CN110205377A - 川崎病患病风险的提前评估 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种基于miRNA分子标记物评估川崎病风险的方法及试剂盒与应用。所述试剂盒中含有针对这13种miRNA分子标记物以及1种内参miRNA进行PCR检测所用引物，使用该试剂盒并配套相应的PCR试剂即可获得13种miRNA的相对表达量。所述试剂盒中含有以上述相对表达量数据为特征，采用随机森林的方法构建的打分预测模型，对早期发热患者进行川崎病患病预测和评价，以用于辅助诊断应用。该方法具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点，能及时、准确的将川崎病患儿与其他发热性疾病患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率，对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值。

Description

川崎病患病风险的提前评估
技术领域
本发明属于疾病风险评估技术领域，具体涉及一种基于miRNA分子标记物评估川崎病风险的方法及试剂盒与应用。
背景技术
川崎病(Kawasaki disease，KD)，是一种好发于儿童的急性、自限性且病因不明的血管炎性反应症候群，主要影响中小动脉，特别是冠状动脉，又被称为黏膜皮肤淋巴结综合征(Mucocutaneous lymph node syndrome，MCLS)。该疾病以免疫系统活化和血管内皮系统广泛性损害为特征，在急性期、恢复期均存在长期的血管内皮功能紊乱，可能导致冠状动脉病变(coronary artery lesions，CALs)，严重者可出现心肌梗死及缺血性心肌病，甚至发生猝死。未经治疗的KD患儿，CAL的发生率为15％～25％，即使在早期(起病10天内)大剂量静脉注射丙种球蛋白联合口服阿司匹林治疗的患儿，仍至少有5％的患儿出现暂时的冠脉扩张，1％的患儿发展为巨大冠状动脉瘤。2017年美国心脏病协会提出：KD恢复后的冠状动脉结果和功能已发生改变，远期有硬化和狭窄的风险。
自1967年首次由日本川崎富作先生报道以后，全世界范围报道了KD的发生。近年来，世界各地川崎病的发病率呈逐年上升的趋势，并且逐渐成为发展中国家特别是中国和印度儿童最常见的获得性心脏病病因。目前，关于KD的临床诊断多依赖于患者的临床表现，包括持续5天之上的发热现象、生殖部位皮疹、颈部淋巴结肿大、眼结合膜充血、杨梅舌、口腔黏膜弥漫充血、手足硬性水肿、掌跖红斑等。另外，超声心动图，血液检测等实验室检查诊断可以辅助临床诊断KD。
川崎病的早期误诊率可高达23.6％，误诊的川崎病患儿不能在早期及时使用丙种球蛋白治疗而导致后期的CAL发生率升高。发生误诊主要有两方面的原因：1.川崎病的早期最主要的症状是高热热程超过5天，其与猩红热及类风湿性关节炎等其他原因发热性疾病之间存在相似的临床表征，仅仅依靠临床表征很难区分，因此存在误诊的风险；2.存在10-20％的不完全或不典型的川崎病，并且其与典型的川崎病出现CAL的发生率相近。由于早期静脉注射大剂量的丙种球蛋白是有效降低CAL发生率的主要手段，然而，现阶段并无一个可以确诊KD的‘黄金标准’，因此，关于在临床上寻找更高效准确的KD早期诊断指标的研究迫在眉睫，促使研究者们寻求更有效的早期诊疗方案。
川崎病被认为是由感染性触发因素和级联放大的炎症反应之间的相互作用引起的。但是所用的诊断川崎病的辅助实验室指标包含血小板升高，白细胞总数升高，C-反应蛋白升高，血沉加快等都不是川崎病特有的指标。因此，寻找特异的KD相关指标至关重要。microRNA(miRNA)是一类内源性小非编码RNA，其通过结合在mRNA上降低mRNA稳定性及翻译效率，从而调节基因表达。是一种常见的基因表达沉默的指导分子。近年来，关于KD患者中miRNA表达谱变化的研究不断出现，研究表明，miR-125a-5p，miR-199b-5p，miR-186-5p，miR-27a-3p，miR-941，miR-30e-3p等多种miRNA在KD患者与其他发热疾病患者或健康儿童直接存在明显的表达差异。这些研究主要使用芯片技术，也有少量研究采用了二代测序，然而其使用的样本量非常有限。此外，研究者提出miRNA可作为KD的新的有希望的诊断和预后分子标记物。
通过KD患者随访发现，与正常人相比，罹患过KD的儿童血小板更加活跃，特别是在KD后期，血小板计数值恢复是KD痊愈的指标之一。近年来研究发现，血小板已成为全身和局部反应的中心分子，在细胞交流和免疫反应中扮演了重要作用，与各种免疫细胞和因子之间存在着精细的平衡。由于血小板没有细胞核，在研究其miRNA时不会存在rRNA的背景干扰，所以研究血小板RNA对川崎病的早期诊断有着理论基础和实际意义，而目前关于川崎病诊断方面的研究主要集中在血清和白细胞方面，对血小板中相应分子指标的筛选的研究报道非常少见。
如何提供一种提前预警和快速评估川崎病高风险的方法，是一个急需解决的问题。
发明内容
