CN117660450A

CN117660450A - 一种miRNA核酸分子、药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用

Info

Publication number: CN117660450A
Application number: CN202311511893.1A
Authority: CN
Inventors: 韦晓玲; 刘月华; 徐华兴; 周梦琪; 周强强
Original assignee: Shanghai Stomatological Hospital Shanghai Stomatological Health Center
Current assignee: Shanghai Stomatological Hospital Shanghai Stomatological Health Center
Priority date: 2023-11-14
Filing date: 2023-11-14
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有促进血管生成功能的经化学修改的miRNA核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用。

Description

一种miRNA核酸分子、药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有促进血管生成功能的经化学修饰的miRNA核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用，尤其在制备用于促进牙髓再生的药物中的应用。

背景技术

随着人们生活习惯、饮食结构的改变，牙髓炎和牙髓坏死的发病率逐渐增高。年轻恒牙常因严重龋坏、外伤导致牙髓组织炎症或坏死，影响牙根正常发育，成人多因牙髓炎导致牙髓不可逆坏死。牙髓是一种高度血管化的结缔组织，牙髓内的血管仅通过根尖孔和根尖处的牙周组织相通，这种独特的血供方式限制了牙髓修复再生能力,当牙髓组织因感染而发生炎症时难以自行恢复。牙根未发育完全的年轻恒牙发生牙髓严重病变时目前临床上普遍通过根尖诱导成形术进行治疗，该方法是在消除感染的基础上通过诱导根尖部尚存的牙乳头细胞、牙髓细胞等增殖分化并诱导根尖部钙化以封闭根尖，但该方法预后受牙髓坏死时牙根发育程度、残存的具有再生能力的细胞量及活力限制，如果根尖部残留的细胞量不足或者细胞状态不佳，即使治疗后牙根能继续发育，也会出现根管壁厚度不足、牙根长度不足及根尖形态异常等问题。

此外，对牙髓坏死的年轻恒牙还可采用根尖屏障术治疗，该方法是通过在根尖处充填生物相容性材料进行物理封闭，但该治疗方法无法使牙根继续发育，因此会导致牙根长度不足、牙列不齐及萌出高度不足等后果。当牙根已经发育完全的恒牙发生不可逆性牙髓炎和牙髓坏死时，首选根管治疗，即彻底清理根管内坏死组织，扩大成形根管并对根管消毒后严密充填。这种治疗方式后根管内仅有充填材料，已丧失牙髓组织，缺乏氧气血供而使牙齿变脆，远期可能导致牙冠或牙根折裂；同时根管内缺乏免疫防御及神经末梢感觉，会导致生理防御功能缺失引起根尖创伤等。

2001年学者首次提出牙髓血运重建术，即在彻底有效的根管消毒基础上，刺穿牙髓和根尖周组织引起根管内出血，待形成血凝块后再将MTA覆盖表面封闭根管口。该方法可通过血凝块为细胞提供良好的增殖分化微环境并获得少量类似牙髓的再生组织，在一定程度上可使牙根继续生长，但牙髓血运重建术无法恢复患牙生理功能，此外有研究结果表明术后髓腔内再生的组织为牙髓和肉芽组织混合物，并非健康牙髓，因此有生物学功能的牙髓再生是未来牙髓疾病治疗的趋势。但现阶段成熟恒牙牙髓再生存在许多难题，其中根管及根尖孔的特殊结构导致的血管网络难以重建是重中之重。组织再生过程中植入物需要充足的血供以获取氧气、营养物质并带走代谢废物以存活，然而，初移植时植入物只能完全依赖现有毛细血管扩散来的氧气，其最大扩散距离只有100-200um，超过这一距离细胞将因缺氧凋亡，极大降低了植入物的生存率。因此需要新的血管从宿主血管中萌发出来，穿透细胞外基质互相连接，但宿主血管长入速度十分缓慢，据研究，单个血管的平均延伸率为5um/h，在12mm长的根管中，微血管从根尖孔直线生长至髓腔大概需要100d。因此牙髓再生中组织快速形成自身局部微血管及与根尖周进行血管网络吻合以恢复血供是成熟恒牙牙髓再生的关键问题。

2005年，有学者通过干细胞移植探索牙本质-牙髓复合体的再生，发现了牙髓干细胞(DPSCs)在牙髓再生方面的潜力，其牙髓干细胞位于牙髓微环境中靠近血管的战略位置，通过影响血管生成发挥着关键作用。DPSCs具有强大的旁分泌能力，能释放促进血管生成所必需的生长因子和细胞因子，协调血管内皮细胞的迁移、增殖和毛细血管样结构的形成，加速功能性血管网络的形成。此外，DPSCs的旁分泌信号还能调节血管生成因子的表达，营造有利于血管萌发和生长的环境。因此，利用DPSCs促血管生成的策略是促牙髓再生十分有潜力途径。

微小RNA(miRNA)在推动干细胞介导的血管生成方面已展现出令人瞩目的前景。这些小型非编码RNA可协调转录后基因表达，影响各种细胞生物学过程，包括血管生成。利用miRNAs的血管生成能力，有望促进血管网络形成和牙髓再生。然而，miRNAs容易被体液和组织中的核糖核酸酶降解，因而不稳定。它们向包括DPSCs在内的靶细胞的有效传递也受到尺寸、电荷和结构障碍的阻碍，导致传递效率低下。

因此，需要开发一种能够将具有血管生成功能的miRNA有效递送到DPSCs在内的靶细胞中的递送体系，促进血管网络形成和牙髓再生。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有促进血管生成功能的经化学修饰的miRNA核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进组织再生的药物中的应用，以解决目前牙体组织再生血管生成困难的问题，并实现加速血管网络的形成以促进牙体组织再生。

为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

第一个方面，本发明提供一种经化学修饰的miRNA核酸分子，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为选自具有促进血管生成功能的miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被化学修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被化学修饰的核酸分子。

优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA或经甲氧基或氟取代的LNA修饰；

其中，

所述LNA的化学式为：

所述经甲氧基取代的LNA的化学式为：

所述经氟取代的LNA的化学式为：

优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的5’端和3’端中的至少一端被如下所示的硫代磷酸酯修饰：

优选地，所述miR-126-3p的核苷酸序列为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG，所述miR-21-3p的核苷酸序列为CAACACCAGUCGAUGGGCUGU，所述let-7b-5p的核苷酸序列为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU，所述miR-210-3p的核苷酸序列为CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA。

优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA、2’-O-Me或2’-Fluoro修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰。

优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第3位G碱基、第6位C碱基、第10位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基插入LNA修饰，第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基、第17位A碱基插入2’-O-Me修饰，3’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod1；所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第1位U碱基、第6位C碱基、第11位A碱基、第16位U碱基和第21位C碱基插入2’-O-Me修饰，第4位U碱基、第7位C碱基、第11位A碱基、第14为A碱基和第19位U碱基插入2’-Fluoro修饰，5’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod2；所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基和第17位A碱基插入LNA修饰，第3位G碱基、第8位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基和第22位G碱基插入2’-O-Me修饰，5’端和3’端分别插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod3；优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为126-Mod1。

