CN105229151A

CN105229151A - 包含包封的antagomir的组合物

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Publication number: CN105229151A
Application number: CN201480017728.3A
Authority: CN
Inventors: M-A·阿莘; E·费雷特; A·佩雷兹; N·B·戈塔尔达; A·罗德里奎兹西诺瓦斯; I·B·瓦尔特; A·D·加西亚-多拉多加西亚
Original assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR; Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR; Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2016-01-06
Also published as: CA2898958A1; US20150352055A1; RU2668794C2; ES2606636T3; HUE032125T2; PL2759595T3; RU2015134770A; KR20160018451A; WO2014115103A1; MX2015009323A; EP2759595A1; ZA201505602B; EP2759595B1; JP2016506923A; EP2948551B1; BR112015017650A2; EP2948551A1; HK1219753A1; AU2014208419A1; ES2688160T3

Abstract

本发明涉及包含有效量的涉及血管生成的miRNA或其前体的至少一种抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成聚合物生物可降解且生物相容的微球。本发明还涉及所述组合物用于预防或治疗心脏疾病，包括由缺血引起的心脏疾病的用途。

Description

包含包封的antagomir的组合物

技术领域

本发明涉及旨在预防或治疗心脏疾病，包括心脏缺血性疾病的药物制剂的领域。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)，也称为心肌梗死并通常被称为心脏病发作，代表世界上大多数工业化国家的一个主要健康风险，并且仍然是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。

通常，AMI是由突然且持续缺乏流向心脏组织的血液造成，这一般是冠状动脉狭窄或闭塞的结果。没有充分的血液供给，所述组织变得缺血，造成心肌细胞(心脏肌肉细胞)和血管结构的死亡。

近几十年来在治疗AMI中有很多进展，主要涉及与药物疗法相结合的冠状动脉再灌注。再灌注疗法已经通过减少梗死面积和改善短期和长期的发病率和死亡率而成功改变AMI的自然进展。然而，使用目前可获得的两种再灌注策略有实质性的限制：纤维蛋白溶解导致低程度的冠状动脉通透性，在AMI进化的开始几小时期间不能频繁应用初期血管成形术。此外，在一些插管的患者中，除了正常的心外膜血流，出现“无复流”现象或缺乏微血管再灌注，导致不良功能性结果。这意味着再灌注疗法不能预防心肌的有害重构(胶原蛋白疤痕形成的复杂的内在修复过程，导致心室扩张、收缩功能障碍和随后的心脏衰竭)的发生。它在大约30％AMI中的发生主要与仍知之甚少的较大的梗死面积、微血管阻塞及不良修复反应有关。

因为修复性纤维化和缺血组织的功能恢复依赖于建立供应氧合血的网络，已经做出努力以通过在愈合区域诱导新血管形成来改善血管床，从而在原位实现将损伤区域直接转变为功能性组织。

血管生成的治疗性诱导可以减轻这种现象的发生。尽管如此，若干年静脉促血管生成因子的临床试验结果并不令人满意。不被理论束缚，认为造成这种失败的原因之一是静脉途径不能够在严重受损的心脏条件下到达并在靶组织中维持有效的药物浓度，从而促进并维持功能性的血管网络。

为了解决这个问题并预防AMI后的心功能不全，在过去十年内开始了再生心肌和血管可能性的研究。施用多能祖细胞和灌注血管生长因子的初始研究显示有前途的结果，但转到临床设置则显示这些治疗不能以足够恢复被破坏的心肌的方式再生新血管。

今天，血管生成和用细胞治疗的受损心脏的再增殖以及特定的药物和再同步化治疗能够减缓这种现象的进展，但预防它的发生对于心脏医学仍然是有疑问的挑战。因此，需要预防有害的左心室重构的新的治疗策略。

发明简述

本发明涉及通过施用通过调节microRNA的活性或表达来逆转或预防心室重构的组合物治疗心脏疾病，优选缺血性疾病。更具体地，本发明提供包含涉及血管生成的microRNA的抑制剂的组合物，所述抑制剂优选包含于能够将所述抑制剂局部释放至缺血靶组织的新的递送介质中。此外，本发明提供逆转或预防心室重构的方法和用于所述方法的试剂盒。

本发明涉及一种组合物，其包含有效量的至少一种涉及血管生成的miRNA或其前体的抑制剂，其中将所述抑制剂微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。

在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA选自包含miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)的家族。

在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂是长度为8-49个核苷酸的具有靶向所述miRNA或其前体的序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸是与所述靶miRNA或其前体至少部分互补的反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、吗啉代寡核苷酸或它们的组合。

在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂由antagomir组成，优选由包含核苷酸序列的antagomir组成，所述核苷酸序列包含至少16个与选自本文所述的SEQIDNO：1-58的序列的核苷酸互补的连续核苷酸。

在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂由包含序列SEQIDNO：59或60和其除碱基替换之外的修饰，及其片段的antagomir组成，所述片段由SEQIDNO：59或60的至少8个连续核苷酸的子序列组成。

在上述组合物的一些实施方案中，所述微球的直径不超过25μm，包括直径为5-20μm，优选5-15μm的微球。

在上述组合物的一些实施方案中，所述微球由聚-d,l-丙交酯(PLA)组成的聚合物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物混合。

本发明还涉及逆转或预防需要其的受试者心室重构的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述组合物。

本发明还涉及生物可降解且生物相容的微球群体用于治疗或预防心肌梗死的用途，其中所述微球：

–平均直径为5-20μm，优选5-15μm；

–由聚-d,l-丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)；聚-d,l-丙交酯(PLA)或它们的混合物制成；

–包含1％-15％w/w的能够预防心室重构的治疗剂；

其中所述治疗剂由选自以下的miRNA或其前体的抑制剂组成：miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，优选miR-92a。

附图说明

图1显示通过扫描电镜测定的antagomir-92a-PLGA微球的形态。

图2显示通过激光散射测定的antagomir-92a-PLGA微球的尺寸分布。

图3显示通过重复注射微球直到120mg对血液动力学和左心室收缩性的作用。

图4显示通过重复注射微球直到240mg对血液动力学和左心室收缩性的作用。

图5显示单次冠状动脉内注射根据本发明的微球的分子作用的研究方案。

图6显示本发明的微球对miR-92a的抑制特异性。

图7显示包封的antagomir-92a诱导梗死组织中的血管生成。通过将血管总数除以总的梗死面积计算梗死区的血管密度。N＝20.*P<0.01。

图8：间接测量。AMI后一个月，在用包封的antagomir-92a、安慰剂或盐水处理的小猪的梗死相关动脉中测量基础和最小的微血管阻力指数。(a)用血压(mmHg)乘以冠脉流量(ml/min)来计算基础微血管阻力指数(MRI)，所述血压用位于顶端LAD(Pd)的压力线测量，和所述冠脉流量用位于LAD远段的感应器定量。用在最大充血测量的相同参数计算最小微血管阻力指数(MRI_hyp)，所述最大充血通过向股静脉12F鞘静脉输注140mg/min的腺苷来实现。n＝12*p<0.01**p＝0.05。(b)坏死区中血管总数和MRI之间的关系。R²0.41,p＝0.02,n＝12。(c)坏死区中血管总数和最小MRI之间的关系。R²0.27,p＝0.08,n＝12。

图9：直接测量。AMI后一个月，在用包封的antagomir-92a处理和不处理的小猪的梗死相关动脉中测量基线和实际微循环阻力。(a)用血压(mmHg)除以冠脉流量(ml/min)来计算基线微循环阻力(基线MR)，所述血压用位于顶端LAD(Pd)的压力线测量，和所述冠脉血流量用位于LAD远段的感应器定量。处理组的基线MR显著低于对照(7.47±1.33vs19.62±2.98,p＝0.005)。n＝13。用在最大充血测量的相同参数计算实际微循环阻力(TMR(hyp))，所述最大充血通过向股静脉12F鞘静脉输注140mg/min的腺苷来实现。在处理组中观察到显著低于对照的TMR(hyp)(5.0±1.15vs14.49±2.4,p＝0.006)。n＝13。(b)所有坏死区中血管密度与基线MR之间的关系。R²＝0.35,P＝0.033,n＝13。(c)所有坏死区中血管密度与TMR(hyp)之间的关系。R²＝0.31,P＝0.047,n＝13。

