CN102016037A

CN102016037A - 血清/血浆miRNA在HBV感染和肝癌早期诊断中的应用

Info

Publication number: CN102016037A
Application number: CN2009801048166A
Authority: CN
Inventors: 曾科; 张辰宇; 张峻峰; 李丽民
Original assignee: Micromedmark Biotech Co Ltd
Current assignee: Micromedmark Biotech Co Ltd
Priority date: 2008-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2029-10-13
Also published as: WO2010043114A1; CN101368213A; CN102016037B

Abstract

一种用于区分正常人与HCV感染者、HBV感染者和HBV肝癌患者的微小核糖核酸组合及其在HBV感染和HBV相关的肝癌早期诊断中的应用，所述组合包含在正常人与HCV感染者、HBV感染者和HBV肝癌病人血清/血浆中差异表达的全部微小核糖核酸。进一步提供一种含有所述微小核糖核酸并能用于HBV感染和HBV阳性肝癌早期诊断的试剂盒及其制备方法。该试剂盒主要具有高特异性、高灵敏度的特点。

Description

血清 /血浆 miRNA在 HBV感染和肝癌早期诊断中的应用技术领域

本发明涉及血清 /血浆微小核糖核酸（microRNA, miRNA ) 在 HBV 阳性肝癌早期诊断和动态监测中的应用研究，具体涉及 HBV相关疾病尤其是肝癌的早期诊断、疗效评价、药物筛选和药效评价等方面的应用。背景技术

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，国际癌症研究中心（IARC )估计 2000年全球肝癌发病 56.4万，死亡 54.9万，中国肝癌发病 30.6万，死亡 30.0万，占肝癌全球发病和死亡人数一半以上，是严重危害我国人民生命健康的主要癌症之一。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，就全球而言，慢性 HBV和 HCV感染是原发性肝细胞癌（HCC )主要的危险因素，尤其是慢性 HBV感染与 HCC 发病呈现高度的地域一致性，与全球 75%的肝癌有关，在发展中国家甚至达到 85%。在中国， HBV感染也是首要的危险因素，据估计我国 HBV携带者达到了 1.2亿之众，其中 20%将发展成慢性乙型肝炎（CHB ) ，慢性乙型肝炎活动性较强有明显的进展倾向， 15%-40%将进展为肝硬化，而我国肝癌患者中 90%以上有肝硬化，因此， HBV感染、乙型肝炎慢性化、肝硬化至肝癌是我国肝癌发生的主要模式。近年来通过新生儿乙肝疫苗的接种和乙型肝炎的防治，肝癌在青少年一代开始显示下降的趋势，但疫苗等措施作用的真正体现可能还需要 10-20年。

HBV感染后的治疗是一个长期漫长的过程，在这个过程中，病情易出现反复活动，病变常成阶段性进展，越晚越恶劣，越晚越难治，发生肝硬化后，抗病毒治疗也难完全防止其进一步发展，而 HCC 更是恶性程度最高的肿瘤之一，病程短、进展快、预后极差， 5年生存率不到 10%。因此，对 HBV感染者的病情需要长期动态检测，掌握患者的疾病状态和病情严重程度，对阶段性的进展更应及早诊断以确定针对性的防治方案，最大限度地长期抑制或消除 HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延緩和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。

目前，血清 HBV 标志物和曱胎蛋白（AFP )是全世界应用最广泛的 HBV感染和 HCC生物标志物（ Biomarker ) , 转氨酶则是反映肝脏损伤程度的常用指标，但它们难以反映 HBV感染相关疾病的动态进展情况，对相应疾病的早期诊断效果也越来越不能满足需要，如，随着影像学的发展， AFP阴性的病例被确诊为肝癌，其诊断肝癌的敏感性仅为 40%-60%,特异性为 70%-90%；针对肝硬化的诊断和病变程度判断则尚缺乏合适的生物标志物。尽管目前国内外研究者正探索筛选新的生物标志物，以对 AFP进行有效的补充，但是难以突破传统生物标志物发展和应用中的瓶颈，即抗体难以制备和定量检测困难。

综上所述， HCC起病比较隐匿，并且预后不良，要加强 HBV感染者病情的监控，发现病情变化的早期指针，就需要针对 HBV感染不同阶段，获得灵敏、特异、易于检测的标志物。另外， HBV感染和 HCC治疗效果有限，要进行治疗效果的早期判断，发现更多有效的治疗靶标，进行靶向治疗就需要动态监测 HBV感染和 HCC治疗的效果，了解 HBV感染的自然史， HCC 发生和发展的分子机制，获得易于调控的治疗靶标。因此，寻找一类新型的特异性生物标志物是肝癌防治的当务之急。

MicroRNA(miRNA)是近年的一个研究热点，它是一类长约 19-23 个核苷酸的单链 RNA 分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的 lin-4与 let-7 被发现以来， microRNA已逐渐成为调控 mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在 2002年和 2003年两度入选 Science杂志年度十大科技突破。现在预测 microRNA至少能调控 5300个人类基因，也就是所有基因的 30%。随着研究的深入，越来越多的 miRNA被发现，其中， miRNA与肿瘤的关系越来越成为研究的重点，已经发现若干 miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。 miRNA的正调控靶基因现象是最近的发现，具体机制还不明确。有学者提出了 "癌 microRNA"(OncomiRs)的观点，即认为某些 miRNA 的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。

肝癌，特别是乙型肝炎相关性肝癌在我国的发病率高，死亡率高，严重危害人们的健康，而乙型肝炎相关性肝癌目前尚无满意的治疗。国内外学者对肝癌开展了广泛而深入的研究，但乙肝病毒与肝癌发生发展的关系尚未完全阐明。近来研究表明 miRNA可能在肝癌发生与进展中发挥重要作用，但是还没有关于血清 /血浆微小核糖核酸用于肝癌诊断与治疗方面的任何报道。

在前期的研究中，我们发现血清 /血浆中存在上百种的 microRNA, 性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清 microRNA 的表达语可作为早期诊断的潜在生物标志物，并首次提出血清中微小核糖核酸作为全新的疾病检测指针（该发明已经申请了专利）。这一发现令人振奋，血清 microRNA作为一类非编码调节性的小分子 RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《自然》（Nature )也在其网站首页的"最新研究进展 "专栏中展示了这一来自中国的最新研究进展。因此若能筛选出 HBV感染引起的 HCC 特异血清 microRNA作为生物标志物，并研制相应的疾病进展监测芯片，不仅在该领域处于国际领先地位，而且对我国 HBV感染相关疾病及 HCC 的防治现状必将是一次有力的推动。

