CN107523641A - 血清miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及血清miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用,其筛选方法包括以下步骤:1)从血清中提取包括miRNAs在内的总RNA;2)比较慢乙肝和慢乙肝后肝硬化患者的miRNAs表达谱,找出肝硬化患者血清中异常表达的miRNAs;3)用实时定量RT‑PCR方法,经小样本初筛及扩大样本验证,筛选可用作肝硬化标志物的miRNAs;4)ROC曲线进行相关分析。本发明筛选的慢乙肝后肝硬化辅助诊断标志物为miR‑27a,在肝硬化患者血清中呈高表达,并影响肝星状细胞的增殖,具有潜在诊断和治疗价值,且样本易得、收集简便、无创,具有重要的学术意义和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及血清miRNAs生物标志物的筛选方法及其在慢乙肝后肝硬化诊断标志物发现中的应用。
背景技术
我国是肝病大国,仅慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者就有2000万人之多,其中有20%以上患者逐步发展为肝硬化,为我国的重大疾病之一。长期以来,我国一直把慢性肝病的防治列为国家科技攻关计划。
MicroRNAs(miRNAs)是现代生物医学中的一个重要的调节分子,它通过对基因转录表达的调控,调控着人体所有细胞、组织和器官的各种功能,在人类疾病的发生和防治中具有十分重要的作用。大量研究发现,miRNAs可以广泛而稳定地存在于细胞外液,包括血清、血浆和组织间液之中。它们不仅是细胞内基因转录和表达的调节分子,还是细胞之间信息传递的信号分子。在病理过程中,血清/血浆miRNAs表达谱会发生特征性的改变,这些改变有助于对疾病进行诊断和预后判断,甚至与临床分期分级密切相关。且循环(血清/血浆)中miRNAs作为疾病诊断和预后的标志物,具有检测损伤小、稳定性好、灵敏度高等诸多优点。
在正常机能状态下,机体内循环miRNAs种类及其表达丰度可能处于一个相对稳定、平衡的状态。肝脏作为机体物质能量代谢枢纽,慢性肝病常常伴随着不同程度、反复性的组织损伤-修复过程,可能会直接或间接破坏机体循环miRNAs稳态,表现为异常代谢或特定疾病状态下某些循环miRNAs的表达水平显著性升高或降低。
本发明采用微阵列芯片和实时定量PCR方法进行检测,发现在慢乙肝后肝硬化患者血清中呈高表达、并与肝硬化严重程度相关的miRNAs,再通过体外实验证实活化后的肝星状细胞及其培养基中此类miRNAs呈高表达;miR-27a影响肝星状细胞的增殖,提示miR-27a对肝硬化的诊断和治疗有重要潜在价值和应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一种血清miRNAs生物标志物的筛选方法。
本发明还将筛选出的生物标志物血清miRNAs用于慢乙肝后肝硬化的诊断标志物或辅助诊断标志物。
技术方案为,血清miRNAs生物标志物的筛选方法,包括如下步骤:
1)采集健康者、慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的血清,提取总RNA;
2)初筛:检测慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者临床血清标本中miRNAs表达,比较慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的miRNAs表达谱,筛选肝硬化患者血清中异常表达的miRNAs作为候选;
3)复筛:采用实时定量RT-PCR技术,测定血清中候选miRNAs的含量,进行小样本和/或扩大样本筛选,筛选和确定用作肝硬化标志物的miRNAs;
4)评价:采用ROC曲线法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行临床价值评价。
上述血清miRNAs生物标志物的筛选方法,还包括采用MTS法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行肝星状细胞增殖的抑制价值评价。具体为用MTS法检测肝硬化标志物miRNAs对肝星状细胞,尤其是LX2人肝星状细胞增殖的影响。