图10：AMI后一个月，用对分配处理盲法的超声心动图评估隔顶运动障碍(septoapicaldiskynesia)的存在。显示了处理和未处理动物中患有隔顶运动障碍动物的百分比(83.3％vs16.7％,p＝0.03)。n＝20。

图11：体外评估包封的antagomir92a和未包封的antagomir92a对miR92a表达的作用。

图12：包封的antagomir17和20a对它们各自miRNA的作用。

发明详述

以下给出由本发明涵盖的所有实施方案的描述相关的一些定义。

MicroRNA(MiR)是作为生物过程关键调节器的小的非编码RNA。

“MicroRNA”、“miRNA”或“miR”是指长度为约18至约25个核苷酸的非编码RNA。这些miR可以来自多种来源，包括：编码miRNA的单个基因，来自蛋白编码基因的内含子，或来自通常编码多个密切相关的microRNA的多顺反子的转录物。

目前的知识显示，miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII)转录，且来自一般为几千个碱基长的称为初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物。pri-miRNA在细胞核中被RNaseDrosha加工成约70-100个核苷酸的发夹型前体(pre-miRNA)。被运输到细胞质后，发夹pre-miRNA进一步被Dicer加工以产生双链microRNA；然后被称为成熟microRNA的其中一条链(有时两条链均可使用)被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其中它与它的靶mRNA通过碱基对互补相关联。在相对罕见情况下，即当miRNA碱基对与信使RNA(mRNA)靶标完全配对时，它促使mRNA降解。更普遍的，microRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，影响mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译。

“茎环序列”是指具有发夹结构且包含成熟miRNA序列的RNA。pre-miRNA序列和茎环序列可以重叠。茎环序列的实例可以在名为miRBase的microRNA数据库中发现。

“microRNA前体”是指来源于基因组DNA且包含含有一个或多个microRNA序列的非编码结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，microRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，microRNA前体是pri-miRNA。

以下说明书将遵循标准命名系统，其中没有大写的“mir-X”是指pre-miRNA，而大写的“miR-X”是指成熟形式。当两个成熟microRNA来自相同pre-miRNA的不同臂，它们分别被加以后缀-3p或-5p。当相对表达水平已知时，名称后面的星号表示microRNA相对于发夹另一条臂的microRNA以低水平表达。

在以下说明书中，除非另有说明，表述miR-X(如果有的话)用来指包括-3p和-5p两种形式的成熟miRNA。

为了避免疑问，在本说明书中，表述microRNA、miRNA和MiR是指相同产物。

因此，在本发明上下文中，目的是用特别关注的涉及血管生成的microRNA调控血管生成或血管生成过程。因此，本发明的目的是调控属于涉及血管生成调控的microRNA家族的至少一种microRNA。

表述“microRNA家族”意欲是指具有由调控血管生成或血管生成过程组成的相关功能的一组microRNA。更具体地且非限制性地，所述microRNA选自显示出抗血管生成活性的microRNA。

更具体地，且非限制性地，这种microRNA选自miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，或其前体。对血管生成具有调控性质，优选拮抗性的任何miRNA应当被认为是该microRNA家族的一部分，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。

为了避免疑问，除非另有说明，以下说明书中的表述microRNA将是指已经从它的前体切割的成熟或经加工的RNA。对于非成熟形式，将使用表述“前体”或“microRNA前体”。

下表1将本说明书涵盖的microRNA前体的不同序列进行了重新分组。

表1

对于各个microRNA，下表2显示microRNA的序列和进入相应前体序列的相应残基(参见表1)。

表2

除非另有说明，本申请中所指的前体和microRNA序列是人序列。然而，在某些情况下，microRNA人序列与来自其他物种的microRNA序列同源。

作为一个实例可以提及，人miR-92a与来自其他物种的miR同源。更具体地，人miR-92a与来自dme(Drosophilamelanogaster，黑腹果蝇)、mmu(Musmusculus，小家鼠)、rno(Rattusnorvegicus，褐家鼠)、dps(Drosophilapseudoobscura，拟暗果蝇)、aga(Anophelesgambiae，冈比亚按蚊)、dre(Daniorerio，斑马鱼)、mml(Macacamulatta，猕猴)、xtr(Xenopustropicalis，热带爪蟾)、ame(Apismellifera，意大利蜜蜂)、odi(Oikopleuradioica，异体住囊虫)、cin(Cionaintestinalis，玻璃海鞘)、csa(Cionasavignyi，萨氏海鞘)、cfa(Canisfamiliaris，家犬)和猪或ssc(Susscrofa，野猪)的miR同源。

根据其公知常识，本领域技术人员将容易发现其他人microRNA序列和来自其他物种的microRNA序列之间的同源性。

本文所述的成熟microRNA的核酸序列以及它们相应的茎环序列是在在线可检索的microRNA序列和注释的数据库miRBase中发现的序列。miRBase序列数据库的进入代表预测的microRNA转录物的发夹部分(茎环)，以及成熟microRNA序列的定位和序列信息。数据库中的microRNA茎环序列不是严格的前体miRNA(pre-miRNA)，而在某些情况下可以包括pre-imRNA和来自假定初级转录物的侧翼序列。

因此，本发明的目的是提供用于治疗或预防AMI后心室重构的组合物，所述组合物包含涉及控制血管生成生理的不同反应的microRNA或其前体的抑制剂，或几种microRNA或其前体的抑制剂的组合。

然而，在大多数发表的研究中，使用静脉途径向动物施用microRNA抑制剂。操纵涉及血管基因表达调控的microRNA代表缺血性疾病的新治疗靶点。在生物医学方面，对施用尤其是设计成抑制特定RNA序列的RNA调节器的研究呈指数增长。

Dimmeler等已经表明，全身施用特定microRNA抑制剂来抑制miR-92a改善了左心室功能的收缩性和恢复。因为多顺反子microRNA17-92a簇与肿瘤发生相关，也因为microRNA细胞型的普遍性，通过静脉重复注射miR或抗miR引起安全性方面的担忧。

由于microRNA控制复杂的过程且存在于各种细胞通路这一事实，极有可能它们也引发显著的副作用。在其他之中，目前的一个问题是用miRNA抑制剂治疗是非选择性的。

此外，由于这些分子的普遍性和低器官特异性，全身施用可能导致在其中这些miRNA具有不同细胞特异性功能或它们通常不表达的组织中的运动调控功能。这种错误调控可能会引发副作用。在潜在的风险中，与microRNA操纵相关的肿瘤发生仍然是对人体病理学应用这种治疗的主要担忧之一。并且，为了在靶细胞中获得足够持续的浓度，必须以很高的剂量重复注射microRNA抑制剂。尽管在控制条件下在小动物上的实验具有较少限制性，换位到人类则意味着生物安全性障碍以及物流和经济障碍。

为了解决这些问题以及使这种新的治疗方法能够转移到患者上，考虑产生用于运输microRNA抑制剂并将它们直接释放到靶器官的释放介质。合适的介质会将microRNA抑制剂直接导向病变组织，从而允许降低剂量以避免重复注射施用，使对其他器官的潜在的不希望的生物作用最小化。

因此，目的是通过仅在靶组织中释放microRNA抑制剂的手段提高选择性以避免这些治疗的副作用。根据本发明，通过将所述microRNA抑制剂微包封成生物可降解且生物相容的微球来解决这个问题。

因此，本发明的目的是提供用于治疗或预防AMI后心室重构的组合物，所述组合物包含至少一种微包封的microRNA的抑制剂，所述microRNA属于与调控血管生成相关的microRNA家族，所述microRNA家族非限制性地包含miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，或其前体。

通过将microRNA抑制剂微包封成微球，促进经腔血管成形术之后的动脉内施用，从而将微球递送并仅保留在受损区域的微血管(也称为毛细血管)中；包封的microRNA抑制剂可以以这种方式局部释放。

通过AMI相关动脉的冠状动脉内注射使微球能够保留在冠状动脉的微循环中，并将microRNA抑制剂直接持续释放至靶缺血组织。microRNA抑制剂诱导新血管生成，这促进受损组织收缩性的功能恢复以及有利的梗死后重构。

出乎意料地，本文表明，当微包封成合适的微球时，microRNA抑制剂，尤其是属于与调控血管生成相关的microRNA家族的microRNA的抑制剂，所述microRNA成功释放至心肌的受损区域从而阻断靶microRNA的生物活性。如本文实施例中所示，通过选择性的冠状动脉内途径向经历心肌梗死的个体施用微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球的给定microRNA抑制剂，即作为非限制性实例的miR-92a抑制剂导致心肌的功能性恢复。