本发明一实施例提供一种基于miRNA分子标记物的试剂盒，用于解决现有技术中提前评估川崎病高风险的问题，包含用于检测生物体内13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的相对表达量的检测试剂，其中13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
优选的技术方案中，所述检测试剂包括用于PCR扩增13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的引物。
优选的技术方案中，所述引物序列包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：14所示的连续核苷酸序列。
优选的技术方案中，所述PCR扩增体系为实时荧光定量PCR反应体系。
本发明的另一目的在于提供一种检测试剂，用于检测生物体内13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的相对表达量，包括用于PCR扩增13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的引物。
优选的技术方案中，所述13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
优选的技术方案中，所述引物序列包括SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：14所示的连续核苷酸序列。
本发明的又一目的在于提供一种检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)提取受试者的血小板中的RNA；
2)以步骤1)提取的RNA为模板，进行逆转录获得cDNA；
3)对cDNA进行实时荧光定量PCR反应进行扩增；
4)以1种内参miRNA校正生物标记组中13种miRNA分子标记物的荧光定量PCR检测值，确定受试者13种分子标记物的含量；
所述13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
本发明的又一目的在于提供一种基于miRNA分子标记物进行提前评估川崎病风险的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(3)通过所述的检测方法获取受试者13种分子标记物的含量；
(4)采用随机森林的方法构建模型，以测定的13种分子标记物的含量作为评估受试者川崎病风险评估的特征，对新数据进行评分，进行川崎病患病预测和评价，当评估树脂高于检测阈值时，判定受试者川崎病患病存在高风险。
本发明的又一目的在于提供一种所述的试剂盒在检测评估受试者中是否存在川崎病患病高风险的体外方法方面的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下显著的特点：
本发明技术方案中所述试剂盒中含有以上述相对表达量数据为特征，采用随机森林的方法构建的打分预测模型，对早期发热患者进行川崎病患病预测和评价，以用于辅助诊断应用。该方法具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点，能及时、准确的将川崎病患儿与其他发热性疾病(如麻疹、热疹、肠胃炎、手足口病、疱疹等)患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率，对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。本发明提供的用于诊断川崎病的分子标记物选取13种miRNA来自于第二代高深度测序的结果并结合已发表的各项研究综合分析评分所得，联合分析13种分子标记物准确度远远大于单一生物标准物的检测，可以降低假阳性、假阴性的发生率。
本发明提供的用于诊断川崎病的试剂盒中含有针对这13种miRNA分子标记物进行荧光定量PCR检测所用引物组，使用者只需取1mL全血分离获得血小板中的RNA，使用该试剂盒并配套相应的PCR试剂盒即可获得13种miRNA分子标记物的测试值，
本发明技术方案中含有针对上述13种miRNA分子标记物测试值构建的川崎病患病风险预测模型。此模型采用随机森林的方法构建，以上述13种miRNA分子标记物测试值为输入值进行川崎病患病预测和评价，得到川崎病的患病风险。
本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点，能及时、精准的将川崎病患儿与其他发热性疾病(如麻疹、热疹、肠胃炎、手足口病、疱疹等)患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率。
因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速简易诊断试剂盒提供了技术保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中用于筛选差异表达miRNA的生物信息分析流程示意图。