第二个方面，本发明还提供一种药物组合物，包括如上所述的经化学修饰的miRNA核酸分子。

优选地，所述药物组合物还包括用于递送和控释所述经化学修饰的miRNA核酸分子的载体。

优选地，所述载体为DNA纳米材料，优选地为DNA四面体核酸框架(tFNAs)。

优选地，所述药物组合物为经化学修饰的miRNA核酸分子负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为miR@TDN；优选地为经化学修饰的miR-126-3p负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为miR-126@TDN；更优选地为126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为126-Mod1@TDN。

优选地，所述药物组合物的粒径为10-100nm，优选地为10-75nm，更优选地为10-50nm；在所述药物组合物中，126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的负载率为10％-60％，优选地为30％-60％，更优选地为40％-60％。第三个方面，本发明还提供一种如上所述的药物组合物在制备用于促进牙体组织再生的药物中的应用。

优选地，所述组织再生包括牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、皮肤和黏膜再生、血管再生、肌肉和肌腱再生、心肌细胞再生、角膜再生、视网膜再生、外周神经元再生、中枢神经元再生、胰岛再生和脂肪再生中的至少一种，优选地为牙髓再生。

优选地，将miR@TDN转染至牙髓干细胞(DPSCs)；优选地，将126-Mod1@TDN转染至牙髓干细胞(DPSCs)。

优选地，126-Mod1@TDN能显著提高牙髓干细胞(DPSCs)中的CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的蛋白表达水平。

优选地，牙髓干细胞(DPSCs)对126-Mod1@TDN的吸收效率在吸收30分钟后为20％-30％、在吸收60分钟后为40％-60％。

优选地，126-Mod1@TDN在牙髓干细胞(DPSCs)中的摩尔浓度为100-300nmol/L，优选地为200nmol/L。

优选地，将miR@TDN转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；优选地，将126-Mod1@TDN转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

优选地，将凝胶、miR@TDN、牙髓干细胞(DPSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中；优选地，将凝胶、126-Mod1@TDN、牙髓干细胞(DPSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的用于促进牙髓再生的药物组合物中，将具有促进血管生成功能的经化学修复的miR-126-3p(126-Mod1)负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中获得miR@TDN(或126-Mod1@TDN)纳米药物递送颗粒，易于制备及验证，可为日后临床上治疗疾病提供更多选择；

(2)TDN可以高效携带micro RNA入胞，本发明实施例的实验结果证明，牙髓干细胞(DPSCs)对126-Mod1@TDN的吸收效率在吸收30分钟后为20％-30％、在吸收60分钟后为40％-60％，说明本发明的126-Mod1@TDN在被吸收30min或60min后即可递送micro RNA入胞，显著提高了micro RNA的作用效率；

(3)细胞增殖实验证明，本发明的miR@TDN(或126-Mod1@TDN)药物组合物的细胞毒性较低，不影响细胞增殖，同时可促进细胞迁移，增强细胞生物学活性，因此可以认为该药物组合物毒性低、安全可靠；

(4)本发明经化学修饰的126-Mod1@TDN药物组合物大大提升了micro RNA的稳定性，防止其入胞后降解，确保126-Mod1@TDN纳米药物递送复合材料将micro RNA携带入胞后能够持续发挥作用，极大发挥药效，节约经济成本；

(5)本发明的miR@TDN(或126-Mod1@TDN)药物组合物对牙髓干细胞(DPSCs)的旁分泌成血管因子的促进效果显著，体内外实验证明，本发明的miR@TDN(或126-Mod1@TDN)可以高效刺激牙髓干细胞(DPSCs)的旁分泌成血管因子以促进血管内皮细胞成血管，为牙髓再生过程中成血管难题提供了十分有潜力的解决方案，对日后临床上实现牙髓再生有着重要的借鉴意义。

附图说明

图1为促进血管生成的microRNA筛选。图中，(a)microRNA筛选过程示意图；(b)将let-7a、miR-21-3p、miR-126-3p和miR-210转染至牙髓干细胞(DPSCs)后，使用定量聚合酶链反应(qPCR)测定血管生成相关基因的表达水平；(c)使用Western印迹(WB)分析评估转染let-7a、miR-21-3p、miR-126-3p和miR-210对血管生成相关蛋白表达的影响；(d)对(c)中相关蛋白的表达进行定量分析；(e)利用管形成试验评估四种microRNA(let-7a、miR-21-3p、miR-126-3p和miR-210)的血管生成潜力；数据包括平均值±SD，统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***P<0.001，NS，无显著性；(f)对(e)中形成管腔的节点数、管腔数目、管腔面积及管腔长度的定量分析。

图2为microRNA的化学修饰和功能验证。图中，(a)miR-126-3p的三种化学修饰方法的设计示意图；(b)三种不同化学修饰后miR-126-3p的稳定性验证：将未修饰的miR-126-3p(miR-126)和修饰后的miR-126-3p(126-mod1、126-mod2、126-mod3)转染到牙髓干细胞(DPSCs)中，在不同的时间点(24小时、48小时、72小时和96小时)使用qPCR评估miR-126的基因表达；(c)化学修饰microRNA的功能验证：转染未修饰和不同修饰的miR-126至DPSCs后，血管生成相关蛋白表达的WB分析；(d)对(c)中相关蛋白的表达进行定量分析；(e)转染未修饰和不同修饰的miR-126至DPSCs后血管生成相关基因表达的qPCR分析；数据包括平均值±SD，统计分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS，无统计学意义。

图3为126-Mod1@TDN的制备、表征和生物相容性验证。图中，(a)126-Mod1@TDN制备示意图；(b)8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证了126-Mod1@TDN的成功合成；(c)126-Mod1@TDN分子结构的TEM图像；(d1)左图：DLS检测到的126-Mod1@TDN平均zeta电位(n＝3)，右图：动态光散射(DLS)检测到的126-Mod1@TDN的平均粒径(n＝3)；(d2)左图：DLS检测到的TDN平均zeta电位(n＝3)，右图：动态光散射(DLS)检测到的TDN的平均粒径(n＝3)；(e)126-Mod1@TDN的结构稳定性(上图：126-Mod1@TDNs在10％ FBS中24小时内的稳定性；中图：126-Mod1@TDNs在4℃环境中的稳定性；下图：126-Mod1@TDNs在不同浓度FBS中的稳定性)；(f)DPSC在30分钟和60分钟对126-Mod1@TDN的摄取能力；红色：Cy3-126-Mod1或Cy3-126-Mod1@TDN，蓝色：DAPI-细胞核，绿色：FITC-细胞骨架；标尺为20μm；(g)流式细胞仪分析DPSC对126-Mod1@TDN的摄取效率；(h)左图：f图荧光强度的定量统计(n＝3)，右图：流式细胞仪检测的细胞摄取定量统计(n＝3)，数据包括平均值±SD，统计分析：***P<0.001。