因此，保留于微循环中的微球允许microRNA抑制剂直接持续释放至靶缺血组织。受损一个月后，在愈合区microRNA抑制剂对靶microRNA的持续作用(也称为下调)导致明显的血管生长和有害重构的抑制。

如本文实施例中所示，已经表明可以通过包封合适的施用于梗死相关动脉的microRNA抑制剂来局部和持续抑制属于与调控血管生成相关的microRNA家族的microRNA来诱导血管生成，从而预防有害心室重构的发生。这代表促进基因调控疗法向患有急性心肌梗死的患者随后安全转移的新递送方法。

这些结果清楚表明，如本文所述的包含属于与调控血管生成相关的microRNA家族的microRNA，例如miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，或其前体的抑制剂的组合物允许所述抑制剂以治疗有效量以及治疗有效释放速率进行有效的局部释放。

在第一个方面，本发明涉及包含有效量的至少一种涉及血管生成的microRNA或其前体的抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。

在另一个方面，本发明涉及包含有效量的至少一种选自以下的microRNA或其前体的抑制剂的组合物：miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，其中将所述抑制剂微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。

还在本发明的另一个方面，本发明涉及包含有效量的至少一种miR-92a或其前体的抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。

表述“微球”必须理解为大小为1μm至几百μm的球形颗粒。表述“微粒”包括“微球”和“微胶囊”。在本说明书中，使用表述“微球”，但必须理解当本领域技术人员可能且愿意使用“微胶囊”的情况时，使用“微球”和“微胶囊”是等同的。

表述“包封”或“微包封”必须理解为包含或包埋于用于保护或用于改性释放的颗粒中。

换言之，本发明涉及包含有效量的包封成生物可降解且生物相容的微球的至少一种涉及血管生成的microRNA抑制剂的药物组合物，所述microRNA抑制剂优选选自包含以下或由以下组成的组：miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)或其前体。

换言之，本发明涉及包含有效量的包封成生物可降解且生物相容的微球的至少一种miR-92a或其前体的抑制剂的药物组合物。

“药物组合物”是指包含药剂的适合向个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含miRNA抑制剂和无菌水溶液。

在本发明组合物的一个实施方案中，所述涉及血管生成的miRNA由成熟miRNA组成。

在本发明组合物的一个实施方案中，所述miRNA由以下成熟miRNA组成：

a)包含选自SEQIDNO：21、22或23的序列或与SEQIDNO：21、22或23之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-92a；

b)包含选自SEQIDNO：24或25的序列或与SEQIDNO：24或25之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-92b；

c)包含选自SEQIDNO：26或27的序列或与SEQIDNO：26或27之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-17；

d)包含选自SEQIDNO：28或29的序列或与SEQIDNO：28或29之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-503；

e)包含选自SEQIDNO：30、31或32的序列或与SEQIDNO：30、31或32之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-16；

f)包含选自SEQIDNO：33、34、35、36、37或38的序列或与SEQIDNO：33、34、35、36、37或38之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-374；

g)包含选自SEQIDNO：39、40、41或42的序列或与SEQIDNO：39、40、41或42之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-24；

h)包含选自SEQIDNO：43或44的序列或与SEQIDNO：43或44之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-483；

i)包含选自SEQIDNO：45、46、47、48、49或50的序列或与SEQIDNO：45、46、47、48、49或50之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-34；

j)包含选自SEQIDNO：51、52、53或54的序列或与SEQIDNO：51、52、53或54之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-20；和

k)包含选自SEQIDNO：55、56、57或58的序列或与SEQIDNO：55、56、57或58之一具有至少90％核苷酸一致性的序列的miR-15。

在本发明组合物的另一个实施方案中，所述miR-92a由包含SEQIDNO：21的序列或与SEQIDNO：21具有至少90％、优选95％的核苷酸一致性的序列的成熟miR-92a组成。

在本发明组合物的另一个实施方案中，所述miR-92a由包含SEQIDNO：22的序列或与SEQIDNO：22具有至少90％、优选95％的核苷酸一致性的序列的成熟miR-92a组成。

在本发明组合物的另一个实施方案中，所述miR-92a由包含SEQIDNO：23的序列或与SEQIDNO：23具有至少90％、优选95％的核苷酸一致性的序列的成熟miR-92a组成。

在本发明中，两个核酸序列之间的“一致性百分比”是指在最佳比对后获得的两个待比较序列之间相同核苷酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的，且两个序列之间的差异沿其长度随机分布。两个核酸序列的比较通常通过将它们最佳比对之后比较它们的序列来进行，所述比较能够通过分段或使用“比对窗口”进行。除了手工比较，用于比较的序列的最佳比对还可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)、通过Pearson和Lipman的相似性检索方法(1988)或通过使用这些算法的计算机软件(在WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或比较软件BLASTNR或BLASTP)来进行。

两个核酸序列之间的一致性百分比通过比较两个最佳比对的序列测定，其中与两个序列之间用于最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸序列可以具有添加或缺失。一致性百分比通过以下计算：测定两个序列之间，优选两个完整序列之间核苷酸残基相同的位置数，将相同的位置数除以比对窗口中总位置数，将结果乘以100即获得两个序列之间的一致性百分比。

如本文所意欲的，与参考序列具有至少90％核苷酸一致性的核苷酸序列涵盖与所述参考序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸一致性的那些。

在本发明组合物的一个实施方案中，所述涉及血管生成的miRNA由microRNA的前体组成。

在本发明组合物的一个实施方案中，所述涉及血管生成的microRNA的前体由以下组成：

a)包含SEQIDNO：1的序列或与SEQIDNO：1具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-92a-1；

b)包含SEQIDNO：2的序列或与SEQIDNO：2具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-92a-2；

c)包含SEQIDNO：3的序列或与SEQIDNO：3具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-92b；

d)包含SEQIDNO：4的序列或与SEQIDNO：4具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-17；

e)包含SEQIDNO：5的序列或与SEQIDNO：5具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-503；

f)包含SEQIDNO：6的序列或与SEQIDNO：6具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-16-1；

g)包含SEQIDNO：7的序列或与SEQIDNO：7具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-16-2；

h)包含SEQIDNO：8的序列或与SEQIDNO：8具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-374a；

i)包含SEQIDNO：9的序列或与SEQIDNO：9具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-374b；

j)包含SEQIDNO：10的序列或与SEQIDNO：10具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-374c；

k)包含SEQIDNO：11的序列或与SEQIDNO：11具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-24-1；

l)包含SEQIDNO：12的序列或与SEQIDNO：12具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-24-2；

m)包含SEQIDNO：13的序列或与SEQIDNO：13具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-483；

n)包含SEQIDNO：14的序列或与SEQIDNO：14具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-34a；

o)包含SEQIDNO：15的序列或与SEQIDNO：15具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-34b；

p)包含SEQIDNO：16的序列或与SEQIDNO：16具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-34c；

q)包含SEQIDNO：17的序列或与SEQIDNO：17具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-20a；

r)包含SEQIDNO：18的序列或与SEQIDNO：18具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-20b；

s)包含SEQIDNO：19的序列或与SEQIDNO：19具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-15a；和

t)包含SEQIDNO：20的序列或与SEQIDNO：20具有至少90％核苷酸一致性的序列的mir-15b。

总体而言，抑制剂是抑制或阻止另一个分子参与反应的分子。

如在此所用，术语“miR-X或mir-X的抑制剂”是指减少或降低miR-X、或mir-X或至少一个前体的表达和/或活性的任何分子或化合物。因此，这种抑制应当阻止新血管生成抑制，即促进新血管生成从而预防梗死后有害的心肌重构。

在本发明的一个实施方案中，所述涉及血管生成的给定microRNA抑制剂是长度为8-49个核苷酸的具有靶向所述给定microRNA的序列的寡核苷酸，所述microRNA优选选自：miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)或其前体。

在另一个实施方案中，所述miR-92a抑制剂是长度为8-49个核苷酸的具有靶向所述miR-92a的序列的寡核苷酸。

表述“靶向”是指具有允许与靶核酸杂交以诱导所需效果的核苷酸序列。在某些实施方案中，所需效果是靶核酸的降低和/或抑制。

“杂交”是指通过“核苷酸互补”(即两个核苷酸通过氢键非共价配对的能力)发生的互补核酸的退火。

在一些实施方案中，miRN抑制剂寡核苷酸的长度为8-49个核苷酸。

本领域技术人员将理解，这包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49，或之内任何范围的寡核苷酸。在一些实施方案中，根据本发明的寡核苷酸的长度为10-20个核苷酸。本领域技术人员将理解，这包含长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，或之内任何范围的寡核苷酸。