目前，对 HBV感染引起的 HCC的诊断仅仅局限于血清 /血浆中的各种生化指标，以及传统医学和影像学手段，还没有关于血清 /血浆微小核糖核酸用于肝癌诊断与治疗方面的任何报道。基于微小核糖核酸的这一发现，本发明人将研究目光锁定在血清 /血浆微小核糖核酸在乙型肝炎引起的肝癌诊断与治疗方面的重大应用前景。因此希望通过本课题的顺利实施获得 HBV感染引起的 HCC特异性血清 microRNA表达数据库和肝癌特异标志物，研制 HBV感染引起的 HCC的诊断试剂盒，为 HBV相关疾病发生和进展机制的研究提供数据支持；通过血清 microRNA生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，使得 HBV感染引起的 HCC的早期诊断和动态监测方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时釆取更具个体化的防治方案提供支持，为后期临床应用效果评价奠定基础。发明内容

本发明人通过分离和研究正常人、 HBV携带者、慢性乙肝患者、丙肝患者以及 HBV感染引起的肝癌患者血清中的微小核糖核酸，寻找一类可用于 HBV感染相关疾病尤其是 HBV感染引起的肝癌早期诊断的高效率、高特异性和高敏感性的微小核糖核酸，并研制出可便于临床应用的 HBV感染相关疾病尤其是 HBV感染引起的肝癌的早期诊断的监测试剂盒。为实现这一目的，本发明需要解决的问题包括：（ 1 )建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序（SOP )釆集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。 ( 2 )血清 miRNA差异表达语分析：选择健康个体、乙肝表面抗原携带者、慢性乙肝患者、慢性丙肝患者和 HBV相关的肝癌患者检测其血清 miRNA表达谱及含量，分析不同人群血清 miRNA的共性和特性，筛选差异表达 miRNA以备进一步大样本独立验证。（3 ) 筛选疾病特异血清 miRNA: 对已筛选的血清差异表达 miRNA在大样本人群中进行定量分析验证，确定乙肝表面抗原携带者、慢性乙肝患者、慢性丙肝患者和肝癌患者特异性血清 miRNA, 能够特异性指示肝癌发展的各个阶段，反映肝癌发生的动态变化。 ( 4 )血清 miRNA诊断试剂盒的研制：根据 HBV 感染至肝癌发生各阶段特异血清 miRNA开发 miRNA诊断试剂盒，该芯片可以识别 HBV感染病人所处的发病阶段及病情严重程度，实现肝癌早期诊断的目的。

为解决以上问题本发明人以标准操作程序 ( SOP )釆集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料，并釆用了 RT-PCR方法、 Real-time PCR方法、 Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中的一种或几种。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.样品分选及归类方法

Group A: 健康对照组（n=80 )

( 1 ) 乙肝表面抗体、乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阴性

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT<40IU/L,AST<45IU/L

( 4 ) 没有其它系统性疾病

( 5 )年龄≥20

Group B: 病毒清除者（n=80 )

( 1 ) 乙肝表面抗原阴性和 /或 HBV-DNA 阴性，乙肝表面抗体和乙肝核心抗体阳性并且没有疫苗注射历史

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT<40IU/L,AST<45IU/L

( 4 ) 没有其它系统性疾病

( 5 )年龄≥20

Group N: 对照组（ n=60 ) Group A和 Group B的整合

Group C: 持续性无症状 HBV感染者（ n=55 ) (1) 乙肝表面抗原和核心抗体阳性

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT<40IU/L,AST<45IU/L

(4) 没有肝炎临床症状

(5) 没有肝硬化临床迹象

(6) 没有其它系统性疾病

( 7 )年龄≥20

Group D: 慢性乙肝患者（n=80)

( 1 ) 乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性至少 6个月

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT和 /或 AST水平高于正常值的两倍

(4) 没有肝硬化临床迹象

(5) 没有其它系统性疾病

( 6 )年龄≥20

Group HBV: HBV组（ n=135 ) Group C和 Group D的整合

Group HBV-HCC: HBV相关的肝细胞癌（ n=65 )

(1) 乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

(3)组织切片检查确诊为肝细胞癌

(4)年龄≥40

Group HCV: 慢性丙肝患者（ n=48 )

( 1 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阳性

(2) 乙肝表面抗原阴性

( 3 ) ALT和 /或 AST水平高于正常值的两倍

(4) 没有肝硬化临床迹象

(5) 没有其它系统性疾病

( 6 )年龄≥20

2. Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取血清总 RNA

( 1 )取 80- 100ml的血清，加入等体积的 Trizol Reagent

(2)相分离

室温放置 15min, 然后按 0.2ml了氯仿 /lml Trizol Reagent的体积比加入氯仿，教育列震荡 15s, 室温 15min, 12,000g, 4°C,离心 15min ( 3 )将水相转移到新的 50ml的离心管， 3步苯酚 /氯仿除去蛋白相 ( 4 ) RNA沉淀

将水相转移到新的离心管中 , 按 0.5ml异丙醇 /lml Trizol Reagent 体积加入异丙醇， -20°C保存 60min, 12,000g, 4°C ,离心 60min ( 5 )用 lml Trizol重悬沉淀，将悬液转移到新的 1.5ml的离心管中

( 6 )重复 2, 4步（第四步离心改为 15min )

( 7 ) RNA洗涤

去掉上清，加入 75%乙醇， 12,000g, 4°C离心 5min

( 8 )测量浓度

通常能得到 5〜10 μg RNA/ 50-100 ml血清

3. Solexa测序

( 1 ) 总 RNA进行 PAGE电泳回收 17-27nt RNA分子

( 2 )将 adaptor prime酶联在小 RNA分子的 3'与 5'端

( 3 )进行 RT-PCR反应后并进行测序

( 4 )数据分析与处理

4. Real-time PCR方法

( 1 )取受试者的血清 /血浆总 RNA,通过 RNA逆转录反应得到 cDNA 样品；或者收集受试者的血清 /血浆样本，以血清 /血浆作为緩冲液进行逆转录反应来制备 cDNA样品；