图4为126-Mod1@TDN对DPSC生物学行为的调控、增殖、迁移和血管生成相关标志物表达；图中，(a)126-Mod1@TDN调节hDPSCs行为的实验示意图；(b)CCK8试验评估不同浓度126-Mod1@TDN干预后hDPSCs的细胞活力，n＝3；(c)，(d)划痕试验和transwell试验评估miR@TDN、TDN和126-Mod1@TDN干预后hDPSCs的迁移能力；(e)定量分析图(c)和(d)中迁移细胞数量；(f)、(g)qPCR和Western印迹分析miR-126、TDN和126-Mod1@TDN干预后hDPSCs中血管生成相关基因和蛋白的表达，n＝3；(h)定量分析(g)中相关蛋白的表达水平；数据包括平均值±SD，统计分析：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。

图5为126-Mod1@TDN通过促DPSCs旁分泌促进血管生成；图中，(a)通过血管形成试验评估HUVECs的血管生成能力：六组实验包括经四种不同干预(PBS、miR-126、TDN或126-Mod1@TDN)处理的hDPSCs上清液，以及作为阳性对照的VEGF(50ng/ml)和作为阴性对照的PBS处理HUVEC 4小时后评估不同组的血管形成状况；(b)图a中的血管形成的图像定量分析；(c)、(e)对六种不同干预后HUVEC中血管相关蛋白和基因的表达进行WB和qPCR分析，n＝3；(d)对(c)中相关蛋白的表达水平进行定量分析；数据包括平均值±SD，统计分析：*P<0.05，***P<0.001，NS，无统计学意义。

图6为126-Mod1@TDN对体内血管生成的促进作用；图中，(a)Matrigel植入前和植入后14天的裸鼠照片；(c)Matrigel的总体观察；(d)、(e)血红素和伊红(HE)染色及CD31免疫组化染色显示新形成的血管，n＝3；(b)统计分析，包括管腔面积、红细胞阳性血管比例及CD31阳性管腔长度，n＝3；数据以平均值±SD表示，统计分析显示P<0.001，NS表示无显著性。

图7为转录组分析126-Mod1@TDN促hDPSCs旁分泌的潜在作用机制；图中，(a)根据126-Mod1@TDN-hDPSCs组和hDPSCs组的差异表达基因进行分析，每个数据点对应每个样本的PCA分析；(b)126-Mod1@TDN-hDPSCs组和hDPSCs组中差异表达的mRNA的维恩图；(c)显示126-Mod1@TDN-hDPSCs组和hDPSCs组基因表达差异的火山图，蓝点代表基因表达量明显降低，且变化倍数大于2，红点代表基因表达量明显上调，且变化倍数大于2；(d)热图显示了126-Mod1@TDN-hDPSCs组和hDPSCs组血管生成相关基因的表达，进一步验证了126-Mod1@TDN促DPSCs血管生成的生物学功能；(e)气泡图显示了差异表达基因的KEGG通路分析结果(差异表达基因的前20个KEGG通路)。

图8为126-Mod1@TDN在体内牙髓再生模型中促进血管生成；图中，(a)裸鼠异位牙髓再生模型示意图；将凝胶、hDPSCs(人牙髓干细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和126-Mod1@TDN的混合物注入牙齿磨片中；随后，将这些牙齿磨片皮下移植到裸鼠背部，让其再生6周；(b)6周后取出的牙齿磨片总体观察及其苏木精和伊红(H&E)染色的切片；免疫荧光染色可观察到作为血管标记的人CD31表达；(c)免疫荧光图像显示，移植细胞形成的血管中存在人类线粒体(绿色)，表明移植细胞参与血管的形成；(d)、(e)、(f)、(g)进行了定量评估，包括细胞计数、血管生成率(来自b组H&E染色切片)、CD31阳性管腔长度(来自b组免疫组化染色)以及再生血管中表达人线粒体的血管比例(来自c组)；数据基于一式三份的实验(n＝3)，以平均值±标度表示；进行了统计分析，显著性水平如下：**P<0.01，**P<0.001，NS表示无显著性。

具体实施方式

本发明提供了一种具有促进血管生成功能的经化学修饰的miRNA核酸分子、包括该核酸分子的药物组合物及其在制备用于促进牙体组织再生的药物中的应用。

<具有促进血管生成功能的miRNA核酸分子>

本发明选择的四种miRNA核酸分子miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p已被证实具有促进血管生成方面的作用，这四种miRNA核酸分子的核苷酸序列为：

miR-126-3p的核苷酸序列：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG；

miR-21-3p的核苷酸序列：CAACACCAGUCGAUGGGCUGU；

let-7b-5p的核苷酸序列：UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU；

miR-210-3p的核苷酸序列：CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA。

本发明通过实验证明，将这四种micro RNA转染至hDPSCs后，这四种micro RNA都能显著上调关键的血管生成相关标记物的表达，例如eNOS、EP、CD31、FGF2和HIF-1α(图1a)，miR-126-3p的影响尤为明显，它诱导的eNOS和FGF2表达水平明显高于其它三种micro RNA(图1b)。

<经化学修饰的四种miRNA核酸分子>

为了延长上述四种micro RNA在细胞环境中的存在时间和有效性，需要通过化学修饰方法增强其稳定性和功能性。

本发明提供的经过化学修饰的miRNA核酸分子为选自上述miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被化学修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被化学修饰的核酸分子。

在一个优选实施例中，本发明提供的经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA或经甲氧基或氟取代的LNA修饰；

其中，

所述LNA的化学式为：

所述经甲氧基取代的LNA的化学式为：

所述经氟取代的LNA的化学式为：

在另一个优选实施例中，本发明提供的经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的5’端和3’端中的至少一端被如下所示的硫代磷酸酯修饰：

作为本发明优选的micro RNA，本发明对miR-126-3p的miRNA核苷酸序列进行上述的化学修饰，将miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA、2’-O-Me或2’-Fluoro修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰。

图2(a)给出了三种经化学修饰的miR-126-3p核酸分子，三种化学修饰方案如下：

方案1(标记为126-Mod1)：经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第3位G碱基、第6位C碱基、第10位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基插入LNA修饰，可以增强结合亲和力和特异性；第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基、第17位A碱基插入2’-O-Me修饰；3’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，进一步强化micro RNA的结构，从而有效阻止micro RNA降解；

方案2(标记为126-Mod2)：经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第1位U碱基、第6位C碱基、第11位A碱基、第16位U碱基和第21位C碱基插入2’-O-Me修饰；第4位U碱基、第7位C碱基、第11位A碱基、第14为A碱基和第19位U碱基插入2’-Fluoro修饰，以增强micro RNA抵御核酸酶降解力的能力；5’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，以增强这一关键部位的稳定性；

方案3(标记为126-Mod3)：经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基和第17位A碱基插入LNA修饰，利用其独特的亲和力增强特性来完善目标的相互作用；第3位G碱基、第8位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基和第22位G碱基插入2’-O-Me修饰，可以提高micro RNA整体结构的稳定性；5’端和3’端分别插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，以进一步增强micro RNA的稳定性。