在某些实施方案中，寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的序列。

在本发明组合物的一个实施方案中，所述寡核苷酸是与涉及血管生成的靶miRNA序列至少部分互补的反义寡核苷酸，所述靶miRNA优选选自miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)或其前体。

在本发明组合物的另一个实施方案中，所述寡核苷酸是与miR-92a的序列至少部分互补的反义寡核苷酸。

表述“反义寡核苷酸”是指具有与特定核苷酸序列(称为有义序列)互补的序列且能够与有义序列杂交的寡核苷酸。

“互补”是指第一核酸与第二核酸之间的核苷酸配对能力。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有与microRNA或其前体互补的核苷酸序列，意味着反义寡核苷酸的序列与miRNA或其前体的补体具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的一致性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在一些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷酸序列相对于它的靶microRNA或其前体序列可以具有一个或多个错配碱基对，并能够与它的靶序列杂交。在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有与microRNA或其前体完全互补的序列，意味着反义寡核苷酸的核苷酸序列与miRNA或其前体的补体具有100％的一致性。

在本发明上下文中，“互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的区域内，与miR-92a的核苷酸序列的补体具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的反义核苷酸或其前体，或是指两个序列在严格杂交条件下杂交。

“互补性百分比”是指核酸序列中互补核苷酸的数量除以该核酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补性百分比是指与靶核酸互补的核苷酸的数量除以该寡核苷酸的长度。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸序列与涉及血管生成的靶microRNA的序列“完全互补”，所述靶microRNA优选选自miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)，更优选为miR-92a或其前体，这意味着反义寡核苷酸的每一个核苷酸均能够与靶microRNA或其前体中各个对应位置的核苷酸配对。

在某些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与以下序列部分或完全互补的序列：

在某些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与mir-92a-1的序列(SEQIDNO：1)序列部分互补的序列。

在某些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与mir-92a-1的序列(SEQIDNO：1)序列完全互补的序列。

在某些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与mir-92a-2的序列(SEQIDNO：2)序列部分互补的序列。

在某些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与mir-92a-2的序列(SEQIDNO：2)序列完全互补的序列。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含改性骨架。此类骨架的实例有吗啉代骨架、氨基甲酸骨架、硅氧烷骨架、硫化物、砜和亚砜骨架、formacetyl和thioformacetyl骨架、methyleneformacetyl骨架、核糖乙酰(riboacetyl)骨架、含烯烃骨架、氨基磺酸酯、磺酸和磺胺骨架、亚甲氨基和亚甲肼基骨架，以及酰胺骨架。

吗啉代寡核苷酸具有不带电荷的骨架，其中DNA的脱氧核糖被六元环代替，和磷酸二酯键被磷酸二酰胺酯键代替。吗啉代寡核苷酸对酶降解有抗性，且似乎作为反义试剂通过阻止翻译或干扰pre-mRNA剪切而不是激活RNaseH来起作用。

改性骨架通常优选提高核酸酶抗性。也可以因为与未改性骨架相比，改性骨架对靶序列具有改变的亲和性而优选改性骨架。未改性骨架可以是RNA或DNA。

另一种合适的反义寡核苷酸包含具有改性聚酰胺骨架的肽核酸(PNA)。基于PNA的分子在碱基配对识别方面完全模仿DNA分子。PNA的骨架由通过肽键连接的7V-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接至骨架。

另一种合适的骨架包含吗啉代核苷酸类似物或等效物，其中核糖或脱氧核糖被六元吗啉环代替。最优选的核苷酸类似物或等效物包含磷酸二酰胺酯吗啉低聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖被六元吗啉环替代，且相邻吗啉环之间的磷酸二酯键被非离子的磷酸二酰胺酯键代替。

在进一步的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸在磷酸二酯键中包含一个非桥氧的取代。这种修饰略微使碱基配对不稳定，但显著增加对核酸酶降解的抗性。

本发明另一种合适的反义寡核苷酸包含一个或多个在2’、3’和/或5’位上单-或双取代(例如-OH、-F)的糖部分；可能被一个或多个杂原子隔断的取代或未取代的直链或支链的较低级(CI-CIO)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；-氨基xy；甲氧基乙氧基；-二甲基氨氧基乙氧基和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。

糖部分可以是吡喃糖或其衍生物，或脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物，或脱氧核糖或其衍生物。这种优选衍生的糖部分包含锁定核酸。

LNA是改性RNA核苷酸，其中LNA核苷酸的核糖部分用额外的连接2’和4’碳的桥修饰。这增强了碱基堆叠和预-组织，并显著提高了热稳定性。这种桥将核糖“锁定”在通常发现于A型DNA或RNA中的3’-内结构构象中。根据需要，本发明中所用的LNA核酸可以与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基混合。

根据本发明，所述反义寡核苷酸选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、吗啉代寡核苷酸或它们的组合。

在另一个实施方案中，反义寡核苷酸可以由antagomir组成。

在本发明组合物的一个优选实施方案中，所述寡核苷酸由antagomir组成。

Antagomir是用来沉默内源microRNA的化学工程化寡核苷酸。Antagomir是与特定靶microRNA完美互补但在剪切位点具有错配或某种碱基改性以抑制剪切的小的合成RNA或DNA。通常，antagomir具有某种改性以使其对降解更加有抗性并促进细胞内在化。Antagomirization(antagomir抑制microRNA活性的过程)是怎样操作的仍不清楚，但相信它通过不可逆地与microRNA结合来抑制。Antagomir用来连续抑制特定microRNA的活性。

在本发明的一个实施方案中，所述antagomir包含含有至少8、9、10、11、12、13、14、15或16个与microRNA或其前体互补的连续核苷酸的核苷酸序列，所述microRNA的序列选自SEQIDNO：1-58。

在本发明的一个实施方案中，所述antagomir包含含有至少8、9、10、11、12、13、14、15或16个与mir-92a互补的连续核苷酸的核苷酸序列，所述mir-92a的序列选自SEQIDNO：1、2或3。

在本发明的一个实施方案中，所述antagomir包含含有至少8、9、10、11、12、13、14、15或16个与mir-92a互补的连续核苷酸的核苷酸序列，所述mir-92a的序列选自SEQIDNO：21、22或23。

在另一个实施方案中，所述antagomir包含含有至少16个与SEQIDNO：21的核苷酸序列互补的连续核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，所述antagomir具有DNA骨架。

在所述本发明组合物的实施方案中，所述antagomir包含SEQIDNO：59的序列及其除了碱基替换之外的修饰，和由其至少8个连续核苷酸的SEQIDNO：59的子序列组成的片段。

在本发明的另一个实施方案中，所述antagomir具有RNA骨架。

在所述本发明组合物的实施方案中，所述antagomir包含SEQIDNO：60的序列及其除了碱基替换之外的修饰，和由其至少8个连续核苷酸的SEQIDNO：60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少8个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少9个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少10个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少11个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少12个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少13个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少14个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在一个实施方案中，根据本发明的antagomir是由其至少15个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

在另一个实施方案中，所述SEQIDNO：59或60序列的antagomir通过相邻核苷酸之间的磷硫酰键(phosphotioatebond)呈现至少1、2、3、4、5、6或7个改性核苷酸。

在另一个实施方案中，所述antagomir可以包括2’-O-甲基改性的核苷酸、胆固醇基团或任何相似或等效的修饰。

通常，如果通过口服或肠胃外施用包含核酸、肽和蛋白质的药物制剂，它在体内被酶降解，该药物制剂的功效快速消失。已经采用各种尝试来克服这个问题。其中之一是配制长效持续释放注射剂。

在实践中，正在对使用支架作为选择性施用microRNA的系统进行研究。然而，支架的快速内皮化可能对microRNA的持续释放提出问题，尤其是对需要长时间基因调控的生物学过程。此外，已经开发并使用了体内的脂质体和纳米颗粒，但其通过循环系统时具有未能避免的严重副作用风险。此外，没有研究显示不含预先主动脉夹的经皮冠状动脉内施用后的功效和安全性。

