CN110484537A - 一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种miR‑92促进剂及其注射剂的制备方法和应用，属于水产生物技术领域，所述miR‑92促进剂为单链小RNA；所述单链小RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’‑AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC‑3’；所述单链小RNA的3’末端进行胆固醇修饰，3’末端四个碱基CUGC位置分别加入四个硫代骨架进行修饰，5’末端两个碱基AA位置加入两个硫代骨架进行修饰，全链进行2’甲基化修饰。本发明的miR‑92促进剂能够有效增强鱼体内miR‑92的表达，从而抑制其靶基因CaSR的表达；通过精准靶向分子生理干预，可以有效的增强巨噬细胞活性，提高其抗链球菌感染能力。

Description

一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及水产生物技术领域，尤其涉及一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用。
背景技术
链球菌是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，是人类的重要病原之一，也是其他多种脊椎动物包括猪、牛、鱼等的重要病原菌。目前已有多个国家报道了鱼类链球菌病的暴发与流行，受感染的鱼类包括多种海水和淡水鱼类，以温水性鱼类最为严重。近年中国罗非鱼链球菌感染的报道也呈现增加趋势。
巨噬细胞是一种抗原递呈细胞，同时具有很强的吞噬和消化异物抗原的能力，是固有免疫系统的主要效应细胞之一。链球菌感染能在短期内明显刺激巨噬细胞功能呈现活跃状态。因此，如何增强罗非鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性与吞噬活性，增加巨噬细胞吞噬病原菌的能力，从而达到促进罗非鱼健康养殖的目的成为我们当前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用，该miR-92促进剂能够增强罗非鱼巨噬细胞呼吸爆发活性与吞噬活性，增加巨噬细胞吞噬病原菌的能力，从而达到促进罗非鱼健康养殖的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种miR-92促进剂，所述miR-92促进剂为单链小RNA；所述单链小RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC-3’；
所述单链小RNA的3’末端进行胆固醇修饰，3’末端四个碱基CUGC位置分别加入四个硫代骨架进行修饰，5’末端两个碱基AA位置加入两个硫代骨架进行修饰，全链进行2’甲基化修饰。
本发明还提供了一种包含上述方案所述miR-92促进剂的巨噬细胞。
本发明还提供了一种注射剂，包括以下原料：上述方案所述miR-92促进剂和PBS缓冲液；所述miR-92促进剂的质量与PBS缓冲液的体积的比例为20nmol:150μL～300μL。
本发明还提供了上述方案所述注射剂的制备方法，包括以下步骤：
将miR-92促进剂和PBS缓冲液混合，静置后4000～6000rpm离心10～20s，取上清液得到注射剂。
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在增强罗非鱼体内miR-92的表达中的应用。
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在制备增强巨噬细胞活性的药物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在制备预防罗非鱼链球菌感染的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种miR-92促进剂，所述miR-92促进剂为单链小RNA；所述单链小RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC-3’；所述单链小RNA的3’末端进行胆固醇修饰，3’末端四个碱基CUGC位置分别加入四个硫代骨架进行修饰，5’末端两个碱基AA位置加入两个硫代骨架进行修饰，全链进行2’甲基化修饰。本发明的miR-92促进剂能够有效增强鱼体内miR-92的表达，从而抑制其靶基因CaSR的表达；通过精准靶向分子生理干预，可以有效的增强巨噬细胞活性，提高其抗链球菌感染能力。
附图说明
图1为miR-92促进剂的示意图；
图2为实施例1中qRT-PCR分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92的表达情况；
图3为实施例1中qRT-PCR分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织CaSR的表达情况；
图4为实施例1中Northern blot与Western blot分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92的表达情况；
图5为实施例1中Northern blot与Western blot分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织CaSR的表达情况；
图6为实施例1中尾静脉注射miRNA促进剂后吉富罗非鱼头肾组织巨噬细胞的呼吸爆发与吞噬活性；
图7为实施例2中转染不同试剂后吉富罗非鱼头肾巨噬细胞中miR-92表达情况；
图8为PBS组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况；
图9为阴性对照组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况；
图10为促进组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况。
具体实施方式
