CN104740634A - miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用 - Google Patents
miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104740634A CN104740634A CN201510121530.6A CN201510121530A CN104740634A CN 104740634 A CN104740634 A CN 104740634A CN 201510121530 A CN201510121530 A CN 201510121530A CN 104740634 A CN104740634 A CN 104740634A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- cell
- virus
- viral infection
- inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,本发明提供了miR-93的新的医药用途,具体是指miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用;本发明还提供了miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用。本发明经实验证明,miR-93抑制后在不影响I型干扰素分泌的情况下,可以显著增加IFN-I响应细胞对于干扰素的敏感性,增强干扰素诱导基因的表达,从而发挥抗病毒感染的作用。本发明为抗病毒感染治疗提供了新的临床手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地讲,miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用。
背景技术
病毒感染是威胁人类健康的重要危险因素之一,病毒感染机体后会寄生于宿主并大量复制,在此过程中与免疫系统抗衡并通过各种方式麻痹宿主的免疫系统,威胁人类健康。天然免疫应答是机体对抗病毒入侵的第一道防线,同时是一个在进化中保守的体系。固有免疫细胞如何识别病原体并调控随后发生的免疫反应是天然免疫研究的一个重要方面。研究发现,多种模式识别受体(PRRs)表达与固有免疫细胞表面,用以识别病原体的特定结构组分,进而启动细胞内的信号转导通路,诱导细胞因子与趋化因子的表达,发挥抗感染作用,从而阻止病原体从感染细胞向邻近的未感染细胞扩散。
天然免疫应答中I型干扰素的合成、分泌和干扰素介导的免疫效应起着重要的作用。病毒核酸被相关受体所识别后会强烈诱导I型干扰素的产生。I型干扰素会被可与细胞膜上的I型干扰素受体IFNAR1/2结合,引发级联性的信号放大过程,将信号最后传递到细胞核内,对一系列干扰素刺激基因(ISG)的表达进行调控,诱导靶细胞产生特异性抗病毒蛋白,如双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)、2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶等,并引发抗病毒反应,抑制病蛋白的转录或直接降解病毒mRNA。在这一过程中,IFN-I下游信号通路JAK/STAT途径被多种机制反馈调节,从而保证抗病毒反应进行的同时不会对机体造成过度的炎症损伤,已经有数个miRNA被报道参与了这一过程,例如miR-155、miR-146a等。
microRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码小片段RNA,其进化保守,通过与mRNA(messenger RNA)的3’非翻译区(3’untranslationalregion,3’UTR)相互作用从而调控mRNA的翻译,进而广泛作用于发育、肿瘤、炎症等各个生物学过程。
miR-93(miRBase编号:MI0000581),其序列如下所示:CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:1)。到目前为止,miR-93已经有数个靶基因被报道,通过这些报道我们可以看到miR-93的部分功能。目前已经被报道,miR-93可以通过靶向integrin-β8促进血管生成从而促进了肿瘤细胞的生长。LATS2同样是一个miR-93的靶点,miR-93靶向该基因后可以促进肿瘤的血管生成从而促进肿瘤的生长。但是这些目前这些研究都集中在肿瘤学中,并未阐明miR-93在固有免疫中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-93的新的医药用途,具体是指miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用;本发明的另一目的在于提供miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用。
本发明的主要技术方案如下:
本发明人通过调阅GEO数据库中RNA病毒感染巨噬细胞的miRNA表达芯片,发现miR-93在VSV病毒(水疱性口炎病毒)感染巨噬细胞后后发生了显著下调。但是VSV并非一种强致病性RNA病毒,因此我们选用了自1918年来多次全球性爆发的流感病毒作为研究对象,分析了流感病毒感染后小鼠肺部miRNA的表达情况,发现在感染24小时与36小时后,均有microRNA的表达发生了显著变化,在肺部所有富集表达的miRNA中,miR-93在感染24小时与36小时均发生显著下调,且下调最为显著(图1A),其具体下调趋势详见表1。而肺部的免疫屏障由多种细胞构成,包括二型肺泡上皮细胞(AT2)、树突状细胞(DC)、成纤维细胞(LF)、巨噬细胞(MΦ)以及T、B细胞。通过定量PCR分析发现miR-93特异性高表达于AT2细胞(图1B)。体外使用甲流病毒(IAVs)感染小鼠原代AT2细胞(图1C),以及鼠肺泡上皮细胞系MLE-12(图1D)以及人肺泡上皮细胞系A549(图1E),均发现miR-93发生不同程度的下调。以上结果提示在RNA病毒感染后,miR-93在天然免疫细胞中会发生下调。
为了研究采用病毒感染后miR-93下调所产生的生物学效应,我们合成了miR-93的拟似物(mimics)用于体外高表达miR-93以及miR-93抑制物(inhibitor)用于体外降解miR-93。使用polyPlus转染试剂将miR-93mimics或miR-93inhibitor转染巨噬细胞后,使用VSV感染,miR-93后可明显促进表达在细胞中的复制(图2A),同时上清中的病毒量也显著增加(图2B);而抑制剂则可明显抑制病毒的复制(图2C),上清中的病毒量也显著降低(图2D)。而在甲流病毒侵染AT2细胞的实验中,高表达miR-93的AT2细胞中病毒复制显著增强(图2E-F),而miR-93低表达的AT2细胞中流感病毒的复制被显著抑制(图2G-H)。上述结果提示,miR-93低表达有助于细胞抵抗RNA病毒的感染,而过高的miR-93水平在抗病毒反应中是不利的。