本发明的另一个方面是使用基于生物可降解且生物相容的微球。

根据本发明，基于寡核苷酸与生物相容生物可降解聚合物的微包封，设计并生产了适用于在心脏区域局部释放所述寡核苷酸的释放系统。本发明允许获得基本上载有寡核苷酸的微球，其具有高包封效率，且没有分子改性/降解。根据本发明，由于所用的生产条件，尤其是产生的乳剂的特征、聚合物溶液的浓度以及微包封过程中涉及的相体积之间的关系，在没有添加稳定剂或保留物质的情况下保存了分子的纯度和质量。此外，微球具有合适的粒径分布，使其能够在梗死区域的微血管中保留而不造成动脉栓塞，且不会被巨噬细胞的吞噬作用破坏。

本发明的目的是提供一种持续释放的微球，其稳定地包封了短链脱氧核糖核酸或短链核糖核酸，并且能够长时间抑制对特定蛋白表达的抑制，尤其是抑制与疾病相关的蛋白。

一般来说，“生物相容”是指与活细胞、组织、器官或系统相容，且没有受损、毒性或被免疫系统排斥的风险。生物相容的微球是指该微球以及该微球的任何降解产物对接受者无毒，且对接受者的机体不会产生明显的有害或不良反应，例如在注射位点的免疫反应。

一般来说，“生物可降解”是指能够被生物剂的作用分解。

如本文所定义，生物可降解的微球是指该微球将在体内降解或损坏以形成更小的化学物质。可以通过例如，酶、化学和/或物理过程造成降解。

合适的生物相容的、生物可降解的聚合物包括例如，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚原酸酯、polyacetyl、聚腈基丙烯酸酯、聚醚酯、聚(对二氧环己酮)、聚(烯烃烷基化物)、聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物、生物可降解的聚氨酯、它们的混合物和共聚物。

现有技术中已经描述了制备微粒的大量技术。

微粒的药物释放谱取决于各种因素，包括所用聚合物的理化性质、聚合物-药物-赋形剂之间的相互作用和/或所得微粒的形态和组成。

为了使微球被毛细血管保留，它们必须具有非常特殊的大小分布从而使其一方面被巨噬细胞的吞噬作用，或另一方面动脉栓塞的破坏最小化；使用生物可降解的、生物相容的聚合物的微包封能够从最初几小时直到2-3周(AMI后心室重构发生的主要时期)控制产物的释放。

在本发明上下文中，因为优选冠状动脉内途径，这些微球的平均大小需考虑心肌毛细血管的大小；为了在保留在心脏区域，这在5到20，优选5到15微米之间变化，且没有超过25微米的颗粒以防止动脉栓塞。

在本发明的一个实施方案中，所述微球的直径不超过25μm。

在一个实施方案中，50到100％的微球在5-25μm的范围内，没有颗粒超过25μm。

在一个优选的实施方案中，60到100％的微球在5-25μm的范围内，没有颗粒超过25μm。

在另一个优选的实施方案中，70到100％的微球在5-25μm的范围内，没有颗粒超过25μm。

在一个更优选的实施方案中，80到100％的微球在5-25μm的范围内，没有颗粒超过25μm。

根据本发明，微球的平均直径在5-20μm的范围内。

根据本发明，微球的平均直径在5-15μm的范围内。

在另一个实施方案中，所述微球的平均直径为8-11μm。

根据本发明的微球将大量所述microRNA抑制剂装载入生物可降解且生物相容的聚合物中以在梗死区域持续释放药物。

microRNA抑制剂的载量为约1-20％(w/w)、优选1-15％(w/w)、更优选1-10，仍然更优选5-10％。保留药物完整性。

在一个实施方案中，根据本发明的微球包含1％-15％w/w的抑制剂。

在另一个实施方案中，根据本发明的微球包含5％-15％w/w的抑制剂。

还在另一个实施方案中，根据本发明的微球包含1％-10％，优选5％-10％w/w的抑制剂。

本发明的另一个特征与用于制备微球的聚合物的性质相关。

在本发明的一个实施方案中，所述微球用由聚-d,l-丙交酯(PLA)组成的聚合物制成。在一个实施方案中，所述微球用PLA作为唯一的聚合物制成。在一个实施方案中，所述微球用与一种或多种其他生物相容的聚合物共混的PLA制成。

在本发明的另一个实施方案中，所述微球用由聚-d,l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)组成的共聚物制成。在一个实施方案中，所述微球用PLGA作为唯一的聚合物制成。在一个实施方案中，所述微球用与一种或多种其他生物相容的聚合物共混的PLGA制成。

还在在本发明的另一个实施方案中，所述微球用由聚-d,l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)和聚-d,l-丙交酯(PLA)组成的聚合物共混物制成。

表述“共混物”必须理解为在将所述混合物溶解于相同有机溶剂之前实现两种或多种聚合物的混合。

本领域技术人员将容易理解，与PLGA共聚物不同，PLA聚合物中丙交酯:乙交酯的比例为100:0摩尔比。

对于PLGA共聚物，PLGA聚合物中丙交酯:乙交酯的比例为50:50至95:5摩尔比。

在一个优选的实施方案中，PLGA共聚物中丙交酯:乙交酯的比例为50:50至95:10摩尔比，优选为50:50至80:20摩尔比。

在本发明的一个实施方案中，聚合物的固有粘度为0.1-0.7dl/g。

在一个优选的实施方案中，聚合物的固有粘度为0.15-0.7dl/g，优选0.15-0.5dl/g。

该方面是令人感兴趣的，因为固有粘度与聚合物分子量相关，因此影响抑制剂从聚合物微球中释放的速度。

因此，本发明的目的还是提供一种用于制备不包括任何助剂且在聚合物组成方面由单一颗粒群组成的微包封的miR-92a抑制剂的方法。

因此，本发明的另一个方面是用于将microRNA抑制剂微包封成聚合物微球的方法，包括：(a)将microRNA抑制剂溶于不包含任何稳定剂的纯化水中；(b)将聚合物溶于有机溶剂中；(c)将(a)添加至(b)以产生第一乳剂；(d)将步骤(c)的乳剂添加至包含表面活性剂和渗透剂的水溶液中以产生第二乳剂；(e)硬化并收集步骤(d)中所得微球；和(f)干燥。

更具体地，本发明还涉及用于制备如上所述的组合物的方法，其特征在于它包括以下步骤：

a)将microRNA抑制剂溶于不包含任何稳定剂的纯化水中；

b)将聚合物溶于有机溶剂中；

c)将(a)添加至(b)以产生第一乳剂；

d)将步骤(c)的乳剂添加至包含表面活性剂和渗透剂的水溶液中以产生第二乳剂；

e)硬化并收集步骤(d)中所得微球；和

f)干燥所得微球。

本发明的另一个方面是根据本发明的组合物用于治疗心肌梗死的用途。

换言之，本发明涉及包含有效量的至少一种microRNA或其前体的抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成用于治疗心肌梗死的聚合物生物可降解且生物相容的微球。

在一个优选的实施方案中，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

本发明的还有另一个方面涉及在需要其的受试者中逆转或预防心室重构的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述组合物。

换言之，本发明涉及包含有效量的至少一种microRNA或其前体的抑制剂的组合物，其中将所述抑制剂微包封成在需要其的受试者中逆转或预防心室重构的方法中使用的聚合物生物可降解且生物相容的微球。

如已经提及的，根据本发明的组合物适合于通过冠状动脉内途径施用。

为了通过冠状动脉内途径施用，微球必须悬浮于合适的介质中，包含或不包含表面活性剂的盐水溶液(PBS)或用于静脉施用的另一种合适介质。合适的分散剂包括，例如表面活性剂，如聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、羧甲基纤维素或聚糖如海藻酸钠；也可能添加等渗剂如氯化钠、甘露醇、山梨糖醇或葡萄糖。考虑到冠状动脉的大小，调节施用介质中微球的浓度以限制血流改变并预防动脉栓塞的风险。该浓度可以在0.05％-1％，优选0.1％-0.5％之间变化。施用可以通过单次注射或重复注射，接着任选的盐水注射。施用可以在经皮冠状动脉成形术之后，非限制性地施用相同导管进行。

本发明方法的特征是，所述施用由通过冠状动脉内途径的施用组成。

该方面尤其令人感兴趣，因为它解决了直接静脉施用化合物，例如像antagomir一样的寡核苷酸的几种预设的限制。在其他预设的限制中，可以提及i)由于miRNA的普遍性和低器官特异性的低水平生物安全性，ii)为了使microRNA抑制剂产生其效果的高剂量和重复注射，和iii)计算的静脉剂量的高理论成本。

