JP2005512976A

JP2005512976A - Ｒｎａ干渉により線維化疾患を処置するための医薬

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Publication number: JP2005512976A
Application number: JP2003537650A
Authority: JP
Inventors: ローラントクロイツァー，; シュテファンリンマー，; デトレフシュッパン，; マティアスジョン，; ミヒャエルバウアー，
Original assignee: リボファーマアーゲー
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2005-05-12
Also published as: CN1604783A; US20080070856A1; WO2003035083A1; WO2003035868A1

Abstract

本発明は、線維化疾患の処置のための薬剤に関し、該薬剤は、ＲＮＡ干渉によって細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む。

Description

本発明は、線維化疾患を処置するための医薬および線維症を処置するための使用に関する。本発明はさらに、２本鎖リボ核酸および医薬を製造するためのその使用に関する。

線維化疾患はここでは、細胞外基質（ＥＣＭ）の合成とその破壊との間の不均衡によって特徴付けられる病症を意味するものと理解される。この不均衡は、細胞外基質および結合組織の形成および沈着の増加をそれぞれもたらす。ＥＣＭは細胞によって、特にコラーゲン、非コラーゲン糖タンパク質、エラスチン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンから形成される。線維化疾患は、例えば、内部器官または皮膚の損傷の後の、治癒に必要である以上の瘢痕の形成を含み得る。細胞外基質の過剰な形成および沈着は、影響を受ける臓器、例えば肺、腎臓または肝臓の機能的な障害または不全を引き起こし得る。ＥＣＭは腎臓では、例えばメサンギウム細胞および間質線維芽細胞によって形成される。肝臓においては、肝星細胞（hepatic star cell）および門脈線維芽細胞が、細胞外基質の形成に主として関与する。肝星細胞は通常は休止しているが、損傷によって、例えば毒素または慢性肝炎によって活性化される。その結果肝星細胞は増殖し、線維芽細胞中に分化転換し、細胞外基質分子を過剰に産生する。細胞外基質の重要な成分であるＩ型コラーゲンの合成をアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって阻害すべく設計された実験では、基質生成を僅かに阻害したのみであった。基質生成を阻害する効果的な分子生物学的方法は現在のところ見出されていない。

細胞内で標的遺伝子の発現を阻害する方法はDE 101 00 586 C1から知られており、該方法においては、２本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチドを細胞内に導入する。ここで、２本鎖構造の１鎖は、標的遺伝子と相補的である。

本発明の課題は、従来技術によるこれらの欠点を克服することである。特に、有効な医薬および線維化疾患を処置するための使用を利用可能とする。さらに、かかる医薬を製造するための使用および細胞外基質の過剰形成を阻害するのに好適な活性物質を、利用可能とする。

この課題は、請求項１、２１、２２および４３に記載の特徴によって解決される。有利な態様は、請求項２〜２０、２３〜４２および４４〜６１に記載の特徴によりもたらされる。

本発明によれば、医薬は、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現をＲＮＡの干渉によって阻害するのに好適な、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含むことを意図している。

ｄｓＲＮＡは、１本鎖または２本鎖のリボ核酸からなるリボ核酸が２本鎖構造を有する場合に存在する。ｄｓＲＮＡの全てのヌクレオチドが正規のワトソン−クリック塩基対を有する必要はない。特に、単一の非相補的塩基対は、全くではないにしても効果にほとんど影響しない。塩基対の最大可能数は、ｄｓＲＮＡに含まれる最短の鎖におけるヌクレオチド数である。

アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる線維化疾患の処置の実験により、分子生物学的アプローチにはほとんど見込みがないことが示された。しかし驚くべきことには、結合組織およびＥＣＭそれぞれの新生を、２本鎖リボ核酸によって効果的に阻害することが可能であることが示された。細胞外基質の形成に関わる遺伝子はまた、本発明との関連では、細胞に細胞外基質を産生させる、または、細胞を細胞外基質を産生する細胞に転換する原因となる因子の生成を引き起こす全ての遺伝子でもある。かかる因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３；結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）；またはオンコスタチンＭを含む。これらの因子は、例えば、肝星細胞および門脈線維芽細胞の、筋線維芽細胞に類似したフェノタイプへの分化転換を惹起して維持することができる。元の細胞と異なり、このフェノタイプは増殖率および基質合成の増加を示し、またしばしば同時に、基質分解プロテアーゼ（matrix-degrading proteases）による細胞外基質の破壊（線維分解(fibrolysis）を減少させる。肝星細胞または門脈線維芽細胞以外の肝細胞はこれらの因子を産生することができる。