图2是实施例1中使用高通量测序测得的各血液样本血小板RNA类型分布示意图。
图3是实施例2中使用miR-15a和miR-222对qRT-PCR进行灵敏度验证示意图。
图4是实施例2中使用高通量测序测得的19种miRNA在各血液样本中表达量变异系数示意图。
图5是实施例2中使用qRT-PCR测得的19种miRNA在各血液样本中表达量经geNorm检测表达稳定性打分示意图。
图6是实施例2中使用qRT-PCR测得的19种miRNA在各血液样本中表达量经NormFinder检测表达稳定性打分示意图。
图7是实施例2中使用qRT-PCR测得的19种miRNA在KD患儿及其他发热患儿样本中表达量差异示意图。
图8是实施例4中采用本发明分子标记物的构建模型在临床样本中检出结果ROC曲线图。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述，否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外，在术语“约”的使用在量值之前之处，除非另外具体陈述，否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
本发明涉及分子生物学技术领域及计算机技术领域，更具体地，涉及用于RNA技术领域及机器学习算法领域，特别是指一种基于miRNA分子标记物评估川崎病风险的方法及试剂盒与应用。
现有技术中构建KD早期诊断模型，大多采用的逻辑回归的模型，仅能提供具体预测结果，无法对其可能性进行打分。随机森林是2001年发表的一种机器学习算法，由LeoBreiman结合他本人于1996年提出的Bagging集成学习理论和Ho于1998年提出的随机子空间方法建立。随机森林是表现一种极好的集成分类器。它是以决策树为基本分类器的一个集成学习模型，包含多个由Bagging集成学习技术训练得到的决策树，当输入待分类的样本时，最终的分类结果由单个决策树的输出结果投票决定，随机森林克服了大多数分类器产生的过拟合问题。
因此，本发明旨在利用二代测序数据寻找KD患者与其他发热疾病患者中差异表达的miRNA，使用Taqman荧光定量qPCR的方法对筛选的miRNA进行验证，并以qPCR检测值为特征通过随机森林的方法构建预测模型，方便临床医生根据实验室患者miRNA检测水平对发热患者进行早期诊断，把握KD早期治疗的优势，减少CAL发生率。
本发明的主要目的就是针对以上川崎病早期诊断存在的问题，提供一种基于miRNA分子标记物的用于辅助临床医生早期评估川崎病风险的方法，本发明的第二目的还在于提供一种辅助早期评估川崎病风险的试剂盒与其用途。
本发明的技术方案使用13种miRNA分子标记物：miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p的组合作为诊断川崎病的分子标记物。并采用一种miRNA作为内参，内参miRNA选用miR-126-3p。在一些较为具体的实施方案中，所述的13种miRNA分子标记物以及1种内参miRNA，来源于血小板。
本发明实施例还提供了一种用于早期辅助评估川崎病风险的试剂盒，其包含对患者血小板中13种miRNA分子标记物以及1种内参miRNA的表达量进行定量检测的配套试剂。在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒包含用于对13种miRNA分子标记物以及1种内参miRNA进行PCR检测的引物组。进一步的，所述引物组中对应于13种miRNA分子标记物以及1种内参miRNA的引物组的序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：14所示。
本发明实施例还提供了miRNA生物标记物在制备用于检测受试者中存在川崎病患病高风险的体外方法中的试剂盒用途，所述的方法包括：
测定来源于受试者的血小板的生物标记组中各生物标记相对于1种内参miRNA，miR-126-3p，的表达水平以获得测定值，所述的生物标记组选自13种miRNA分子标记物：miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p的组合；
将所述的测定值利用川崎病患病风险预测模型进行打分，若分值高于阈值，则确定受试者具有川崎病患病高风险。
本发明还提供了基于随机森林建模的川崎病患病风险预测模型，其判断依据是以所述的13种miRNA分子标记物：miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p的测定值为辅助诊断应用的特征，并采用随机森林的方法构建模型，对新数据打分，进行川崎病患病预测和评价，检测阈值为0.5，高于此值即预测为川崎病。
优选的，所述的检测方法包括：
1)提取受试者的血小板中的RNA；
2)以步骤1)提取的40ng RNA为模板，利用miScript II RT Kit进行翻转，反转体系为20μl，反应条件为60℃温育60min，95℃灭活5min，4℃终止反应；
3)将步骤2)中得到的cDNA稀释至40μl；