( 2 )用微小核糖核酸设计引物；

( 3 )加入荧光探针进行 PCR反应；

( 4 )检测并比较正常人、乙肝携带者、乙肝患者血清 /血浆样本中微小核糖核酸的量的变化。

5. 诊断试剂盒制备方法

Solexa方法确定正常人和病人血清中有 50个以上拷贝的微小核糖核酸。然后通过定量 PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清 /血浆微小核糖核酸，作为预测是否发生肝癌和 HBV相关的其它疾病以及诊断病变程度的指标。最后筛选出的对应肝癌和 HBV相关疾病的血清小核糖核酸的数量控制在几至十几条，这是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精简。诊断试剂盒包括一批血清微小核糖核酸引物， Taq酶、 dNTP 等试剂。

根据上述 Solexa测序方法本发明人检测到的存在差异表达的正常人和慢性乙肝患者血清 /血浆中的微小核糖核酸包括 let-7c、 miR-l、 miR-10a、 miR-122、 miR-125b、 miR-128a、 miR-128b、 miR-150, miR-197、 miR-221 , miR-222 , miR-223、 miR-23a、 miR-23b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-30a、 miR-342-3p、 miR-361-5p、 miR-423-5p、 miR-532-5p、 miR-574-3p、 miR-629、 miR-92a、 miR-92b、 miR-99a、 miR-139-5p、 miR-193a-5p、 miR-193b、 miR-365、 miR-375 , miR-455-3p、 miR-483-3p、 miR-483-5p、 miR-486-3p、 miR-885-5p、 miR-99b、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-101、 miR-103、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107、 miR- 126、 miR- 130a、 miR-130b、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-144、 miR-146a、 miR-146b-5p、 miR- 148b, miR-151-5p、 miR- 15a, miR-16、 miR- 17 , miR- 182 , miR- 183 , miR- 185 , miR- 186 , miR- 18a, miR-191、 miR- 19b , miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210, miR-26a、 miR-26b、 miR-29c、 miR-30e、 miR-340、 miR-362-5p、 miR-363、 miR-374a、 miR-378、 miR-424、 miR-451、 miR-454、 miR-532-5p、 miR-652 , miR-660、 miR-7、 miR-923、 miR-93、 miR-96、 miR-98。

本发明人证明了正常对照者和病毒清除者之间、慢性乙肝患者和 HBV 携带者之间血清 microRNAs的表达无显著性差异，并将正常对照者和病毒清除者整合为对照组，将慢性乙肝患者和 HBV携带者整合为 HBV组。具体实施方法是：

根据上述 Solexa结果，选择在慢性乙肝患者中的拷贝数是健康对照者中拷贝数的 20倍的 microRNAs作为本发明中初步筛查的血清 markers , 并且这些 microRNAs在慢性乙肝患者中的拷贝数都大于 50拷贝，由于技术操作问题，舍弃了 miR-221 和 miR-629。

根据上述 real-time PCR方法，本发明人在 30例正常对照（用 Solexa 测序的样品）、 30例病毒清除者、 30例慢性乙肝患者（用 Solexa测序的样品 )和 30例无症状 HBV感染者血清中成功检测了如下 13个 microRNAs: miR- 122a , miR-423、 miR-92a、 let-7c、 miR-23a、 miR-23b、 miR-223、 miR-342-3p、 miR-375 , miR-99a、 miR- 150、 miR- 125b、 miR- 10a„

分析结果，本发明人发现正常对照者和病毒清除者之间、慢性乙肝患者和 HBV携带者之间这 13个 microRNAs的表达无显著性差异，因此，将正常对照者和病毒清除者整合为对照组，将慢性乙肝患者和 HBV携带者整合为 HBV组。

本发明人还证明了所选择的 13个 microRNAs可以将对照组、慢性丙肝感染者和 HBV组分开，具体实施方法是：进一步检测 HBV的特异性表达语，用上述 real-time PCR方法检测了这 13个 microRNAs在 30例慢性丙肝患者血清中的表达情况，结果发现慢性丙肝感染者可以和 HBV组分开。

进一步确认这 13个 microRNAs可以将慢性丙肝感染者和 HBV组分开，检测比较这 13个 microRNAs在 100例对照组 ( 50例健康对照和 50例病毒清除者）、 75个 HBV组 ( 25例 HBV携带者和 50例慢性乙肝患者 )和 18 例慢性丙肝患者中的表达情况，用 Cluster3.0聚类分析，这 193例样品确实可被分为三大类：对照组、 HBV组和 HCV组，正常对照者和病毒清除者之间、慢性乙肝患者和 HBV携带者之间确实无显著性差异。

在上述结果的基础上，本发明人用聚类分析方法还证明了所选择的 13 个 markers中的 6个 microRNAs: miR-375 , miR-92a、 miR-10a、 miR-223、 miR-423-5 和 miR-99a就能将对照组、 HBV组和 HCV组 3个组区分开来， 160例对照组只有 2例、 135例 HB V组中只有例个被错误的归类，而 HC V 组中没有一例被错误归类。

在上述一系列研究结果的基础上，本发明人最后证明了所选择的 13个 markers中的 8个 microRNAs: miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375, miR-23a、 miR-342-3p、 miR-10a、 miR-125b、 miR-92a就可以将 HBV-HCC组与 HBV 组和对照组分开。具体实施方法是：

搜集 65例 HBV相关的 HCC患者的血清进行上述的 real-time PCR检测， real-time PCR结果与上述的对照组结果、 HBV组结果进行聚类分析，结果显示 8 个 microRNAs: miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a、 miR-342-3p、 miR-10a、 miR-125b、 miR-92a就可以将 HBV-HCC组与 HBV 组和对照组分开， 160例对照组中只有例个、 135例 HBV组中只有 2例被错误归类，而 HBV-HCC组中没有一例被错误归类。

另外，本发明人还提供了单个或多个标志物低表达或高表达区分 4组样品（ Group N、 Group HBV, Group HCV, Group HBV-HCC )的诊断能力，具体实施方法和结果如下：