一つの有利な態様においては、遺伝子は、結合組織成長因子ＣＴＧＦ；トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、特にＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３；Ｉ型もしくはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体；シグナル伝達物質ｓｍａｄ−２、ｓｍａｄ−３、またはｓｍａｄ−４；ＳＡＲＡ（受容体活性化のためのｓｍａｄアンカー）；ＰＤＧＦ；コラーゲン原線維の形成に関わる遺伝子、オンコスタチンＭ；プロコラーゲン；プロリル−４−ヒドロキシラーゼ；リシル−ヒドロキシラーゼ；リシル−オキシダーゼ；Ｎ−プロペプチダーゼ；またはＣ−プロペプチダーゼをコードする遺伝子である。ｓｍａｄ−２、ｓｍａｄ−３、ｓｍａｄ−４およびＳＡＲＡは、ＴＧＦ−βのＩ型もしくはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体への結合によって誘発されるシグナル伝達に関連する。プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、リシル−ヒドロキシラーゼ、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−プロペプチダーゼおよびＣ−プロペプチダーゼは、前駆体分子であるプロコラーゲンからのコラーゲン原線維の形成に関連する。Ｎ−プロペプチダーゼは、プロコラーゲンからＮ末端プロペプチドを切断し、Ｃ−プロペプチダーゼは、プロコラーゲンからＣ末端プロペプチドを切断する。

プロコラーゲンが、α１（Ｉ）型、α２（Ｉ）型、α１（ＩＩ）型、α１（ＩＩＩ）型、α１（Ｖ）型、α２（Ｖ）型、α３（Ｖ）型、α１（ＶＩ）型、α２（ＶＩ）型、α３（ＶＩ）型、α１（ＸＩ）型、α２（ＸＩ）型、またはα３（ＸＩ）型プロコラーゲンである場合は特に有利である。各々において括弧内のローマ数字は、プロコラーゲンから形成されるコラーゲンの型を示す。各々においてアラビア数字は、プロコラーゲンの鎖を示す。

線維化疾患は、例えば肝線維症、腎臓または肺の線維症、例えば外傷後の、治癒に必要な瘢痕形成を上回る瘢痕組織の形成であってよい。

好ましくは、ｄｓＲＮＡの１つの鎖Ｓ１は、遺伝子と少なくとも断片的に（segmentally）相補的である、特に２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる領域を有する。「遺伝子」は、ここでは、タンパク質またはペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡのＤＮＡ鎖であって、転写のための鋳型（matrix）として用いられるすべての転写された領域を含むＤＮＡ鎖と相補的なものを意味すると解される。この遺伝子に関して、我々は一般的にはセンス鎖を取り扱う。鎖Ｓ１は、従って、遺伝子の発現中に形成される、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物またはそのプロセシング産物と相補的であることができる。ここでタンパク質またはペプチドは、細胞外基質の形成に関連するタンパク質またはペプチドである。

相補的なｄｓＤＮＡ領域は、好ましさの低い順に、１９〜２４個、２０〜２４個、２１〜２３個、そして特に２２または２３個のヌクレオチドを有することができる。この構造を有するｄｓＲＮＡは、遺伝子を阻害するのに特に有効である。ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１は、好ましさの低い順に、３０個未満、２５個未満、２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有することができる。これらのヌクレオチドの数はまた、ｄｓＲＮＡにおける塩基対の可能な最大数でもある。
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する場合、特に有利であることが示された。かかるｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの末端に１本鎖のオーバーハングを有さないｄｓＲＮＡと比較して、遺伝子の発現を阻害するのにより優れた有効性を示す。ここで、１つの末端とは、５’および３’鎖末端が存在するｄｓＲＮＡの領域である。従って、鎖Ｓ１のみからなるｄｓＲＮＡは、ループ構造および１つのみの末端を有する。鎖Ｓ１および鎖Ｓ２からなるｄｓＲＮＡは２つの末端を有する。ここで各々の場合において、１つの末端は鎖Ｓ１上の鎖末端および鎖Ｓ２上の鎖末端により形成される。