4)以权利要求6所述的生物标记组中各生物标记一一对应的引物组进行扩增，检测反应体系为15μl，其中包括：7.5μl QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、1μlmiScript Universal Primer、1μl Target-specific miScript Primer，1μl稀释后cDNA模板，无菌双蒸水补充至15μL；
5)荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃，15min；PCR扩增40个循环，94℃15s、62℃30s、72℃荧光检测15s；95℃灭活15s；
6)以所述的1种内参miRNA，miR-126-3p，校正生物标记组中各分子标记物的荧光定量PCR检测值，计算各分子标记物的ΔCt值；
7)以测定的13种来源于血小板的miRNA分子标记物：miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p的ΔCt值为辅助诊断应用的特征，采用随机森林的方法构建模型，对新数据打分，进行川崎病患病预测和评价，检测阈值为0.5，高于此值即为川崎病患病高风险。
进一步的，所述的PCR检测采用QuantiTect SYBR Green进行荧光定量PCR检测。
进一步的，所述试剂盒还包括荧光定量qPCR扩增检测的常规组件，所述荧光定量qPCR扩增检测的常规组件包括扩增模板、快速优化预混液(2X)、优化miRNA引物混合液和无核酸酶超纯水。
本发明还提供了基于随机森林建模的川崎病患病风险预测模型，其判断依据是以所述的13种miRNA分子标记物：miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p的测定值为辅助诊断应用的特征，并采用随机森林的方法构建模型，对新数据打分，进行川崎病患病预测和评价，检测阈值为0.5，高于此值即预测为川崎病。
采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
藉由上述技术方案，本发明用于早期辅助诊断川崎病的分子标记物选取的13种miRNA来自于第二代高深度测序的结果并结合各项研究综合分析评分所得，联合分析13种分子标记物准确度远远大于单一生物标准物的检测，可以降低假阳性假阴性的发生率。本发明的试剂盒中含有针对这13种miRNA分子标记物进行荧光定量PCR检测所用引物组，使用者只需取1mL全血分离获得血小板中的RNA，使用该试剂盒并配套相应的PCR试剂盒即可获得13种miRNA分子标记物的测试值，以上述分子标记物测试值为辅助诊断应用的特征，并采用随机森林的方法构建模型，对新数据打分，进行川崎病患病预测和评价，检测阈值为0.5，高于此值即预测为川崎病。本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好、易操作等优点，能及时、精准的将川崎病患儿与其他发热性疾病(如麻疹、热疹、肠胃炎、手足口病、疱疹等)患儿区分，提高了川崎病在早期诊断的检出率。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速简易诊断试剂盒提供了技术保障。
以下结合附图和若干实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
实施例1
1.RNA提取试剂盒筛选及高通量测序筛选用于评估川崎病高风险的分子标记物
(1)为得到高质量完整的血小板total RNA，比较三种不同提取方法(mirVanamiRNA Isolation Kit、MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit和Trizol裂解法)的提取效果，确定最终的提取方案用于后续实验研究。
(2)同一血小板样本分别进行三种方法提取，两两比较提取的total RNA总量和质量(如下表)。
(3)由上表可得MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit在提取总量较高，但由于2100质检图未检测到特征峰，再次重复实验后结果相同，并且操作步骤较为繁琐，所以后续qPCR检测时RNA质量时保留方法mirVana miRNA Isolation Kit，Trizol裂解法再次进行比较(如下表)。
(4)从上述结果来看在qPCR验证及建库测试中，mirVana miRNA Isolation Kit表现更优，且血小板保存方法为-80℃直接冻存更优。
血小板中差异表达miRNA筛选方法如下：
使用EDTA抗凝管分别采集44例KD患儿和31例其他发热性疾病患儿血液1mL，4℃冰箱保存，48小时内通过离心分离血小板，分离的血小板使用磷酸盐缓冲液清洗2次后，若不立即使用，可保存在-80℃冰箱中。
按照miVana miRNA Isolation Kit试剂盒的操作说明，提取血小板中的RNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定。
