CN101921863A - 一种独立诊断肝脏疾病的miRNA表达量模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种独立诊断肝脏疾病的miRNA表达量模型。通过对肝硬化、肝细胞癌患者血清标本中潜在的循环miRNAs种类及相对表达水平进行了分析，并与健康对照血清中相应的循环miRNAs的表达丰度进行了比较，找到了与肝脏疾病相关的循环miRNAs中的miR-885-5p表达量模型。该模型由miR-885-5p的表达量指标组成，其中miR-885-5p表达水平显著高于健康对照，达到p＜0.0001。ROC曲线分析显示，miR-885-5p鉴别肝脏疾病HCC、LC和CHB和健康对照的效能为AUC＝0.904，敏感性和特异性分别为90.5％和79.2％。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，特别是涉及一种独立诊断肝脏疾病的miRNA表达量模型。
背景技术
慢性乙肝、丙型肝炎(简称丙肝)、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等肝脏相关疾病依旧是严重危害人们身体健康的重大疾病。研究表明，在正常生理状态下，miRNAs与肝脏发育、肝细胞表型分化、肝脏代谢及应激等基本生命活动密切相关，而miRNAs的异常表达调控与肝脏病毒感染与复制、HCC(肝细胞癌)、的发生发展等密切关联。例如，肝脏特异性表达的miR-122可能通过调控CAT-1等靶基因的表达进而影响肝细胞的生长发育、胆固醇及脂类代谢。另外，miR-122不但与HCV的复制密切相关，还以类似于抑癌基因的作用方式参与HCC的发生发展。
研究表明，机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能会导致特定疾病状态下某些循环miRNAs的表达水平升高或降低。例如肿瘤细胞可以释放其内源性miRNAs进入外周血循环；组织细胞特异性表达的miRNAs可因细胞坏死而直接进入血循环，导致特定疾病状态下特定循环miRNAs的表达水平显著变化。因此，可以通过深入研究不同疾病状态下循环miRNAs表达谱的差异性及其与疾病的关联关系为疾病诊断、筛查及疗效监控等提供新的分子标志物。
目前筛选标志性循环miRNAs的研究策略主要是：通过比较不同生理和病理条件下miRNAs表达谱的差异，寻找相应的miRNAs作为生理和病理相关的候选分子并进行病例-对照研究，分析循环miRNAs的差异化表达与生理、临床病理资料的相关性，进而结合miRNAs功能分析，评价候选循环miRNAs作为辅助诊断等标志物的可能性，其中的关键问题是找到不同病理生理状态下差异化表达的miRNAs。
近年，通过基因芯片等高通量表达谱分析技术可以从CHB(慢性乙肝)、HCV感染肝组织标本、LC(肝硬化)和HCC等肝脏组织标本中检测到多种异常表达的、与肝脏疾病发展可能密切相关的miRNAs。例如，miR-101在肝细胞肝癌的表达下调促进细胞凋亡并抑制成瘤。再如，Murakami等发现miR-18、miR-224和pre miR-18在肝癌组织中高表达，而miR-195，miR-199a，miR-200a和miR-125a在肝癌组织中低表达；基于异常表达的miRNAs，利用支持向量机(support vector machine，SVM)可对97.8％的肝癌进行准确判别。此外发现miR-182，miR-224，miR-15b和miR-199b前体在CHB中表达升高，而miR-28，miR-342，miR-126，miR-199a和miR-145b等8种miRNAs在LF中表达升高。显然，深入解析理解miRNAs与肝脏疾病发生发展的关系，有助从发展新的肝病诊疗技术。
就肝病的血清学诊断而言，除了ALT、AST和AFP等传统的生化标志物以外，发现、发展更加特异、敏感、微创性的肝病标志物，对于肝脏相关疾病的辅助诊断、治疗评价、病情评估等依然具有十分重要的临床意义。
miR-885-5p基因定位于3号染色体的p25.3，由Berezikov E等克隆测序发现，目前未见其功能研究报道。
发明内容
本发明采用“miRNAs cDNA 文库+文库预扩增+TLDA”的研究策略，首先建立基于临床常规收集的血清样本筛查差异化表达miRNAs的技术路径，并以肝硬化和肝癌患者为研究对象，利用基于实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，rt-qPCR)的低密度阵列TLDA(TaqMan low density array，TLDA)为基本技术平台，对健康对照、肝硬化及肝癌患者血清标本中潜在的循环miRNAs表达谱进行了分析和比对。
本发明通过对肝硬化、肝细胞癌患者血清标本中潜在的循环miRNAs种类及相对表达水平进行了分析，并与健康对照血清中相应的循环miRNAs的表达丰度进行了比较，找到了与肝脏疾病相关的循环miRNAs中的miR-885-5p表达量模型。
具体的，本发明提供了一种诊断肝脏疾病的模型，该模型由miR-885-5p的表达量指标组成，其中miR-885-5p表达水平显著高于健康对照，达到p＜0.0001。
具体的，患者是否患有肝脏疾病，通过验证该诊断模型是否符合标准即可，如果患者的miR-885-5p表达水平显著高于健康对照，则说明其患有肝脏疾病。
其中肝脏疾病优选为HCC、LC和CHB中的一种或多种。
本发明通过病例-对照研究，发现HCC、LC和CHB患者血清中miR-885-5p的表达水平显著高于健康对照。ROC曲线分析显示，miR-885-5p鉴别肝脏疾病HCC、LC和CHB和健康对照的效能为AUC＝0.904，敏感性和特异性分别为90.5％阳79.2％。
