CN102399898A - 一种与临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了一种与临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421的组合。该标志物可用于制备临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
生育是一个复杂的过程，不能由单独的个体完成，而是取决于男女双方，只有在双方各种条件均适宜的情况下，才能顺利完成。据WHO统计，大约每七对夫妇中就有一对存在着各种程度的生育障碍，其中有近一半与男方因素有关，由此被称为男性不育。男性不育给个人、家庭造成了沉重的精神和经济负担，成为家庭和社会的不稳定因素之一。因此，男性不育已逐渐成为一个全球性的公共社会问题，是许多国家生殖健康服务的重要内容之一。
在所有导致男性不育病因中，无精子症是最为常见的病因之一，在成年男性中约占1％。无精子症是指患者三次正常排精后，精液中没有精子。它可分为梗阻性和非梗阻性无精子症。梗阻性无精子症【obstructive azoospermia(OA)】是由输精管道梗阻而引起精液中没有精子，非梗阻性无精子症【non-obstructive azoospermia(NOA)】是由于男性睾丸生精障碍而导致，后者的精子数量和形态都比较差，所有的睾丸精子活动能力都低或没有活动能力，其危害程度远大于OA。引起NOA的原因很多，包括遗传性疾病(如Klinefelter综合征)、先天性睾丸异常、睾丸本身病变(如睾丸外伤，炎症，扭转以及睾丸血管病变)、内分泌疾病(如垂体功能亢进或低下、垂体肿瘤、肾上腺功能亢进或低下和甲亢或甲低)、严重全身性疾病和营养不良，以及放射损伤及药物等。值得注意的是，相当数量的NOA临床原因不明，其早期诊断和治疗就显得更为困难。在我国，约有25％的男性不育是NOA，因此，NOA，尤其是临床原因不明的NOA，不仅是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一，也是男性不育治疗的一个严峻问题。
目前，NOA的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、精液参数、精浆生化、血性激素检测、B超以及染色体检测等。世界卫生组织在男性不育的诊断检查及处理手册指明：无精子症是指精子密度等于0，即使将精液离心后检查亦不能发现精子。临床上通常3次离心镜检精液仍未见到精子，同时，排除不射精和逆行射精后方可确诊为无精子症病人。常规的精子密度分析目前主要依靠精子密度判别(人工计数或利用计算机辅助系统分析，即CASA)，尚无其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如个体精液质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子密度测量不准确；对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。而明确诊断常需进行睾丸穿刺活检，这给寻求生育帮助的人群带来极大的痛苦。尽管目前国内外研究者正努力探索新的NOA诊断生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即有创穿刺活检、精液质量分析结果波动、以及早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治疗手段，大多数NOA病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法满足心理上的要求，而且有可能出现后代的遗传缺陷。
研究表明，遗传因素是引起男性不育的主要因素，单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)在其中起重要作用。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以实现中国古语中“上医治未病”的理想，对疾病作出前瞻性的“基因诊断”。近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。
然而，目前还没有将SNP应用于临床原因不明的NOA诊断的报道，若能筛选出临床原因不明的NOA易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国临床原因不明的NOA的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与临床原因不明的NOA辅助诊断相关的SNP标志物及其应用
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性荧光探针对。
本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性荧光探针在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第五个目的是提供临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究临床原因不明的NOA患者及与其年龄匹配的健康男性对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与临床原因不明的NOA高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的原因不明的NOA辅助诊断试剂盒，为临床原因不明的NOA的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与临床原因不明的NOA辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421的组合。
所述的SNP标志物的特异性引物，这些引物为：
rs1014331的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs10765875的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs10889203的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10；rs11066453的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11167809的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs12097821的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs1990264的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs3000811的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs3130048的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs391129的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs4716515的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs658239的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs6589102的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs7042232的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs7099208的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs7144703的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs7194的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs985421的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70。
所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，这些荧光探针为：
rs1014331的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs10765875的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs10889203的荧光探针对序列为SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12；rs11066453的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ IDNo：16；rs11167809的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12097821的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs1990264的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs3000811的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs3130048的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs391129的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs4716515的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs658239的荧光探针对序列为SEQ IDNo：47和SEQ ID No：48；rs6589102的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ IDNo：52；rs7042232的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs7099208的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；rs7144703的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs7194的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ IDNo：68；rs985421的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72。
所述的SNP标志物在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性引物在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。
一种临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物和/或特异性荧光探针。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为：
rs1014331的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs10765875的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs10889203的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10；rs11066453的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11167809的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs12097821的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs1990264的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs3000811的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs3130048的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs391129的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs4716515的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs658239的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs6589102的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs7042232的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs7099208的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs7144703的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs7194的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs985421的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性荧光探针对为：
rs1014331的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs10765875的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs10889203的荧光探针对序列为SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12；rs11066453的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；rs11167809的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12097821的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs1990264的荧光探针对序列为SEQ IDNo：27和SEQ ID No：28；rs3000811的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs3130048的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs391129的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs4716515的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs658239的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs6589102的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs7042232的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs7099208的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；rs7144703的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs7194的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs985421的荧光探针对序列为SEQID No：71和SEQ ID No：72。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择临床原因不明的NOA病例、与临床原因不明的NOA病例年龄匹配的健康男性对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与临床原因不明的NOA相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒的研制：根据临床原因不明的NOA病例和健康男性对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，TaqMan基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症；
(2)一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；
(3)性功能正常；排除具有隐睾症病史、血管外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者
(4)与病例年龄匹配的健康男性对照
本研究共采用4700例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix 6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中的分别差异。