还可以包括:用TGFβ1干预LX2肝星状细胞,并检测细胞内和培养基中肝硬化标志物miRNAs的表达。
步骤2)中,用miRNAs表达谱芯片检测miRNAs的表达;利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为差异倍数变化值≥2且P值≤0.01。
通过上述筛选方法,步骤2)初筛发现,有33个miRNAs表达呈上调,分别为:miR-146a、miR-221、miR-151-5p、miR-199a-3p、miR-130a、miR-27a、miR-199a-5p、miR-103、miR-27b、miR-142-3p、miR-21、miR-324-5p、miR-23b、miR-140-5p、miR-148b、miR-652、miR-340、miR-338-3p、miR-126、miR-331-3p、miR-23a、miR-30b、miR-374b、miR-301a、miR-223、miR-33a、miR-30c、miR-148a、miR-744、miR-424、miR-17、miR-128、miR-30e*;5个miRNAs表达呈下调,分别为:miR-939、miR-1275、miR-1915、miR-638、miR-940。
步骤3)中,采用实时定量RT-PCR方法对步骤2)初筛得到的miRNAs进行小样本筛选,将小样本筛选得到的miRNAs进行扩大样本筛选,确定最终用作肝硬化标志物的miRNAs。进行小样本筛选的步骤2)的候选miRNAs均选自33个呈上调表达的miRNAs,尤其是miR-27a、miR-27b、miR-142-3p、miR-151-5p和miR-424。
经过小样本复筛后,得到miR-27a进行扩大样本筛选。
采用上述血清miRNAs生物标志物筛选方法筛选出的慢乙肝后肝硬化辅助诊断标志物为miR-27a。
采用ROC曲线法(受试者工作特性曲线,Receiver Operator CharacteristicCurve,简称ROC曲线)评估miR-27a作为慢乙肝后肝硬化标志物的临床价值,血清miR-27a进行肝硬化诊断的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.87(HBC/Ctrl)和0.82(HBC/CHB),效果良好。
进一步采用MTS法测定细胞增殖的影响,miR-27a的抑制剂(miR-27a inhibitor,100nmol)转染LX2肝星状细胞48h、72h后,可以显著抑制肝星状细胞的增殖(P<0.01)。
采用TGF-β1(10ng/ml)刺激LX2细胞,对照组用无血清培养基进行平行处理,另外培养24h后,实时定量RT-PCR方法检测TGF-β1对LX2细胞及培养基中miR-27a表达的影响。结果显示,在肝星状细胞活化后,细胞内及培养基中miR-27a表达呈上调,说明miR-27a参与肝星状细胞的活化,并由肝星状细胞释放分泌到细胞外。
由此可见,miR-27a在肝硬化患者血清中呈高表达,可以作为血液样本,尤其是血清样本中诊断或辅助诊断肝硬化、肝纤维化的生物标志物,也可以用来制备或筛选治疗肝硬化的药物。
miR-27a可用于制备诊断或辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片,或者用于筛选治疗肝硬化药物的试剂、试剂盒或生物芯片。miR-27a的检测试剂可用于制备或筛选治疗肝硬化药物,或者用于制备诊断或辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片。
一种用于诊断或者辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片,含有miR-27a的检测试剂,优选的,含有miR-27a的逆转录引物和检测引物。
本发明的有益效果在于:
1.建立血清miRNAs生物标志物的筛选方法,并发现肝硬化患者血清中miRNAs存在异常表达;血清miRNAs可作为肝硬化诊断标志物,可用于肝硬化患者的辅助诊断,对于肝硬化的辅助诊断及丰富肝硬化的病理机制等,具有重要的学术意义和应用前景。
2.miR-27a在肝硬化患者血清中呈高表达,可能是肝硬化患者特征性的miRNAs分子;采用miR-27a作为血清中的肝硬化生物标志物,可以方便快速地检测,不会对患者造成创伤,miR-27a可用于诊断或辅助诊断的标志物及筛选治疗肝硬化的药物。