１本鎖のオーバーハングは、好ましくは鎖Ｓ１の３’末端に位置する。この１本鎖オーバーハングの位置は、医薬の効力のさらなる増加をもたらす。１つの例において、ｄｓＲＮＡは１つの末端、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに１本鎖のオーバーハングを有する。２つの末端を有するｄｓＲＮＡの他方の末端は平滑であり、すなわちオーバーハングを有さない。驚くべきことには、ｄｓＲＮＡの干渉作用を増強するために、ｄｓＲＮＡは１つの末端にのみオーバーハングを有していれば十分であり、２個のオーバーハングによって生じるような安定性の減少を起こさないことが示された。オーバーハングを１個だけ有するｄｓＲＮＡは、種々の細胞培養培地中、ならびに血液、血清および細胞中で十分安定で特に効果的であることが示された。発現の阻害は、オーバーハングが鎖Ｓ１の３’末端に位置する場合に特に効果的である。

好ましくは、ｄｓＲＮＡは鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有しており、すなわち、２本の独立した１本鎖からなる。本医薬は、鎖Ｓ１（アンチセンス鎖）が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成される１本鎖のオーバーハングを有する場合に、特に有効である。鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である。鎖Ｓ１は、遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的であることができる。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、添付の配列表に示すとおりの、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる。かかるｄｓＲＮＡは、α１（Ｉ）型プロコラーゲンまたはＣＴＧＦをコードしおよび細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害するのに、特に有効である。

本医薬は、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注入または注射、または線維化疾患に冒された組織への直接注入または注射に好適な製剤であることができる。吸入、注入または注射に好適な製剤は、最も単純には特に、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝生理食塩水とのみからなることができる。驚くべきことに、かかる溶媒またはバッファーに単純に溶解されて投与されたｄｓＲＮＡは、遺伝子を発現する細胞に取り込まれることが示された。遺伝子の発現、従って疾病の発現は、ｄｓＲＮＡが特殊なビヒクルに包まれることを要することなく阻害される。ｄｓＲＮＡは本医薬において、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイド（capsoid）または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在することができる。生理学的に許容されるバッファーは、リン酸緩衝生理食塩水であることができる。ミセル構造、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、遺伝子を発現する細胞へのｄｓＲＮＡの取り込みを促進することができる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、ポリブチルシアノアクリレートなどの少なくとも１種の生分解性ポリマーからなる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、それに含まれたまたは結合したｄｓＲＮＡを、体内で輸送し、放出することができる。

ｄｓＲＮＡは、線維化疾患に冒された器官、特に肝臓、腎臓、肺または皮膚の細胞での該ｄｓＲＮＡの標的化された取り込みを可能とする剤と組み合わせることができる。組み合わせるとは、ｄｓＲＮＡが剤に結合しているか、または、リポソームまたはナノもしくはマイクロカプセルの場合のように、剤に包まれていてもよいことを意味する。分子はかかる標的化された取り込みを可能にするリポソームまたはナノもしくはマイクロカプセルに組み込むことができ、これはターゲティングと呼ばれる。好ましくは剤は、ＶＩ型コラーゲン受容体またはＰＤＧＦβ受容体、特に肝星細胞または筋線維芽細胞のものとの結合を媒介するものである。肝星細胞または筋線維芽細胞を活性化することができる。添付の配列表の配列番号２５による環状ペプチドＣ^＊ＧＲＧＤＳＰＣ^＊は、ＶＩ型コラーゲン受容体に特に好適である。Ｃ^＊はシステイン残基を表し、これはジスルフィド結合によってペプチド環の形成を引き起こす。

好ましくは、本医薬は、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量を達成するのが可能な量でｄｓＲＮＡを含む、少なくとも１用量単位で存在する。驚くべきことに、ｄｓＲＮＡが、この１日用量においても遺伝子の発現を阻害するのに顕著な有効性を発揮し、抗線維化活性を示すことが示された。用量単位は、単回の１日用量の投与または摂取のために設計することができる。この場合、全１日用量が単一の用量単位に含まれる。用量単位が１日数回投与または摂取されるように設計する場合、各用量に含まれるｄｓＲＮＡ量は、１日の総用量の達成が可能となるように、対応してより少ない。用量単位はまた、単回の投与または摂取を数日間におよぼすために、例えば、ｄｓＲＮＡが数日にわたって放出されるように設計することができる。この場合、用量単位は、相応して総数の１日用量を含む。ｄｓＲＮＡは、用量単位中に細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で含まれる。本医薬はまた、複数単位の医薬の合計が、合わせて十分な量を含むように設計することもできる。十分な量はまた、用量単位の薬学的剤形にも依存する。十分な量を決定するために、量または用量をそれぞれ増加しつつｄｓＲＮＡを投与することができる。続いて、知られた方法により冒された線維症組織からの試料を評価し、前記の遺伝子の発現の阻害がこの量で起きたかどうかを決定することができる。かかる方法は、例えば、分子生物学的、分子化学的、または免疫学的方法を含んでよい。