4.单个SNP的TaqMan基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性引物和特异性荧光探针对；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定临床原因不明的NOA病例与健康男性对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为临床原因不明的NOA诊断的指标。最后筛选出的与临床原因不明的NOA发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和特异性荧光探针对，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这18个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与临床原因不明的NOA发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.3×rs1014331的评分)+(0.26×rs10765875的评分)+(0.29×rs10889203的评分)+(0.5×rs11066453的评分)+(0.25×rs11167809的评分)+(0.34×rs12097821的评分)+(0.27×rs1990264的评分)+(0.32×rs3000811的评分)+(0.26×rs3130048的评分)+(0.52×rs391129的评分)+(0.23×rs4716515的评分)+(0.22×rs658239的评分)+(0.21×rs6589102的评分)+(0.27×rs7042232的评分)+(0.46×rs7099208的评分)+(0.62×rs7144703的评分)+(0.31×rs7194的评分)+(0.33×rs985421的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的2700例样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述1000例符合条件的临床原因不明的NOA病例及1700例健康男性对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“临床原因不明的NOA病例”组和“健康男性对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421。
根据上述检测结果，我们将这18个与临床原因不明的NOA发病相关的SNP在另外1000例临床原因不明的NOA病例和与其年龄匹配的1000例健康男性对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这18个SNP与临床原因不明的NOA的发病存在着显著关联，18个SNP均是危险因素，变异等位基因可增加临床原因不明的NOA的发病风险。
进一步分析这18个SNP的组合用于临床原因不明的NOA诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于临床原因不明的NOA辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检测试剂。
具体而言，这18个SNP的组合，或者这18个SNP的特异性引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于临床原因不明的NOA的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为临床原因不明的NOA辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为临床原因不明的NOA的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于临床原因不明的NOA的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用TaqMan基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究SNP在临床原因不明的NOA辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于临床原因不明的NOA进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了临床原因不明的NOA发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得临床原因不明的NOA的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示临床原因不明的NOA病例组对健康男性对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2005月4月开始至2011年1月从南京医科大学生殖医学中心收集了大量的NOA患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了4700例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP TaqMan基因分型的实验样品：
1、重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症；
2、一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；
3、性功能正常；排除具有隐睾症病史、血管外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者
4、与病例年龄匹配的健康男性对照
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的1000例临床原因不明的NOA患者和1700例健康男性对照中，两组年龄匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描；
9、数据分析与处理：在“临床原因不明的NOA病例”组和“健康男性对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
表1病例组与对照组全基因组关联分析结果
实施例3单个SNP的TaqMan基因分型
将上述全基因组扫描发现与临床原因不明的NOA发病有关的SNP在另外1000临床原因不明的NOA病例和1000健康男性对照中进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行TaqMan基因分型。对全基因组扫描发现的18个阳性关联的SNP设计特异性引物和特异性荧光探针对(表2)。反应体系包括2.5μl 2X TaqMan基因分型Master Mix、每对正向和反向引物的混合物0.25μl(20pmol/μl)、0.125μl TaqMan荧光探针(10pmol/μl，同时含有相应的两种等位基因的荧光探针)和1.25μl双蒸水。加入0.5μl DNA。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR反应条件为：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。
9、基因型判读：采用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的addtive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组合对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与临床原因不明的NOA发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“临床原因不明的NOA病例组”和“健康男性对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对临床原因不明的NOA发病的判断能力。对18个SNP标志物的联合分析发现，这18个SNP以71.8％的AUC将健康男性对照组和临床原因不明的NOA病例组分开，最佳临界点的灵敏度为67.24％，特异度：67.81％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421的组合能够很好地将健康男性对照和临床原因不明的NOA患者区分。
实施例5用于临床原因不明的NOA辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和TaqMan基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列引物：rs1014331的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs10765875的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs10889203的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs11066453的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11167809的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ IDNo：18；rs12097821的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs1990264的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs3000811的引物序列为SEQ ID No：29和SEQID No：30；rs3130048的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs391129的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs4716515的引物序列为SEQ ID No：41和SEQID No：42；rs658239的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs6589102的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs7042232的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs7099208的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs7144703的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs7194的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs985421的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70)、特异性荧光探针对(包括下列荧光探针：rs1014331的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQID No：4；rs10765875的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs10889203的荧光探针对序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；rs11066453的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；rs11167809的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12097821的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs1990264的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs3000811的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs3130048的荧光探针对序列为SEQ IDNo：35和SEQ ID No：36；rs391129的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ IDNo：40；rs4716515的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs658239的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs6589102的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs7042232的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQID No：56；rs7099208的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；rs7144703的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs7194的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs985421的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQID No：72)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物及荧光探针对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断临床原因不明的NOA，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表2.相关SNP引物和探针信息
Claims (9)
1.一种与临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物，其特征在于该引物为：
rs1014331的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs10765875的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs10889203的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10；rs11066453的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs11167809的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs12097821的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs1990264的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs3000811的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs3130048的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs391129的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs4716515的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs658239的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs6589102的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs7042232的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs7099208的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs7144703的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs7194的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs985421的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，其特征在于该荧光探针为：
rs1014331的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs10765875的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs10889203的荧光探针对序列为SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12；rs11066453的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ IDNo：16；rs11167809的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs12097821的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs1990264的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs3000811的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs3130048的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs391129的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs4716515的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs658239的荧光探针对序列为SEQ IDNo：47和SEQ ID No：48；rs6589102的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ IDNo：52；rs7042232的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs7099208的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；rs7144703的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs7194的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ IDNo：68；rs985421的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性引物在制备临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种临床原因不明的非梗阻性无精子症辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性荧光探针对。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
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