鉴于microRNA本身易受细胞外降解的影响，加入这些复杂的化学修饰有望极大地增强miR-126-3p的潜在效用，使其成为一系列治疗和组织工程应用的候选材料。

<药物组合物(miR@TDN)>

由于miRNAs容易被体液和组织中的核糖核酸酶降解，因而不稳定，它们向包括DPSCs在内的靶细胞的有效传递也受到尺寸、电荷和结构障碍的阻碍，导致传递效率低下。因此，需要递送技术，如基于脂质的纳米颗粒、病毒载体和修饰的RNA分子，将负载有上述micro RNA递送至包括DPSCs在内的靶细胞，旨在增强miRNA的稳定性和细胞摄取能力，从而提高血管生成效应。此外，经化学修饰的miRNA核酸分子除了可以增强miRNA的稳定性，还可以延长其半衰期并防止酶降解。

DNA纳米材料由于具有天然的生物相容性、稳定的结构、高生物利用度的特点近年来引起了越来越多的关注，广泛应用于组织再生领域。其中，四面体核酸框架(tetrahedralframework nucleic acids，tFNAs)作为一种多功能纳米材料由四个单链DNA(ssDNA)通过退火组装制备，易于合成及验证，且由于其双链结构和化学特性，可以高效地携带多种生物活性或非生物活性物质，不需要转染试剂就可以通过小窝蛋白内吞作用实现跨膜运输，将物质运输至目标细胞，调控多种细胞增殖、迁移分化及旁分泌等生物学行为和功能，在多种组织修复和再生中发挥巨大潜力。因此，DNA核酸框架有望成为miRNA的控释支架，彻底改变给药效率，可对miRNA的递送进行空间和时间控制，实现对细胞的精确靶向，并促进细胞吸收。

因此，本发明进一步提供了一种药物组合物，为经化学修饰的miRNA核酸分子负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒(miR@TDN)；优选地为经化学修饰的miR-126-3p负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒(miR-126@TDN)，更优选地为126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒(126-Mod1@TDN)。本发明通过试验证实了它们在增强对血管网络形成至关重要的内皮细胞功能方面的潜力，使其可以成为推动牙髓再生和血管生成研究的重要工具。

<miR@TDN的制备与表征>

miR@TDN由四种DNA核酸单链(T1，T2，T3，T4-miR)通过互补配对合成(图3a)。这四种核酸序列参考了以往文献中的研究结果，购自圣工生物工程(上海)有限公司，其中T4的3’端连接miR126-3p序列(miR126-3p的3’端连接Cy3标记的荧光标记物)。为了合成miR@TDN，四种单链DNA在含有50mmol L-1MgCl₂-6H₂O和10mmol L-1Tris-HCl的TM缓冲液(pH＝8)中混合均匀。然后，将材料快速加热至95℃ 10分钟，再冷却至4℃ 20分钟。将带有粘性末端的miR-126-3p模拟物加入合成的miR@TDN。然后将它们充分混合并振动，将混匀的溶液在20℃温育2小时。使用高性能毛细管电泳仪(Qsep100，带S2夹，Bioptic)和8％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测ssDNA、TDN和miR@TDN的碱基对。透射电子显微镜(TEM，Tecnai G2 F20 S-TWIN，FEI)用于检测tFNAs-MMs的形态。使用DLS仪器(ZETA-SIZERNANO ZS90，Malvern)测定了裸TDNs和miR@TDN的ζ电位和尺寸。

本发明提供的药物组合物miR@TDN可以如以纳米颗粒的颗粒形式提供。颗粒的大小对于确定颗粒是否能够通过细胞膜进入细胞中是重要的。较大的颗粒被阻止通过细胞膜，或者充分的扩展被阻止，使得它们不能实现用作细胞递送系统。较小的颗粒也能够自由循环通过。因此，在一个实施方式中，颗粒的平均最大尺寸为例如不超过100nm、不超过75nm、不超过50nm。图3(c)为本发明的126-Mod1@TDN分子结构的TEM图像。

在一个实施方式中，在本发明的药物组合物中，126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的负载率通常为10-60wt％，例如可以为10-55wt％、10-50wt％、10-45wt％、10-40wt％、10-35wt％、10-30wt％、10-25wt％、10-20wt％、10-15wt％、15-60wt％、15-55wt％、15-50wt％、15-45wt％、15-40wt％、15-35wt％、15-30wt％、15-25wt％、15-20wt％、20-60wt％、20-55wt％、20-50wt％、20-45wt％、20-40wt％、20-35wt％、20-30wt％、20-25wt％、25-60wt％、25-55wt％、25-50wt％、25-45wt％、25-40wt％、25-35wt％、25-30wt％、30-60wt％、30-55wt％、30-50wt％、30-45wt％、30-40wt％、30-35wt％、35-60wt％、35-55wt％、35-50wt％、35-45wt％、35-40wt％、40-60wt％、40-55wt％、40-50wt％、40-45wt％、45-60wt％、45-55wt％、45-50wt％、50-60wt％、50-55wt％、55-60wt％。

可以通过热重分析法(TGA)来测定本发明的纳米药物组合物中126-Mod1的负载量。

<药物产品>

本发明的药物组合物还可以进一步制备成药物产品，所述药物产品的活性化合物为本发明的上述药物组合物，还包括医学上可接受的辅料。

一般来说，本发明的药物产品可以在有效量下，通过任何可接受的用于其他类似用途的给药方式进行给药。举例来说，本发明的药物产品可以注射、口服、非肠道给药、透皮给药、局部给药、直肠给药或鼻内给药。

当用作药物时，本发明通常以药物产品的形式给药。这些药物产品可用制药学领域熟知的方法进行制备，这些药物产品包含至少一种活性化合物，在本发明中，该活性化合物为本发明的上述药物组合物，例如优选地为经化学修饰的miR-126-3p负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒。在配制本发明提供的药物产品时，有效成分通常与医学上可接受的辅料或载体混合，被医学上可接受的辅料或载体稀释或被以胶囊，小袋，纸或其他形式的容器包裹。当所述医学上可接受的辅料或载体作为稀释剂时，可以是固体，半固体，或液体物质，可作为有效成分的运载体、载体或媒介。由此，所述药物产品可以是药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、喷雾(作为固体或在液体介质里)，软膏，软和硬的明胶胶囊，栓剂，无菌注射溶液，和无菌包装粉末的形式。

一些典型的医学上可接受的辅料或载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外还可以包括润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、浸润剂、乳化和悬浊剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和增味剂。本发明的药物产品可以通过具体赋形方式在对病人进行给药之后达到药物活性成分的快速、持续或延时释放，这也是本领域中广泛应用的方法。

活性成分，即本发明中的上述药物组合物，例如优选地为经化学修饰的miR-126-3p负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，在药物构成和单位剂型中的数量可根据具体应用情况、特定化合物的活性和预期浓度进行改变或有较大调整。

“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。

<miR@TDN纳米结构的细胞摄取>

在加入miR@TDN纳米结构的30分钟和60分钟后观察和检测细胞内吞作用。用激光共聚焦显微镜(FV3000，Olympus)进行荧光染色定性观察，用流式细胞仪(FC500，BECKMAN)定量检测荧光强度。数据使用FLOW JO X软件进行分析。