さらに本発明によれば、線維化疾患を処置する医薬を製造するための、２本鎖リボ核酸の使用が意図され、ここでｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害するのに好適である。さらにまた本発明によれば、線維化疾患の処置のための２本鎖リボ核酸の使用が意図され、ここでｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害するのに好適である。さらに、２本鎖リボ核酸が意図され、該２本鎖リボ核酸は、ＲＮＡ干渉によって線維化疾患における細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を阻害する、好適な活性な剤である。

本発明の使用および本発明のｄｓＲＮＡのさらなる有利な態様については、上述の記載を参照されたい。

配列表に示す配列番号１〜６の配列を有する以下の２本鎖オリゴリボヌクレオチドを、一過性トランスフェクションの実験に用いた：
鎖Ｓ１がＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のゲノム配列に相補的であるＨＣＶｓ５／ａｓ５：

鎖Ｓ１がヒトのα１（Ｉ）型プロコラーゲン遺伝子および、この領域において１００％相同であるRattus norvegicusのα１（Ｉ）型プロコラーゲン遺伝子の配列に相補的である、ＰＣＡ１＋２：

鎖Ｓ１がヒトのＣＴＧＦ遺伝子および、この領域において１００％相同であるRattus norvegicusのＣＴＧＦ遺伝子の配列に相補的である、ＣＴＧ１＋２：

以下の細胞を実験に用いた：
−ＲＤ細胞：これはヒト胎児性横紋筋肉腫細胞株の細胞である。この細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USAよりNo. CCL136として入手できる。

−ＣＦＳＣ−２Ｇ細胞：Dr. Marcos Rojkind (Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York City, New York, USA)から入手可能となったラット肝星細胞株からの細胞である。ＣＦＳＣ幹細胞の単離については、Laboratory Investigation 65 (1991), 644-53に記載されている。ＣＦＳＣ−２Ｇサブクローンの単離および特徴づけは、Patricia Greenwel et al., Laboratory Investigation 69 (1993), 210-26に記載されている。

−ラットの肝臓より、Knook, D. et al., Exp. Cell Res. 139 (1982), pp. 468-471に従って単離したプライマリー肝星細胞。

全ての細胞は、８６２ｍｇ／ｌの１−アラニル−１−グルタミンおよび４．５ｇ／ｌのグルコース（Invitrogen GmbH, Technology Park Karlsruhe, Emmy-Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe）と共に、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加えたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（細胞培養培地）中で培養した。培養は、インキュベータ中で３７℃、ＣＯ_２８％および空気９２％の湿潤雰囲気下で行った。

ＲＤ細胞のｄｓＲＮＡによる一過性トランスフェクションは、カチオン性脂質からのＤＮＡ含有リポソーム（DNA-laden liposome from cationic lipids）を用いたリポフェクションにより達成した。Invitrogen製のリポフェクタミンプラス試薬キットをこのために用いた。キットには、リポフェクタミンおよびプラス試薬が含まれている。各トランスフェクションは、製造者の指示に従って平行して４回行った。１回のトランスフェクションにおいては、１ウェル当たり約７０，０００個のＲＤ細胞を、滅菌した１２穴プレートに播いた。２４時間後、１２穴プレートの２ウェルにつき、それぞれのｄｓＲＮＡを含んだ２０μｍｏｌ／ｌの水溶液５μｌを１００μｌのＤＭＥＭに希釈した。それぞれのケースにおいて、この中に１０μｌのプラス試薬を加え、混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、ＤＭＥＭ中１：２５希釈の新鮮なリポフェクタミン試薬（２４０μｌの脂質混合物／ｍｌに相当）１００μｌを加え、混合し、ＲＴで１５分間インキュベートすることでＤＮＡ含有リポソームの形成を可能とした。その後、細胞培養培地を細胞から除き、細胞は２回、１ウェルあたり１ｍｌのＤＭＥＭにて洗浄した。各トランスフェクションアッセイは１ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、これを０．６ｍｌ／ウェル、細胞上（アッセイあたり２ウェル）にピペットで導入した。インキュベータにて４時間インキュベートした後、細胞培養培地１ｍｌを各ウェルに加え、さらに４４時間インキュベートした。

