊。分析血漿中豐富的代謝物可用以探究無法從BNP含量異常中看出的複雜之整體代謝波動，包括在HF病程期間之麩胺酸-鳥胺酸-脯胺酸、多胺、嘌呤及牛磺酸合成途徑的增加；一氧化氮、多巴胺及磷脂醯膽鹼合成途徑的減少(參見表2)；以及尿素循環、生物蝶呤循環、MTA循環、甲硫胺酸循環、鳥胺酸-脯胺酸-麩胺酸、多胺合成、多巴胺合成、甲基化(肌酸酐及磷脂醯膽鹼)、轉硫化反應(牛磺酸)及嘌呤代謝中的變化。一些代謝物(例如：嘌呤、組胺酸、苯丙胺酸、鳥胺酸、精胺酸、精胺、亞精胺、牛磺酸及磷脂醯膽鹼)在血漿中的 濃度於不同的心臟衰竭期別會有所變化，該等代謝物的變化係為有潛力的生物標誌。
藉由代謝體學分析，相較於ACC/AHA分類、BNP或其他傳統標誌所能提供者，本發明提供更靈敏且更專一的心臟衰竭階段代謝評估。本發明提供之方法能夠區分第C期HF之病患與健康個體、第A期HF之病患與健康個體，以及第C期HF之病患與第A期HF之病患。相較於ACC/AFA分類方法，本發明提供之方法能更科學性的區分不同HF期別之病患。
相較於BNP與傳統標誌所能提供者，本發明藉由使用代謝體學分析而辨識出新的生物標誌(例如：黃嘌呤、亞精胺、丁醯肉鹼、一些磷脂醯膽鹼及其他代謝物之組合)，藉此提供心臟衰竭病患更好的診斷值與預後值。
本發明之有些實施例已於上文中詳細描述，然而，本發明所屬技術領域者可針對特定的實施例做出多種修改或變化而實質上不悖離本發明之教示與優點。該修改與變化包含在本發明之精神與範圍，如後附之申請專利範圍所陳明者。

Claims (15)

  1. 一種活體外偵測個體心臟衰竭之方法，該方法包括：自取自個體之生物樣本獲得至少二種選自於黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、對硫甲酚、胺基酸、次黃嘌呤及磷脂醯膽鹼所組成之群組之生物標誌的量，且其中一種生物標誌係亞精胺、丙醯肉鹼或丁醯肉鹼；組合計算該至少二種生物標誌的量以獲得經組合計算之值；以及比對該經組合計算之值與參考值。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該生物樣本係選自於血液、血漿、血清及尿液所組成之群組至少一者。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組至少一者。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯 膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組至少一者。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組至少一者。
  6. 一種活體外偵測個體心臟衰竭期別之方法，該方法包括：自取自個體之生物樣本獲得至少二種選自於黃嘌呤、亞精胺、丙醯肉鹼、胺基酸、次黃嘌呤及磷脂醯膽鹼所組成之群組之生物標誌的量，且其中一種生物標誌係亞精胺或丙醯肉鹼；組合計算該至少二種生物標誌的量以獲得經組合計算之值；以及比對該經組合計算之值與參考值。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該胺基酸係選自於麩醯胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、精胺酸、白胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸及脯胺酸所組成之群組至少一者。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼二醯基C34：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽 鹼醯基-烷基C34：3、磷脂醯膽鹼二醯基C36：0、磷脂醯膽鹼二醯基C36：1、磷脂醯膽鹼二醯基C36：3、磷脂醯膽鹼二醯基C38：6、磷脂醯膽鹼二醯基C36：6、磷脂醯膽鹼二醯基C38：5、磷脂醯膽鹼二醯基C40：5、磷脂醯膽鹼二醯基C36：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C36：5、磷脂醯膽鹼二醯基C38：0、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C32：3、磷脂醯膽鹼二醯基C40：4、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C38：3及磷脂醯膽鹼二醯基C42：6所組成之群組至少一者。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，該磷脂醯膽鹼係選自於磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：2、磷脂醯膽鹼醯基-烷基C34：3及磷脂醯膽鹼二醯基C34：4所組成之群組至少一者。
  10. 一種活體外評估心臟衰竭預後之方法，該方法包括：自取自個體之生物樣本獲得至少二種選自於黃嘌呤、亞精胺、丁醯肉鹼、對硫甲酚、胺基酸、次黃嘌呤及磷脂醯膽鹼所組成之群組之生物標誌的量，且其中一種生物標誌係亞精胺或丁醯肉鹼；組合計算該至少二種生物標誌的量以獲得經組合計算之值；以及比對該經組合計算之值與參考值。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該胺基酸係必需胺基酸。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，該必需胺基酸係選自於組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、 甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸所組成之群組至少一者。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該必需胺基酸係選自於白胺酸、蘇胺酸及色胺酸所組成之群組至少一者。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該胺基酸係二甲基精胺酸及精胺酸，且該方法進一步包括計算二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該胺基酸係對稱性二甲基精胺酸及精胺酸，且該方法進一步包括計算對稱性二甲基精胺酸/精胺酸之比率。
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