对正常对照组（ Group N ) 、 HBV组（ Group HBV ) 、 HCV组（Group HCV )和 HBV-HCC组（ Group HBV-HCC )样品的 real-time PCR结果进行风险评分，以每个 microRNA表达量的 5%或 95 %的参考区间为风险值，通过绘制 ROC 曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估单个或多个 microRNAs低表达或高表达在肝癌早期诊断中的诊断能力。 ROC分析结果显示， miR-375, miR-10a、 miR-223 ( miR-122a或 miR-342-3p ) 、 miR-423 以 100%的 AUC ( ROC曲线下面积）将对照组和 HBV组分开， miR-92a和 miR-423-5 以 99.6%的 AUC 将对照组和 HCV 组分开， miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375, miR-23a和 miR-342-3p以 99.9%的 AUC将对照组和 HCC组分开，而 miR-375和 miR-92a将 HBV组和 HCV组分开， miR-10a 和 miR-92a将 HBV组和 HCC组分开。当用 miR-375、 miR-10a、 miR-223 和 miR-423-5p 4个 markers来区分对照组和 HBV组时， AUC为 99.9士 0.1%, 灵敏度为 99.3%, 特异性为 98.8%。当用 miR-92a、 miR-423-5p 2个 markers 来区分对照组和 HCV组时， AUC为 99.6士 0.4%, 灵敏度为 97.9%, 特异性为 99.4%。同样地，当用 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375、 miR-23a 和 miR-342-3p 5 个 markers 来区分对照组和 HBV-HCC 组时， AUC 为 99.9%士 0.1%,灵敏度为 96.9%,特异性为 99.4%,而当用 miR-10a和 miR-125b 区分 HBV组和 HBV-HCC组时， AUC为 99.2%, 灵敏度为 98.5%, 特异性为 98.5%。

根据上述诊断试剂盒制备方法和上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于肝癌早期诊断的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清 /血浆中稳定存在且可检测的成熟 miR-375、 miR-92a、 miR-10a、 miR-223、 miR-423-5p、 miR-23b、 miR-23a、 miR-342-3p、 miR-99a、 miR-125b 的引物和工具。

具体而言，上述 microRNAs组合、方法、诊断试剂盒可用于 HBV相关的肝癌和 HBV感染的早期诊断和动态监测，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时釆取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度地长期抑制或消除 HBV, 减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延緩和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。

本发明还为血清 microRNA生物标志物和监测试剂盒推向临床应用提供了理论基础，为发现其它疾病病情变化的早期指针、进行疾病治疗效果的早期判断、发现疾病更有效的治疗靶标、阐明疾病发生和发展的分子机制提供了理论基础和技术支持。

综上所述， microRNA作为 HBV相关的肝癌和 HBV感染早期诊断标志物的优越性在于： ( 1 )血清 miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子 RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为 HBV相关的肝癌和 HBV感染的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。（2 )血清 miRNA监测试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，血清 miRNA监测试剂盒能够明确 HBV相关的肝癌患者疾病进展情况，全面的反映患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约了成本和时间，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时釆取更具个性化的防治方案提供支持。（3 )釆用严密、多阶段的验证和评价体系，本发明人初期釆用 Solexa测序技术对血清 miRNA的进行直接测序以获取疾病特异的血清 miRNA表达语，并应用 q-PCR的方法在大样本进行独立验证；对血清 miRNA标志物和诊断试剂盒在现有的病人资源中进行初步效果评价，而后应用两个大样本前瞻性随访队列进行评估，以上方法和策略的应用加速和保证了血清 miRNA生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

总之，使用血清 /血浆微小核糖核 S史检测技术可以早期确诊 HBV相关的肝癌和 HBV感染 , 这种新的 HBV相关的肝癌和 HBV感染的血清 /血浆标记物不仅为人们在分子水平上全面了解肝癌的发生、发展机理提供了物质基础，也加速了肝癌了临床疾病诊断学和治疗学的进步。当然，早期检测肝癌的诊断试剂盒的有效性还有待进一步的临床验证。但是，基于 microRNA作为 HBV相关的肝癌和 HBV感染早期诊断标志物的优越性，相信不久的将来，对肝癌的血清 /血浆微小核糖核酸诊断技术将会成为肝癌早期诊断的一种新技术而被临床医生所应用，便于临床医生对病人做出及时有效的个体化治疗，征服肝癌不再是梦想。附图的简要说明

图 1显示以 hsa-miR-122a、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-92a、 hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR-150 , hsa-miR-125b、 hsa-miR-lOa 13个 microRNAs 作为 markers时对健康对照者（A )和病毒清除者（B )进行聚类分析的结果。

图 2显示以 hsa-miR-122a、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-92a、 hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR-150 , hsa-miR-125b、 hsa-miR- 10a 13个 microRNAs 作为 markers时对无症状 HBV携带者（C ) 和慢性乙肝患者（D ) 进行聚类分析的结果。

图 3显示以 hsa-miR-122a、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-92a、 hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 150, hsa-miR- 125b, hsa-miR- 10a 13个 microRNAs 作为 markers时对健康对照者（ A )、病毒清除者（ B )、慢性丙肝患者（ HCV)、无症状 HBV感染者（C) 和慢性乙肝患者（D) 进行聚类分析的结果。

图 4显示以 hsa-miR-122a、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-92a、 hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 150, hsa-miR- 125b, hsa-miR- 10a 13个 microRNAs 作为 markers时对正常对照组（N) 、慢性丙肝病人组（HCV)和 HBV组 ( HBV ) 进行聚类分析的结果。

图 5显示正常对照组和 HBV组之间的 ROC曲线，。

图 6显示正常对照组和 HCV组之间的 ROC曲线。

图 7显示以 has-miR-375、 has-miR-92a、 has-miR-10a、 has- miR-223、 has-miR-423-5 和 has-miR-99a 6个 microRNAs作为 markers时对正常对照组（N) 、慢性丙肝病人组（HCV) 和 HBV组（HBV) 进行聚类分析的结果。

图 8显示正常对照组和 HBV-HCC组之间的 ROC曲线。

图 9显示 HBV组和 HBV-HCC组之间的 ROC曲线。

图 10显示以 has-miR-23b、 has-miR-423-5p、 has-miR-375, has- miR-23a、 has-miR-342-3p、 has-miR-10a、 has-miR-125b和 has-miR-92a 8 个 microRNAs作为 markers时对正常对照组（ N )、肝癌病人组（ HBV-HCC ) 和 HBV组（HBV) 进行聚类分析的结果。实施发明的最佳方式