肝星細胞およびＣＦＳＣ−２Ｇ細胞の一過性トランスフェクションでは、ｄｓＲＮＡはオリゴフェクタミン（Invitrogen）を用いて細胞内に導入した。このため、ＣＦＳＣ−２Ｇまたはラットから単離した肝星細胞を、無菌の１２穴プレート上に細胞数２０，０００個／ウェルの密度で播いた。播種の２４時間後、各アッセイ当たり、４μｌのオリゴフェクタミンを１１μｌのＤＭＥＭで希釈し、室温で１０分間インキュベートした。さらに各アッセイ当たり、ｄｓＲＮＡを含む２０ｍｏｌ／ｌ水溶液５μｌを１８５μｌのＤＭＥＭで希釈した（１２穴プレートの２ウェル）。予め希釈したオリゴフェクタミンをそれぞれ１５μｌ、希釈したｄｓＲＮＡにピペットで導入し、混合し、２０分間室温でインキュベートした。最後に１０５０μｌのＤＭＥＭをアッセイに加えた。得られた混合物のそれぞれ６００μｌを、１ウェル当たり１ｍｌのＤＭＥＭで２回洗浄した細胞に加えた。インキュベータで４時間インキュベートした後、細胞培養培地１ｍｌを各ウェルに加え、インキュベータで４４時間インキュベートした。

細胞外基質の形成に関わる遺伝子の転写物レベルに対するｄｓＲＮＡの作用は、定量ＰＣＲを用い、全ての細胞について決定した。インキュベータ中で４４時間の後、細胞を溶解し、細胞が含んでいたＲＮＡはペクゴールドＲＮＡピュアキット（PeqGold RNAPure kit）（PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str. 2b, D-91052 Erlangen, Order No. 30-1010)を用いて、製造者の指示に従って単離した。

ｃＤＮＡは、各ケースにおいて、同じ量のＲＮＡ（１００−１０００ｎｇ）を逆転写に用い、スーパースクリプトＩＩ（Invitrogen GmbH, Technology Park, Karlsruhe, Emmy-Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe; Catalogue No. 18064-014）を用いて生成した。プライマーは、１００ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマーおよび５０ｐｍｏｌのランダムプライマーを用いた。ＲＮＡ（１００−１０００ｎｇ）１０μｌ、オリゴｄＴプライマー（１００ｐｍｏｌ）５μｌ、およびランダムプライマー（５０ｐｍｏｌ）１μｌを、７０℃で１０分間インキュベートし、次に氷の上に短時間保管した。続いて、逆転写酵素混合物７μｌ（４μｌの５ｘバッファー；２μｌの０．１ｍｏｌ／ｌＤＴＴ；各１μｌの１０ｍｍｏｌ／ｌｄＮＴＰ）、スーパースクリプトＩＩを１μｌ、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤であるＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（Promega GmbH, Schildkroetstr. 15, D-68199 Mannheim）を１μｌ加えた。混合物は２５℃で１０分間、続いて４２℃で１時間、最後に７０℃で１５分間保管した。