进一步研究miR-93的表达通过何种机制影响了病毒在细胞内的复制。在流感病毒感染后,病毒RNA被模式识别受体所识别,并激活入核信号MAPK、NF-KB以及IRF3引起细胞因子的表达。因此首先我们考虑到miR-93是否会影响到细胞因子的表达。在AT2细胞转染miR-93mimics以及inhibitor,用流感病毒感染细胞,检测细胞中以及上清中的细胞因子表达。结果都显示,miR-93mimics与inhibitor对于VSV诱导的IFN-β、IL-6、IL-8的产量不发生影响(图3A-C),检测同时IRF3、NF-κB、P38、ERK、JNK的活化,发现miR-93对上述转录因子的活化不产生影响(图3D)程度没有发生变化。于是我们着重探究I型干扰素下游信号的变化。Western结果显示miR-93高表达后STAT1的磷酸化水平被抑制(图3E)。使用IFN-β刺激转染miR-93mimics或者inhibitor的AT2细胞,发现I型干扰素途径的下游基因ISG15、MxA与OAS1与miR-93的表达呈负相关(图3F)。以上结果提示,miR-93是通过抑制了I型干扰素途径的下游信号发挥了促进病毒复制作用,对于干扰素本身的产量没有影响。
进一步我们探讨了miR-93作用的靶分子。通过TargetScan(www.targetscan.org)在线软件分析其作用的靶点,发现JAK1(图4A)、Tnfaip1(TNF-α诱导蛋白,tumor necrosis factor alpha-induced protein 1)、RASD1(糖皮质激素诱导蛋白)、IL25(interleukin 25)、Tnfrsf21(tumor necrosisfactor receptor superfamily,member 21)、Map3k2(mitogen-activated proteinkinase kinase kinase 2)、Irf9(interferon regulatory factor 9)、Tgfbr2(transforminggrowth factor,beta receptor II)等多个靶点;通过构建上述分子的双荧光报告基因表达载体,我们发现miR-93在JAK1的3’UTR区域存在保守的靶位点(图4B)。根据双荧光报告基因的结果我们推测miR-93的作用靶点是JAK1蛋白的翻译。进一步通过qPCR和Western Blot实验证实了miR-93在AT2细胞中高表达后,JAK1蛋白的mRNA与蛋白水平均发生下降(图4C-D),提示miR-93可以靶向JAK1的3’UTR区域发挥作用。
综上所述,机体在RNA病毒感染时可通过下调miR-93促进JAK1分子的表达,更有利于I型干扰素发挥抗病毒效应,因此利用miR-93抑制剂开发出的核酸药物有望通过调控干扰素信号通路帮助机体抵抗病毒感染,具有重要潜在临床应用价值。
本发明的第一方面,提供了miR-93的新的医药用途,具体是指miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用;所述的miR-93的序列如SEQ ID NO:1所示。
miR-93在哺乳动物中高度保守,序列为CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:1)。
本发明所述的抗病毒感染,是指预防或治疗病毒感染,所述的病毒包括但不限于:甲型流感病毒(IAV)、水疱性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、仙台病毒(Sev)、鼻病毒(RhV)等。
本发明的miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用,所述的药物能够抑制或下调miR-93的表达量。
本发明的第二方面,提供了miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用。
本发明所述的抗病毒感染,是指预防或治疗病毒感染,所述的病毒包括但不限于:甲型流感病毒(IAV)、水疱性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、仙台病毒(Sev)、鼻病毒(RhV)等。
所述的miR-93抑制剂是包括但不限于:特异性结合miR-93的蛋白,特异性干扰miR-93基因表达、加工的小干扰分子,如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等。
所述的miR-93抑制剂选自特异性干扰miR-93基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸。
在本发明的一个优选实施例中,所述的miR-93抑制剂为Antogmir-93(市售的,购自广州锐博公司,用接胆固醇运输,甲基化修改)。
进一步地,本发明提供了miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,所述的应用是指miR-93抑制剂和I型干扰素联用。
本发明中,所述的药物或者是以miR-93或miR-93抑制剂为唯一活性成份,或者是含有miR-93或miR-93抑制剂的药物组合物。
所述的药物组合物含有有效量的所述的miR-93或其抑制剂,以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即有合理的效益/风险比的物质。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
任何适用的给药途径都是可以的,包括但不限于:口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
本发明的第三方面,提供了miR-93在制备诊断病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。
所述的试剂为检测miR-93有效量的试剂。
所述的试剂盒包含检测miR-93有效量的试剂。
本发明提供了miR-93、含有miR-93拮抗序列的miR-93体内抑制剂antagomiR-93具有帮助生物体抵抗RNA病毒感染的应用。
本发明经实验证明,miR-93抑制后在不影响I型干扰素分泌的情况下,可以显著增加IFN-I响应细胞对于干扰素的敏感性,增强干扰素诱导基因的表达,从而发挥抗病毒感染的作用。
本发明为抗病毒感染治疗提供了新的临床手段。
附图说明