实施例 1 样品的搜集和样品资料的整理

本发明人于 2007年 9月到 2008年 7月间从南京医科大学第一附属医院和南京市传染病医院搜集了大量的血清样品，通过对样品资料的整理，本发明人从中选择了 80例健康对照者（平均年龄： 37.52± 12.09, 年龄跨度： 20-75, 男性： 37, 女性： 43 ) 、 80 例病毒清除者（平均年龄： 37.2 ±9.85, 年龄跨度： 25-52, 男性： 48, 女性： 32) 、 55例长期无症状 HBV 感染者（平均年龄： 35.80 ± 11.40, 年龄跨度： 21-67, 男性： 33, 女性： 22) 、 80例慢性乙肝病人（平均年龄： 36.22± 12.18, 年龄跨度： 20-86, 男性： 55, 女性： 25) 、 65例 HBV相关的 HCC患者（平均年龄： 53.43 ±9.10, 年龄跨度： 40-83, 男性： 59, 女性： 6 )和 48例慢性丙肝患者（平均年龄： 35.96 ± 7.15 , 年龄跨度： 24-58, 男性： 39, 女性： 9 )作为 Solexa 测序和后续一系列 q-PCR验证的实验样品。具体的样品归类标准如下： Group A: 健康对照组（n=80 )

1.乙肝表面抗体、乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阴性

2.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

3.ALT<40IU/L,AST<45IU/L

4.没有其它系统性疾病

5.年龄 > 20

Group B: 病毒清除者（n=80 )

1.乙肝表面抗原阴性和 /或 HBV-DNA阴性，乙肝表面抗体和乙肝核心抗体阳性并且没有疫苗注射历史

2.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

3.ALT<40IU/L,AST<45IU/L

4.没有其它系统性疾病

5.年龄 > 20

Group N: 对照组（ n=60 ) Group A和 Group B的整合

Group C: 持续性无症状 HBV感染者（ n=55 )

1.乙肝表面抗原和核心抗体阳性

2.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

3. ALT<40IU/L,AST<45IU/L

4.没有肝炎临床症状

5.没有肝硬化临床迹象

6.没有其它系统性疾病

7.年龄 > 20

Group D: 慢性乙肝患者（n=80 )

1.乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性至少 6个月

2.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

3. ALT和 /或 AST水平高于正常值的两倍

4.没有肝硬化临床迹象

5.没有其它系统性疾病

6.年龄 > 20

Group HBV: HBV组（ n=135 ) Group C和 Group D的整合

Group HBV-HCC: HBV相关的肝细胞癌（ n=65 ) 1 ·乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性

2.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

3.组织切片检查确诊为肝细胞癌

4.年龄 > 40

Group HCV: 慢性丙肝患者（ n=48 )

1.丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阳性

2.乙肝表面抗原阴性

3. ALT和 /或 AST水平高于正常值的两倍

4.没有肝硬化临床迹象

5.没有其它系统性疾病

6.年龄 > 20 实施例 2 血清 /血浆中微小核糖核酸的 Solexa测序实验

使用 Solexa测序技术发现并证明 30个健康对照者和 30个慢性乙肝患者血清 /血浆中稳定存在 88种差异表达的微小核糖核酸。具体步骤为： ( 1 ) 收集健康对照者和慢性乙肝病人的血清 /血浆

( 2 )分别取 80-100ml的血清，加入等体积的 Trizol Reagent

( 3 )相分离

室温放置 15min, 然后按 0.2ml了氯仿 mi Trizol Reagent的体积比加入氯仿，教育列震荡 15s, 室温 15min, 12,000g, 4°C ,离心 15min

( 4 )将水相转移到新的 50ml的离心管， 3步苯酚 /氯仿除去蛋白相

( 5 ) RNA沉淀

将水相转移到新的离心管中 ,按 0.5ml异丙醇 /lml Trizol Reagent体积加入异丙醇， -20 °C保存 60min, 12,000g, 4 °C ,离心 60min ( 6 )用 1 ml Trizol重悬沉淀，将悬液转移到新的 1.5ml的离心管中

( 7 )重复 2, 4步（第四步离心改为 15min )

( 9 ) RNA洗涤

去掉上清，加入 75%乙醇， 12,000g, 4°C离心 5min

( 10 ) 测量浓度

通常能得到 5〜10 μg RNA/ 50-100 ml血清

( 11 ) 总 RNA进行 PAGE电泳回收 17-27nt RNA分子

( 12 )将 adaptor prime酶联在小 RNA分子的 3'与 5'端

( 13 )进行 RT-PCR反应后并进行测序 ( 14 )数据分析与处理

具体实验结果见表 1。根据表中的 Solexa结果，我们选择在慢性乙肝病人中的拷贝数是健康对照者中拷贝数的 20倍的 microRNAs作为本发明中初步筛查的血清 markers,并且这些 microRNAs在慢性乙肝病人中的拷贝数都大于 50拷贝，由于技术操作问题，我们舍弃了 miR-221 和 miR-629 (表 1中下划线标记）。通过筛选，选择了 hsa-miR- 122a、 hsa-miR-423-5p、 hsa-miR-92a、 hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 150, hsa-miR- 125b, hsa-miR- 10a 13个 microRNAs (表 1中斜体标记）作为初步筛查的 markers, 并设计逆转录和 q-PCR的引物（见表 2 ) 。

表 1 健康对照者和慢性乙肝病人血清 Solexa测序结果

ϋ3/: O 8επο1£soiAV

hsa-mi -10a-F ACACTCCAGCTGGGTACCCTGTAGATCCGAA

hsa-mir-122a-F ACACTCCAGCTGGGTGGAGTGTGACAATGG

hsa-mi -125b-F ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTAAC

hsa-mir-150-F ACACTCCAGCTGGGTCTCCCAACCCTTGTA

hsa-mi -223-F ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT

hsa-mi -23a-F ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGG

hsa-mi -23b-F ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGG

hsa-mi -342-3p-F ACACTCCAGCTGGGTCTCACACAGAAATCGC

hsa-mi -423-5p-F ACACTCCAGCTGGGTGAGGGGCAGAGAGCGA

hsa-mi -92a-F ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCG

hsa-mi -99a-F ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATCCGAT

hsa-mi -375-F ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTCGGCTC 实施例 3 包括 Solexa样品在内的血清中小核糖核酸的 real-time PCR实验

用表 2的引物对 30例健康对照者（Solexa测序样品）、 30例病毒清除者、 30例无症状 HBV感染者、 30例慢性乙肝患者（Solexa测序样品）和 30例慢性丙肝患者的血清进行微小核糖核酸的 qRT-PCR检验。