ｄｓＲＮＡをトランスフェクトされた細胞内における、ｄｓＲＮＡの、α１（Ｉ）型プロコラーゲンおよびＣＴＧＦをコードする遺伝子の発現に及ぼす作用は、これら遺伝子の転写物の量（転写物レベル）を、定量「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定することにより示した。このために、形成されたｃＤＮＡの同体積からの具体的なｃＤＮＡ量を、「ライトサイクラー（Light-Cycler）」（Roche Diagnostics GmbH）において、「タグマン（TagMan）」法（PerkinElmer, Ferdinand-Porsche-Ring 17, D-63110 Rodgau-Juegesheim）により、製造者の指示に従って、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブキット（LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes Kit）（Roche Diagnostics GmbH）を用いて定量した。検出は、５’末端をフルオロホア６’−ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）で、そして３’末端をクェンチャー分子ＴＡＭＲＡ（カルボキシ−テトラ−メチル−ローダミン）でマークしたプローブを用いて行った。フルオロフォアは光により励起され、励起エネルギーをすぐ近傍の３’側のクェンチャー分子に伝達する。ＰＣＲの伸長相（extension phase）の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性はプローブの加水分解を引き起こし、従ってフルオロフォアをクェンチャー分子から空間的に分離する。６’ＦＡＭの蛍光は、次第に少なく消光される。そのためそれは増加し、定量的に測定される。定量化は、既知の転写物量または参照ｃＤＮＡの希釈列を用いて作製した標準曲線により行う。さらに、ハウスキーピング遺伝子であるβ２−ミクログロブリンの転写物レベルを測定し、標準化に用いる。β２−ミクログロブリンは、一定の量で構成的に、発現されるタンパク質である。α１（Ｉ）型プロコラーゲン−ｃＤＮＡまたはＣＴＧＦ−ｃＤＮＡの量は、β２−ミクログロブリン−ｃＤＮＡの量に対する比率として決定され、図１〜４に相対転写物レベルとして、グラフで表されている。

以下のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ラット細胞におけるα１（Ｉ）型プロコラーゲンおよびＣＴＧＦの転写物レベルの決定に用いた。

以下のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ヒト細胞におけるα１（Ｉ）型プロコラーゲンおよびＣＴＧＦの転写物レベルの決定に用いた。

図１〜４はｄｓＲＮＡの作用を示す。実験における一定のトランスフェクション効率を保証するため、全ての細胞は１００ｎｍｏｌ／ｌのｄｓＲＮＡでトランスフェクトした。このために、α１（Ｉ）型プロコラーゲンまたはＣＴＧＦに特異的な０〜１００ｎｍｏｌ／ｌのｄｓＲＮＡを、非特異的ＨＣＶｓ５／ａｓ５ｄｓＲＮＡで補完して濃度を１００ｎｍｏｌ／ｌとし、細胞内にトランスフェクトした。０ｎｍｏｌ／ｌの特異的ｄｓＲＮＡを用いて測定した転写物レベルを、任意に１００％と規定した。

図１に、α１（Ｉ）型プロコラーゲンに向けられたｄｓＲＮＡを、その濃度を上昇させつつトランスフェクトした、ＲＤ細胞に関する結果を示す。ｄｓＲＮＡの作用は濃度に依存する。α１（Ｉ）型プロコラーゲンの転写物レベルは、１００ｎｍｏｌ／ｌのＰＣＡ１＋２ｄｓＲＮＡによって２０％に減少させることができた。β２−ミクログロブリンの発現はこのｄｓＲＮＡによっては変化しなかった。これは、用いたｄｓＲＮＡの特異性を示す。

図２は、トランスフェクションに用いたＣＴＧ１＋２ｄｓＲＮＡ濃度に依存した、ＣＴＧＦ遺伝子の相対転写物レベルを示す。ここでも、用いたｄｓＲＮＡの効果は濃度に依存する。１００ｎｍｏｌ／ｌのＣＴＧ１＋２ｄｓＲＮＡによって転写物レベルは１０％に減少する一方、ｄｓＲＮＡ５０ｎｍｏｌでは、非特異的ＨＣＶｓ５／ａｓ５ｄｓＲＮＡで処理した細胞の転写物レベルの３２％に減少した。ここでも、β２−ミクログロブリンの発現には変化がみられない。

図３は、トランスフェクションの４８時間後におけるＣＦＳＣ−２Ｇ細胞中の、ＣＴＧＦ遺伝子の相対転写物レベルを示す。ここでも、用いたｄｓＲＮＡの濃度に依存した転写物レベルの減少がみられる。

図４は、ラットから単離した肝星細胞および筋線維芽細胞における、ＣＴＧＦ遺伝子の相対転写物レベルをそれぞれ示す。これらの細胞は、プラスチック上で７日間培養した。その結果それらはすでに活性化されていた。１００ｎｍｏｌ／ｌのｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクションの４８時間後、転写は約５０％減少した。