图1为流感感染后,miR-93在二型肺泡上皮中出现显著下调:其中A为小鼠感染甲流病毒前后miRNA表达谱热力图;B为miR-93在小鼠T细胞、B细胞、二型肺上皮细胞(AT2)、树突状细胞(DC)、肺成纤维细胞(LF)、巨噬细胞(MΦ)中的表达情况;C为小鼠原代AT2细胞在不同时间点感染IAV后,miR-93的表达情况;D为小鼠原代AT2细胞经过不同浓度IAV感染后,miR-93的表达情况;E为小鼠肺上皮细胞系MLE-12在不同时间点感染IAV后,miR-93的表达情况;F为小鼠肺上皮细胞系MLE-12经过不同浓度IAV感染后,miR-93的表达情况;G为人肺上皮细胞系A549在不同时间点感染IAV后,miR-93的表达情况;H为人肺上皮细胞系A549经过不同浓度IAV感染后,miR-93的表达情况。
图2为miR-93对VSV在巨噬细胞中复制以及IAV在AT2细胞中复制的影响:其中A为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制情况;B为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制情况;C为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中的复制情况;D为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中的复制情况;E为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞内的复制情况;F为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞内的复制情况;G为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中的复制情况;H为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中的复制情况。
图3为miR-93靶向于I型干扰素产生而不影响病毒感染后的细胞因子产生:其中A为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IFN-β的RNA表达量;B为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IFN-β的RNA表达量;C为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IFN-β的产量;D为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IFN-β的产量;E为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IFN-β的RNA表达量;F为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IFN-β的RNA表达量;G为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IFN-β的产量;H为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IFN-β的产量;I为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IL-8的RNA表达量;J为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞中IL-8的RNA表达量;K为miR-93在AT2细胞中高表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IL-8的产量;L为miR-93在AT2细胞中低表达后,使用IAV刺激,检测细胞培养上清中IL-8的产量;M为miR-93在AT2细胞中高表达或低表达后,抽提总蛋白Western-Blot检测MAPK、NF-KB以及IRF-3信号途径的活化;N为miR-93在AT2细胞中高表达后,Western-Blot检测JAK/STAT途径的活化;O为miR-93在AT2细胞中高表达或低表达后,IFN-β刺激,检测I型干扰素下游信号ISG15的表达水平;P为miR-93在AT2细胞中高表达或低表达后,IFN-β刺激,检测I型干扰素下游信号MxA的表达水平;Q为miR-93在AT2细胞中高表达或低表达后,IFN-β刺激,检测I型干扰素下游信号OAS1的表达水平。
图4为miR-93靶向于I型干扰素下游信号通路中的JAK1分子:其中A为Targetscan预测miR-93对JAK1的靶向性与保守性;B为双荧光报告系统检测miR-93拟似物与JAK1报告质粒共转293T细胞的荧光读数;C为双荧光报告系统检测miR-93抑制物与JAK1报告质粒共转293T细胞的荧光读数;D为miR-93转染AT2细胞后,JAK1mRNA表达量;E为miR-93转染AT2细胞后,JAK1蛋白质表达量。
图5为miR-93表达对于VSV病毒在巨噬细胞中复制的影响;其中A为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制情况;B为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制情况;C为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中的复制情况;D为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中的复制情况。
图6为miR-93表达对于IAV在AT2细胞中复制的影响:其中A为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞内的复制情况;B为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞内的复制情况;C为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中的复制情况;D为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中的复制情况。
图7为miR-93对VSV病毒感染影响的体内研究:其中A为miR-93体内过表达试剂AgomiR-93小鼠尾静脉注射后,miR-93在各器官中的表达;B为miR-93体内抑制剂AntagomiR-93小鼠尾静脉注射后,miR-93在各器官中的表达;C为AgomiR-93小鼠尾静脉注射后,VSV感染小鼠后,肺部HE染色;D为AntagomiR-93小鼠尾静脉注射后,VSV感染小鼠后,肺部HE染色;E为AgomiR-93或AntagomiR-93小鼠尾静脉注射后,VSV感染小鼠后肝脏与脾脏中VSV病毒的负载量;F为AgomiR-93或AntagomiR-93小鼠尾静脉注射后,小鼠肝脏、脾脏与肺脏中JAK1的表达;G为AgomiR-93或AntagomiR-93小鼠尾静脉注射后感染VSV病毒,外周血中IFN-β的产量。