( 1 )制备 cDNA样品： a )取 500ul血清； b )加等体积的水饱和酚，振荡混匀， 4 °C , 13200rpm离心 3分钟，取上清； c )上清 + 1/2体积（ 250ul ) 酚 + 1/2体积（ 250ul )氯仿，振荡混匀， 4 °C , 13200rpm离心 3分钟，取上清； d )加与上清等体积的氯仿震荡混勾， 4 °C , 13200rpm离心 3分钟，取上清作为 RNA样品； e ) 然后通过 RNA逆转录反应得到 cDNA。逆转录的反应体系包括 4μ1 5 AMV buffer, 2μ1 lOmM each dNTP mixture ( Takara公司）、 0.5μ1 RNase Inhibitor ( Takara公司）、 2μ1 AMV ( Takara 公司）以及 1.5μ1基因特异性反向引物混和物。反应步骤为 16°C孵育 15 分钟， 42°C反应 1小时， 85°C孵育 5分钟；

( 2 ) q-PCR:将 cDNA按 1/5稀释，取 Ιμΐ稀译后的 cDNA,加入 0.3μ1 Taq酶（ Takara公司）， Ιμΐ 20xEVA GREEN, 0.2μ1 10μΜ正向引物， 0.2μ1 10μΜ 通用反向引物， 1.2 l 25mM MgCl₂, 1.6μ1 2.5mM each dNTP mixture ( Takara公司） , 2μ1 lOxPCR buffer, 13.5μ1Η₂0, 20μ1体系进行 q-PCR。仪器使用的是 ABI Prism 7300荧光定量 PCR仪， PCR的反应条件是： 95 °C、 5分钟进行 1个循环→ 95 °C、 15秒， 60°C、 1分钟进行 40个循环。两组样品血清 microRNA的表达量比值可用方程 2—^AG表示，其中 AG=C_T groupi -C_{T g}rou_P2 o 对数据结果用 Cluster 3.0进行聚类分析，从结果分析得出，健康对照者和病毒清除者之间无明显区别， HBV携带者和慢性乙肝病人之间也无明显区别。以 hsa-miR-122a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、 hsa-miR-23a、 hsa-miR-23b、 hsa-miR-223、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 150、 hsa-miR- 125b、 hsa-miR- 10a 13个 microRNAs 作为 markers对数据结果用 Cluster 3.0进行聚类分析，结果见图 1、 2、 3。图 1是 30例健康对照者（A ) 和 30例病毒清除者（B ) 聚类分析的结果，图 2是 30例无症状 HBV携带者者（ C )和 30例慢性乙肝患者（ D ) 聚类分析的结果，图 3是 30例健康对照者（A ) 、 30例病毒清除者（B ) 、 30 例慢性丙肝患者（HCV ) 、 30例无症状 HBV携带者者（C )和 30例慢性乙肝患者（D ) 的聚类分析的结果。从图 1 可以看出健康对照者（A ) 和病毒清除者（B ) 聚类分不开，从图 2可以看出 HBV携带者（C )和慢性乙肝患者（D ) 聚类也分不开，从图 3 中可以看出健康对照者（A ) 和病毒清除者（B ) 、 HBV携带者（C )和慢性乙肝患者（D )都能和慢性丙肝患者（HCV ) 分开，因此将健康对照者（A ) 和病毒清除者（B ) 整合为对照组（Group N ) , 将 HBV携带者（C ) 和慢性乙肝患者（D ) 整合为 HBV组 ( Group HBV ) 。实施例 4 样品重新整合并扩大样品量后血清中微小核糖核酸的 real-time PCR实验

用表 2的引物对 100例对照组（ 50例健康对照者和 50例病毒清除者）、

75例 HBV组 ( 25例 HBV携带者和 50例慢性乙肝患者）和 18例慢性丙肝患者的血清进行微小核糖核酸的 qRT-PCR检验。实验方法、 qRT-PCR 结果处理方法和聚类方法与实施例 3相同。

qRT-PCR结果进一步证明健康对照者和病毒清除者之间、 HBV携带者和慢性乙肝病人之间确实无明显区别。以 hsa-miR- 122a、 hsa-miR-423 -5p、 hsa-miR-92a 、 hsa-let-7c 、 hsa-miR-23a 、 hsa-miR-23b 、 hsa-miR-223 、 hsa-miR-342-3p、 hsa-miR-375、 hsa-miR-99a、 hsa-miR- 150、 hsa-miR- 125b、 hsa-miR- 10a 13个 microRNAs作为 markers对数据结果用 Cluster 3.0进行聚类分析，聚类结果见图 4。从图 4中可以看出，实验所用的 193例血清样品可以被明显地分为 3组：对照组（ N ) 、曼性丙肝病人组（ HCV )和 HBV 组 ( HBV ) 。

为了评估这 13个 microRNAs在 HBV疾病早期诊断中的诊断能力，本发明人又对对照组、 HBV组、 HCV组和 HBV-HCC组样品的 real-time PCR 结果进行风险评分，以每个 microRNA表达量的 5%或 95 %的参考区间为风 P佥值，通过绘制 ROC 曲线来评估预测的灵敏性和特异性。 ROC分析结果见表 3、 4、 5和图 5、 6。

表 3显示， miR-375 , miR-10a、 miR-223 ( miR-122a或 miR-342-3p ) 、 miR-423以 100%的 AUC ( ROC曲线下面积 )将对照组和 HBV组分开，表 4显示 miR-92a和 miR-423-5p以 99.6%的 AUC将对照组和 HCV组分开，而表 5显示 miR-375和 miR-92a将 HBV组和 HCV组分开。当用 miR-375、 miR-10a、 miR-223和 miR-423-5p 4个 markers来区分对照组和 HBV组时， AUC为 99.9 + 0.1%,灵敏度为 99.3%,特异性为 98.8%(图 5 )。当用 miR-92a、 miR-423 -5p 2个 markers来区分对照组和 HCV组时， AUC为 99.6士 0.4%, 灵敏度为 97.9%, 特异性为 99.4% (图 6 ) 。

表 3 区分对照组和 HBV组的单个或多个 microRNAs的 AUCs

表 4 区分对照组和 HCV组的单个或多个 microRNAs的 AUCs

表 5 区分 HBV和 HCV组的单个或多个 microRNAs的 AUCs 在上述结果的基础上对 miR-375、 miR-92a、 miR-10a、 miR-223、 miR-423-5 和 miR-99a 6个 markers进行聚类分析，聚类分析结果见图 7。图 7显示，当用 miR-375、 miR-92a、 miR-10a、 miR-223、 miR-423-5 和 miR-99a 6个 markers时，本发明人就能将对照组、 HBV组和 HCV组 3个组区分开来， 160个对照组只有 2个、 135个 HBV组中只有 1个被错误的归类，而 HCV组中没有一个被错误归类实施例 5 HBV 相关的肝癌病人血清中微小核糖核酸的 real-time PCR实