本発明を図に基づいて例示的に説明する。それらの図は以下を示す：

処置に用いられたα１（Ｉ）型プロコラーゲン特異的ｄｓＲＮＡの量に依存した、ＲＤ細胞におけるα１（Ｉ）型プロコラーゲンの相対転写物レベル(relative transcript level)を示した図である。処置に用いられたＣＴＧＦ特異的ｄｓＲＮＡの量に依存した、ＲＤ細胞におけるＣＴＧＦの相対転写物レベルを示した図である。処置に用いられたＣＴＧＦ特異的ｄｓＲＮＡの量に依存した、ＣＦＳＣ−２Ｇ細胞におけるＣＴＧＦの相対転写物レベルを示した図である。ＣＴＧＦ特異的ｄｓＲＮＡを用いる処置に依存した、ラットから単離された肝星細胞におけるＣＴＧＦの相対転写物レベルを示した図である。

【配列表】

Claims

線維化疾患を処置するための医薬であって、該医薬が、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現をＲＮＡ干渉によって阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、前記医薬。
遺伝子が、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｉ型もしくはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体、ｓｍａｄ−２、ｓｍａｄ−３、またはｓｍａｄ−４、ＳＡＲＡ、ＰＤＧＦ、オンコスタチン−Ｍ、コラーゲン原線維の形成に関わる遺伝子、プロコラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、リシル−ヒドロキシラーゼ、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−プロペプチダーゼ、またはＣ−プロペプチダーゼをコードする遺伝子である、請求項１に記載の医薬。
プロコラーゲンが、α１（Ｉ）型、α２（Ｉ）型、α１（ＩＩ）型、α１（ＩＩＩ）型、α１（Ｖ）型、α２（Ｖ）型、α３（Ｖ）型、α１（ＶＩ）型、α２（ＶＩ）型、α３（ＶＩ）型、α１（ＸＩ）型、α２（ＸＩ）型、またはα３（ＸＩ）型である、請求項２に記載の医薬。
線維化疾患が、肝線維症、腎臓もしくは肺の線維症、または治癒に必要な瘢痕形成を上回る瘢痕組織の形成である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、特に２５個未満の連続したヌクレオチドからなり、遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬。
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
鎖Ｓ１が、３０個未満の、好ましくは２５個未満の、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
１本鎖のオーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する、請求項８に記載の医薬。
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに、１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬。
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１１に記載の医薬。
鎖Ｓ１が、遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬。
医薬が、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注入または注射、または線維化疾患に冒された組織への直接注入または注射に好適な製剤である、請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬。
医薬中のｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬。
ｄｓＲＮＡが、線維化疾患に冒された器官、特に肝臓、腎臓、肺または皮膚の細胞での該ｄｓＲＮＡの標的化された取り込みを可能とする剤と組み合わされている、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬。
剤が、ＶＩ型コラーゲン受容体またはＰＤＧＦβ受容体、特に肝星細胞または筋線維芽細胞のものとの結合を媒介する剤である、請求項１７に記載の医薬。
剤が、環状ペプチドＣ^＊ＧＲＧＤＳＰＣ^＊である、請求項１８に記載の医薬。
医薬が、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量を達成するのが可能な量でｄｓＲＮＡを含む少なくとも１用量単位で存在する、請求項１〜１９のいずれかに記載の医薬。
線維化疾患の処置用の医薬を製造するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、該ｄｓＲＮＡが、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現をＲＮＡ干渉によって阻害するのに好適である、前記使用。
線維化疾患の処置のための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、該ｄｓＲＮＡが、細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現をＲＮＡ干渉によって阻害するのに好適である、前記使用。
遺伝子が、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｉ型もしくはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体、ｓｍａｄ−２、ｓｍａｄ−３、またはｓｍａｄ−４、ＳＡＲＡ、ＰＤＧＦ、オンコスタチン−Ｍ、コラーゲン原線維の形成に関わる遺伝子、プロコラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、リシル−ヒドロキシラーゼ、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−プロペプチダーゼ、またはＣ−プロペプチダーゼをコードする遺伝子である、請求項２１または２２に記載の使用。
プロコラーゲンが、α１（Ｉ）型、α２（Ｉ）型、α１（ＩＩ）型、α１（ＩＩＩ）型、α１（Ｖ）型、α２（Ｖ）型、α３（Ｖ）型、α１（ＶＩ）型、α２（ＶＩ）型、α３（ＶＩ）型、α１（ＸＩ）型、α２（ＸＩ）型、またはα３（ＸＩ）型である、請求項２３に記載の使用。
線維化疾患が、肝線維症、腎臓もしくは肺の線維症、または治癒に必要な瘢痕形成を上回る瘢痕組織の形成である、請求項２１〜２４のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、特に２５個未満の連続したヌクレオチドからなる、遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有する、請求項２１〜２５のいずれかに記載の使用。