图8为肺部吸入AntagomiR-93可帮助小鼠抵抗甲流病毒感染:其中A为IAV感染小鼠吸入AgomiR-93后生存曲线;B为IAV感染小鼠吸入AntagomiR-93后生存曲线;C为IAV感染小鼠吸入AgomiR-93后肺部HE染色;D为IAV感染小鼠吸入AntagomiR-93后肺部HE染色;E为IAV感染小鼠吸入AgomiR-93后肺部病毒负荷;F为IAV感染小鼠吸入AntagomiR-93后肺部病毒负荷;G为IAV感染小鼠吸入AgomiR-93或AntagomiR-93后肺部灌洗液中的IFN-β水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另有描述,本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述:例如,Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985);《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑,1984);《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984);《蛋白质纯化:原理和实践》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者,可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1:VSV病毒感染巨噬细胞实验中miR-93对病毒复制的影响。
委托广州市锐博生物科技合成miR-93的拟似物(mimics),序列为CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ ID NO:1)。
miR-93抑制物(inhibitor)为Antogmir-93,购自广州市锐博生物科技。
实验方法:
1、巨噬细胞培养与转染:小鼠腹腔巨噬细胞通过3%巯基乙酸肉汤(购自默克公司)2mL小鼠腹腔注射刺激72h后产生,用1640培养基冲出细胞后,2×105细胞铺入含0.5ml培养基的24孔板中,2h后换液除去杂细胞,培养过夜后次日使用INTERFERin转染试剂(购自Polyplus-transfection公司)并按试剂说明书转染RNA。
2、实时定量RT-PCR:细胞总RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提,总mNRA使用Fast200试剂盒(购自上海飞捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara)并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。miRNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(U6为内参),mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
3、病毒滴度TCID50测定:TCID50为半数细胞培养物感染量,是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后,能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释,即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合,接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4~6孔,每孔100μL,同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。计算按Reed和Muench法:TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。
实验结果:分离小鼠腹腔巨噬细胞转染miR-93mimics或者inhibitor后,将MOI=100的VSV病毒感染细胞1小时后换液,继续培养72小时,检测病毒复制情况。实验结果显示miR-93mimics可以显著增强VSV病毒在巨噬细胞中的复制,而miR-93inhibitor可以抑制VSV的复制(图5)。其中A为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制增强;B为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞内的复制受到抑制;C为miR-93在巨噬细胞中高表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中滴度显著升高;D为miR-93在巨噬细胞中低表达后,VSV病毒RNA在细胞上清中滴度显著下降。
实施例2:甲型流感病毒感染AT2细胞实验中miR-93对病毒复制的影响。
实验方法:
1、小鼠原代II型肺泡上皮细胞培养与转染:实验前将小鼠全身血液放净,取得完全无血液残留的肺脏,通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化。用抗Ⅱ型上皮细胞的单抗进行免疫荧光标记,再用流式细胞仪进行筛选,得到96%的Ⅱ型上皮细胞。2×105细胞铺入含0.5ml培养基的24孔板中,2h后换液除去杂细胞,培养过夜后次日使用INTERFERin转染试剂(购自Polyplus-transfection公司)并按试剂说明书转染RNA。
2、实时定量RT-PCR:细胞总RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提,总mNRA使用Fast200试剂盒(购自上海飞捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara)并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。miRNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(U6为内参),mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
