CN106546721B - 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒 - Google Patents

腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106546721B
CN106546721B CN201611048058.9A CN201611048058A CN106546721B CN 106546721 B CN106546721 B CN 106546721B CN 201611048058 A CN201611048058 A CN 201611048058A CN 106546721 B CN106546721 B CN 106546721B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bladder cancer
mir
cystitis glandularis
diagnosis
cystitis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611048058.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106546721A (zh
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Maiwei Metabolic Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
Wuhan Mai Tver Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Mai Tver Biological Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Mai Tver Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201611048058.9A priority Critical patent/CN106546721B/zh
Publication of CN106546721A publication Critical patent/CN106546721A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106546721B publication Critical patent/CN106546721B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒，生物标志物包括甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)。联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.872，具有一定准确度。本发明提供的生物标志物可以用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，克服膀胱镜检查的不足，有望代替活检，可以开发成诊断试剂或试剂盒。

Description

腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒
技术领域
本发明涉及生物标志物，具体涉及腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒，用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌。
背景技术
腺性膀胱炎是一种黏膜增生性病变，镜检除见上皮细胞巢、腺体和小囊肿外，在固有膜内尚有不同程度的浆细胞浸润【参考文献：汤昊等，第二军医大学长海医院泌尿外科，腺性膀胱炎及其诊治，临床泌尿外科杂志，2008年】。PantuckAJ等通过免疫组化方法发现了腺性膀胱炎及膀胱癌中单抗表达的相关性，证实腺性膀胱炎是膀胱癌的癌前病变，同时容易被误诊为膀胱癌【参考文献：Adenocarcinoma of the urachus and bladder expressesa unique colonic epithelial epitope:an immunohistochemical study,J Urol.1997Nov；158(5):1722-7】。
腺性膀胱炎临床表现为尿频、尿急、尿痛、排尿困难、肉眼或镜下血尿，如并发肾积水，可出现腰酸、腰胀等不适症状。影像学检查中，B超、IVU可发现膀胱占位性病变，但无特异性；CT检查敏感性高，当发现膀胱内占位性病变伴膀胱壁广泛增厚时，要高度怀疑本病，增强扫描对鉴别膀胱癌和腺性膀胱炎意义不大。所有这些都是非特异性的，确诊主要依据膀胱镜检加活检。膀胱镜检可见：(1)滤泡样水肿，表现为片状浸润型的滤泡状水肿隆起或绒毛状增生；(2)膀胱黏膜乳头状增生，可见带蒂的乳头状物，充血水肿；(3)慢性炎症，表现为局部黏膜粗糙、血管纹理增多及模糊不清；(4)黏膜无显著改变。其中乳头状病变与膀胱乳头状肿瘤很难鉴别，仔细观察可发现腺性膀胱炎的乳头状肿物末端透亮且无血管进入，而膀胱乳头状肿瘤则末端不透亮且可见有血管进入乳头。但确诊只能依据活检。【参考文献：汤昊等，第二军医大学长海医院泌尿外科，腺性膀胱炎及其诊治，临床泌尿外科杂志，2008年】。但是，膀胱镜检查有很多禁忌，如尿道、膀胱处于急性炎症期不宜进行检查，膀胱容量过小不宜进行检查，妇女月经期或妊娠3个月以上不宜进行检查。而且，术前准备和术后处理繁琐。这些增加了检查者的身体和心理痛苦。
哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科丁德鑫等研究了腺行膀胱炎和膀胱癌中livin和caspase-9的表达，结果发现livin和caspase-9在腺行膀胱炎和膀胱癌中差异表达，提示livin和caspase-9可以作为诊断早期膀胱癌的检测指标【参考文献：丁德鑫等，腺性膀胱炎及膀胱癌中livin和caspase-9的表达，现代生物医学进展，2016】。上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院泌尿外科杨安卿等发现P27蛋白阳性表达率在正常膀胱组织、腺性膀胱炎组织及膀胱癌组织中分别为80％、48.84％及32％，其中后两者显著低于前者，表明P27蛋白的减弱或缺失，与腺性膀胱炎及膀胱癌的发生密切相关，可以作为诊断早期膀胱癌的检测指标【参考文献：杨安卿等，P27蛋白在腺性膀胱炎的表达及其与膀胱癌的关联，贵州医药2016年7月第40卷第7期】。国内外的类似研究也都关注于蛋白分子的表达。
申请人2016年11月14日提交了两份申请(申请号为2016109975148和201610997535X)，分别以外周血循环微小RNA和血浆代谢物为生物标志物对不同类型的腺性膀胱炎进行诊断分型，可以将这些生物标志物制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂，不通过介入手段就可以对腺性膀胱炎诊断分型，仅需患者少量血浆，检查时没有禁忌，克服了膀胱镜检查的不足。