出人意料地，阅读以下实施例后将更加明显，本发明解决了所有这些问题。

更具体地，它显示：

a)可以在供应病变组织的动脉中选择性施用包封的antagomir(参见实施例5)；

b)微球保留在动脉中(参见实施例6)；

c)微球的动脉内施用用于肿瘤栓塞，能够永久干扰血流并阻止肿瘤发展，任选地与活性释放物质组合。考虑到这些因素，考虑栓塞风险的存在。为此，以确定微球对心肌不会造成损害或在冠脉流量上产生任何显著改变为目的设计了研究(参见实施例7)；

d)microRNA抑制剂在介质中的良好稳定性以及所述抑制剂从微球的持续释放；这通过它的生物效果同时在施用后长达10天抑制microRNA来证实(实施例8)；

e)施用具有miRNA抑制剂的微球促进受损组织的收缩恢复，并预防有害梗死后重构的发生(参见实施例9)；

f)通过局部施用微球，可以将抑制剂剂量降低至单次注射，这意味着潜在副作用的明显降低和成本的明显减少。

根据本发明的用于控制施用、递送和释放microRNA抑制剂的合适介质/系统的可用性具有以下优势：

–提高生物安全性，因为药物在不是治疗靶标的组织和器官中的生物分布是有限的；

–避免重复的静脉注射i)通过提高患者的支持质量减少住院和门诊就诊，ii)避免长时间静脉注射药物施用的需要以及由此造成的潜在风险，和iii)使静脉注射产物的固有风险(感染、局部反应……)最小化；

–减少剂量允许减少剂量依赖性的不良反应；

–所需剂量减少使成本降低以及重复注射所需的职员和设备减少。

在另一个实施方案中，本发明涉及生物可降解且生物相容的微球群体用于治疗或预防心肌梗死后心室重构的用途，其中所述微球：

–平均直径为5-15μm；

–用聚-d,l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚-d,l-丙交酯(PLA)或其共混物制成；

–包含1％-10％w/w的能够预防心室重构的治疗剂，

其中所述治疗剂由涉及血管生成的microRNA或其前体的抑制剂组成，优选选自miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)的microRNA，更优选miR-92a，其中所述microRNA的抑制剂优选是antagomir。

本发明还涉及试剂盒，包含至少i)根据本发明的组合物和/或微球；ii)置放所述组合物的注射器或小瓶或安瓿。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括置于溶剂容器中的溶剂。所述溶剂容器可以是小瓶、安瓿或预充式注射器。

微球和溶剂可以置于双隔室预充式注射器中。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在小瓶中包含微球，在单独小瓶中包含溶剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在小瓶中包含微球，在单独安瓿中包含溶剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在小瓶中包含微球，在预充式注射器中包含溶剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在预充式注射器中包含微球，在单独小瓶中包含溶剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在预充式注射器中包含微球，在单独安瓿中包含溶剂。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以在双隔室注射器中分别包含微球和溶剂。

参考以下实施例，本发明将更好被理解。

具体实施方式

实施例1：制备载有antagomir-92a的微球

通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0.2dL/g且包含游离的末端羧基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烷添加至0.6gPLGA。将0.3ml纯化水中的Antagomir-92浓缩溶液(I-Ssc-miR-92a；分子量:5366g/mol(也称为Da)；序列:CCGGGACAAGTGCAAT；DNA碱基:9；LNA碱基:7；生产商:IDT(Exiqon))(222mg/ml)添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化20s。将这种初级乳剂添加至由1％(w/v)聚乙烯醇和1％(w/v)氯化钠的水溶液组成的外相，并于约10300rpm均质化60s。将所得的第二乳剂(w/o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过搅拌蒸发二氯甲烷。将所得微球通过离心收集，用纯化水洗涤两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为9μm(82％在5-25μm之间，0％超过25μm)，包封效率为74％。

图1示出了所得微球的图像。

图2说明了微球尺寸的分布。

实施例2：制备载有RNA的微球

通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0.2dL/g且包含游离的末端羧基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烷添加至0.6gPLGA。将0.3ml不含RNAsa的纯化水中的RNA浓缩溶液(222mg/ml)(RNASigma5000-10000Da)添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化20s。将这种初级乳剂添加至由1％(w/v)聚乙烯醇和1％(w/v)氯化钠的不含RNAsa的水溶液组成的外相，并于约10300rpm均质化60s。将所得的第二乳剂(w/o/w)添加至一定体积的不含RNAsa的纯化水中，通过搅拌蒸发二氯甲烷。将所得微球通过离心收集，用不含RNAsa的纯化水洗涤两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为10μm(86％在5-25μm之间，0％超过25μm)，包封效率为73％。

实施例3：制备安慰剂微球

通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0.2dL/g且包含游离的末端羧基的50:50PLGA共聚物。将3ml二氯甲烷添加至0.6gPLGA。将0.3ml纯化水添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化20s。将这种初级乳剂添加至由1％(w/v)聚乙烯醇和1％(w/v)氯化钠的水溶液组成的外相，并于约10300rpm均质化60s。将所得的第二乳剂(w/o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过搅拌蒸发二氯甲烷。将所得微球通过离心收集，用纯化水洗涤两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为7μm(84％在5-25μm之间，0％超过25μm)。

实施例4：制备载有白蛋白荧光素异硫氰酸酯的微球

通过w/o/w乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，使用固有粘度为约0.2dL/g且包含游离的末端羧基的50:50PLGA共聚物。将1ml二氯甲烷添加至0.2gPLGA。将0.1ml白蛋白荧光素异硫氰酸盐水溶液(20mg/ml)添加至PLGA有机溶液中，并超声乳化15s。将这种初级乳剂添加至由1％(w/v)聚乙烯醇和1％(w/v)的水溶液组成的外相，并于约10300rpm均质化60s。将所得的第二乳剂(w/o/w)添加至一定体积的纯化水中，通过搅拌蒸发二氯甲烷。将所得微球通过离心收集，用纯化水洗涤两次，然后冷冻干燥。微球的平均直径为9μm(91％在5-25μm之间，0％超过25μm)。

实施例5：供应靶组织的动脉中选择性施用的研究

在大白猪中触发AMI之后，通过置于供应梗死区域的对AMI负责的动脉的2.5/12同轴气球，通过冠状动脉内途径施用30mg如实施例4所示制备的包含荧光白蛋白的微球。将微球原位悬浮于10ml包含Tween-80的生理盐水溶液中；连续两次注射5ml，每次后接着注射5ml生理盐水溶液。实验显示可以在供应病变组织的动脉中选择性施用包封的antagomir。

实施例6：微球保留在病变组织的毛细血管中而不外流至血流的研究

通过置于中间前降支的同轴气球通过冠状动脉内途径施用，在猪模型上进行4次试验，注射2次，每次5ml如实施例4所示制备的荧光微球。将4只动物安乐死，获得毗邻前降支的组织和被其他冠状动脉冲洗的对照组织的心肌样品。通过光学荧光显微镜观察样品，证实存在保留于受损心肌毛细血管中的微球，以及其不存在于对照组织中。

为了排除全身性生物分布的可能性，在前述动物的两只中，除缺血和对照心肌组织外，从肺、脾和肝获得5个重复样品，用B光的光学显微镜观察。仅在前壁心肌壁中检测到荧光。该分析揭示了微球保留在心脏中，避免了antagomir92a的全身性释放(减少副作用)。

实施例7：微球保留在病变组织的毛细血管中而不损害靶组织本身的研究

进行实验来调查潜在的局部心脏毒性和治疗安全性剂量范围。为了检测局部缺血对心肌的损害，采用了在其检测缺血能力上高度敏感的2个配对压电晶体。当心肌组织受缺血影响时，其他组织出现运动障碍并溶胀；这与由其余连续健康组织产生的血压一起使微晶体分离并进一步远离彼此。在进行了开胸手术和心包切除之后的两只猪中插入两对微晶体，一对对照在外侧区，和一对在由前降支(微球通过此施用)供应的前区。对于每对培养基晶体，测量在心脏周期期间的两个点上它们之间的距离：在舒张结束(EDL)和收缩结束(ESL)。EDL和ESL之间的关系用参数SS(收缩缩短：(EDL–ESL)/EDL)表示。当左心室收缩完全消失时，EDL＝ESL，SS＝0。正常值在0.2±0.1的范围。如附图所示，研究剂量诱导了每次注射后持续几秒钟的最小和瞬间振动，这对应于第一次和第二次注射。并且，出乎意料地，重复冠状功脉内注射根据实施例4制备的荧光微球达到研究剂量的14倍，没有观察到局部副作用。限制性最大剂量不与不可逆的缺血损害、血液动力学影响(hemodynamicrepercussion)或心律失常相关。