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項２１〜２６のいずれかに記載の使用。
鎖Ｓ１が、３０個未満の、好ましくは２５個未満の、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項２１〜２７のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する、請求項２１〜２８のいずれかに記載の使用。
１本鎖のオーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する、請求項２９に記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに、１本鎖のオーバーハングを有する、請求項２１〜３０のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項２１〜３１のいずれかに記載の使用。
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項３２に記載の使用。
鎖Ｓ１が、遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項２１〜３３のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項２１〜３４のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注入または注射、または線維化疾患に冒された組織への直接注入または注射に好適な製剤中に存在する、請求項２１〜３５のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項２１〜３６のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射によって、特に静脈内もしくは腹腔内注入または注射によって、または線維化疾患に冒された組織への直接注入または注射によって投与される、請求項２１〜３７のいずれかに記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、線維化疾患に冒された器官、特に肝臓、腎臓、肺または皮膚の細胞での該ｄｓＲＮＡの標的化された取り込みを可能とする剤と組み合わされている、請求項２１〜３８のいずれかに記載の使用。
剤が、ＶＩ型コラーゲン受容体またはＰＤＧＦβ受容体、特に肝星細胞または筋線維芽細胞のものとの結合を媒介する剤である、請求項３９に記載の使用。
剤が、環状ペプチドＣ^＊ＧＲＧＤＳＰＣ^＊である、請求項４０に記載の使用。
ｄｓＲＮＡが、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量で用いられる、請求項２１〜４１のいずれかに記載の使用。
線維化疾患における細胞外基質の形成に関わる遺伝子の発現を、ＲＮＡ干渉によって阻害するのに好適である、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
遺伝子が、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｉ型もしくはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体、ｓｍａｄ−２、ｓｍａｄ−３、またはｓｍａｄ−４、ＳＡＲＡ、ＰＤＧＦ、オンコスタチン−Ｍ、コラーゲン原線維の形成に関わる遺伝子、プロコラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、リシル−ヒドロキシラーゼ、リシル−オキシダーゼ、Ｎ−プロペプチダーゼ、またはＣ−プロペプチダーゼをコードする遺伝子である、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ。
プロコラーゲンが、α１（Ｉ）型、α２（Ｉ）型、α１（ＩＩ）型、α１（ＩＩＩ）型、α１（Ｖ）型、α２（Ｖ）型、α３（Ｖ）型、α１（ＶＩ）型、α２（ＶＩ）型、α３（ＶＩ）型、α１（ＸＩ）型、α２（ＸＩ）型、またはα３（ＸＩ）型である、請求項４４に記載のｄｓＲＮＡ。
線維化疾患が、肝線維症、腎臓もしくは肺の線維症、または不所望な瘢痕形成である、請求項４３〜４５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、特に２５個未満の連続したヌクレオチドからなる、遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有する、請求項４３〜４６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項４３〜４７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
鎖Ｓ１が、３０個未満の、好ましくは２５個未満の、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項４３〜４８のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する、請求項４３〜４９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
１本鎖のオーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する、請求項５０に記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに、１本鎖のオーバーハングを有する、請求項４３〜５１のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項４３〜５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項５３に記載のｄｓＲＮＡ。
鎖Ｓ１が、遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項４３〜５４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項４３〜５５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内もしくは腹腔内注入または注射、または線維化疾患に冒された組織への直接注入または注射に好適な製剤中に存在する、請求項４３〜５６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項４３〜５７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
ｄｓＲＮＡが、線維化疾患に冒された器官、特に肝臓、腎臓、肺または皮膚の細胞での該ｄｓＲＮＡの標的化された取り込みを可能とする剤と組み合わされている、請求項４３〜５８のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
剤が、ＶＩ型コラーゲン受容体またはＰＤＧＦβ受容体、特に肝星細胞または筋線維芽細のものとの結合を媒介する剤である、請求項５９に記載のｄｓＲＮＡ。
剤が、環状ペプチドＣ^＊ＧＲＧＤＳＰＣ^＊である、請求項６０に記載のｄｓＲＮＡ。