使用NEBNext miRNA Library PrepKit对100ng提取的RNA进行miRNA文库构建，并切胶回收140bp-350bp的片段，文库构建过程完全遵守NEBNext miRNA Library PrepKit的使用说明。
miRNA文库采用HiseqX10平台进行高通量测序，测序数据通过miRDeep2等信息分析流程(图1)得到建库质量，如包含的RNA类型等(图2)，及其中上调或下调表达差异的基因(如下表)。
2、qRT-PCR灵敏性验证和用于诊断川崎病的内参基因的筛选及差异基因的验证
1)使用qRT-PCR验证差异表达的miRNA需要对其灵敏度进行验证。通过加入不同的cDNA起始量，模拟不同miRNA含量情况，在保证一定cDNA的情况下(1-2ul)，检测呈线性(图3)，说明qRT-PCR灵敏度足以保证后续验证。
2)使用qRT-PCR验证差异表达的miRNA需要使用适当的参考基因进行标准化，但目前没有已建立适合人血小板miRNA的标准化内参物。因此，通过对二代测序数据集分析结合已发表的研究筛选了在KD患儿和其他发热疾病患儿中表达差异较小(CV值较小)的及差异较显著的共19种miRNA(参见第9步下表)以及常用的标准品U6作为候选基因，使用SYBRGreen荧光定量PCR进行稳定的内参miRNA的筛选及差异表达基因的验证。
3)使用EDTA抗凝管分别采集74例KD患儿和74例其他发热性疾病患儿血液1mL，4℃冰箱保存，48小时内通过离心分离血小板，分离的血小板使用磷酸盐缓冲液清洗2次后，若不立即使用，可存在-80℃冰箱中。
4)按照miVana miRNA Isolation Kit试剂盒的操作说明，提取血小板中的RNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定.
5)使用miScript II RT kit对上述血小板RNA进行反转录，反转录使用血小板RNA40ng，反应条件如下：
6)加20μL 0.1×TE缓冲液进行模板稀释备用；
7)按照下表进行qPCR反应配置：
8)将配置好的预混液加入至96well孔板中，加入1μL稀释后的模板。混合后，500g短暂离心，放入ABI 7500qPCR仪中；
9)设置qPCR程序如下：
10)开始运行程序，程序约运行1.5h，运行结束后，统计每个样本的Ct值(如下表)；
11)血小板没有细胞核，常用的标准品U6作为一种核内小RNA，基本没有表达，难以检测(参见上表)。因此，后续使用geNorm和normfinder内参基因稳定性检测软件对上述筛选全部miRNA进行检测，并对各个样本中Ct值的CV值进行计算，发现miR-126-3p在两组样本中表达相对较高(平均Ct值为21.8)，并且使用geNorm和normfinder的方法评估稳定性排名均靠前(图4、图5和图6)，可以作为参考标准化基因。
12)以miR-126-3p为标准化基因，对其余18个基因在两组间的差异进行检测(图7)。
3.预测模型的构建及验证
(1)使用EDTA抗凝管分别采集41例KD患儿和46例其他发热性疾病患儿血液1mL，4℃冰箱保存，48小时内通过离心分离血小板，分离的血小板使用磷酸盐缓冲液清洗2次后，若不立即使用，可保存在-80℃冰箱中；
(2)按照miVana miRNA Isolation Kit试剂盒的操作说明，提取血小板中的RNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定。
(3)使用miScript II RT kit对上述血小板RNA进行反转录，反转录使用血小板RNA 40ng，反应条件如下：
(4)加20μL 0.1×TE缓冲液进行模板稀释备用；
(5)按照下表进行qPCR反应配置：
(6)将配置好的预混液加入至96well孔板中，加入1μL稀释后的模板。混合后，500g短暂离心，放入ABI 7500qPCR仪中；
(7)设置qPCR程序如下：
(8)开始运行程序，程序约运行1.5h，运行结束后，统计每个样本的Ct值(如下表)；
(9)以miR-126-3p为内参计算各个miRNA的ΔCt。
(10)以各个miRNA的ΔCt值为特征用于训练随机森林的分类模型，使用袋外误差以消除过拟合和欠拟合，并逐个去除表现最差的miRNA获得最佳组合为13个miRNA生物标志组，预测效果如下。
4.独立测试样本集检测模型准确性
(1)使用EDTA抗凝管采集另外61例临床表现症状出现高热72小时以上的患儿血液1mL，4℃冰箱保存，48小时内通过离心分离血小板，分离的血小板使用磷酸盐缓冲液清洗2次后，若不立即使用，可保存在-80℃冰箱中。
(2)按照miVana miRNA Isolation Kit试剂盒的操作说明，提取血小板中的RNA，并使用Qubit和Nanodrop并对其进行浓度和纯度的测定。
(3)使用miScript II RT kit对上述血小板RNA进行反转录，反转录使用血小板RNA 40ng，反应条件如下：
(4)加180μL 0.1×TE缓冲液进行模板稀释备用；