3.本发明以血清为样本,生物样本易得,收集简便、无创、数量大,通过检测疾病标志物miRNAs就可以进行诊断或辅助诊断,miRNAs作为疾病生物标记物具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明筛选方法的流程图。
图2为健康者(Ctrls)、慢乙肝(CHB)和慢乙肝后肝硬化(HBC)患者血清miR-27a、miR-27b、miR-142-3p、miR-151-5p和miR-424的小样本RT-PCR检测结果示意图。
图3为健康者(Ctrls)、慢乙肝(CHB)和慢乙肝后肝硬化(HBC)患者血清miR-27a的扩大样本RT-PCR检测结果示意图。
图4为慢乙肝后肝硬化(HBC)患者血清miR-27a的ROC曲线示意图。
图5为MTS法测定的miR-27a的细胞增殖结果示意图。
图6为RT-PCR法检测TGF-β1对LX2细胞及培养基中miR-27a表达的影响结果示意图。
具体实施方式
筛选过程如图1所示,步骤包括:
(a)采集健康者(Ctrls)、慢乙肝(CHB)和慢乙肝后肝硬化(HBC)患者血清,提取总RNA(包括miRNAs);
(b)初筛:用miRNAs芯片检测慢乙肝(CHB)和慢乙肝后肝硬化(HBC)患者临床血清标本中miRNAs表达谱,比较慢乙肝(CHB)和慢乙肝后肝硬化(HBC)患者的miRNAs表达谱,初筛找出慢乙肝后肝硬化(HBC)患者血清中异常表达的miRNAs作为候选;
(c)小样本复筛:用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术,测定每份血清中候选miRNAs的含量,筛选可以用作HBC标志物的miRNAs;
(d)扩大样本复筛:用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术,测定每份血清样本中候选miRNAs的含量,进一步确定可用作HBC标志物的miRNAs;
(e)用ROC曲线法分析筛选的HBC标志物的miRNAs,进行临床价值评估。
实施例1
采集样本和用mirVanaTM PARISTM Kit(Ambion-1556)提取血清Total RNA:
1.取血清样本200μL,加入等量的2×Denaturing Solution,涡旋混匀,冰上放置5分钟。
2.加入等体积的酚/氯仿,涡旋混匀30-60秒。
3.室温,12000转/分钟离心5分钟。
4.小心吸取上清到新的1.5mL离心管中,添加1.25倍体积的无水乙醇,涡旋混匀。
5.转移至柱子中(最大体积700μL),10000g离心30s。
6.混合10μL DNase I和70μL Buffer RDD QIAGEN(#79254)总体积:80μL,加到离心柱中的膜上,室温放置15min。
7.加入350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中,10000g,室温离心15秒,弃流过液,将离心柱重新放置到收集管中
8.加入500μL Wash Solution 2/3过柱两次,10000g,室温离心15秒,弃流过液,之后空柱离心1分钟。将离心柱放置到新的收集管中,柱中心加50μL 95℃预热的ElutionSolution,室温12000转/分钟离心20-30秒,收集管中的液体即为提取的Total RNA,可放置在-80℃保存或进行后继实验。
实施例2
芯片检测初筛,结果如表1所示,如miR-146a、miR-221、miR-151-5p、miR-27a、miR-27b、miR-142-3p等的表达均有2倍以上提高,而且P值≤0.01。
表1.慢乙肝后肝硬化患者(HBC)血清中miRNAs的表达(HBC/CHB)
实施例3
复筛:RT-qPCR检测
小样本复筛选取miR-27a、miR-27b、miR-142-3p、miR-151-5p和miR-424,检测Ctrls、CHB和HBC患者血清中这些miRNAs分子表达情况(Ctrls 7个,CHB 10个,HBC 10个)。结果显示,与CHB比较,miR-27a、miR-142-3p和miR-151-5p在肝硬化患者血清中呈高表达(P<0.01),如图2所示。其余的miRNAs表达量没有显著差异,而且P值超过0.06。与Ctrls和CHB比较,只有miR-27a在肝硬化患者血清中呈高表达(P=0.04,P<0.0039)。