此外，为了检测冠脉流量的变化，将流量传感器置于中间LAD来测量冠脉流量。冠状动脉注射后没有观察到冠脉流量的明显变化。

结果由其中注射了120mg微球的图3和其中注射了240mg微球的图4说明。

实施例8：单次冠状动脉内注射具有小剂量antagomir的微球的分子效应的研究

为了说明小剂量微包封的antagomir可以产生分子反应，冠状动脉内施用包封的antagomir-92a后测量缺血和对照组织中miR-92a的体内表达。在3只猪中，将60mg根据实施例1制备的包含antagomir-92a的微球(0.1mg/Kg)递送至LAD。处理后第1天、第3天和第10天将动物安乐死，在2个重复梗死和对照样品中，通过总RNA分离以及使用特定引物的实时定量RT-PCR定量miR-92a的表达，以内源microRNA作为对照(miR-123、203和126)(参见图5)。

在梗死组织中，miR-92a的表达与对照组织相比下调了8倍，而内源miR的表达不受处理影响。抑制从早至第1天开始存在，并在第10天仍然存在，比对照区的表达水平低5倍。

在内源miR中没有检测到明显调控。这些结果揭示，介质/系统为antagomir-92a的控制递送和释放提供足够条件，从而用单次冠状动脉内施用产生了microRNA-92a的持续抑制。

图6所示的这些结果也证实了antagomir在微球制备过程中没有被降解。

实施例9：单次冠状动脉内注射包含低剂量antagomir的微球的生物效应的研究

为了说明微球输送的antagomir-92a的分子效应是否伴随生物效应，用26只成年小猪进行了临床前研究。该研究的目的是调查通过选择性冠状动脉内施用包封的antagomir-92a来抑制mir-92a是否会导致梗死区血管生成的增强，从而预防心室重构的发生。

施用3种制剂：

-盐水溶液(对照制剂)

-根据实施例3制备的安慰剂微球

-根据实施例1制备的antagomir-92a微球，以3mg/小猪为一次antagomir剂量。

处理后4周，与对照相比，在接受包封的antagomir-92a的那些动物中的坏死区中检测到明显更高的血管密度，从而证实了在之前研究中观察到的antagomir-92s的促血管生成活性(161.57±58.71vs安慰组的68.49±23.56vs盐水组的73.91±24.97,p＝0.001)。

ii)血管密度(参见图7)

微血管形成在梗死区以及周边梗死边缘均有增加。那些处理动物中的微血管阻力指数一直显示较低(200.67±104.46vs对照的511.73±202.1,p＝0.007)，这与血管密度显著相关(R²0.41,p＝0.02)(参见图8)。

处理组中的基线微循环阻力(基线MR)和实际微循环阻力(TMR(hyp))显著低于对照组(分别是7.47±1.33vs19.62±2.98,p＝0.005和5.0±1.15vs14.49±2.4,p＝0.006)。基线和实际微循环阻力与血管密度显著相关(分别是R20.35,p＝0.033和R20.31,p＝0.047)(参见图9)。

这些数据表明包封的antagomir-92a在体内诱导了持续血管生成。

发现生长血管后，因此进一步调查它在AMI之后发生的愈合过程中的潜在益处。为了确定包封的antagomir-92a对心室重构的作用，比较了处理和未处理组的通过立体磁共振成像(CMR)的形态和结构参数，以及通过血管内超声心动图(IVE)分析的功能性参数。与处理动物相比，对照在IVE中存在明显更高百分比的具有前区和隔顶运动障碍的动物(p＝0.03)(尤其参见图10)，在离体CMR中也具有明显更高的受损心室壁减薄以及左心室中有害重构的形态变化(表3)。

更具体地，图10说明了通过血管内超声心动图(IVE)分析区域壁运动功能障碍的结果。通过使用VividQ超声成像器(GEHealthcare,Belford,UK)和置于右心室顶端的超声导管(Siemens)来进行。

本研究的结果表明施用antagomir-92a微球与急性心肌梗死后有害重构的统计学上显著的减少有关。

表3：CMR中左心室重构的参数

包封的antagomir-92a阻止在急性心肌梗死1个月后的有害的左心室重构。测定各小猪中离体CMR的所有梗死片中计算的不同重构参数。示出了四只小猪中代表性的L2片(在L1顶端)。T_{最大梗死壁}＝平均最大梗死壁厚度，用各片中最大梗死壁厚度的∑除以受影响的片数来计算；T_正常后壁＝在后乳头肌插入旁边测量的正常后壁的平均厚度，用各受影响片中后壁厚度的∑除以受影响的片数来计算；平均最小减薄百分比用[100–(T_{最大梗死壁}/T_正常后壁x100)]来计算；T_{最小梗死壁}＝平均最小梗死壁厚度，用各受影响片中最小梗死壁厚度的∑除以受影响的片数来计算；平均最大减薄百分比用[100–(T_{最小梗死壁}/T_正常后壁x100)]来计算；D_R：梗死壁与对侧正常壁之间的平均最大直径，用各梗死片中梗死壁之间最大直径的∑除以受影响的片数来计算；D_N：正常壁之间的平均最大直径，与D_R形成直角，与心室腔中心最近，用各梗死片中正常壁之间最大直径的∑除以受影响的片数来计算；D_R/D_N：平均球形指数，用各梗死片中D_R/D_N的∑除以受影响的片数来计算。表中数据以平均值±s.e.m表示。

代表性CMR的结果表明：

A：小猪14(诱导AMI之后立即死亡)的心脏NMR和IVE：由于紧接着AMI之后发生死亡，没有足够的时间触发重构过程。这就是为什么观察到同轴左心室在所有片段中具有相似的尺寸。

B：AMI后20-30天小猪的心脏NMR和IVE：有害心室重构的证据：AMI后一个月，在CMR上观察到前隔段的极度消瘦，并在IVE上观察到动脉瘤形成和运动障碍，这是典型的AMI后有害重构。

C：AMI后22-30天小猪的心脏NMR和IVE：没有心室重构：AMI后一个月，在IVE中观察到前隔区中顶叶区域的轻度减少，没有动脉瘤形成，没有运动障碍。这是AMI后有利修复反应的典型情况。

实施例10：包封的antagomir-92a诱导血管肿瘤或在短期死亡率中的作用的研究

在对所有动物进行的尸检分析中没有观察到血管肿瘤，从而表明在远距离的其他器官中缺少对microRNA-92a的异位全身性抑制。研究的死亡率是23％。没有观察到短期死亡率的差异。只有一只施用包封的antagomir92a的小猪死亡(p＝0.39)。

表4

实施例11：对包封的antagomir-92a致心率失常谱的研究

为了解包封的antagomir-92a致心率失常的可能性，通过Collect5S软件(GE)记录并分析操作期间所有的心律失常事件。此外，为了解决这个问题，在研究的26只小猪中的10只中随机植入可插入式循环记录仪以检测潜在心律失常的发作直至死亡(梗死形成以及处理后一个月)。与对照相比，在处理组中没有观察到玛琳心动过速(malignetachyarrhythmias)或心动过缓(bradiarrhythmias)，表明冠状动脉内包封的antagomir-92s没有致心率失常的作用。