<细胞增殖试验>

评估不同浓度(12.5、25、50、100和200nmol/L)的miR@TDN对h-DPSCs的影响。首先，用CCK8法检测h-DPSCs的增殖情况。h-DPSCs用含有上述不同浓度的miR@TDN的5％FBS/α-MEM培养(处理组)，5％FBS/α-MEM为对照组。使用酶标仪(Thermo，美国)在12，24，36，48，72，96，120小时检测450nm处的吸光度。

<检测h-DPSC的迁移能力>

h-DPSC的迁移能力通过划痕试验和transwell试验进行评估。在划痕试验中，用200μL移液枪头在h-DPSCs汇合的6孔板中形成无细胞区域。然后将h-DPSCs与1％ FBS/αMEM或额外补充的(PBS，200nmol miR-126，200nmolTDN，200nmol 126-Mod1@TDN)培养24小时。在transwell试验中，将5×10⁴h-DPSCs加入200μLα-MEM的培养基中，然后将其接种到上室，下室则加入500μL上述培养基。培养24小时后，用棉签去除上腔中的h-DPSC。用ImageJ软件(10.2版；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)对用结晶紫染色的迁移细胞进行计数。

<miRNA转染>

收获培养的DPSCs并将其接种到培养皿中，使其达到所需的汇合度。将化学修饰的miRNA(126-Mod1@TDN)和Lipofectamine 3000分别与培养液混合。然后将它们混合并孵育以形成复合物。将转染混合物添加到DPSC中并进行孵育，让复合物进入细胞。孵育结束后，用新鲜的生长培养基替换转染混合液。进行RNA提取和定量实时PCR(qPCR)，以确认转染DPSC中miR-126-3p的上调。

<总RNA分离和实时PCR分析>

用trizol从细胞中提取总RNA，然后用QIAGEN RNeasy Mini Kit(74104；QIAGEN，德国)纯化。用iScript cDNASynthesis Kit(Bio-Rad，Hercules，CA)反转录总RNA(2μg)。使用Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix(Stratagene，San Diego，CA)和BioRadReal-Time PCR系统进行实时PCR。结果以18s rRNA为标准。引物序列见表1。

表1

简言之，将组织和细胞匀浆，经SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。在含5％脱脂奶的阻断缓冲液中37℃孵育1小时后，用eNOS(1:1000；武汉蛋白科技有限公司，中国)、CD31(1:3000；武汉蛋白科技有限公司，中国)、VEGFA(1:3000；武汉蛋白科技有限公司，中国)和HIF-1a(1:200，Santa Cruz，CA，USA)一抗单克隆抗体在4℃孵育过夜。用二抗(1:2000；贝奥天美，上海，中国)与一抗结合，37℃ 1小时。用TBST(三缓冲盐水)洗涤三次后，用ECL(增强化学发光)化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)检测每个条带。GAPDH用作内部对照。

<体内Matrigel成血管实验>

实验采用6-8周大的BALB/c裸鼠(20-23克)，随机分为6组(每组3只)。将300μLMatrigel混合物(含100μL经上述方法处理过的1×10⁶HUVECs)皮下注射到每只小鼠的背侧。14天后，处死动物，从周围组织中取出植入的胶塞。

<RNA测序(RNA-seq)和生物信息学分析>

经miR@TDN处理的DPSCs为实验组，正常DPSCs作为对照。使用试剂从组织中提取总RNA。RNA纯化、反转录、文库构建和测序由上海硕贝生物医药技术有限公司(Shanghai Majorbio Bio-pharm Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai,China)完成。选择PE150测序模式，按照标准程序使用Illumina Novaseq 6000进行成对端测序。在分析阶段，使用fastp35对原始配对端读数进行修剪和质量控制，并使用默认参数。然后使用HISAT236软件以定向模式将干净的读数分别与参考基因组进行比对。每个样本的映射读数由StringTie37基于参考方法进行组装。为了识别两个不同样本之间的DEGs(差异表达基因)，根据每百万读数转录本(TPM)方法计算每个转录本的表达水平。RSEM38用于量化基因丰度，差异表达分析使用DESeq2或DEGseq进行的。|log2FC|≧1且FDR＜0.05(DESeq2)或FDR＜0.001(DEGseq)的DEG被认为是显著差异表达基因。此外，还进行了包括GO和KEGG在内的功能富集分析，以确定与全转录组背景相比，在Bonferroni校正P值＜0.05时，哪些DEGs在GO术语和代谢通路中明显富集。GO功能富集和KEGG通路分析分别通过Goatools和Pythonscipy进行。Reactome功能富集由Python scipy完成。所有数据均在Majorbio云平台(https://cloud.majorbio.com/)上进行分析。/>

<裸鼠模型中的异位牙髓再生>

所有操作均在伦理指导下进行，并经中国上海申昌生物科技有限公司伦理委员会批准(2022-KQYY-WXL-034)。在知情同意的情况下，从接受正畸治疗的患者身上拔除健康的前磨牙(N＝40)。所有牙齿都应健康完好。然后用裂隙器将牙齿修剪成长度为6-8毫米的根段(RSs)。用无菌PBS超声波清洗10分钟，重复三次。然后用17％、10％和5％的乙二胺四乙酸(EDTA，KESHI)在PBS中处理10分钟，并在1％的青霉素/链霉素溶液中浸泡3天以上(4℃)。分组设计如下：PBS组(未处理DPSC+HUVEC)、TDN组(TDN预处理DPSC和HUVEC)和126-Mod1@TDN组(126-Mod1@TDN预处理DPSC和HUVEC)。每组由DPSC和HUVEC按3:1的比例组成。然后将这种DPSC-HUVEC混合物封装在I型胶原水凝胶(Nitta Gelatin，日本大阪)中，从而形成了一种含有细胞的凝胶复合体。经过48小时的体外培养后，将含有细胞的水凝胶复合材料植入解剖的裸鼠牙髓腔中。所有移植体在6周后收取，用4％多聚甲醛固定8小时，用17％EDTA在37℃下脱矿8周，并进一步准备进行组织学分析。

<组织学分析>

将所有样本包埋在石蜡块中，切成厚度为4um的切片。进行苏木精和伊红染色以检查形态，特别是Matrigel胶塞和再生牙髓组织的新生血管。使用人特异性CD31抗体(Proteintech，中国武汉)进行免疫组化，以检测血管内皮细胞。使用Image J对H&E图像中的血管面积和IHC图像中的CD31+细胞衬里管腔进行量化。为了确定再生牙髓组织是宿主来源还是供体来源，使用人类特异性线粒体抗体(HSP90，Abcam，Cambridge，UK)进行免疫荧光染色。

<统计>

使用SPSS统计软件(IBM SPSS Statistics for Windows，Version 22.0.Armonk，NY，USA)和Prism 6.0软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)进行统计分析。数据以均数±标准差(SD)表示。两组比较采用非配对t检验。对于两组以上的比较，正态分布数据采用单因素方差分析(ANOVA)，非正态分布或小样本采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05的值被认为具有统计学意义。