大样本复筛检测miR-27a在肝硬化患者血清中的表达(Ctrls 36个,CHB 64个,HCC87个)。结果显示,与Ctrls和CHB比较,miR-27a在肝硬化患者血清中呈高表达(P<0.0001),如图3所示。
用“两步法”RT-qPCR的方法定量基因表达。两步法中,首先,RNA用反转录酶生成cDNA。第二步为取一部分cDNA作为模板再进行多个qPCR反应。小样本复筛和扩大样本复筛均按以下步骤操作。
1.第一步:cDNA模板的制备(反转录)
反转录采用miScriptGreen PCR Kit,20μl反转录体系如下:
表A
试剂 | 体积 |
5x miScript HiFlex Buffer | 4μl |
miScript逆转录混合液(10x miScript Nucleics Mix) | 2μl |
miScript Reverse Transcriptase Mix | 2μl |
模板RNA(Template RNA) | 10μl |
轻柔混匀,37℃孵育60min,之后,95℃孵育5min,灭活miScript ReverseTranscriptase Mix(miScript逆转录混合液)活性。置于冰上冷却,短暂离心收集,可以直接用于PCR扩增,或于-20℃保存。
2.第二步:PCR反应
(A)PCR反应液的配制
表B
(B)PCR的反应条件
95℃15min,(94℃15s,55℃30s,70℃30s)×40循环,溶解曲线分析。
根据PCR扩增反应的miRNA的不同分为5各组(miR-27a、miR-27b、miR-142-3p、miR-151-5p和miR-424),每个组添加通用引物(miScript Universal Primer)以及与各自miRNA对应的扩增引物(miScript Primer Assay)。
数据处理与统计分析
采用miR-24标化、计算每一种被检miRNAs的△Ct值,录入Excel数据表,建库。采用2△Ct分析不同组别间的miRNAs表达水平的差异,△Ct=Ct内参基因-Ct靶基因。
数据正态性检验采用动差法,非正态数据的组间比较采用Mann-whitney检验或Kruskal-Wallis检验。对差异表达的miRNAs、差异表达的miRNAs与中医证候及临床指标等进行相关性分析和统计学处理,采用SPSS 15.0和SAS软件完成,以P<0.05为显著性检验水准。ROC(receiver operating characteristic,ROC)分析及AUC(area under the curve,AUC)计算由GraphPad Prism软件完成。
小样本复筛的结果如图2所示,其中Ctrls数量为7个,CHB样本数量10个,HBC样本数量10个。结果显示,与CHB比较,HBC中miR-27a,miR-142-3p和miR-151-5p的表达量有显著提高,而且P<0.01;其余2种miRNAs的CHB和HBC表达量没有明显差异miR-27b和miR-424,P值大于0.06,其中,miR-27b为0.3636,miR-424为0.06。
扩大样本复筛进一步验证(Ctrls数量为36个,CHB样本数量64个,HBC样本数量87个),miR-27a的复筛结果如图3所示,HBC患者血清中的miR-27a表达量有明显增加,而且P<0.0001,且miR-27a的表达肝硬化严重程度相关,miR-27a在与失代偿肝硬化患者血清中呈高表达(P=0.0009)。
实施例4
用ROC曲线法(受试者工作特性曲线,Receiver Operator CharacteristicCurve,简称ROC曲线)分析miR-27a在HBC方面的诊断价值。结果如图4所示,其中纵轴为灵敏度,横轴为100%-Specificity%(即100%-特异度%,假阳性率)。曲线下面积AUC分别为0.87(HBC/Ctrl)和0.82(HBC/CHB),说明诊断的正确度高。
实施例5
用MTS法测定miR-27a对细胞增殖的影响。用miR-27a抑制剂(miR-27a inhibitor,100nmol)和对照抑制剂(100nmol)分别转染LX2肝星状细胞,结果如图5所示,miR-27a抑制剂转染48h、72h后显著抑制LX2细胞的增殖(P<0.01)。说明miR-27a是LX2细胞增殖的活性成分,影响LX2细胞的增殖。