表5：研究期间检测到的心律失常

PVC：室性早搏波群(prematureventricularcomplexes)，NSVT：非持续性室性心动过速，

IVR：心室自主心律，

PSVC：室上性早搏波群

AMI：急性心肌梗死

实施例12：包封的antagomir-92a和未包封的antagomir-92a对 miR92a体外表达的作用的评估

12.1：材料和方法

a.细胞

使用通过融合原代人脐静脉细胞和肺细胞A549的硫鸟嘌呤抗性克隆(CRL-2922^TM)建立的人脐静脉细胞系EA.hy926。

b.处理

将大约500000个EA.hy926细胞接种在六孔板上，并于标准条件下(37℃,5％CO2)在添加有10％胎牛血清(FBS)和2mML-谷氨酰胺(Sigma,L’Isled’abeau,France)的RPMI1640中孵育。然后用包含各自antagomir及其相应对照(PBS或微球)的新鲜完整PRMI培养基替换培养基。用10和150nM的antagomir92a(游离的，三批antagomir92a微球)、包封的antagomir17或包封的antagomir20处理EA.hy926细胞。在收集用于提取RNA之前，将细胞进一步孵育24h。提取总RNA，并通过定量RT-PCR定量miRNA的表达。

c.RNA提取

根据生产商的说明(Qiagen,Courtaboeuf,France)，分别用QiagenRNeasy微型版(参考号74106)和RNeasy+通用试剂盒(参考号73404)从EA.hy926细胞和小猪组织中分离miRNA。用NanoDropND1000分光光度计(LabtechInternational,Paris,France)评估提取的RNA的质量和纯度。

d.miRNA的逆转录

使用TaqManMicroRNA逆转录试剂盒(LifeTechnologies,参考号4366596)在包含5ng总RNA和特定miRNA探针的15ml终体积中逆转录miRNA。将样品于16℃孵育30分钟，于42℃孵育30分钟，并通过加热至85℃5分钟使逆转录酶失活，然后一直冷却在4℃。

e.实时RT-PCR

理论基础。从Ct数获得定量值，在该Ct数信号的增加与开始被检测的PCR产物的指数增长相关(根据生产商手册，使用QuantStudio6and7Flex软件)。为了控制原料量的差异，将数据归一至2个内源对照(miRNA103和miRNA191)的几何平均数，所述对照的表达水平经验上表明不会随处理而变化。随后将靶miRNA的值归一，从而使对照中靶miRNA的值等于1。结果用DDCt计算方法(RQ分析软件,Applied)表示。

PCR扩增。用QuantStudio^TM6Flex实时PCR系统和TaqMan探针(Applied)进行所有的PCR反应。热循环条件包括初始变形步骤(95℃，10分钟)和45个循环(95℃，15s和65℃，1分钟)。重复测试样品。

12.1：结果

10nM游离的和包封的antagomir-92a均抑制了miR-92a的表达，其中下降约90％。

150nM游离的和包封的antagomir-92a之后miR-92a的表达不可检测。

Antagomir-92a处理没有显著减少miR-17或miR-20a的表达。

图11总结了这些数据。

实施例13：三种包封的antagomir(antagomir17、20a和92a)对其各自miR表达的作用的体外评估

13.1制备载有antagomir-17的微球

通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物(i.v.0.2dL/g)制备微球。在PLGA有机溶液中乳化antagomir-17(HSA-miR-17-5p；分子量:5305Da；序列:CTGCACTGTAAGCACT；来自Exiqon)溶液。转而将所得乳剂融入分散的水相，并均质化以获得理想的粒径。最后，蒸发溶剂之后，将所得微球冷冻干燥。微球的平均直径为10μm，antagomir-17含量为7.3％。

13.2制备载有antagomir-20a的微球

通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物(i.v.0.2dL/g)制备微球。在PLGA有机溶液中乳化antagomir-17(HSA-miR-20a；分子量:5289Da；序列:CTGCACTATAAGCACT；来自Exiqon)溶液。转而将所得乳剂融入分散的水相，并均质化以获得理想的粒径。最后，蒸发溶剂之后，将所得微球冷冻干燥。微球的平均直径为10μm，antagomir-20a含量为6.8％。

13.3结果

材料和方法与实施例12相同。

-miR-17被10nM包封的antagomir-17抑制了76％。150nM包封的antagomir-17处理完全消除了miR17的表达。

-miR-20a被10nM包封的antagomir-20a处理抑制了7％，被150nM包封的antagomir-20a处理抑制了87％。

图12示出了结果。

实施例14：具有载量、大小和丙交酯/乙交酯比例特征的三批 antagomir92a微球的体外评估

14.1制备具有低antagomir-92a载量的微球(L13250:聚合物: RESOMERRG502H)

如实施例1所述，通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物(i.v.0.2dL/g)制备微球，但采用较低的药物初始量和较高的搅拌速度以制备具有低antagomir-92a含量的较小微球。微球的平均直径为7μm，antagomir-92a含量为1.5％。

14.2制备具有高antagomir-92a载量的微球(L13262:聚合物: RESOMERRG502H)

如实施例1所述，通过乳剂/溶剂蒸发方法使用50:50PLGA共聚物(i.v.0.2dL/g)制备微球，但采用较高的药物初始量和较低的搅拌速度以制备具有高antagomir-92a含量的较大微球。微球的平均直径为15.6μm，antagomir-92a含量为9.8％。

14.3使用长效聚合物制备载有antagomir-92a的微球(L13230: 聚合物:LACTELB6006)

如实施例1所述通过乳剂/溶剂蒸发方法制备微球，但采用具有高分子量的85:15PLGA共聚物(i.v.0.64dL/g)，以获得药物缓释。微球的平均直径为12μm，antagomir-92a含量为3.1％。

14.4结果

检测具有载量、大小和丙交酯/乙交酯比例特征的三批antagomir92a微球。

根据微球含量，在2和30nM检测L13250，在14和210nM检测L13262，以及在4和66nM检测L13230。

L13250、L13262和L13230完全消除了miR92a的表达。

Claims

1.一种组合物，包含有效量的涉及血管生成的miRNA或其前体的至少一种抑制剂，其中将所述抑制剂微包封成聚合物生物可降解且生物相容的微球。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述miRNA选自miR-92(包括miR-92a-1、miR-92a-2和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-1和miR-16-2)、miR-374(包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1和miR-24-2)、miR-483、miR-34(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)、miR-20(包括miR-20a和miR-20b)、miR-15(包括miR-15a和miR-15b)。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述miRNA由以下成熟miRNA组成：

4.权利要求1所述的组合物，其中所述miRNA前体由以下组成：

5.权利要求1-4所述的组合物，其中所述miRNA抑制剂是长度为8-49个核苷酸的具有靶向所述miRNA或其前体的序列的寡核苷酸。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述寡核苷酸是与所述靶miRNA或其前体至少部分互补的反义寡核苷酸。

7.权利要求6所述的组合物，其中所述反义寡核苷酸选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、吗啉代寡核苷酸或它们的组合。

8.权利要求6所述的组合物，其中所述寡核苷酸由antagomir组成。

9.权利要求8所述的组合物，其中所述antagomir包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含至少16个与选自SEQIDNO：1-58的序列的核苷酸互补的连续核苷酸。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述antagomir包含序列SEQIDNO：59或60及其除碱基替换之外的修饰，以及由至少8个连续核苷酸的SEQIDNO：59或60的子序列组成的片段。

11.权利要求1-10所述的组合物，其中所述微球的直径不超过25μm。

12.权利要求1-10所述的组合物，其中至少50％的所述微球的直径为5-20μm，优选5-15μm。

13.权利要求1-12所述的组合物，其中所述微球包含1％-15％w/w的抑制剂。

14.权利要求1-12所述的组合物，其中所述微球包含1％-10％w/w的抑制剂。

15.权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d,l-丙交酯(PLA)组成的聚合物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物共混。

16.权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d,l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)组成的共聚物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物共混。

17.权利要求1-14所述的组合物，其中所述微球用由聚-d,l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)和聚-d,l-丙交酯(PLA)组成的聚合物共混物制成。

18.权利要求16或17所述的组合物，其中PLGA聚合物中丙交酯：乙交酯的比例为50:50至95:5摩尔比。

19.权利要求16-18所述的组合物，其中所述聚合物的固有粘度为0.1-0.70dl/g。

20.前述权利要求任一项所述的组合物用于治疗心肌梗死的用途。

21.权利要求20所述的组合物，其中所述心肌梗死是急性心肌梗死。

22.在需要治疗的受试者中逆转或预防心室重构的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-19任一项所述的组合物。

23.权利要求22所述的方法，其中所述施用是通过冠状动脉内途径施用。

24.生物可降解且生物相容的微球群体用于治疗或预防心肌梗死的用途，其中所述微球：

–平均直径为5-15μm；

–由聚-d,l-丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚-d,l-丙交酯(PLA)或它们的共混物制成；

–包含1％-15％w/w的能够预防心室重构的治疗剂；

25.权利要求24所述的微球，其中所述抑制剂是antagomir。

26.一种试剂盒，包括至少i)根据权利要求1-19所述的组合物和/或根据权利要求24或25所述的微球；ii)置放所述组合物的注射器或小瓶或安瓿。

27.权利要求26所述的试剂盒，进一步包括置于溶剂容器中的溶剂。