以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例：

挑选了四种microRNA(miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p)，它们在促进血管生成方面的作用已得到证实。将这些microRNA转染到hDPSCs后，对血管生成相关基因标记物表达进行了全面评估(图1a)。与对照组相比，所有四种microRNA都能显著上调关键的血管生成相关标记物的表达，如eNOS、EP、CD31、FGF2和HIF-1α。特别值得注意的是，miR-126-3p的影响尤为明显，它诱导的eNOS和FGF2表达水平明显高于其他3种microRNA(图1b)。

为了进一步验证以上结果，进行了Western印迹实验，以验证关键的血管生成相关标记物的蛋白表达水平。与对照组和其他受检micro RNA相比，miR-126-3p能显著提高CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的蛋白表达(图1c、1d)。

接着，进一步探索miR-126-3p促进血管生成的潜力，研究它在激活DPSCs旁分泌信号中的作用，这种信号反过来又会促进邻近内皮细胞中血管的形成。为此，从转染了miR-126-3p和其他选定的micro RNA的hDPSCs中获得了条件培养基(CM)。随后，在涉及HUVECs的血管生成试验中使用了这种CM。血管形成试验被用来评估来自不同micro RNA组的条件培养基的促血管生成能力。结果表明，来自转染了miR-126-3p的hDPSCs的CM显著增强了HUVEC的血管生成，明显优于转染了其它micro RNA的hDPSCs的CM的血管生成潜力(图1e)。血管连通性、血管网络面积和血管长度等各种血管生成参数的增强有力地表明，miR-126-3p在通过DPSCs的旁分泌信号介导内皮细胞血管生成方面具有独特的能力(图1f)。

接着，将深入探讨miR-126-3p的三种不同化学修饰策略，旨在增强其稳定性和功能性。这是其在细胞环境中延长其存在时间和有效性的关键前提。鉴于micro RNA本身易受细胞外降解的影响，加入这些复杂的化学修饰有望极大地增强miR-126-3p的潜在效用，使其成为一系列治疗和组织工程应用的候选材料。在确立了这些化学修饰策略后，全面评估三种化学修饰miR-126-3p变体的稳定性。通过一系列转hDPSCs的实验，在四个关键时间点(转染后24小时、48小时、72小时和96小时)仔细监测了细胞中miR-126的表达。结果揭示，与未修饰的miR-126对应物相比，所有三种经化学修饰的miR-126-3p变体都表现出大幅增强的稳定性，为后续研究奠定了坚实的基础。

接着，进一步研究这些化学修饰对microRNA血管生成特性的影响，包括在转染后96小时收集mRNA和蛋白质样本，然后对关键的血管生成相关标志物进行定量分析。蛋白质分析显示，方案1(126-Mod1)组的CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA表达水平明显升高。与对照组和其它两个修饰组相比，方案1(126-Mod1)对hDPSCs中这些血管生成相关标记物的蛋白质表达有明显的强力影响(图2c、2d)。在qPCR结果中也观察到了类似的趋势，这与蛋白质分析的结果一致。虽然与方案2(126-Mod2)组相比，方案1(126-Mod1)组的VEGFA和HIF-1α表达水平略有降低，但这些差异并没有达到统计学意义(图2e)。

以上这些实验凸显了所有三种化学修饰的miR-126-3p变体在增强hDPSCs中血管生成相关标志物的表达方面所蕴含的潜力。具体来说，方案1(126-Mod1)是一个突出的候选者，它能最明显地提高CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的蛋白水平。与此同时，方案2(126-Mod2)在mRNA水平上对VEGFA和HIF-1α的表达产生了更明显的影响。这进一步证实了经化学修饰的miR-126-3p变体在治疗干预血管生成和组织再生方面的潜力。

接着，将合成126-Mod1@TDN(126-Mod1负载四面体框架核酸纳米结构)并进行验证及深入研究其显著的生物相容性和细胞摄取效率。126-Mod1@TDN的合成是通过内聚末端TDN与内聚末端126-Mod1的碱基互补配对实现的(图3a)。使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳法仔细确认了四条DNA单链(T1、T2、T3、T4)、TDN和126-Mod1@TDN之间的分子量差异(图3b)。利用透射电子显微镜和纳米电位计检测其结构和生物物理表征，揭示了126-Mod1@TDN的几何结构(图3c)，为一个独特的带负电的三角形结构，尺寸为19.32±2.799nm(图3c)，与TDN的尺寸17.18±3.364nm(图3d2)紧密吻合。Zeta电位分析强调了颗粒的胶体稳定性，126-Mod1@TDN(-5.19±2.23mV)和TDN(-4.47±2.58mV)接近中性电荷(图3d1，3d2)。TEM和8％ PAGE的观察结果也证实了这些趋势，显示了大量团聚体的形成。126-Mod1@TDN结构的稳定性对其作为潜在生物载体的作用至关重要。研究揭示了血清浓度和作用时间在影响126-Mod1@TDN稳定性方面的相互作用。126-Mod1@TDN在10％FBS(体外细胞存活的最佳环境)中的稳定性超过24小时。值得注意的是，126-Mod1@TDN可在4℃下储存长达7天(图3e)，这与早先的研究结果一致。

在牙髓再生中，DPSCs起着关键作用。采用流式细胞术和免疫荧光技术研究了DPSCs对miR@TDN的细胞吸收。在荧光显微镜的观察下，126-Mod1@TDN在DPSCs细胞质中一致且均匀的分布，而未修饰的miR@TDN则显示出明显较低的吸收率(图3f和图3h左)。流式细胞仪是揭示126-Mod1@TDN和未修饰miR@TDN在DPSCs中细胞摄取效率差异的不可或缺的工具，其结果表明30分钟后，DPSCs对126-Mod1@TDN的吸收效率为25.9％，明显高于未修饰miR@TDN的9.65％。60分钟后，126-Mod1@TDN的吸收效率飙升至45.4％，与未修饰miR@TDN的9.85％吸收效率形成鲜明对比(图3g)。126-Mod1@TDN的细胞吸收率之所以提高，是因为它们具有独特的核酸纳米结构，能有效地封装和保护miRNA，防止其过早降解，从而促进其内化。此外，126-Mod1@TDN有利的表面电荷和配体功能化促进了受体介导的内吞作用，增加了DPSCs的吸收。相比之下，未修饰miR@TDN的吸收有限，这是因为细胞内核酸酶的易感性和细胞质进入的障碍阻碍了未修饰miRNA@TDN的有效吸收。随着时间的推移，入胞效率不断提高，这可能由于126-Mod1@TDN的固有特性和细胞环境，促进了更有效的DPSC内吞。

接着，进一步评估126-Mod1@TDN对牙髓干细胞细胞增殖、迁移和基因表达的影响，如图4a所示。在CCK-8试验中，DPSCs暴露于不同浓度的126-Mod1@TDN(从12.5nmol/L到200nmol/L)，并在120小时内监测其增殖活性(图4b)。虽然12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L浓度的126-Mod1@TDN对DPSC增殖的影响微乎其微，但与对照组相比，增殖活性在120小时的标记处明显增加。值得注意的是，200nmol/L的126-Mod1@TDN能显著提高DPSC的增殖能力，这凸显了126-Mod1@TDN作为细胞生长和组织再生的强大刺激物的潜力。

