CN108410977A - 酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒 - Google Patents
酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了早期酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs检测试剂盒，该试剂盒中含有定量检测miR‑127‑3p、miR‑1、miR‑628‑3p、miR‑432‑5p、miR‑483‑3p、miR‑483‑5p、miR‑885‑5p的引物序列。本发明这7个miRs诊断超早期酒精性股骨头坏死具有很好的正确性；其中部分miRs区分的效能的敏感性可达100.00％、特异性达100.00％，具有很好的临床运用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒。
背景技术
酒精性股骨头坏死(AIONFH)是由于世界卫生组织(WHO)提出的因饮用酒精类饮品导致的骨组织内细胞凋亡的病理过程之一。AIONFH如果不治疗会导致股骨头塌陷，约80％的AIONFH患者需要髋关节置换，这是一种不可恢复的破坏性疾病。虽然AIONFH的发病机基于各种理论，如血管内凝血理论和血管内脂肪栓塞的概念，但目前还不清楚。就目前而言，迄今为止还没有早期诊断评估AIONFH的金标准。只有通过组织学检查和磁共振成像(MRI)可以作为最早的诊断依据，但是发现指征已经在疾病发病有一定时间了。因此，对于尝试为AIONFH患者提供足够诊断信息以进行早期诊断方面，就目前的技术而言仍存在差距。
因此，寻找快速简便的AIONFH早期生物标志物，开展二级预防显得尤为重要，microRNA就是其中一类。microRNA，简写作miRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，近五年来在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸分子。miRNA通过识别靶mRNA的3’端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使miRNA成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用。因此，成功地挖掘AIONFH中特定的miRNA特征，明确内皮细胞与骨细胞之间的信息交流，建立细胞分子机制和生物标志物调控，为生物标志物的选择条件是快速、简便和稳定，人体外周血血清非常容易获取，近年来miRNA作为生物标志物的重要性成为了血清miRNA的新焦点。
miRNA与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一些miRNA表达量是上调的，一些是下调的。miRNA与疾病的关联有两个层面：首先，miRNA的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都有可能是miRNA的靶位点，当miRNA本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的miRNA表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的miRNA表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，miRNA的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若miRNA正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。
根据最新的研究发现，系统性红斑狼疮(SLE)患者因服用糖皮质激素导致股骨头坏死的生物标记物初步测序工作已经完成。在这类病人中，不同的表达miRNA有15个microRNA过表达，12个低表达。另外，在糖皮质激素干预的人类组织或动物模型及细胞中，运用各种基因芯片，许多研究者都进行了相关实验。miRNA完全可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的坏死病理切片或单一使用的生化指标等手段，能更加准确帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段，判断股骨头坏死的预后，并判断药效和疗效。对miRNA的进一步探索将为我们提供AIONFH诊断途径。血清miRNA试剂盒的研发和在临床医学的应用将产生巨大经济效益和社会前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测早期酒精性股骨头坏死患者血清的miRNAs及其试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的试剂在制备检测超早期酒精性股骨头坏死试剂盒中的应用。
进一不的，所述定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的试剂为定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的引物。
进一步的，所述定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的引物分别如下所示：
miR-127-3p-GSP:5'GGTCGGATCCGTCTGAGC3'(SEQ ID NO:1)
miR-127-3p-R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:2)
miR-1-GSP:5’GGGGTGGAATGTAAAGAAGT3’(SEQ ID NO:3)
miR-1-R:5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’(SEQ ID NO:4)
miR-628-3p-GSP:5’GGGGTCTAGTAAGAGTGGC3’(SEQ ID NO:5)
miR-628-3p-R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3’(SEQ ID NO:6)
miR-432-5p-GSP:5’GGGTCTTGGAGTAGGTCATT3’(SEQ ID NO:7)
miR-432-5p-R:5'CAGTGCGTGTCGTGGAG3’(SEQ ID NO:8)
miR-483-3p-GSP:5'GGGGTCACTCCTCTCCTCC3'(SEQ ID NO:9)
miR-483-3p-R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:10)
miR-483-5p-GSP:5’GGGTAAGACGGGAGGAAAGA3'(SEQ ID NO:11)
miR-483-5p-R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'(SEQ ID NO:12)
miR-885-5p-GSP:5'GCCCTTCCATTACACTACCCT3’(SEQ ID NO:13)
miR-885-5p-R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:14)。
一组检测超早期酒精性股骨头坏死的引物序列，所述引物序列为定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-885-5p的引物序列。
一种超早期酒精性股骨头坏死检测试剂盒，该检测试剂盒中含有上述所述的引物序列。
进一步的，上述所述的序列如SEQ ID NO:1～14所示。
本发明的有益效果是：
本发明7种miRs区分AIONFH患者和非AIONFH患者的准确性非常好；能够检测超早期酒精性股骨头坏死，具有很好的临床运用前景。
附图说明
图1为各miRNA在AIONFH患者和非AIONFH患者(Control)的表达水平。
图2为各miRNAs诊断AIONFH的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)RT-PCR引物合成：
按照下表合成miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-885-5p、miR-423-5p(内参)的检RT-PCR测引物序列如表1所示。
表1为各miR的RT-PCR检测引物GSP和引物R的序列
(2)miRs表达水平检测
1)逆转录合成cDNA模板
分别从AIONFH患者和非AIONFH患者血清或血浆中抽提RNA，并反转录成cDNA模板。逆转录合成cDNA的反应体系如下：
将制备得到的cDNA模板，nuclease free water和SYBRTMGreen master mix置于冰上溶解15-20分钟。SYBRTMGreen master mix应避光溶解，使用前应倒置混匀，其他试剂震荡混匀。所有试剂应离心后使用。
2)实时PCR反应
以上述制备的cDNA为模板，以表1中所述的各miR的引物GSP和引物R为引物，分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：
2×PCR master mix(Arraystar) 5μl
10uM的PCR特异引物GSP(见表1) 0.5μl