其中,miR-27a抑制剂是抑制miR-27a表达的小分子,通过化学方法合成,可与成熟miRNA分子特异性结合而抑制miRNA活性,进而削弱细胞中内源性miRNA的基因调控作用,进行miRNA功能缺失性(loss-of-function)研究。
对照抑制剂是不抑制miRNA分子表达的阴性对照小分子(miRNA inhibitorNegative Control),选用自C.elegans的miRNA,经过生物信息学分析表明其与人、小鼠、大鼠的基因组,以及miRBase数据库中所有miRNA具有最小的同源性,适用于人、小鼠、大鼠的miRNA实验阴性对照。
实施例6
激活的肝星状细胞及其激活后细胞外基质异常表达和沉积是肝纤维化发生的关键。转化生长因子β1(TGFβ1)激活HSC并促进其合成ECM,已被认为是肝纤维化发生的最重要的因素之一。用TGF-β1(10ng/ml)刺激LX2细胞,对照组用无血清培养基进行平行处理,另外培养24h后,实时定量RT-PCR方法检测,确定TGF-β1对细胞及培养基中miR-27a表达的影响。结果如图6所示,在活化后肝星状细胞(图6A)及培养基(图6B)中miR-27a表达呈上调。提示:miR-27a参与肝星状细胞的活化,并由肝星状细胞释放分泌到细胞外。
由此可见,miR-27a在慢乙肝肝硬化患者血清中高表达,可以作为筛选肝硬化的生物标志物,也可以用来筛选治疗肝硬化的药物。
miR-27a可用于制备诊断或辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片,或者用于制备筛选治疗肝硬化药物的试剂、试剂盒或生物芯片。含有miR-27a检测试剂(如扩增检测引物及试剂、逆转录引物及试剂)的试剂盒或生物芯片,可用来检测血清样本中miR-27a的表达量,从而用于诊断或辅助诊断肝硬化,或者筛选、制备治疗肝硬化药物。
Claims (10)
1.血清miRNAs生物标志物的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)采集健康者、慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的血清,提取总RNA;
2)初筛:检测慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者临床血清标本中miRNAs表达,比较慢乙肝患者和慢乙肝后肝硬化患者的miRNAs表达谱,筛选肝硬化患者血清中异常表达的miRNAs作为候选;
3)复筛:采用实时定量RT-PCR技术,对步骤2)中候选miRNAs进行小样本和/或扩大样本筛选,筛选和确定用作肝硬化标志物的miRNAs;
4)评价:采用ROC曲线法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行临床价值评价。
2.根据权利要求1所述的血清miRNAs生物标志物的筛选方法,其特征在于,步骤2)中,用miRNAs表达谱芯片检测miRNAs的表达;利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为差异倍数变化值≥2且P值≤0.01。
3.根据权利要求1所述的血清miRNAs生物标志物的筛选方法,其特征在于,还包括采用MTS法对步骤3)筛选的肝硬化标志物miRNAs进行肝星状细胞的增殖抑制价值评价。
4.根据权利要求1所述的血清miRNAs生物标志物的筛选方法,其特征在于,步骤3)中,采用实时定量RT-PCR方法对步骤2)的候选miRNAs进行小样本筛选,将小样本筛选得到的miRNAs进行扩大样本筛选,确定最终用作肝硬化标志物的miRNAs。
5.miR-27a作为血液样本中慢乙肝后肝硬化诊断标志物或辅助诊断标志物的应用。
6.miR-27a作为血清样本中慢乙肝后肝硬化诊断标志物或辅助诊断标志物的应用。
7.一种用于诊断或者辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片,其特征在于,含有miR-27a的检测试剂。
8.根据权利要求7所述用于诊断或者辅助诊断肝硬化的试剂、试剂盒或生物芯片,其特征在于,含有miR-27a的逆转录引物和检测引物。
9.miR-27a在制备或筛选治疗肝硬化药物方面的应用。
10.miR-27a的检测试剂在制备或筛选治疗肝硬化药物方面的应用。
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