3、病毒滴度TCID50测定:TCID50为半数细胞培养物感染量,是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后,能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释,即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合,接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4~6孔,每孔100μL,同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。计算按Reed和Muench法:TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。
实验结果:分离小鼠原代II型肺泡上皮细胞后转染miR-93mimics或者inhibitor后,将MOI=10的甲流病毒感染细胞1小时后换液,继续培养72小时,检测病毒复制情况。结果显示miR-93mimics可以显著增强IAV在巨噬细胞中的复制,而miR-93inhibitor可以抑制其复制(图6)。其中A为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞内复制增强;B为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞内复制受到抑制;C为miR-93在AT2细胞中高表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中的滴度升高;D为miR-93在AT2细胞中低表达后,IAV病毒RNA在细胞上清中滴度下降。
实施例3:体内注射AntagomiR-93显著抑制VSV病毒在小鼠体内的复制
实验方法:
1、核酸药物AntagomiR-93尾静脉注射进小鼠体内。
2、Western blot检测蛋白表达:取2×106个细胞,3500rpm,离心5分钟,转移至EP管内;向细胞沉淀内加入300μlM-PER蛋白抽提试剂(含有TrionX-100、去氧胆酸钠、NP-40、偏钒酸钠、EDTA等,能有效抑制蛋白酶的活性,保持抽提蛋白的完整性),冰浴放置30分钟,期间每10分钟振荡一次;4℃、12500rpm离心15分钟,将上清转移至干净EP管内,-20℃保存。取少量上清,按照BCA法蛋白浓度检测试剂盒说明书进行蛋白定量。定量后调整各组样品蛋白浓度至一致,向蛋白样品内加入等量6×上样缓冲液(100mmol/LTris-HCl、200mmol/LDTT、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油、PH6.8)并混匀;100℃水浴煮沸5分钟,冷却后上样(30μg蛋白/泳道),同时上样蛋白Marker;用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质;用转膜系统(Bio-Rad)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上;常温下用含5%脱脂奶粉的TBST(Tris-bufferedsaline,pH7.6,containing 0.05%Tween20)封闭2小时;TBST洗脱,两次,每次15分钟;加入1:1000稀释的第一抗体,4℃孵育过夜;TBST洗脱,三次,每次15分钟;加入辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育1小时;TBST洗脱三次,每次15分钟;将WesternBlotting发光检测试剂中的A液和B液等体积混匀,室温孵育5分钟,于凝胶成像分析仪上进行检测。
3、实时定量RT-PCR:细胞总RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提,总mNRA使用Fast200试剂盒(购自上海飞捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBRRT-PCR试剂盒(Takara)并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。miRNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(U6为内参),mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
4、ELISA:取所要包被的物质,提前设计好所需浓度,根据包被孔数计算所需包被物的量,用包被液稀释至所需体积,分加至各孔中。包被结束后弃掉包被液,用PBST进行洗涤,方法为PBST加满每孔,静置5-10min,弃掉洗液,重新加满,重复洗涤3-5次,最后拍干ELISA板等待下一步封闭。封闭用10%小牛血清,取第2步的ELISA板加封闭液至每孔,体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择:直接置于4℃过夜,或者置于37℃温育2-4h,具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。封闭结束的ELISA板进行洗涤,方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。一抗样品一般用包被液稀释,稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h,洗涤。加相应的商品化HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗),一般也用封闭液稀释,稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔,37℃反应1-1.5h。洗涤。常用OPD作为显色底物,但OPD致癌,也有用TMB作为底物,,这里只介绍前者。显色需要配置显色液,具体方法为:在步骤8进行到一半使配置显色液,为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末(实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可),等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀,立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37℃反应约10min。将ELISA板取出,每孔加终止液(2mol/L硫酸溶液)终止反应,立即到酶标仪上读数(OPD为底物是读数波长为490nm,TMB为底物时波长为450nm)。