用表 2的引物对 65例 HBV相关的肝癌病人的血清进行微小核糖核酸的 qRT-PCR检验。实验方法、 qRT-PCR结果处理方法和聚类方法与实施例 3、 4相同。

为了评估这 13个 microRNAs在肝癌早期诊断中的诊断能力，本发明人对对照组、 HBV组、 HCV组和 HBV-HCC组样品的 real-time PCR结果也进行风险评分，以每个 microRNA表达量的 5%或 95 %的参考区间为风险值，通过绘制 ROC 曲线来评估预测的灵敏性和特异性。 ROC分析结果见表 6、 7和图 8、 9。

表 6显示， miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a和 miR-342-3p 以 99.9%的 AUC将对照组和 HCC组分开，表 Ί显示 miR-10a和 miR-92a 将 HBV组和 HCC组分开。当用 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a 和 miR-342-3p 5个 markers来区分对照组和 HBV-HCC组时， AUC为 99.9% ± 0.1%, 灵敏度为 96.9%, 特异性为 99.4% (图 8 ) , 而当用 miR-10a和 miR-125b区分 HBV组和 HBV-HCC组时， AUC为 99.2%,灵敏度为 98.5%, 特异性为 98.5% (图 9 ) 。

在上述结果的基础上对 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a、 miR-342-3p、 miR-10a、 miR-125b和 miR-92a 8个 markers进行聚类分析，聚类分析结果见图 10。图 10显示，当用 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a、 miR-342-3p、 miR-10a、 miR-125b和 miR-92a 8个 markers时，本发明人就能将 HBV-HCC、 HBV和对照组 3个组分开， 160个对照组中只有 4个、 135个 HBV组中只有 2个被错误归类，而 HBV-HCC组中没有一个被错误归类。

表 6 区分对照组和 HBV肝癌组的单个或多个 microRNAs的 AUCs

表 7 区分 HBV和 HBV肝癌组的单个或多个 microRNAs的 AUCs

实施例 6 用于 HBV相关的肝癌和 HBV感染早期诊断的微小核糖核酸试剂盒的制作

微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于 solexa测序技术、 real-time PCR技术和生物芯片技术。

首先通过测序的方和 real-time PCR方法确定正常人和曼性乙肝病人血清 /血浆中有一个以上拷贝的微小核糖核酸。然后通过定量 PCR技术和生物芯片技术筛选在 HBV相关的肝癌、 HBV感染相关其它疾病及正常生理状态下表达量和差异程度大的一类血清 /血浆微小核糖核酸，作为预测是否发生 HB V相关的肝癌和 HB V感染以及诊断病变程度的指标。最后筛选出的对应 HBV相关的肝癌和 HBV感染的血清 /血浆微小核糖核酸的数量控制在几条至十几条，这是在芯片探针库的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清 /血浆微小核糖核酸引物， Taq酶、 dNTP等试剂，其中微小核糖核酸的引物包括 has-miR-375、 has-miR-92a、 has-miR-10a、 has-miR-223、 has-miR-423-5p、 has-miR-23b、 has-miR-23a、 has-miR-342-3p、 has-miR-99a和 has-miR-125b的引物。此试剂盒的价值在于只需要血清 /血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的探针库检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测 HBV肝癌发生的可能性或诊断 HBV肝癌的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加在早期发现 HBV肝癌和 HBV感染的可能，帮助指导诊断和治疗。

Claims

权利要求

1. 一种和正常人相比、慢性乙肝患者血清 /血浆中差异表达的微小核糖核酸的组合，具体包含 let-7c、 miR-l、 miR-10a、 miR-122、 miR-125b、 miR-128a、 miR-128b、 miR-150, miR-197、 miR-221 , miR-222, miR-223、 miR-23a、 miR-23b、 miR-27a、 miR-27b、 miR-30a、 miR-342-3p、 miR-361-5p、 miR-423-5p、 miR-532-5p、 miR-574-3p、 miR-629、 miR-92a、 miR-92b、 miR-99a、 miR-139-5p、 miR-193a-5p、 miR-193b、 miR-365、 miR-375、 miR-455-3p、 miR-483-3p、 miR-483-5p、 miR-486-3p、 miR-885-5p、 miR-99b、 let-7f、 let-7g、 let-7i、 miR-101、 miR-103、 miR-106a、 miR-106b、 miR-107, miR-126、 miR-130a、 miR-130b、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-144、 miR-146a、 miR-146b-5p、 miR-148b、 miR-151-5p、 miR-15a、 miR-16、 miR-17、 miR-182、 miR-183、 miR-185、 miR-186、 miR-18a、 miR-191、 miR-19b、 miR-20a、 miR-20b、 miR-21、 miR-210 , miR-26a、 miR-26b、 miR-29c、 miR-30e、 miR-340, miR-362-5p、 miR-363 , miR-374a、 miR-378, miR-424、 miR-451、 miR-454、 miR-532-5p、 miR-652, miR-660、 miR-7、 miR-923、 miR-93、 miR-96和 miR-98。

2. 根据权利要求 1所述的正常人，其特征在于，

( 1 ) 乙肝表面抗体、乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阴性

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT<40IU/L,AST<45IU/L

( 4 ) 没有其它系统性疾病

( 5 )年龄≥20。

3. 根据权利要求 1所述的慢性乙肝患者，其特征在于，

( 1 ) 乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性至少 6个月

( 2 ) 丙肝抗体和 /或丙肝 RNA阴性

( 3 ) ALT和 /或 AST水平高于正常值的两倍

( 4 ) 没有肝硬化临床迹象

( 5 ) 没有其它系统性疾病

( 6 )年龄≥20。

4. 根据权利要求 1所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，慢性乙肝患者血清 /血浆中存在高于正常人 20 倍差异表达的微小核糖核酸的组合合，，具具体体包包含含 mmiiRR--112222aa、、 mmiiRR--442233、、 mmiiRR--9922aa、、 lleett--77cc、、 mmiiRR--2233aa、、 mmiiRR--2233bb、、 mmiiRR--222233、、 mmiiRR--334422--33pp、、 mmiiRR--337755,, mmiiRR--9999aa、、 mmiiRR--115500,, mmiiRR--112255bb、、 mmiiRR--1100aa。。