在肝病疾患个体中，miR-885-5p的升高与传统肝功生化参数ALT、AFP、AST和GGT间未见相关关系。因此，循环miR-885-5p是一种相对独立的肝脏疾病标志物。
本发明通过筛选可能与肝病相关的循环miRNAs作为候选分子进行了验证。最终结果显示，HCC、LC和CHB患者血清中miR-885-5p的表达水平显著高于健康对照(p＜0.0001)，而GC(胃癌)患者血清中miR-885-5p的表达水平与健康对照组比较未见显著差异。ROC曲线分析显示，miR-885-5p对肝脏疾病(HCC、LC和CHB)和健康对照的鉴别效能为0.904(95％CI：0.837-0.951)，敏感性和特异性分别为90.5％和79.2％，远高于ALT的鉴别效能(AUC＝0.742)。在肝脏疾患个体中，miR-885-5p的升高与传统肝功生化参数ALT、AFP、AST和GGT间未见相关关系。因此，血清循环miR-885-5p是一种潜在的、相对独立的肝脏疾病标志物。
附图说明
图1：不同组别间miR-885-5p相对表达水平的比较(使用U6 snRNA标化miRNAs；组间比较采用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis检验).
图2：ROC曲线分析显示血清miR-885-5p对肝脏疾病(N＝95)和健康对照(N＝24)的鉴别效能.
图3：ALT对肝脏疾病组(N＝95)和健康对照组(N＝24)的鉴别效能.(ROC曲线的纵轴表示真阳性率，TPR横轴示假阳性率FPR).
图4：对ICC、FNH及NC血清标本中miR-885-5p的定量(散点图中横线表示各组中miR-885-5p的中位数值；ICC，肝胆管细胞癌，FNH，肝脏结节性增生).
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。研究对象
血清标本包括24例健康对照(NC)、23例CHB、26例肝硬化(LC)和46例肝细胞癌(HCC)患者。另外，纳入17例胃癌(GC)血清标本作为疾病对照。其中，健康对照、肝硬化、肝细胞癌的纳入标准同前所述。所有CHB病例的乙肝表面抗原HBsAg均为阳性。胃癌患者均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，排除所有肝脏相关疾病，术后均经过病理检查确认。其中健康对照血清来自本院工作人员，除个别人员患有糖尿病或高血脂外，其他检查均未见异常。肝硬化和肝细胞癌患者血清标本收集自本院生化科。
标本收集
所有血清标本均于血样采集后24小时内进行血清收集及处理，获得无细胞血清标本。其中，健康对照血清样本来自本院健康体检中心，所有纳入个体的血液常规、血液生化检测、肝功等参数均未见异常，排除相关肝脏疾病。肝硬化诊断由富有经验的临床医师按照相关诊断标准进行，标本的纳入依据临床诊断。肝细胞癌病例的纳入标准为：首次就诊、病理诊断确切、血清样本收集前尚未经任何治疗。肝硬化和肝细胞癌患者血清标本收集自本院生化科。
主要仪器、试剂及耗材
主要仪器设备参见第一部分，多通道移液器(0.5-10μL量程)为Eppendorf公司产品，96-孔板及光学贴膜购自ABI公司。
TaqMan gene expression master mix ABI公司
miRNAs反转录试剂盒 ABI公司
mirVana PARIS kit Ambion公司
RNase/DNase free water Sigma
hsa-miR-885-5p assay ABI公司
U6 snRNA assay ABI公司
DNase I Promega
琼脂糖 Sigma
血清(浆)总RNA的抽提与纯化
按照mirVana PARIS试剂盒(Ambion)使用说明书从血清(血浆)中提取400μl血清(血浆)总RNA。使用DU-800(Beckman Coulter，美国)对RNA抽提液浓度进行定量，详细操作见仪器使用说明书。
根据血清总RNA定量结果，将每一份总RNA提取液的浓度均调整为2ng/μL，分装，置-80℃低温冰箱冻存备用。
RNA提取液的消化
参照DNase I(promega)使用说明书进行。
反转录(RT)
利用Mastercycler epgradient PCR仪进行批量RT反应。RT反应体系及参数同第一部分，共计7.5μL的RT反应体系中包括包括：2.08μL水、0.75μL的10×RT缓冲液、0.075μL的dNTP mix、RNA酶抑制剂0.095μL、miR-885-5p的茎-环式RT引物1.5μL、反转录酶0.5μL及消化后RNA样品2.5μL(5ng)。
RT参数设置为：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min灭活逆转录酶，RT产物置-20℃冻存备用。
miR-885-5p的序列入库号为MIMAT0004947，序列为uccauuacacuacccugccucu
实时荧光定量PCR
所有实时荧光定量PCR反应均于96-孔板进行，每一个样品中对miRNAs及内参基因U6snRNA的定量均做3次复孔，计算平均值。qPCR在ABI 7300实时荧光定量PCR系统上进行，每一孔的反应体积为10μL，读取Ct(cycle threshold，Ct)值时系统阈值均设定为0.2。qPCR循环参数：按照5ul(RT产物)∶29ul(水)的比例对RT产物进行稀释，短暂vortex混匀、离心。按照“4.5ul RT产物稀释液∶TaqMan基因表达定量主反应液5.0ul∶TaqMan microRNA assay的0.5ul”的比例确定PCR体系，利用ABI 7300系统进行miRNA定量检测，循环参数设定为95℃ 10min活化Taq酶，然后95℃ 15sec，60℃1min，共40个循环。