干细胞的迁移能力使其能够迁移到体内需要血管发育的区域。为了进一步研究126-Mod1@TDN对DPSCs行为的影响，进行了细胞划痕和transwell试验。结果表明，24小时后，DPSC迁移的速度明显加快，这在所有实验组中结果一致(图4c、4d)，且与miR处理组和TDN处理组相比，126-Mod1@TDN处理组的迁移反应明显增强。transwell试验再次证实了这一一致的结果(图4e)，进一步证实了126-Mod1@TDN在增强DPSC迁移能力方面的功效，这一结果是因为核酸纳米结构促进了126-Mod1@TDN的高效递送。TDN可保护并促进miR的封装，从而实现了定向递送并对细胞生物学行为产生影响。经126-Mod1@TDN处理的DPSCs的迁移能力明显优于经miR处理的DPSCs组，这凸显了有效miRNA递送系统的重要性。通过利用核酸纳米结构的潜力，为精准和高效的miRNA递送提供了一个良好的途径，优化了再生医学应用中的细胞生物学调控。

干细胞的旁分泌能力使其能够释放生长因子、细胞信号和调节因子等。这些分子可影响周围细胞的行为。在此，进一步通过试验揭示了在126-Mod1@TDN干预下，DPSCs中血管生成相关因子表达上调。定量PCR(qPCR)分析表明，126-Mod1@TDN处理的DPSCs中，VEGFa、CD31、eNOS、EP和FGF的表达量显著增加，超过了miR组和TDN组(图4f)。这一效应在Western印迹(WB)实验中得到了证实，在miR处理组中，CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的蛋白表达水平均有所提高(图4g、4h)。qPCR和WB实验的结果共同表明126-Mod1@TDN在增强DPSCs中血管生成相关因子表达的强大能力。这一实验结果与之前的研究一致，阐明了miR-126-3p在促进血管生成和调控血管相关基因中的关键作用。将经过化学修饰的miR-126-3p与核酸纳米结构结合(126-Mod1@TDN)可进一步提高其稳定性和递送效率，最终提高miRNA介导的基因表达。

为了验证126-Mod1@TDN促DPSCs旁分泌并促进内皮细胞血管生成的潜力，收集了各种条件干预的DPSCs的上清，即条件培养基。然后利用这种条件培养基刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，从而评估它们的血管生成能力和血管生成相关标志物的表达。实验结果表明，在经126-Mod1@TDN处理DPSCs条件培养基培养的HUVECs的血管生成能力显著增强(图5a)。这些指标的增强与VEGF组(阳性对照)水平相当，从而确定了126-Mod1@TDN在诱导血管生成方面的强大潜力。这种等效性在Western印迹(WB)中被验证，WB分析显示，126-Mod1@TDN组的CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的表达明显升高，与VEGF组没有明显区别(图5c、5d)。相应的qPCR结果也反映了这一趋势(图5e)。实验表明，暴露于经126-Mod1@TDN处理的DPSCs条件培养基的HUVECs的血管形成能力明显提高，这意味着126-Mod1@TDN推动DPSCs分泌促血管生成因子。这些因子反过来又有助于创造有利于血管生成的微环境，从而促进内皮细胞的血管生成过程。

miR@TDN和强效血管生成因子VEGF的促血管生成的等效性突出了miR@TDN作为促进血管生成的治疗药物的潜力，这在再生医学领域尤为重要，因为基于血管内皮生长因子的传统疗法可能会受到限制。上述实验结果为探索miR@TDN作为一种有效工具利用旁分泌信号通路进行有针对性的血管生成调节铺平了道路，为再生疗法开辟了新天地。

为了进一步证实126-Mod1@TDN诱导的旁分泌血管生成效应，进行了Matrigel胶塞实验，这是一种广泛使用的评估体内血管生成的有效技术，即将细胞和Matrigel的混合物注入裸鼠皮下，达到体温后凝固。植入后，随着时间的推移，新形成的血管会浸润胶塞，如图4a所示。经初步目测，126-Mod1@TDN处理组Matrigel塞在颜色和血管密度方面明显区别于空白对照组(图6c)，而与VEGF阳性对照组之间的区分相对不那么明显。图6d展示了胶塞的HE染色以及免疫组织化学染色结果，这些数据揭示了Matrigel塞内的血管生成情况。HE染色可直接评估新形成的血管，区分功能性和非功能性管腔。虽然所有六个实验组都有明显的类似管腔的结构，但管腔面积和含红细胞管腔的比例存在差异。

值得注意的是，经126-Mod1@TDN处理的实验组血管生成显著增加，其特点是新形成的血管中含有大量红细胞(RBC)。这一实验结果凸显了126-Mod1@TDN强大的促血管生成能力。相比之下，对照组(PBS)含红细胞血管的出现率较低，表明功能性血管的建立相对较少。裸TDN处理组新形成的血管结构相对较细，但仍有一些含有RBC的血管。而miR处理组与VEGF处理组相比，功能血管的数量相当(图6d)。典型的内皮标记物CD31的免疫组化染色证实了这一趋势，在VEGF组和126-Mod1@TDN组中都发现了粗大的CD31阳性的功能性血管管腔(图6e)。对此的定量分析(包括管腔总面积、RBC阳性管腔比率和CD31阳性管腔长度等)证实了126-Mod1@TDN可促进血管内皮生长因子介导的血管生成，从而增强体内功能性血管的形成。总之，从Matrigel塞实验中进一步证实了126-Mod1@TDN对DPSCs的干预会触发一个旁分泌级联，刺激内皮细胞的血管生成，从而为潜在的再生治疗提供有效策略。

为了进一步了研究126-Mod1@TDN处理的人牙髓干细胞(miR@TDN-hDPSCs)的分化表型和分子特征，对hDPSCs和126-Mod1@TDN-hDPSCs进行了mRNA测序分析。如图7a所示，主成分分析(PCA)显示，126-Mod1@TDN-hDPSCs组与hDPSCs组的基因表达谱截然不同。在维恩图(图7b)中，得到两组共有12978个基因表达，而126-Mod1@TDN-hDPSCs组只有1475个基因表达。火山图(图7c)进一步表明，126-Mod1@TDN-hDPSCs组有1919个差异表达基因(DEGs)，其中1465个基因上调，454个基因下调，表明与hDPSCs相比，126-Mod1@TDN-hDPSCs的血管生成潜力更强。图7d中的热图显示，在126-Mod1@TDN-hDPSCs组中，与血管生成和细胞增殖相关的基因明显上调。此外，为了阐明受影响的主要通路，对此进行了通路富集分析，结果显示，DEGs在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路等与血管生成密切相关的通路中显著富集(图7e)。这些结果共同表明，126-Mod1@TDN处理hDPSCs后基因表达谱的重大变化，有利于血管生成表型和促进血管生成的关键信号通路的激活。