本发明提供了一种miR-92促进剂，所述miR-92促进剂为单链小RNA；所述单链小RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC-3’；所述单链小RNA能够作为增强内源性microRNA表达的高效促进剂；所述单链小RNA的3’末端进行胆固醇修饰，3’末端四个碱基CUGC位置分别加入四个硫代骨架进行修饰，5’末端两个碱基AA位置加入两个硫代骨架进行修饰，全链进行2’甲基化修饰；所述miR-92促进剂的示意图如图1所示。
本发明中，所述miR-92促进剂是根据microRNA-92成熟体序列设计；所述microRNA-92成熟体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5’-AATTGCACTCGTCCCGGCCTGC-3’。本发明具体实施过程中，所述miR-92促进剂由广州锐博生物科技有限公司合成。
本发明还提供了一种注射剂，包括以下原料：上述方案所述miR-92促进剂和PBS缓冲液；所述miR-92促进剂的质量与PBS缓冲液的体积的比例为20nmol:150μL～300μL，优选为20nmol:200μL～250μL。
本发明还提供了上述方案所述注射剂的制备方法，包括以下步骤：
将miR-92促进剂和PBS缓冲液混合，静置后4000～6000rpm离心10～20s，取上清液得到注射剂；所述混合的方式优选为震荡混合；本发明对所述混合的时间和温度没有特殊限制，以混合均匀为准；所述静置的时间优选为3～7min，更优选为5min；所述静置的温度优选为22～25℃；所述静置的作用是使注射剂与室温达到平衡；所述离心的转速优选为5000rpm；所述离心的时间优选为15s。
本发明还提供了一种包含上述方案所述miR-92促进剂的巨噬细胞；所述miR-92促进剂通过转染导入巨噬细胞；所述转染采用的转染剂优选的包括lipofectamine 2000。本发明所述miRNA激活方法属于精准靶向分子生理干预，可以有效的增强巨噬细胞活性，提高其抗链球菌感染能力
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在增强罗非鱼体内miR-92的表达中的应用。
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在制备增强巨噬细胞活性的药物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述miR-92促进剂在制备预防罗非鱼链球菌感染的药物中的应用。
本发明中，上述方案所述应用的方式优选为罗非鱼尾静脉注射包含miR-92促进剂的注射剂；所述注射的时间优选为链球菌高发季节；所述miR-92促进剂的注射剂量优选为30～100mg/kg，更优选为50～80mg/kg；所述注射采用的注射器优选为0.25ml电子针管；本发明具体实施过程中，在注射结束后，针管缓慢从鱼体抽离，轻轻按压注射位置30s以止血，尽可能避免注射液体随血液流出体外。
本发明通过连续电子针管进行尾静脉注射，操作简单，可以在链球菌高发季节进行定向预防。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1miR-92促进剂及其应用
1.miR-92促进剂是根据microRNA-92成熟体(AUUGCACUUGUCCCGGCC)序列设计，具体核苷酸序列为5’-AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC-3’，同时，对促进剂进行3’端胆固醇修饰，3’端四个硫代骨架修饰，5’端两个硫代骨架修饰，全链2’甲基化修饰，增加miR-92促进剂与靶基因结合，从而抑制靶基因活性。miR-92促进剂由广州锐博生物科技有限公司制备，可以作为增强内源性microRNA表达的高效促进剂。
2.将200mg miR-92促进剂和阴性促进剂(如SEQ ID NO：3所示，具体为5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’，所述阴性促进剂是C.elegans的miRNA，经过生物信息学分析表明其与人、小鼠、大鼠的基因组，以及miRBase数据库中所有miRNA具有最小的同源性，适合用作miRNA实验阴性对照，以防止出现假阳性反应。)的干粉试剂分别加入3.3ml PBS缓冲液进行稀释，上下震荡，充分混匀，静置5min后，5000rpm离心15s，配置成miR-92促进剂注射剂和阴性促进剂注射剂。
3.将180尾吉富罗非鱼(每条约100g)随机分配到9个800L塑料桶(每桶20条鱼)中，暂养10天。按照30mg/kg的注射计量，采用0.25ml电子针管，每尾实验鱼尾静脉分别注射50μL的miR-92促进剂，阴性促进剂或相同体积的PBS溶液分别作为促进组、阴性对照组和PBS组。注射结束后，针管缓慢从鱼体抽离，轻轻按压注射位置30s以止血，尽可能避免注射液体随血液流出体外。
4.用脑心浸液培养基28℃恒温振荡培养箱中培养海豚链球菌菌液24h，进行菌株的复壮。用灭菌后的生理盐水(0.85％)清洗、集菌，以4000r/min离心15min，收集沉淀细菌体。然后用0.85％生理盐水以10为倍数稀释，比浊法粗略估算，试验前先进行预试验确定攻毒浓度。
5.注射miR-92促进剂48h后，促进组、阴性对照组和PBS组分别按每50g鱼体腹腔注射菌液0.3ml。采用qRT-PCR与Northern blot分析miR-92的表达，U6作为内参基因，靶基因CaSR的表达采用qRT-PCR与Western blot进行验证，18s rRNA作为内参基因。具体引物设计见表1。
表1引物序列
6.实验结果
1)qRT-PCR分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92与CaSR的表达情况参见图2和图3，其中图2为qRT-PCR分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92的表达情况；图3为qRT-PCR分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织CaSR的表达情况；由图2和图3可知，吉富罗非鱼尾静脉注射miRNA促进剂后可能明显促进miR-92的表达与蛋白水平，抑制其靶基因CaSR的基因表达与蛋白水平。