数据处理与统计分析：
采用内参基因U6snRNA标化、计算被检miRNAs的ΔCt值，录入Excel数据表，建库。
采用相对定量法(2-ΔΔCt法)分析不同组别间的miRNAs表达水平的差异。以计算A组样品和B组样品间某一个靶基因表达水平差异为例，-ΔΔCt的计算公式为：
-ΔΔCt＝(Ct靶基因-Ct内参基因)A组样品-(Ct靶基因-Ct内参基因)B组样品
数据正态性检验采用动差法，非正态数据的组间比较采用Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis检验。相关统计学处理采用Chiss 2005软件完成，以p＜0.05为显著性检验水准。数据相关性分析采用Sigmaplot。ROC(receiver operating characteristic，ROC)分析及AUC(area under the curve，AUC)计算由MedCalc 9.6.4软件完成。
独立纳入的样本包括健康对照24例，肝脏疾病患者共计95例，包括CHB(N＝23)、肝硬化(N＝26)和肝细胞癌(N＝46例)。另以17例胃癌(GC)血清标本为疾病对照。
定量分析结果证实，HCC和LC患者血清中miR-885-5p的表达水平显著高于健康对照(p＜0.0001)，且CHB患者血清中miR-885-5p亦显著高表达(p＜0.0001，Mann-Whitney检验)。有趣的是，GC患者血清中miR-885-5p的表达水平与健康对照组比较未见统计学差异(图1)。
将HCC、LC和CHB患者视为同一个肝脏疾病组(N＝95)，利用ROC曲线分析miR-885-5p对肝脏疾病和健康对照的鉴别效能。结果显示，通过ROC分析得到的最佳cut-off值为1.06(2-ΔCt，相对于U6snRNA)，此时得到的曲线下面积(AUC)为0.904(95％CI：0.837-0.951)(图2)，敏感性和特异性分别为90.5％和79.2％，而此时ALT对肝脏疾病组和健康对照组的鉴别效能为AUC＝0.742(图3)。
另外，对数例ICC(肝胆管细胞癌)、FNH(肝脏结节性增生)患者血清标本中miR-885-5p定量检测也发现，其中位数值高于健康对照(图4)。
综上试验，本发明提供的应用miR-885-5p的指标值作为诊断肝脏疾病的模型敏感性和特异性高。
本发明的模型已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (2)
1.一种诊断肝脏疾病的模型，该模型由miR-885-5p的表达量指标组成，其中miR-885-5p表达水平显著高于健康对照，达到p＜0.0001。
2.根据权利要求1所述的模型，其中肝脏疾病为HCC、LC和CHB中的一种或多种。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102727909A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-10-17 | 中国人民解放军总医院 | 一种抑制原发性肝癌生长和转移的新方法 |
| CN102888453A (zh) * | 2012-06-28 | 2013-01-23 | 中国人民解放军总医院 | miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途 |
| EP2829613A1 (en) * | 2013-07-26 | 2015-01-28 | Istituto Nazionale Di Genetica Molecolare-INGM | Biomarkers of liver diseases and uses thereof |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102727909A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-10-17 | 中国人民解放军总医院 | 一种抑制原发性肝癌生长和转移的新方法 |
| CN102888453A (zh) * | 2012-06-28 | 2013-01-23 | 中国人民解放军总医院 | miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途 |
| CN102727909B (zh) * | 2012-06-28 | 2014-06-04 | 中国人民解放军总医院 | 一种抑制原发性肝癌生长和转移的新方法 |
| CN102888453B (zh) * | 2012-06-28 | 2014-08-06 | 中国人民解放军总医院 | miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途 |
| EP2829613A1 (en) * | 2013-07-26 | 2015-01-28 | Istituto Nazionale Di Genetica Molecolare-INGM | Biomarkers of liver diseases and uses thereof |
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