为了评估牙髓再生的潜力，进行了经典的牙髓异位移植实验。首先使用不同条件下对hDPSCs进行预处理：PBS组、TDN组和126-Mod1@TDN组。随后，这些预处理过的hDPSCs按3:1的比例与HUVECs共同培养，将得到的hDPSCs-HUVECs复合材料放入I型胶原水凝胶中，形成负载细胞凝胶结构。如图8a所示，然后将这种复合材料注射到预先处理过的牙根段中，再进行48小时的体外培养，随后将其皮下植入裸鼠体内6周。6周后对植入物HE切片染色的组织学分析显示，各实验组的组织形态和组织结构存在明显差异。126-Mod1@TDN组的再生效果最好，其特点是细胞集群组织良好，细胞外基质沉积广泛(图8b)。组织结构显示出紧凑和密集的模式，表明细胞增殖和结构排列增强。相反，TDN组表现出中等再生特征，包括明显的细胞集群和适度的细胞外基质沉积。虽然组织结构看起来相对有序，但与126-Mod1@TDN组相比，其结构性较差。相比之下，对照组的再生反应不明显，细胞分布分散，细胞外基质沉积有限。细胞计数和血管化率的定量分析显示，126-Mod1@TDN组的表现明显优于其他两组(图8d、8e)。CD31是内皮细胞和血管生成的有效标记物，通过对移植物进行CD31免疫组化染色，可以了解再生牙髓中的血管生成情况，结果126-Mod1@TDN组表现出强烈的CD31染色，表明血管生成和新生血管增加(图8b)，凸显了126-Mod1@TDN诱导的强大的促血管生成效应。对CD31+管腔长度的定量分析进一步证实了126-Mod1@TDN组的显著优势。此外，移植后，周围的宿主细胞也可能通过根尖迁移到牙管。为了证实牙髓组织再生是由植入的DPSCs和HUVECs启动的，使用人类线粒体抗体进行了免疫荧光鉴定。结果显示，人线粒体抗原在再生组织中广泛表达，尤其是在血管附近(图8c)。在已形成的血管中，阳性表达人类线粒体的血管比例在三组之间没有显著差异(图8f)，这表明血管主要是由植入的细胞形成的。这些研究结果凸显了miR@TDN治疗对牙髓再生的显著积极影响，既增强了组织结构，又提高了血管生成能力。

综上所述，本实施例的实验证明了miRNA负载核酸纳米结构(miR@TDN)通过DPSC介导的血管生成促进牙髓再生的潜力。化学修饰增强了miR-126-3p的稳定性和血管生成特性。miR@TDN能有效递送miR-126-3p，增强DPSC的生物学行为和旁分泌，从而增强体外和体内的血管生成。这些实验展示了miR@TDN在促进组织再生和血管生成方面的治疗潜力，为牙髓再生提供了一条前景广阔的途径。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为选自具有促进血管生成功能的miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被化学修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被化学修饰的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA或经甲氧基或氟取代的LNA修饰；

其中，

所述LNA的化学式为：

所述经甲氧基取代的LNA的化学式为：

所述经氟取代的LNA的化学式为：

3.根据权利要求1所述的经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为在选自miR-126-3p、miR-21-3p、let-7b-5p和miR-210-3p的miRNA核苷酸序列中的5’端和3’端中的至少一端被如下所示的硫代磷酸酯修饰：

4.根据权利要求1-3任一项所述的经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，所述miR-126-3p的核苷酸序列为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG，所述miR-21-3p的核苷酸序列为CAACACCAGUCGAUGGGCUGU，所述let-7b-5p的核苷酸序列为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU，所述miR-210-3p的核苷酸序列为CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA。

5.根据权利要求4所述的经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的一个或多个碱基被LNA、2’-O-Me或2’-Fluoro修饰、和/或5’端和3’端中的至少一端被硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰。

6.根据权利要求5所述的经化学修饰的miRNA核酸分子，其特征在于，

所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第3位G碱基、第6位C碱基、第10位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基插入LNA修饰，第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基、第17位A碱基插入2’-O-Me修饰，3’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod1；

所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第1位U碱基、第6位C碱基、第11位A碱基、第16位U碱基和第21位C碱基插入2’-O-Me修饰，第4位U碱基、第7位C碱基、第11位A碱基、第14为A碱基和第19位U碱基插入2’-Fluoro修饰，5’端插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod2；所述经化学修饰的miRNA核酸分子为miR-126-3p的miRNA核苷酸序列中的第2位C碱基、第5位A碱基、第9位U碱基、第12位G碱基和第17位A碱基插入LNA修饰，第3位G碱基、第8位G碱基、第13位U碱基、第18位A碱基和第22位G碱基插入2’-O-Me修饰，5’端和3’端分别插入硫代磷酸酯Phosphorothioate修饰，标记为126-Mod3；

优选地，所述经化学修饰的miRNA核酸分子为126-Mod1。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-6任一项所述的经化学修饰的miRNA核酸分子。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括用于递送和控释所述经化学修饰的miRNA核酸分子的载体。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为DNA纳米材料，优选地为DNA四面体核酸框架(tFNAs)。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为经化学修饰的miRNA核酸分子负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为miR@TDN；优选地为经化学修饰的miR-126-3p负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为miR-126@TDN；更优选地为126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的纳米药物递送颗粒，标记为126-Mod1@TDN。

11.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的粒径为10-100nm，优选地为10-75nm，更优选地为10-50nm；在所述药物组合物中，126-Mod1负载在DNA四面体核酸框架(tFNAs)中的负载率为10％-60％，优选地为30％-60％，更优选地为40％-60％。

12.一种如权利要求7-11任一项所述的药物组合物在制备用于促进组织再生的药物中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述组织再生包括牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、皮肤和黏膜再生、血管再生、肌肉和肌腱再生、心肌细胞再生、角膜再生、视网膜再生、外周神经元再生、中枢神经元再生、胰岛再生和脂肪再生中的至少一种，优选地为牙髓再生。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，将miR@TDN转染至牙髓干细胞(DPSCs)；

优选地，将126-Mod1@TDN转染至牙髓干细胞(DPSCs)。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，126-Mod1@TDN能显著提高牙髓干细胞(DPSCs)中的CD31、eNOS、HIF-1α和VEGFA的蛋白表达水平。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，牙髓干细胞(DPSCs)对126-Mod1@TDN的吸收效率在吸收30分钟后为20％-30％、在吸收60分钟后为40％-60％。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，126-Mod1@TDN在牙髓干细胞(DPSCs)中的摩尔浓度为100-300nmol/L，优选地为200nmol/L。

18.根据权利要求13或14所述的应用，其特征在于，将miR@TDN转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；优选地，将126-Mod1@TDN转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

19.根据权利要求13-18任一项所述的应用，其特征在于，将凝胶、miR@TDN、牙髓干细胞(DPSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中；优选地，将凝胶、126-Mod1@TDN、牙髓干细胞(DPSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的混合物注入体内牙齿或体外牙齿磨片中。