2)Northern blot与Western blot分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92与CaSR的表达情况参见图4和图5，其中图4为Northern blot分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织miR-92的表达情况；图5为Western blot分析尾静脉注射miRNA促进剂后头肾组织CaSR的表达情况；由图4和图5可知，吉富罗非鱼尾静脉注射miRNA促进剂后可能明显促进miR-92的表达，抑制其靶基因CaSR的蛋白表达水平。
3)尾静脉注射miRNA促进剂后吉富罗非鱼头肾组织巨噬细胞的呼吸爆发与吞噬活性参见图6，由图6可知尾静脉注射miR-92促进剂能明显增强吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发与吞噬活性。
4)设置尾静脉注射PBS组作为对照组，注射促进剂后吉富罗非鱼感染链球菌的死亡率具体结果如表2所示，由表2可知，尾静脉注射miR-92促进剂能，降低吉富罗非鱼头链球菌感染后的死亡率。
表2尾静脉注射miR-92促进剂对吉富罗非鱼链球菌感染后成活率的影响
实施例2
1.分别将miR-92促进剂和阴性促进剂(5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)的干粉试剂20nmol加入200μL PBS缓冲液进行稀释，上下震荡，充分混匀，静置5min后，5000rpm离心15s，配置成miR-92促进剂工作液用注射。
2.无菌条件下剖取健康的罗非鱼头肾组织，将巨噬细胞分离及纯化后，放置于置于RPMI 1640培养基(含5％胎牛血清)中27℃，5％CO2环境下培养24h后收集细胞，接种于无抗生素的培养基中。
3.通过lipofectamine 2000转染剂将miR-92促进剂，阴性促进剂或相同体积的PBS溶液分别导入巨噬细胞，作为促进组、阴性对照组和PBS组。
4.实验结果
1)转染不同试剂后吉富罗非鱼头肾巨噬细胞中miR-92表达情况参见图7，由图7可知巨噬细胞中转染miR-92促进剂能显著提高细胞内miR-92的表达，从而抑制细胞内CaSRCaspase-8与Caspase-3基因的蛋白表达水平。
2)转染不同试剂后吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况参见图8～图10和表3，其中图8为PBS组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况；图9为阴性对照组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况；图10为促进组吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况；由图8～10以及表3可知，巨噬细胞中转染miR-92促进剂能够提高巨噬细胞的活性，降低细胞凋亡。
表3转染不同试剂后吉富罗非鱼头肾巨噬细胞的细胞凋亡变化情况
PBS 阴性对照 miR-92促进剂
Q4象限 11.27％ 12.46％ 3.03％
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种miR-92促进剂及其注射剂的制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 1
aauugcacuc gucccggccu gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 2
aattgcactc gtcccggcct gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 3
uuuguacuac acaaaaguac ug 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 4
aattgcactc gtcccggc 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 5
aaaatctatg atgcttgtgg ctcc 24
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 6
attgccatgc aaggggag 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 7
ggccgttctt agttggtgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 8
ttgctcaatc tcgtgtggct 20

Claims (7)

1.一种miR-92促进剂，所述miR-92促进剂为单链小RNA；所述单链小RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-AAUUGCACUCGUCCCGGCCUGC-3’；
所述单链小RNA的3’末端进行胆固醇修饰，3’末端四个碱基CUGC位置分别加入四个硫代骨架进行修饰，5’末端两个碱基AA位置加入两个硫代骨架进行修饰，全链进行2’甲基化修饰。
2.一种包含权利要求1所述miR-92促进剂的巨噬细胞。
3.一种注射剂，包括以下原料：权利要求1所述miR-92促进剂和PBS缓冲液；所述miR-92促进剂的质量与PBS缓冲液的体积的比例为20nmol:150μL～300μL。
4.权利要求3所述注射剂的制备方法，包括以下步骤：
将miR-92促进剂和PBS缓冲液混合，静置后4000～6000rpm离心10～20s，取上清液得到注射剂。
5.权利要求1所述miR-92促进剂在增强罗非鱼体内miR-92的表达中的应用。
6.权利要求1所述miR-92促进剂在制备增强巨噬细胞活性的药物中的应用。
7.权利要求1所述miR-92促进剂在制备预防罗非鱼链球菌感染的药物中的应用。
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