5、HE染色:二甲苯(Ⅰ)5-10min,二甲苯(Ⅱ)5-10min,95%乙醇(Ⅰ)1-3min,95%乙醇(Ⅱ)1-3min,80%乙醇1min,蒸馏水1min,苏木精液染色5-15min,流水稍洗去苏木精液1-3s,1%盐酸乙醇1-3s,稍水洗10-30s,促蓝液返蓝10-30s,流水冲洗10-15min,蒸馏水过洗1-2s,0.5%曙红液染色1-3min,蒸馏水稍洗1-2s,80%乙醇稍洗1-2s,95%乙醇(Ⅰ)3-5min,95%乙醇(Ⅱ)3-5min,无水乙醇5-10min,无水乙醇5-10min,二甲苯(Ⅰ)3-5min,二甲苯(Ⅱ)2-5min,二甲苯(Ⅲ)3-5min,中性树胶封固,显微镜检测。
实验结果:合成胆固醇修饰的miR-93体内运载试剂Agomir-93(广州市锐博生物科技),以及miR-93抑制剂AntagomiR-93(广州市锐博生物科技),尾静脉注射检测其在各个脏器中的表达。实验结果发现,除脑组织外,小鼠全身主要脏器在注射AgomiR-93后都会高表达miR-93(图7A),而AntagomiR-93则可显著降低miR-93的表达(图7B)。小鼠体内高表达miR-93后感染VSV,检测其肺部损伤状况,组织切片HE染色显示,miR-93高表达后肺中的有核细胞数显著增加,肺泡结构不清,损伤加重(图7C);而miR-93低表达小鼠的肺部损伤则显著降低(图7D)。定量PCR检测肝脏和脾脏中的病毒负荷,发现miR-93高表达后病毒复制增强,而抑制miR-93可以显著抑制病毒复制(图7E)。检测肝脏、脾脏、肺脏中的JAK1蛋白,发现JAK1的表达与miR-93呈现负相关(图7F),而miR-93的表达与血清中IFN-β的量无显著关联性(图7G)。
以上体内实验结果说明机体感染病毒后可通过上述机制下调miR-93表达从而增强I型干扰素下游信号发挥抗病毒效应。
实施例4:肺部吸入AntagomiR-93可以保护超过75%的流感感染小鼠免于死亡
流感病毒是一种负链RNA病毒,有着很高的变异度,因此全球型大规模流感每十年左右就会爆发一次。新型流感病毒通常无法被适应性免疫系统所识别,机体针对新病毒的抗体通常要经过2周以上的时间才能大量产生。在新型流感爆发时,肺部的固有免疫屏障对于机体的保护具有决定性作用。
实验方法:
1、给小鼠感染流感12小时后,肺部吸入AgomiR-93或AntagomiR-93,观察小鼠的生存情况。
2、实时定量RT-PCR:细胞总RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提,总mNRA使用Fast200试剂盒(购自上海飞捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara)并在LightCycler(Roche)实时定量PCR仪上完成。miRNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(U6为内参),mRNA的相对定量使用GAPDH作为内参照。
3、ELISA:取所要包被的物质,提前设计好所需浓度,根据包被孔数计算所需包被物的量,用包被液稀释至所需体积,分加至各孔中。包被结束后弃掉包被液,用PBST进行洗涤,方法为PBST加满每孔,静置5-10min,弃掉洗液,重新加满,重复洗涤3-5次,最后拍干ELISA板等待下一步封闭。封闭用10%小牛血清,取第2步的ELISA板加封闭液至每孔,体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择:直接置于4℃过夜,或者置于37℃温育2-4h,具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。封闭结束的ELISA板进行洗涤,方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。一抗样品一般用包被液稀释,稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h,洗涤。加相应的商品化HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗),一般也用封闭液稀释,稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔,37℃反应1-1.5h。洗涤。常用OPD作为显色底物,但OPD致癌,也有用TMB作为底物,这里只介绍前者。显色需要配置显色液,具体方法为:在步骤8进行到一半使配置显色液,为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末(实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可),等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀,立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37℃反应约10min。将ELISA板取出,每孔加终止液(2mol/L硫酸溶液)终止反应,立即到酶标仪上读数(OPD为底物是读数波长为490nm,TMB为底物时波长为450nm)。
4、HE染色:二甲苯(Ⅰ)5-10min,二甲苯(Ⅱ)5-10min,95%乙醇(Ⅰ)1-3min,95%乙醇(Ⅱ)1-3min,80%乙醇1min,蒸馏水1min,苏木精液染色5-15min,流水稍洗去苏木精液1-3s,1%盐酸乙醇1-3s,稍水洗10-30s,促蓝液返蓝10-30s,流水冲洗10-15min,蒸馏水过洗1-2s,0.5%曙红液染色1-3min,蒸馏水稍洗1-2s,80%乙醇稍洗1-2s,95%乙醇(Ⅰ)3-5min,95%乙醇(Ⅱ)3-5min,无水乙醇5-10min,无水乙醇5-10min,二甲苯(Ⅰ)3-5min,二甲苯(Ⅱ)2-5min,二甲苯(Ⅲ)3-5min,中性树胶封固,显微镜检测。
实验结果:肺部高表达miR-93后,小鼠生存率显著下降;而抑制miR-93的表达可以使超过75%的小鼠免于死亡(图8B)。肺部病理结果显示miR-93有效保护了呼吸系统免于病毒造成的损伤(图8C-D)。检测肺部流感病毒RNA复制情况,发现AntagomiR-93显著抑制了流感病毒在肺部的复制(图8E-F)。同样这种抗病毒作用并不依赖于干扰素水平(图8G)。
表1:RNA病毒感染巨噬细胞的miRNA表达量的变化
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的抗病毒感染是指预防或治疗病毒感染,所述的病毒包括甲型流感病毒、水疱性口炎病毒、呼吸道合胞病毒、仙台病毒、鼻病毒。
3.根据权利要求1或2所述的miR-93在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的药物能够抑制或下调miR-93的表达量。
4.miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的抗病毒感染是指预防或治疗病毒感染,所述的病毒包括甲型流感病毒、水疱性口炎病毒、呼吸道合胞病毒、仙台病毒、鼻病毒。