55.. 根根据据权权利利要要求求 44所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸的的组组合合，，其其特特征征在在于于，，所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸组组合合不不能能区区分分正正常常人人和和病病毒毒清清除除者者。。

55 66.. 根根据据权权利利要要求求 55所所述述的的病病毒毒清清除除者者，，其其特特征征在在于于，，

(( 11 )) 乙乙肝肝表表面面抗抗原原阴阴性性和和 //或或 HHBBVV--DDNNAA阴阴性性，，乙乙肝肝表表面面抗抗体体和和乙乙肝肝核核心心抗抗体体阳阳性性并并且且没没有有疫疫苗苗注注射射历历史史

(( 22 )) 丙丙肝肝抗抗体体和和 //或或丙丙肝肝 RRNNAA阴阴性性

(( 33 )) AALLTT<<4400IIUU//LL,,AASSTT<<4455IIUU//LL

1100 (( 44 )) 没没有有其其它它系系统统性性疾疾病病

(( 55 ))年年龄龄≥≥2200。。

77.. 根根据据权权利利要要求求 44所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸的的组组合合，，其其特特征征在在于于，，所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸组组合合不不能能区区分分慢慢性性乙乙肝肝患患者者和和 HHBBVV携携带带者者。。

88.. 根根据据权权利利要要求求 77所所述述的的 HHBBVV携携带带者者，，其其特特征征在在于于，，

1155 (( 11 )) 乙乙肝肝表表面面抗抗原原和和核核心心抗抗体体阳阳性性

(( 22 )) 丙丙肝肝抗抗体体和和 //或或丙丙肝肝 RRNNAA阴阴性性

(( 33 )) AALLTT<<4400IIUU//LL,,AASSTT<<4455IIUU//LL

(( 44 )) 没没有有肝肝炎炎临临床床症症状状

(( 55 )) 没没有有肝肝硬硬化化临临床床迹迹象象

2200 (( 66 )) 没没有有其其它它系系统统性性疾疾病病

(( 77 ))年年龄龄≥≥2200。。

99.. 根根据据权权利利要要求求 44所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸的的组组合合，，其其特特征征在在于于，，所所述述的的微微小小核核糖糖核核酸酸组组合合可可以以将将对对照照组组、、慢慢性性丙丙肝肝患患者者和和 HHBBVV组组分分开开。。

1100.. 根根据据权权利利要要求求 99所所述述的的对对照照组组，，其其特特征征在在于于，，由由权权利利要要求求 22所所述述 2255 的的正正常常人人和和权权利利要要求求 66所所述述的的病病毒毒清清除除者者构构成成。。

1111.. 根根据据权权利利要要求求 99所所述述的的慢慢性性丙丙肝肝患患者者，，其其特特征征在在于于，，

(( 11 )) 丙丙肝肝抗抗体体和和 //或或丙丙肝肝 RRNNAA阳阳性性

(( 22 )) 乙乙肝肝表表面面抗抗原原阴阴性性

(( 33 )) AALLTT和和 //或或 AASSTT水水平平高高于于正正常常值值的的两两倍倍

3300 * ( 5 ) 没有其它系统性疾病

( 6 )年龄≥20。

12. 根据权利要求 9所述的 HBV组，其特征在于，由权利要求 3所述的慢性乙肝患者和权利要求 8所述的 HBV携带者构成。 13. 根据权利要求 4所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的小核糖核酸组合中存在将对照组和 HBV组区分开的小核糖核酸，具体包含 miR-375、 miR-10a、 miR-223和 miR-423-5p。

14. 根据权利要求 4所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的小核糖核酸组合中存在将对照组和 HCV组区分开的小核糖核酸，具体包含 miR-92a和 miR-423-5p。

15. 根据权利要求 4所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的微小核糖核酸组合中存在将对照组和 HBV-HCC组区分开的微小核糖核酸，具体包含 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a和 miR-342-3p。

16. 根据权利要求 2所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的微 d、核糖核酸组合中存在将 HBV组和 HBV-HCC组区分开的微 d、核糖核酸，具体包含 miR- 10a和 miR- 125b。

17. 根据权利要求 4、 9、 13、 14所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的微小核糖核酸组合中存在将对照组、 HBV组和 HCV组区分开的微小核糖核酸，具体包含 miR-375、 miR-92a、 miR- 10a, miR-223、 miR-423-5 和 miR-99a。

18. 根据权利要求 4、 9、 13、 15、 16所述的微小核糖核酸的组合，其特征在于，所述的微小核糖核酸组合中存在将对照组、 HBV组和 HBV-HCC 组区分开的微小核糖核酸，具体包含 miR-23b、 miR-423-5p、 miR-375 , miR-23a、 miR-342-3p、 miR- 10a, miR- 125b、 miR-92a„ 19. 根据权利要求 4至 18所述的微小核糖核酸，其特征在于，所述的小核糖核酸包含各小核糖核酸所在的小核糖核酸家族，具体包含 miR- 122a , miR-423、 miR-92a、 let-7c、 miR-23a、 miR-23b、 miR-223、 miR-342-3p、 miR-375, miR-99a、 miR- 150, miR- 125b, miR-lOa的家族。

20. 根据权利要求 4至 19所述的微小核糖核酸组合制备的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含 has-miR-375、 has-miR-92a、 has-miR-10a、 has-miR-223、 has-miR-423-5p、 has-miR-23b、 has-miR-23a、 has-miR-342-3p, has-miR-99a和 has-miR-I b的引物以及 Taq酶、 dNTP 等试剂。 21. 根据权利要求 20所述的微小核糖核酸试剂盒的制备方法，其特征是由以下几个步骤构成：

( 1 )通过 Solexa测序法初步确定正常人和慢性乙肝患者血清 /血浆中存在差异表达的微小核糖核酸

( 2 )根据测序的结果再进行实时定量 PCR方法进一步确定正常人、 HBV感染者和 HBV肝癌病人血清 /血浆中存在差异表达的微小核糖核酸

( 3 )根据 PCR结果，最终确定可以作为区别正常人、 HBV感染者和 HBV肝癌病人的标志 microRNA

( 4 )设计试剂盒，试剂盒由标志 microRNA 的引物、实时定量 PCR 试剂构成。

22. 根据权利要求 20和 21所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可用于 HBV相关的肝癌和 HBV感染的早期诊断和动态监测，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时釆取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度地长期抑制或消除 HBV, 减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延緩和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、原发性肝细胞癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。