10uM的PCR特异引物R(见表1) 0.5μl
加水至总体积为8μl。
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。然后将上述8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。再加入对应的2μl cDNA作为模板。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
将上述PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。内参&所有的指标均按以下程序进行实时荧光PCR检测：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光)。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。
(3)结果分析
1)各miRNA表达量的检测结果
反应后以hsa-miR-423-5p为内参，用Δct计算AIONFH患者血清miRNA表达量相对于对照组(正常人组)增加或减少的倍数，计算公式如下：ΔCt＝目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值；ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)；比率(实验组/对照组)＝2-ΔΔCt。2-ΔΔCt的值大于1表示实验组较对照组miRNA表达上调，小于1表示实验组较对照组miRNA表达下调。
检测结果显示：miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p在AIONFH患者体内显著上调表达，miR-885-5p、miR-483-3p和miR-483-5p在AIONFH患者体内显著下调表达(图1)。
2)各miRNA诊断AIONFH的特异性和敏感性
使用ROC曲线分析来评估上述AIONFH患者和非AIONFH患者血清中鉴定的7种miRNA的相对表达。使用曲线下面的相关面积(AUC)来确定每个miRNA的诊断价值。
结果表明，miR-127-3p的AUC为0.969(95％CI：0.831-0.999，p<0.0001)。另外miR-1的AUC为0.904(95％置信区间0.740-0.981，p<0.0001)。miR-432-5p的AUC为0.927(95％CI：0.770-0.990，p<0.0001)，miR-483-3p的AUC为0.960(95％CI：0.818-0.998，p<0.0001)，miR-483-5p的AUC为0.900(95％CI：0.735-0.979，p<0.0001)，miR-628-3p的AUC为0.964(95％CI：0.824-0.999，p<0.0001)，miR-885-5p的AUC为0.931(95％CI：0.766-0.991，p<0.0001)；见图2。
miR-1敏感性为73.33％，特异性为93.33％；miR-432-5p敏感性为86.67％，特异性为100.00％；miR-483-3p敏感性为80.00％，特异性为100.00％；miR-483-5p敏感性为100.00％，特异性为66.67％；miR-628-3p敏感性为93.33％，特异性为93.33％；miR-885-5p敏感性为86.67％，特异性为93.33％；miR-127-3p敏感性为100.00％，特异性为80.00％；见图2。
从上述结果中可以看出，对上述7个miRs诊断超早期酒精性股骨头坏死(AIONFH)的效能进行评估，其ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线下面积均在0.9以上，非常接近1，说明利用上述7种miRs区分AIONFH患者和非AIONFH患者的正确的概率非常高；其中部分miRs区分的效能的敏感性可达100.00％、特异性达100.00％。具有很好的临床运用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈, 镇秋
洪, 郭驹
魏, 秋实
<120> 酒精性股骨头坏死患者血清miRNAs超早期检测试剂盒
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ggtcggatcc gtctgagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
ggggtggaat gtaaagaagt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
ggggtctagt aagagtggc 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
tgcgtgtcgt ggagtc 16
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
gggtcttgga gtaggtcatt 20
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
cagtgcgtgt cgtggag 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
ggggtcactc ctctcctcc 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
gggtaagacg ggaggaaaga 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 13
gcccttccat tacactaccc t 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 14
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 15
tgaggggcag agagcga 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 16
gtgcgtgtcg tggagtcg 18
Claims (6)
1.定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的试剂在制备检测超早期酒精性股骨头坏死试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的试剂为定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p或/和miR-885-5p的引物分别如下所示：
miR-127-3p-GSP:5'GGTCGGATCCGTCTGAGC3'(SEQ ID NO:1)
miR-127-3p-R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:2)
miR-1-GSP:5’GGGGTGGAATGTAAAGAAGT3’(SEQ ID NO:3)
miR-1-R:5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’(SEQ ID NO:4)
miR-628-3p-GSP:5’GGGGTCTAGTAAGAGTGGC3’(SEQ ID NO:5)
miR-628-3p-R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3’(SEQ ID NO:6)
miR-432-5p-GSP:5’GGGTCTTGGAGTAGGTCATT3’(SEQ ID NO:7)
miR-432-5p-R:5'CAGTGCGTGTCGTGGAG3’(SEQ ID NO:8)
miR-483-3p-GSP:5'GGGGTCACTCCTCTCCTCC3'(SEQ ID NO:9)
miR-483-3p-R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:10)
miR-483-5p-GSP:5’GGGTAAGACGGGAGGAAAGA3'(SEQ ID NO:11)
miR-483-5p-R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'(SEQ ID NO:12)
miR-885-5p-GSP:5'GCCCTTCCATTACACTACCCT3’(SEQ ID NO:13)
miR-885-5p-R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO:14)。
4.一组检测超早期酒精性股骨头坏死的引物序列，其特征在于，所述引物序列为定量检测miR-127-3p、miR-1、miR-628-3p、miR-432-5p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-885-5p的引物序列。
5.一种酒精性股骨头坏死超早期检测试剂盒，该检测试剂盒中含有权利要求4所述的引物序列。
6.根据权利要求5所述的序列，其特征在于，所述的序列如SEQ ID NO:1～14所示。
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