6.根据权利要求4或5所述的miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的miR-93抑制剂为特异性结合miR-93的蛋白,或特异性干扰miR-93基因表达、加工的小干扰分子。
7.根据权利要求4或5所述的miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的miR-93抑制剂选自特异性干扰miR-93基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸。
8.根据权利要求4或5所述的miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的miR-93抑制剂为Antogmir-93。
9.根据权利要求4或5所述的miR-93抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用,其特征在于,所述的药物为miR-93抑制剂和I型干扰素联用。
10.miR-93在制备诊断病毒感染的试剂或试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510121530.6A CN104740634A (zh) | 2015-03-19 | 2015-03-19 | miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510121530.6A CN104740634A (zh) | 2015-03-19 | 2015-03-19 | miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104740634A true CN104740634A (zh) | 2015-07-01 |
Family
ID=53581247
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510121530.6A Pending CN104740634A (zh) | 2015-03-19 | 2015-03-19 | miR-93及其抑制剂在制备抗病毒感染药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104740634A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110484537A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-22 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用 |
CN112691094A (zh) * | 2019-10-22 | 2021-04-23 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 防治病毒的新型化合物及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101368213A (zh) * | 2008-10-13 | 2009-02-18 | 南京大学 | 血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用 |
CN104053775A (zh) * | 2011-10-17 | 2014-09-17 | 医药匈牙利2000有限公司 | 用于治疗缺血性损伤的化合物 |
-
2015
- 2015-03-19 CN CN201510121530.6A patent/CN104740634A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101368213A (zh) * | 2008-10-13 | 2009-02-18 | 南京大学 | 血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用 |
CN104053775A (zh) * | 2011-10-17 | 2014-09-17 | 医药匈牙利2000有限公司 | 用于治疗缺血性损伤的化合物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
郭猛: "miRNA-93调控I型干扰素通路的作用机制及其体内效应的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
郭猛等: "《第九届全国免疫学学术大会论文集》", 31 October 2014 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110484537A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-22 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用 |
CN112691094A (zh) * | 2019-10-22 | 2021-04-23 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 防治病毒的新型化合物及其应用 |
CN112691094B (zh) * | 2019-10-22 | 2022-09-23 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 防治病毒的新型化合物及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Xu et al. | MiR-221 accentuates IFN׳ s anti-HCV effect by downregulating SOCS1 and SOCS3 | |
Wen et al. | Function of shrimp STAT during WSSV infection | |
WO2016029833A1 (zh) | 甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用 | |
Liu et al. | Xanthohumol inhibits PRRSV proliferation and alleviates oxidative stress induced by PRRSV via the Nrf2–HMOX1 axis | |