(5)按照下表进行qPCR反应配置：
(6)将配置好的预混液加入至96well孔板中，加入5μL稀释后的模板。混合后，500g短暂离心，放入ABI 7500qPCR仪中；
(7)设置qPCR程序如下：
(8)开始运行程序，程序约运行1.5h，运行结束后，统计每个样本的Ct值(如下表)；
(9)以miR-126-3p为内参计算各个miRNA的ΔCt，利用上述模型进行预判，在61例患儿中，判断33例患儿川崎阳性，28例其他发热性疾病，最终得到的川崎病患病风险预测模型具有81.8％的灵敏度和85.7％的特异性，总体准确率为87.9％和ROC曲线下面积为0.89(图8)。
从以上实施例可以明显看到，本发明提供的用于诊断川崎病与其他发热性疾病的分子标记物及试剂盒可以有效、准确、及时地将川崎病患儿与其他发热性疾病患儿快速区分，在实施例1中本发明通过高通量测序的方法筛选出了在川崎病和其他发热疾病之间差异表达的miRNA；为了寻找与川崎病早期诊断筛查直接相关的miRNA分子标记物并使用荧光定量PCR的方法进行验证，我们共选取了19个候选分子标记物和内参miRNA基因，并根据分析比较CV值、geNorm和normfinder的结果得出miR-126-3p可作为检测使用的内参基因；在此基础上本发明采用了Sybr Green qPCR方法对分子标记物的检出率进行了复检，在检测的148例临床样本中，阳性检出率高达91.9％；在61例独立样本中检测模型准确性，最终得到的川崎病患病风险预测模型具有81.8％的灵敏度和85.7％的特异性，总体准确率为87.9％。本发明通过检测血小板中miRNAs的表达，较现有的临床指征用于川崎病早期诊断有着高灵敏、快速、操作简单、稳定性好等优势，较现有使用外泌体miRNAs检测川崎病的方法有着取材更加便利、检测背景低的优势。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (10)

1.一种基于miRNA分子标记物的试剂盒，其特征在于，包含用于检测生物体内13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的相对表达量的检测试剂，其中13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括用于PCR扩增13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物序列包括SEQ ID NO：1～SEQID NO：14所示的连续核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系为实时荧光定量PCR反应体系。
5.一种检测试剂，用于检测生物体内13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的相对表达量，包括用于PCR扩增13种miRNA分子标记物和作为内参的1种miRNA的引物。
6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于所述13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
7.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于所述引物序列包括SEQ ID NO：1～SEQID NO：14所示的连续核苷酸序列。
8.一种检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)提取受试者的血小板中的RNA；
2)以步骤1)提取的RNA为模板，进行逆转录获得cDNA；
3)对cDNA进行实时荧光定量PCR反应进行扩增；
4)以1种内参miRNA校正生物标记组中13种miRNA分子标记物的荧光定量PCR检测值，确定受试者13种分子标记物的含量；
所述13种miRNA分子标记物为miR-30c-5p、miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-186-5p、let-7g-5p、miR-941、miR-92a-3p、miR-22-3p、miR-151a-3p、miR-140-3p、miR-199a-3p、miR-4433b-5p。
9.一种基于miRNA分子标记物进行提前评估川崎病风险的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)通过权利要求8所述的检测方法获取受试者13种分子标记物的含量；
(2)采用随机森林的方法构建模型，以测定的13种分子标记物的含量作为评估受试者川崎病风险评估的特征，对新数据进行评分，进行川崎病患病预测和评价，当评估树脂高于检测阈值时，判定受试者川崎病患病存在高风险。
10.一种权利要求1～4任意一项所述的试剂盒在检测评估受试者中是否存在川崎病患病高风险的体外方法方面的用途。
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