申请人在研究腺性膀胱炎和膀胱癌患者血浆中微小RNA谱和代谢物谱时，发现了可以准确诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的标志物，可以用于开发成诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物，用于无创诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，以克服膀胱镜检查的不足，有望代替活检。
本发明上述目的是通过以下技术方案得以实现：
循环微小RNA角度：
用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，包括SEQ ID NO.1所示的miR-383-3p、SEQ ID NO.2所示的miR-423-3p、SEQ ID NO.3所示的miR-299-5p。联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.844，具有一定准确度。
进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p和SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括SEQ ID NO.4所示的miR-371a-3p、SEQ ID NO.5所示的miR-215-5p和SEQ ID NO.6所示的miR-423-3p。进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
生物标志物在制备诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或诊断试剂盒方面的用途。
SEQ ID NO.1所示的miR-383-3p在预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变易感性方面的应用。miR-383-3p在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调1.8～2.2倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调2.3～2.5倍，表明miR-383-3p可以预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。
小分子代谢物角度：
用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，包括甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)。联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，AUC为0.872，具有一定准确度。
进一步包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括次黄嘌呤。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
进一步包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和次黄嘌呤。进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，AUC＞0.9，具有较高的准确性。
所述生物标志物源于血浆。
生物标志物在制备诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或诊断试剂盒方面的用途。
甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸在预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变易感性方面的应用。甲基巴豆酰肉碱在腺性膀胱炎患者血浆中水平比膀胱正常人上调2.4～2.6倍，在膀胱癌患者血浆中水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.9～2.3倍；花生四烯酸在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调3.6～3.9倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.6～2.0倍。这表明甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸可用于预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。
本发明的有益效果：
联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，AUC＞0.8，可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒；联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，AUC＞0.8，可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
实施例1：基于外周血循环微小RNA诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌
第一部分：筛选阶段
一、实验材料和实验方法
1、血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁，男12例，女11例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型6例(3M/3F)、滤泡水肿型5例(3M/2F)、乳头状瘤型5例(2M/3F)、肠腺瘤样型7例(4M/3F)；膀胱癌组研究对象21例，年龄43～54岁，平均50.1岁，男12例，女9例，具体为膀胱尿路上皮癌(12M/9F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
2、血浆总RNA提取：取400μL血浆，使用mirVanaTM RNAIsolation试剂盒(Ambion公司)抽提总RNA，依照试剂盒说明书操作，采用分光光度计测定所提取RNA的质量。
3、分离标记：将1μg RNA，7μL DEPC水，2μL RNA Spike Control Oligospoly，5μLATP浓度为1mmol/L Tris的溶液混合后快速离心。向上述溶液加入1.5μL 25mmol/L MnCl2，1.5μL 10×reaction buffer，1.0μL酸性磷酸酶，1.0μL diluted ATP Mix后37℃孵育15min；荧光标记连接，取上述混合物15μL快速离心后置冰浴上，加入2μL T4DNA连接酶，4μL5×FlashTag连接Mix生物素，混匀后快速离心，25℃孵育0.5h。
4、芯片杂交：采用Affymetrix公司miRNA芯片试剂盒，遵从试剂盒说明书进行操作。.杂交液的配制：50μL 2×杂交Mix，5μL 20×杂交对照物，5μL去离子甲酰胺，10μL DEPC水，1.7μL对照物寡聚核苷酸B2及10μL二甲基亚砜。将上述杂交液与生物素样本混合后99℃孵育5min，45℃孵育5min，取100μL用于微阵列杂交，48℃，60r/min孵育16h。
5、芯片扫描及图像数据处理：通过GenePix 4000B microarray scanner(AxonInstruments，Foster City，CA)扫描仪对芯片扫描，并采集荧光强度。然后再通过GenepixPro 6.0 software(Axon)图像分析软件对采集的杂交图像进行数字化分析，用每个探针的原始信号值减去该点的背景值得到每个探针的修正值；用同一批次实验中在每张芯片上修正值≥50的非对照探针做标准化，以这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理。经过标准化处理后，用腺性膀胱炎组/膀胱癌组计算相应miRNAs分子的差异倍数，挑选差异大于1.5或小于0.5的miRNA作为有表达差异的miRNAs，即获得初筛结果，用于进一步验证。
6、表达验证：对初筛有表达差异的miRNAs进行验证，其引物参照GenBank数据库基因序列进行设计。按照qPCR逆转录试剂盒说明书，20μL反应体系，37℃孵育60min，95℃温育5min终止反应，逆转录成cDNA后-20℃储存备用。遵照qPCR试剂盒说明书，20μL反应体系，95℃预变性2min，40个循环，反应条件为95℃，15s及60℃，60s。通过ABI 7500定量PCR仪获得Ct值，单个反应重复2次。
二、实验结果
1、腺性膀胱炎和膀胱癌相比有差异性表达的miRNA
芯片结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组患者血浆中miR-383-3p、miR-371a-3p、miR-215-5p、miR-204-5p、miR-423-3p、miR-361-3p、miR-367-3p、miR-452-5p、miR-299-5p这9种miRNAs表达上调或下调，表达差异显著(P＜0.05)。
2、qPCR表达验证结果
对腺性膀胱炎组和膀胱癌组血浆中的上述差异性miRNA进行qPCR验证，结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组患者血浆中miR-383-3p上调2.3～2.5倍，miR-423-3p下调0.2～0.4倍，miR-299-5p上调1.6～1.8倍，miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p上调1.5～2.0倍。
第二部分：验证阶段
血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁，男42例，女39例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型20例(11M/9F)、滤泡水肿型22例(11M/11F)、乳头状瘤型21例(11M/10F)、肠腺瘤样型18例(8M/10F)；膀胱癌组研究对象54例，年龄42～57岁，平均51.6岁，男29例，女25例，具体为膀胱尿路上皮癌(29M/25F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
其它试验材料和方法同筛选阶段。
受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述qPCR表达验证的miRNAs对腺性膀胱炎诊断分型的能力。
结果显示：联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，ROC曲线下面积(AUC)为0.844，灵敏度和特异性分别为91.3％和92.5％(在最佳cutoff值下，下同)，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7；进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p后，ROC曲线下面积(AUC)均在0.9以上，具体见表1。
表1 ROC曲线验证miRNAs诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的能力
结论分析：ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。结果表明，联合应用miR-383-3p、miR-423-3p和miR-299-5p诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，进一步联合miR-371a-3p、miR-215-5p和miR-423-3p中的一个或多个后，准确度进一步提高，具有较高的准确性。这6个miRNAs可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。
通过与申请人先前申请(申请号2016109975148)比较发现，miR-383-3p在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调1.8～2.2倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调2.3～2.5倍，表明miR-383-3p可以预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。
实施例2：基于血浆小分子代谢物诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌
第一部分：筛选阶段
一、实验材料和实验方法
1、血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁，男12例，女11例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型6例(3M/3F)、滤泡水肿型5例(3M/2F)、乳头状瘤型5例(2M/3F)、肠腺瘤样型7例(4M/3F)；膀胱癌组研究对象21例，年龄43～54岁，平均50.1岁，男12例，女9例，具体为膀胱尿路上皮癌(12M/9F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
2、LC-MS分析用样品的制备
取血浆50μl，加入200μl乙腈，手动混合30s后超声混合20min，再以10,000×g离心30min，收集上清液于分离式玻璃管中，沉淀继续用200μl体积浓度50％的甲醇萃取，将甲醇萃取的上清液与乙腈萃取的上清液合并，氮气吹干，残留物于-80℃保存。LC-MS分析前，用100μl体积浓度5％的乙腈水溶液将残留物溶解，14,000×g离心5min，上清液进样分析(8h内有效)。
3、LC-MS分析参数
色谱系统：Waters Acquity HPLC/Q-TOF Micro MS
色谱柱：Acquity UPLCTM BEH C18(2.1m×100mm×1.7μm)
流动相：A相为水(含0.1％甲酸)；B相为乙腈(含0.1％甲酸)
梯度条件：0-2min，2-50％B；2-3min，50-98％B；3-4.5min，98％B；4.5-6min，2％B。
流速：0.5mL/min；柱温：45℃。
MS条件：电喷雾(UPLC/Q-TOF/MS ESI)离子源，在正、负离子模式下，扫描范围m/z100-1000；毛细管电压3.0kV，锥孔电压35kV，离子源温度100℃，干燥气温度为450℃，干燥气流速900L/h，锥孔气流量50L/h。
4、数据处理分析和差异代谢结构鉴定
将LC-MS得到的数据导入SIMCA软件(version 13.0.2，Umetrics)进行多元统计分析。通过建立OPLS-DA模型，寻找腺性膀胱炎组和膀胱癌组之间代谢轮廓贡献较大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代谢物，然后将这些代谢物的确切分子质量数据提交至在线数据库KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜寻，解析化合物质谱，对化合物进行结构鉴定，最终通过这些化合物标准品确证差异代谢物的结构。
5、定量验证：采用质谱对差异代谢物定量，测定差异代谢物在各组样本中的浓度水平。
二、实验结果
质谱定量(三重四级杆QqQ-MS)结果显示：与腺性膀胱炎组相比，膀胱癌组血浆中甲基巴豆酰肉碱上调1.9～2.3倍，花生四烯酸上调1.6～2.0倍，溶血磷脂酰胆碱(18:2)下调0.4～0.6倍，溶血磷脂酰胆碱(20:3)下调0.3～0.5倍，二酰基磷脂酰胆碱(40:4)下调0.3～0.5倍，次黄嘌呤上调1.7～1.9倍。这6个代谢物的VIP值和p值见表2。
表2 腺性膀胱炎组和膀胱癌组差异代谢物
差异代谢物 VIP值 p值
甲基巴豆酰肉碱 2.87 0.001
花生四烯酸 2.69 0.002
溶血磷脂酰胆碱(18:2) 2.54 0.009
溶血磷脂酰胆碱(20:3) 1.92 0.004
二酰基磷脂酰胆碱(40:4) 2.13 0.006
次黄嘌呤 1.77 0.003
第二部分：验证阶段
血浆样本：腺性膀胱炎组研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁，男42例，女39例，经膀胱镜检查包括慢性炎症型20例(11M/9F)、滤泡水肿型22例(11M/11F)、乳头状瘤型21例(11M/10F)、肠腺瘤样型18例(8M/10F)；膀胱癌组研究对象54例，年龄42～57岁，平均51.6岁，男29例，女25例，具体为膀胱尿路上皮癌(29M/25F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。各组研究对象的年龄无显著性差异，所有患者均有正常的心肺肝肾及造血功能。收集上述患者的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
其它试验材料和方法同筛选阶段。
受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述质谱定量验证的差异代谢物对腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断区分能力。
结果显示：联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌时，ROC曲线下面积(AUC)为0.872，灵敏度和特异性分别为90.8％和91.9％(在最佳cutoff值下，下同)，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.5；进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，ROC曲线下面积(AUC)均在0.9以上，具体见表3。
表3 ROC曲线验证差异代谢物诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的能力
结论分析：ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。结果表明，联合应用甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌具有一定的准确性，进一步联合二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和/或次黄嘌呤后，准确度进一步提高，具有较高的准确性。这6个血浆代谢物可以用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌，可以制备成诊断试剂或诊断试剂盒。
通过与申请人先前申请(申请号201610997535X)比较发现，甲基巴豆酰肉碱在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调2.4～2.6倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.9～2.3倍；花生四烯酸在腺性膀胱炎患者血浆中的水平比膀胱正常人上调3.6～3.9倍，在膀胱癌患者血浆中的水平比腺性膀胱炎患者进一步上调1.6～2.0倍。这些表明甲基巴豆酰肉碱和花生四烯酸可以用于预示腺性膀胱炎向膀胱癌转变的易感性。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京拓睿谱基因科技有限公司
<120> 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
acagcacugc cuggucaga 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
agcucggucu gaggccccuc agu 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
ugguuuaccg ucccacauac au 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
aagugccgcc aucuuuugag ugu 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
augaccuaug aauugacaga c 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
agcucggucu gaggccccuc agu 23

Claims (5)

1.用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，其特征在于：包括甲基巴豆酰肉碱、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(20:3)。
2.根据权利要求1所述的用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，其特征在于：还包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)。
3.根据权利要求1所述的用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，其特征在于：还包括次黄嘌呤。
4.根据权利要求1所述的用于诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的生物标志物，其特征在于：还包括二酰基磷脂酰胆碱(40:4)和次黄嘌呤。
5.权利要求1-4任一所述的生物标志物在制备诊断区分腺性膀胱炎和膀胱癌的诊断试剂或诊断试剂盒方面的用途。
CN201611048058.9A 2016-11-25 2016-11-25 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒 Active CN106546721B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611048058.9A CN106546721B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611048058.9A CN106546721B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106546721A CN106546721A (zh) 2017-03-29
CN106546721B true CN106546721B (zh) 2019-01-04

Family

ID=58395593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611048058.9A Active CN106546721B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106546721B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116148481A (zh) * 2017-03-31 2023-05-23 学校法人庆应义塾 并用抗癌剂的感受性判定标记
CN107917980B (zh) * 2017-11-14 2020-10-16 河南科技大学 鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL131985A0 (en) * 1997-03-21 2001-03-19 Atairgin Biotechnologies Inc Method for detecting cancer associated with altered concentrations of lysophospholipids
EP2270699A1 (en) * 2009-07-02 2011-01-05 BIOCRATES Life Sciences AG Method for normalization in metabolomics analysis methods with endogenous reference metabolites
US20150065366A1 (en) * 2011-11-11 2015-03-05 Metabolon, Inc. Biomarkers for Bladder Cancer and Methods Using the Same
US20150090010A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 Chang Gung University Method for diagnosing heart failure
CN105445408B (zh) * 2016-01-25 2018-06-12 齐炼文 诊断区分冠状动脉粥样硬化和稳定型心绞痛的代谢标志物

Also Published As

Publication number Publication date
CN106546721A (zh) 2017-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Njoku et al. Urinary biomarkers and their potential for the non-invasive detection of endometrial cancer
Granato et al. HE4 in the differential diagnosis of ovarian masses
JP2017224283A5 (zh)
CN105603101A (zh) 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用
WO2022012292A1 (zh) 一种胰腺癌的外周血tcr标志物及其检测试剂盒和应用
CN102399898A (zh) 一种与临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的snp标志物及其应用
CN106546721B (zh) 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒
CN105624166B (zh) 一种检测人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适配体及其在制备检测制剂中的应用
CN106555003A (zh) 腺性膀胱炎和膀胱癌诊断区分标志物、诊断试剂或试剂盒
CN106119347B (zh) 基于血清exosomal microRNAs的结直肠癌转移检测的引物和试剂盒
EP2924126A1 (en) Method for using microRNA (miRNA) for detection of endometriosis
KR102211972B1 (ko) 액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법
CN109593851A (zh) 一种与乳腺癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN108103199B (zh) 一种与卵巢癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物及其应用
CN109593852A (zh) 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN110257514A (zh) 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用
Vallvé-Juanico et al. External validation of putative biomarkers in eutopic endometrium of women with endometriosis using NanoString technology
CN107340385B (zh) 生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途
EP1934367A4 (en) MOLECULAR METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER
CN106520949A (zh) 生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途
US11098371B2 (en) Method for treating urothelial carcinoma
WO2024067848A1 (zh) 血液胞外囊泡miRNA在卵巢癌诊断中的应用
CN109957609A (zh) 利用PCR-荧光探针法检测MicroRNA 155核酸定量的试剂盒
CN111662985B (zh) 一种microRNA联合CEA用于制备宫颈癌早期诊断试剂盒的用途
CN115948545B (zh) 一种基于血浆外泌体miRNA的ESCC诊断试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181105

Address after: 430000 B7 and B8 Biological Industry Innovation Bases, 666 High-tech Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province

Applicant after: Wuhan Mai Tver Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 211505 D building, 9 Chuang Chuang Road, Zhongshan science and Technology Park, Liuhe District, Nanjing, Jiangsu.

Applicant before: Nanjing Gene Technology Co., Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190320

Address after: 314100 Room 101, D1 Building, Haitian Talent Pioneering Park, Dayun Town, Jiashan County, Jiaxing City, Zhejiang Province

Patentee after: Jiaxing Maiwei Metabolic Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 430000 B7 and B8 Biological Industry Innovation Bases, 666 High-tech Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province

Patentee before: Wuhan Mai Tver Biological Technology Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right