Zhang et al. | Downregulation of miR-146a inhibits influenza A virus replication by enhancing the type I interferon response in vitro and in vivo | |
Zhu et al. | MicroRNA-155 downregulation promotes cell cycle arrest and apoptosis in diffuse large B-cell lymphoma | |
Ouyang et al. | gga-miR-9* inhibits IFN production in antiviral innate immunity by targeting interferon regulatory factor 2 to promote IBDV replication | |
Wang et al. | miR-194 inhibits innate antiviral immunity by targeting FGF2 in influenza H1N1 virus infection | |
Coppola et al. | Lowered expression of microRNA-125a-5p in human hepatocellular carcinoma and up-regulation of its oncogenic targets sirtuin-7, matrix metalloproteinase-11, and c-Raf | |
Stenfeldt et al. | Proof-of-concept study: profile of circulating microRNAs in Bovine serum harvested during acute and persistent FMDV infection | |
Yu et al. | Neddylation facilitates the antiviral response in zebrafish | |
Sun et al. | Exosomal miR-181a-5p reduce Mycoplasma gallisepticum (HS strain) infection in chicken by targeting PPM1B and activating the TLR2-mediated MyD88/NF-κB signaling pathway | |
Zhang et al. | p-STAT1 regulates the influenza A virus replication and inflammatory response in vitro and vivo | |
Chen et al. | Gga-miR-19b-3p inhibits newcastle disease virus replication by suppressing inflammatory response via targeting RNF11 and ZMYND11 | |
Yan et al. | microRNA-125a targets MAVS and TRAF6 to modulate interferon signaling and promote HCV infection | |
Hu et al. | Chicken gga-miR-19a Targets ZMYND11 and Plays an Important Role in Host Defense against Mycoplasma gallisepticu m (HS Strain) Infection | |
Zhao et al. | Host microRNA hsa-miR-494-3p promotes EV71 replication by directly targeting PTEN | |
He et al. | MicroRNA-182-3p negatively regulates cytokines expression by targeting TLR5M in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides | |
Zhang et al. | PI3K/AKT/p53 pathway inhibits infectious spleen and kidney necrosis virus infection by regulating autophagy and immune responses | |
Gholizadeh et al. | The role of non-coding RNAs in the diagnosis of different stages (HCC, CHB, OBI) of hepatitis B infection | |
Li et al. | Peste des petits ruminants virus-induced novel microRNA miR-3 contributes to inhibit type I IFN production by targeting IRAK1 | |
Ye et al. | MiR-103a-3p promotes Zika virus replication by targeting OTU Deubiquitinase 4 to activate p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway | |
Chen et al. | Differential microRNA expression in Newcastle disease virus-infected HeLa cells and its role in regulating virus replication | |
Wang et al. | DF-1 cells prevent MG-HS infection through gga-miR-24-3p/RAP1B mediated decreased proliferation and increased apoptosis | |
Chen et al. | gga-miR-1603 and gga-miR-1794 directly target viral L gene and function as a broad-spectrum antiviral factor against NDV replication |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150701 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |