JP4543189B2

JP4543189B2 - ＴＧＦβ１レセプターＩＩ型に対するＲＮＡｉとして作用するＲＮＡ配列

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Publication number: JP4543189B2
Application number: JP2004068151A
Authority: JP
Inventors: 義昭水口; 拓也三嶋; 孝田尻; 俊広瀧澤; 茂樹横室
Original assignee: Nippon Medical School Foundation
Current assignee: Nippon Medical School Foundation
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2024-03-10
Also published as: JP2005253344A

Description

本発明は、急性および慢性肝障害および肝硬変に対する治療および予防のための組成物に関する。

急性および慢性肝障害および肝硬変は、進行にともない肝癌に至る極めて重篤な致死性の疾患である。

現在のところ、肝硬変の薬物療法としては、肝水解物、消化剤および各種ビタミン剤等の投与、または肝庇護剤としてのグリチルリチン、グルタチオン、チオプロニン、ＡＴＰ製剤もしくは動物肝抽出物等の投与対症療法がほとんどであり、根本的な治療方法および治療薬は、現在のところ開発されていない。

その病理学的解析により、肝細胞がアポトーシスによる細胞死を起こしていることは知られている。そこで、該アポトーシスを非常に有効に抑制し、かつ他の細胞には影響を与えない（即ち、副作用がない）治療方法が開発されることが望まれている。しかしながら、未だその開発には至っていない。

肝障害および肝硬変の治療薬開発の有力なターゲットの１つとしては、TGFβ１のシグナル伝達の遮断が挙げられる。

TGFβ１はサイトカインの一種であり、多彩な作用を有しており、その標的となる細胞の種類、細胞の状態、TGFβ１の濃度によって作用が異なるという特徴を有している。TGFβ１は、腫瘍細胞だけでなく様々な正常細胞で産生され、細胞の増殖調節、細胞の分化等に関与している。特に、生体肝臓内では、a）細胞周期のG1期での停止、b）線維化の促進、c）アポトーシスの惹起などに関与し、特に急性、慢性肝障害発症時にはその発現量が増大することが示されている（Hepatology 34: 859 2000）。

TGFβ１のシグナル伝達の最初の段階において、TGFβ１レセプターの活性化があり、ついで細胞内シグナル伝達により核内ヘシグナルが伝達され、最終的に標的遺伝子の転写が誘導される。この標的遺伝子には、線維化に関連するPAI-1およびαプロコラーゲン、ならびに細胞周期に関連するp21およびp16などが含まれる。

TGFβ１のシグナルを遮断するために、TGFβ１受容体II型（TR2）の発現を抑制するということが考えられるが、このように特定のタンパク質の発現を抑制する手法としては、近年RNA干渉（RNA interference; RNAi）法が開発された。

RNAiは、二本鎖RNAが、その配列特異性を有するｍRNAを分解、さらにそのｍRNAの翻訳を抑制することにより、特定の遺伝子発現を抑制する。したがってRNAiを利用したノックダウン法は、簡便かつ安価に特定の遺伝子発現を抑制し得る手法として、例えば、遺伝子治療への応用などにおいて近年注目を浴びている。

Hepatology 34: 859 2000 Hepatology 39: 724 2003 Gastroenterology 3: 29 2003 CellGrowth & Differentiation 13: 265 2002 http://igene-therapeutics.co.jp/piGENEtRNAManual(Clon)040203.pdf

急性および慢性肝障害および肝硬変に対する、副作用の少ない新規治療薬を提供することである。

TGFβ１は上述のように、非常に多彩な生理作用を有することから、そのシグナル伝達機構も多様であると推測される。したがって、TGFβ１のシグナル伝達を抑制するには、そのシグナル伝達の最も上流に位置するTGFレセプターの発現を抑制することが、最も確実かつ簡単な方法であると考えられる。

TGFβ１レセプターは、I型（53ｋDa）とII型（70ｋDa）とのヘテロ二量体を形成している。
したがって、本発明においては、TGFβ１レセプターII型（TR2）の発現を抑制することによりTGFβ１シグナルを抑制し、急性および慢性肝障害および肝硬変に対する治療および予防のための組成物を提供する。

これにより、副作用の無いまたは少ない急性および慢性肝障害および肝硬変に対する治療薬が提供される。
したがって、本発明は、以下の態様：
１．以下の（a）と（b）：
（a）配列番号１に示す配列中の連続する少なくとも１９塩基からなる配列を含むRNA；
（b）ストリンジェントな条件下で（a）のRNAにハイブリダイズする配列を有するRNA；
がハイブリダイズした二本鎖RNAであって、ヒトTGFβ１レセプターII型（TR2）を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、二本鎖RNA；
２．以下の（a）と（b）：
（a）配列番号１に示す配列中の連続する少なくとも１９塩基からなる配列を含むRNA；
（b）ストリンジェントな条件下で（a）のRNAにハイブリダイズする配列を有するRNA；
がタンデムに連結されており、その連結部分が、
（c）CUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択される１の配列を有するRNA；
からなる構造を有し、（c）の部分が上記（a）と（b）とがハイブリダイズして二本鎖を形成する際にループ構造をとることを特徴とするRNAであって、ヒトTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、RNA；
３．（b）のRNAの配列が(a)の配列に完全に相補的である、上記１または２に記載のRNA；
４．（a）が、配列番号１に示す配列を有するRNAである、上記１〜３のいずれかに記載のRNA；
５．配列番号４の配列を有する、上記４記載のRNA；
６．以下の（a）と（b）：
（a）配列番号２または３に示す配列を有するRNA；
（b）ストリンジェントな条件下で（a）のRNAにハイブリダイズする配列を有するRNA；
がハイブリダイズした二本鎖RNAであって、マウスTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、二本鎖RNA；
７．以下の（a）と（b）：
（a）配列番号２または３に示す配列を有するRNA；
（b）ストリンジェントな条件下で（a）のRNAにハイブリダイズする配列を有するRNA；
がタンデムに連結されており、その連結部分が、
（c）CUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択される１の配列を有するRNA；
からなる構造を有し、（c）の部分が上記（a）と（b）とがハイブリダイズして二本鎖を形成する際にループ構造をとることを特徴とするRNAであって、マウスTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、RNA；
８．（b）のRNAの配列が(a)の配列に完全に相補的である、上記６または７に記載のRNA；
９．配列番号５または６の配列を有する、上記８記載のRNA；
１０．上記１〜９のいずれかに記載のRNAをコードするDNA；
１１．配列番号７〜９の配列のいずれかを含む、上記５または９に記載のRNAをコードするDNA；
１２．上記１０または１１に記載のDNAを含み、かつその5’側に該DNAを制御し得る形でプロモーターを含み、該DNAの3’側にターミネーターを含む、転写ユニット；
１３．プロモーターが、tRNAプロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター、ポリメラーゼII系プロモーターおよびCMVプロモータからなる群より選択される、上記１２記載の転写ユニット；
１４．ターミネーターが、チミジン塩基が少なくとも４つ以上連続した配列からなるターミネーターである、上記１２または１３記載の転写ユニット；
１５．上記１２〜１４のいずれかに記載の転写ユニットを含む、ベクター；
１６．ベクターが哺乳動物に導入可能であることを特徴とする、上記１５記載のベクター；
１７．上記１〜９のいずれかに記載のRNA、上記１０または１１に記載のDNA、上記１２〜１４のいずれかに記載の転写ユニットおよび上記１５または１６に記載のベクターからなる群より選択される少なくとも1つ以上を含む組成物であって、これが投与された細胞におけるTGFβ１に対するTR2の発現を抑制することを特徴とする、TGFβ１関連疾患を治療するための組成物；
１８． TGFβ１関連疾患が肝硬変または肝炎であり、TR2の発現を抑制することにより、線維化促進、細胞周期のG1期停止、および/または肝細胞死が抑制されることを特徴とする、上記１７記載の組成物；
１９．上記３〜５のいずれかに記載のRNAまたはこれをコードするDNAを少なくとも1つ以上含む組成物を、マウスに投与して、該マウス体内の細胞におけるTGFβ1に対するTR2の発現を抑制することを特徴とする、マウスのTGFβ１関連疾患を治療する方法；
２０． TGFβ1関連疾患が肝硬変または肝炎であり、TR2の発現を抑制することにより、線維化促進、細胞周期のG1期停止、および/または肝細胞死が抑制されることを特徴とする、上記１９記載の方法；
に関する。

本発明により、TR2の発現を効率的に抑制するRNAi分子およびこれをコードするDNAが提供される。該RNAi分子またはDNA分子を含有する組成物は、TGFβ１関連疾患、特に急性および慢性肝障害および肝硬変に対する新規治療薬であり、かかる治療薬を投与することは、副作用の非常に低い治療法となり得る。

本発明は、まず第1の態様として、ヒトTR2特異的RNAi分子として作用し得る二本鎖RNAを提供する。RNAi分子として作用するのは、二本鎖RNAであり、その配列は標的とするｍRNAの配列に相補的な鎖を含む。したがって、本発明者らは、ヒトおよびマウスそれぞれについて、そのTR2の発現を抑制するためのRNAi分子を設計すべく、常法に従ってヒトについては７種類、マウスについては１４種類もの候補配列を選択し、その配列を有するRNAi分子の作用効果を検出することにより、その中から特定の配列を有するもののみが、有意な効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。RNAi分子の配列の選択方法については、種々の文献等に記載されている。例えば、S. M. Elbashirら（2001）Nature 411: 494-498、S. M. Elbashirら(2001)Genes & Dev. 15: 188-200、S. M. Elbashirら(2001). EMBO J. 20: 6877-6888、Q. Geら(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100: 2718-23、J. Harborthら(2001). J. Cell Science 114: 4557-4565、J. Harborthら(2003) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13: 83-106、J. R. Mastersら(2001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8012-8017、T. Tuschlら(1999) Genes & Dev. 13: 3191-3197などを参照されたい。しかし、その記載に従って選択された配列を有するRNAi分子が必ずしも予想どおりにRNAi分子の効果を示す訳ではなく、実際に効果を確かめてみるしかないのが現状であり、効果を有するRNAi分子の設計は、現在の技術水準においては、困難な課題である。本発明者らは、TR2特異的RNAi分子の配列を模索してこの課題を克服した結果、TR2に対するRNAi分子として作用するRNA鎖は、ヒトでは配列番号１に記載の配列とこれに相補的な配列、およびマウスでは配列番号２および３に記載の配列とこれに相補的な配列からなるそれぞれの二本鎖RNAが、TR2特異的RNAi分子として作用しうることを導き出した。

ただし、該配列中に1塩基の欠失、置換もしくは付加を含む配列であっても、RNAi分子として作用する場合がある。

さらに、RNAiとして作用し得るRNA分子は、19塩基長以上であり30塩基長以下であることが望ましいため、配列番号１に示す30塩基長からなる配列のうちの連続する少なくとも19塩基からなる配列を含むRNAであってよい。ただし、30塩基長を超えないことが好ましい。

また、RNAi分子は二本鎖RNAであるため、上記配列を有するRNAとこれにハイブリダイズするRNAとがハイブリダイズして二本鎖を形成する必要がある。ここで、上記配列番号１〜３のいずれかとハイブリダイズする配列は、それぞれに完全に相補的であることが望ましいが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であってもよい。ストリンジェントな条件下とは、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは42〜55℃、より好ましくは42℃での条件をいう。または配列番号１〜３のいずれかに完全に相補的な配列と90％以上、好ましくは93％以上、さらに好ましくは96％以上の同一性を有する配列であってもよい。

好ましいRNAi分子として作用する二本鎖RNA（dsRNA）分子は、ヒトについては配列番号１、マウスについては配列番号２および３に示す配列を有する一本鎖RNAとそれに完全に相補的な配列を有する一本鎖RNAとがハイブリダイズした形で提供される。

RNAi分子は、一本のRNA鎖がヘアピン構造を形成するヘアピン型dsRNAとして提供される場合もある。なお本明細書中RNAi分子とは、RNA干渉(RNA interference)作用を示すRNA分子をいい、shRNA(short hairpin RNA)、siRNA（small interfering RNA）の両方を含む。かかるヘアピン型dsRNAでは、ヘアピンのループ部分が一本鎖であるが、RNAiとして作用する際には該ループ部分が切断される。かかるヘアピン型dsRNAのループ部分の配列は、CUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択された配列であることが好ましい。即ち、上述の配列番号１〜３に示す配列のうちの選択されたいずれかの配列の3’末端に隣接してCUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択された配列のいずれかが続き、さらにその3’末端に隣接して、配列番号１〜３に示す配列のうちの上記選択されたものに相補的な配列、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列が連結されている配列を有する一本鎖RNA分子が、ヘアピン型dsRNAとして好ましい。例えば、ヒトについては配列番号４、マウスについては配列番号５または６に示す配列が挙げられる。

これらのRNA分子を、TGFβ１のシグナル伝達を抑制もしくは遮断することが望まれている個体に注入、または個体のTGFβ１のシグナル伝達を抑制もしくは遮断することが望まれている局所に送達することにより、送達を受けた細胞内でTR2の発現が抑制され、TGFβ１の細胞内シグナル伝達が抑制または遮断される。上記個体への注入法は、注射等の公知の方法で実施可能である。RNA分子は血液中の代謝分解を受け得るため、これを防ぐために、公知の核酸修飾法により修飾することが望ましい。注入する量は、RNA分子の安定性、局所送達の効率等により異なる。局所送達のための方法としては、直接、対象とする局所に注射することもできるが、リポソームや高分子ミセル等の種々の技術が開発されており、これらを適宜用いるとよい。

上記dsRNAは、生体内で合成されてもよい。即ち、上記RNAをコードするDNAを、細胞に導入して、細胞の内因性RNAポリメラーゼにより生体内で転写され、dsRNAが生成されるようにすることもできる。したがって、上記RNAをコードするDNAもまた、本発明の範囲に包含され得る。例えば、上記ヘアピン型RNAi分子(shRNA)である配列番号４〜６に示す配列を有するRNAをコードする、配列番号７〜９に示す配列を有するDNAが挙げられる。該DNAの転写は、調節領域、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライシングドナー及びアクセプター、ならびにポリＡにより制御されることが好ましく、特にプロモーターが該DNAの5’末端側に存在し、該プロモーターにより該DNAの転写が制御されることが好ましい。特に好ましいプロモーターの例としては、tRNAプロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター、ポリメラーゼII系プロモーター、CMVプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。そして、該DNAの転写を終結させるための、ターミネーターが該DNAの3’側に連結されていることが好ましい。好ましいターミネーターとしては、チミジン塩基が少なくとも４つ以上連続する配列からなるターミネーター、特にTx6ターミネーターが挙げられるがこれに限定はされない。ここに例示したもの以外の調節領域、プロモーターおよびターミネーターもまた、本発明において有用であり得、適切なものを選択することは当業者であれば容易に実施できる。上記RNAをコードするDNAと、その5’側に該DNAを制御し得る形でプロモーターと、該DNAの3’側にターミネーターとを含む、転写ユニットもまた本発明の範囲に包含される。

さらに、本発明の転写ユニットをベクター内に挿入して、該ベクターを、対象とする個体、または個体の組織の細胞に導入し、該ベクター中の転写ユニットからの転写によりRNAiとして作用し得るRNA分子を生成させることが可能である。該ベクターは、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、ヒトまたはマウスの標的とする細胞に導入可能であり、該細胞内で増幅し得るものであることが好ましい。例えば、プラスミドpiGENE（商標）tRNAPurを用いると、該ベクターは、tRNAプロモーターとTx7ターミネーター、およびその間にクローニング用の複数の制限酵素部位とを含む形で設計されたものであるため、上述のRNAをコードするDNAをクローニング用制限酵素部位と切断末端が合致するようにリンカーに連結させた、DNAとその相補鎖を設計して合成し二本鎖の形で該ベクターに挿入することで、上記転写ユニットを含むプラスミドベクターを構築できる。

かかるベクターを、生体内の所定の細胞に導入する方法としては、脂質を媒介とする担体輸送法（例えば、リポフェクトアミン法）、化学物質（リン酸カルシウムなど）を媒介とする輸送、マイクロインジェクション、遺伝子銃による打ち込み法、電気穿孔法等が挙げられるが、当業者は、公知の方法の中から適切な方法を選択することができる。

RNAi分子をコードするDNAを含むベクターは、二本鎖RNAまたはループ型RNAを合成するより安価であり、かつ、細胞内に導入後増幅されてRNAi分子を安定して大量に生成可能であることから、RNAを導入するのに比べて量的な効率もよいという点で、二本鎖RNAまたはループ型RNAを細胞に導入するよりかかるベクターを用いて細胞にトランスフェクトする方が有利であると考えられる。また、二本鎖RNAまたはループ型RNAを細胞に導入するために、これらをコードするDNAを含むベクターを用いてin vitro転写法またはin vivoでの転写により、二本鎖RNAまたはループ型RNAを製造することもできる。

上記の通り、本発明のTR2に対するRNAi分子を生成し得るRNAまたはDNAは、細胞内でRNAiとして作用して該細胞のTR2の発現を抑制し、TGFβ１のシグナルを抑制または遮断するため、TGFβ１のシグナル伝達により悪い影響を受ける疾患、該シグナル伝達により進行する疾患等のTGFβ１が関連する疾患の治療または該疾患の症状の軽減、進行の抑制等が可能となる。本明細書中において、「TGFβ１関連疾患」とは、TGFβ１のシグナル伝達により悪い影響を受ける疾患、該シグナル伝達により進行する疾患を指す。例としては、線維化を伴う疾患、特に慢性または急性肝炎、肝硬変(あらゆる型のものを含む)が挙げられる。肝炎、肝硬変では、TGFβ１が細胞のアポトーシスによる細胞死を誘発している。したがって、TGFβ１のシグナルを遮断することにより、肝細胞の細胞死が抑制され、症状の進行を妨げることとなる。さらに、TGFβ１は、肝臓における線維化および細胞周期G1期停止に関与しており、TGFβ１のシグナルを遮断することにより、線維化および細胞周期G1期停止が抑制され症状の進行が妨げられることとなる。

すなわち、本発明のRNAi分子(二本鎖RNAおよびヘアピン型RNAを含む)、またはこれをコードするDNAを活性成分として含む、TR2の発現を抑制するための医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。該組成物は、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよく、上記活性成分の安定性を高めるための安定化剤等、種々の有用な添加剤を含んでいてもよい。また、上記DNAは、前述のとおり転写ユニット内またはベクター内に存在してもよい。該医薬組成物は、ヒトまたはマウスのTGFβ１関連疾患、特に肝硬変または肝炎の治療または予防に有用である。

また、本発明のRNAi分子、またはこれをコードするDNAを投与することを含む、ヒトまたはマウスのTGFβ１関連疾患、特に肝硬変または肝炎を治療する方法もまた、本発明の範囲に包含され得る。

１．ヒトTR2に対するRNAi分子(shRNA)をコードするDNAベクターの構築
まず、配列番号１０に示す配列を有するDNAを常法により合成した。これらの配列はいずれも、ヒトTR2mRNAの一部に相同的なRNA（センス鎖：配列番号１）をコードするDNAと、該配列に相補的なRNA（アンチセンス鎖）をコードするDNAと、これらの間に配列番号１９に示す配列からなるRNA（ループ部分）をコードするDNAを含む。さらに、piGENE^TM tRNAベクターに挿入するために、5’末端側にSacI部位連結用リンカーと3’末端側にKpnI部位連結用リンカーが存在する。さらに、リンカー部位以外はこれに相補的で、5’末端側にKpnI部位連結用リンカーと3’末端側にSacI部位連結用リンカーが存在する、配列番号１４に示す、もう一方のDNA鎖も合成する。合成した二本のDNA鎖（図１参照）がアニーリングした際、両端それぞれにSacIとKpnI切断部位とライゲーション可能な突出末端が存在する。このようにして、合成した二本のDNAをアニーリングさせて、SacIとKpnIとで処理したpiGENE^TM tRNAベクターの該部位に連結させ、ヒトTR2shRNAコードDNA含有piGENE^TM tRNAを得る。

２．ヒト肝癌細胞株を用いたRNAi作用の確認
これを、大腸菌にトランスフェクトし、プラスミドを調製する。以上はすべて常法に従って行うことができる。

得られたプラスミドを、以下の通り、ヒト肝内胆管癌由来HuCC-T1細胞株にトランスフェクトする。該細胞株は、通常10％ウシ胎児血清（FCS）含有RPMI1640（100U／mlペニシリンと100μg／mlストレプトマイシン添加）中で37度5％CO₂環境下で培養および維持する。該細胞を48ウェルプレートに5×10⁴個／ウェルの密度で播いた。24時問後、細胞が70〜90％コンフルエントの状態になったところで、上記プラスミドDNA0.6μgを50μlのOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Gibco)に溶解したものとLipofectamin2000(Invitrogen) 1μlを50μlの上記OPTIMEM I培地に溶解したものとを、それぞれ溶解後5分間室温で静置した後、混合し20分問室温でインキュベートする。これを、300μl/ウェルのOPTIMEM Iで培地交換した上記細胞の入ったウェルに添加し、37度にて培養する。4時問後に培地交換を行い、通常のRPMI1640培地に戻す。

上記トランスフェクトから36時間後に、isogen (nipponngene)を用いて細胞からRNAを抽出・精製し、リアルタイムPCR法により、TR2のmRNA量を定量した。図２にあるように、上記ベクターをトランスフェクトした細胞（Sh TR2²⁸⁷）では、コントロール（Sh TR2^NC）に比べてTR2mRNA量が有意に減少していた。

３．マウスTR2に対するshRNAをコードするDNAベクターの構築
配列番号１１〜１３に示す配列のいずれかを含有するDNAを常法により合成した。これらの配列はいずれも、マウスTR2のRNAiの標的となり得る配列として選択されたマウスTR2mRNA一部に相同的なRNA（センス鎖：配列番号２、３または１８のいずれか）をコードするDNAと、該配列に相補的なRNA（アンチセンス鎖）をコードするDNAと、これらの間に配列番号２０に示す配列からなるRNA（ループ部分）をコードするDNAを含み、さらにターミネーター配列を3’末端に含む。5’末端側にBamHI部位連結用リンカーと３’末端側にHindIII部位連結用リンカーが存在する。さらに、リンカー部位以外はこれに相補的で、5’側にHindIII部位連結用リンカーと3’末端側にBamHI部位連結用リンカーが存在する、配列番号１５〜１７に示す配列を有するもう一方のDNA鎖も合成する。合成した二本のDNA鎖(図３参照)がアニーリングした際、両端それぞれにBamHI切断部位とHindIII切断部位とライゲーション可能な突出末端ができる。このようにして、合成した２本のDNAをアニーリングさせて、BamHIとHindIIIとで処理したpSilencer・3.1-H1puroベクターの該部位に連結させ、マウスTR2shRNAコードDNA含有pSilencer・3.1-H1puroを得る。

４．マウス肝細胞株を用いたRNAi作用の確認
これを、大腸菌にトランスフェクトし、プラスミドを調製する。以上はすべて常法に従って行うことができる。

得られたプラスミドを、以下の通り、マウスBNL CL. 2細胞株にトランスフェクトする。該細胞株は、通常10％ウシ胎児血清（FCS）含有DMEM（100U/mLペニシリンと100μg/mLストレプトマイシン添加）中で37度 5％CO₂環境下で培養および維持する。該細胞を48ウェルプレートに5×10⁴個/ウェルの密度で撒いた。24時間後、細胞が70-90％コンフルエントの状態になったところで、上記プラスミドDNA0.6μgを50μlのOpti-MEM I Reducecd-Serum Medium (Gibco)に溶解したものとlipofectamin2000 1μlを50μlの上記OPUTIMEM I培地に溶解したものとを、それぞれ溶解後5分間室温で静置した後、混合し20分間室温でインキュベートする。これを、300μl/wellのOPUTIMEM Iで培地交換した上記細胞の入ったウェルに添加し、37度にて培養する。4時問後に培地交換を行い、通常のDMEM培地に戻す。24時間毎に上記トランスフェクションを合計3回繰り返す。

最後のトランスフェクトから36時問後に、isogen（NIPPONGENE）を用いて細胞からRNAを抽出・精製し、リアルタイムPCR法により、TR2のmRNA量を定量した。このリアルタイムPCR法では、GAPDH mRNAを内因性コントロールとしてこれに対する比率を求めている。図４にあるように、ShTR2⁸⁰（配列番号１１の配列からなるDNAを含む）、ShTR2²⁷⁸（配列番号１２の配列からなるDNAを含む）およびShTR2¹⁰⁴⁷（配列番号１３の配列からなるDNAを含む）の3種のベクターをトランスフェクトした細胞のうち、ShTR2⁸⁰およびShTR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞では、mRNAレベルの低下が認められたが、ShTR2¹⁰⁴⁷をトランスフェクトした細胞ではその効果は認められなかった。

また、上記細胞からタンパク質を抽出して、抗TR2抗体によるウェスタンブロットを行った結果を図５上のパネルに示す。この結果を画像解析によりGAPDHを内因性コントロールとしてこれに対する比率を数値化したグラフを図５下のグラフに示す。mRNAレベルと同様、TR2タンパク質レベルでもShTR2⁸⁰およびShTR2²⁷⁸は顕著にその低下が認められたが、ShTR2¹⁰⁴⁷は、これらよりその低下の度合いは少なかった。

さらに、ShTR2⁸⁰またはShTR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞のDNA合成能を³H標識チミジンの取り込みにより測定した。BNL CL. 2細胞を96ウェル培養プレート中で、上記と同様に3回トランスフェクトし、最後のトランスフェクションの溶液交換から24時問後に無血清培地に交換し、その24時間後に2500pg/mlの濃度となるように組換えヒトTGFβ1（R＆D）を添加し、さらに21時間後に1μCi/ウェルの濃度になるように、³H-チミジンを各ウェルに添加した。その3時間後に細胞を回収して、液体シンチレーションにより³Hの取り込みをカウントした。同じトランスフェクタントにおける、TGFβ1を添加していない細胞の³H取り込み量に対する2500pg/mlの濃度で添加した細胞の³H取り込み量の比率をグラフに示す（図６）。

ShTR2⁸⁰またはShTR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞では、TGFβ１刺激時の³Hの取り込みが無刺激時の3倍以上であった。すなわち、ネガティブコントロールでは、TGFβ1刺激によりアポトーシスが誘導されるため取り込みが下がっているが、ShTR2⁸⁰またはShTR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞では、その取り込みの低減が抑制されていることが分かる。

さらに、各トランスフェクタントのTGFβ１刺激下36時間培養後のH-E染色による顕微鏡写真を図７に示す。ネガティブコントロールでは、細胞が減少してウェル底から剥離し底面が露呈しているのが観察されたが、ShTR2⁸⁰またはShTR2²⁷⁸のトランスフェクタントした細胞では、露呈した底面の面積は明らかに少なく、生細胞が底面に接着した正常な状態で存在していることがわかる。ShTR2¹⁰⁴⁷のトランスフェクタントでは、コントロールに比べると底面の露呈は少ないが、ShTR2⁸⁰またはShTR2²⁷⁸のトランスフェクタントに比べると、細胞が死んでいるのがわかる。

piGENETM tRNAベクターに挿入するためのリンカーを連結したヒトTR2shRNAをコードするDNA（Sh TR2²⁸⁷）の構造を示す。30塩基からなるセンスRNAコード部分とループ部分およびアンチセンスRNAコード部分からなり、両端に制限酵素部位を有している。 Sh TR2²⁸⁷をトランスフェクトした細胞とコントロール（Sh TR2^NC）をトランスフェクトした細胞とのTR2mRNAレベルを示す。ネガティブコントロールは、何も挿入していないpiGENE^TM tRNAベクターをトランスフェクトした細胞である。ターミネーターを含むマウスTR2shRNAをコードする配列を示す。常法に従いRNAi分子コード配列は3種類設計し、作製した（Sh TR2¹⁰⁴⁷、Sh TR2⁸⁰、Sh TR2²⁷⁸）。うち、Sh TR2¹⁰⁴⁷は、その作用は低レベルでしか見られなかった。 Sh TR2¹⁰⁴⁷、Sh TR2⁸⁰またはSh TR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞のTR2mRNAレベルを示す。ネガティブコントロールは、何も挿入していないベクターをトランスフェクトした細胞である。うち、Sh TR2¹⁰⁴⁷は、その作用は低レベルでしか見られなかった。 Sh TR2¹⁰⁴⁷、Sh TR2⁸⁰またはSh TR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞のTR2タンパク質レベルを示す。うち、Sh TR2¹⁰⁴⁷は、その作用は低レベルでしか見られなかった。 Sh TR2⁸⁰またはSh TR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞の³H-チミジンの取り込み量を示す。Sh negaはネガティブコントロール、EGFPは対照としてEGFPをコードするベクターをトランスフェクトした細胞を示す。 Sh TR2¹⁰⁴⁷、Sh TR2⁸⁰またはSh TR2²⁷⁸をトランスフェクトした細胞のH-E染色による顕微鏡写真を示す。白く抜けた部分は細胞が死滅して培養容器から剥がれた部分である。

Claims

以下の（a）と（b）：
（a）配列番号１に示す配列からなるRNA；
（b）配列番号１に完全に相補的な配列からなるRNA；
がハイブリダイズした二本鎖RNAであって、ヒトTGFβ１レセプターII型（TR2）を標的として、細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、二本鎖RNA。
以下の（a）と（b）：
（a）配列番号１に示す配列からなるRNA；
（b）配列番号１に完全に相補的な配列からなるRNA；
がタンデムに連結されており、その連結部分が、
（c）CUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択される１の配列を有するRNA；
を含んでなる構造を有し、（c）の部分が上記（a）と（b）とがハイブリダイズして二本鎖を形成する際にループ構造をとることを特徴とするRNAであって、ヒトTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、RNA。
配列番号４の配列からなる、請求項２記載のRNA。
以下の（a）と（b）：
（a）配列番号２または３に示す配列からなるRNA；
（b）（a）のRNAに完全に相補的な配列からなるRNA；
がハイブリダイズした二本鎖RNAであって、マウスTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、二本鎖RNA。
以下の（a）と（b）：
（a）配列番号２または３に示す配列からなるRNA；
（b）（a）のRNAに完全に相補的な配列からなるRNA；
がタンデムに連結されており、その連結部分が、
（c）CUUCCUGUCA(配列番号１９)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCCおよびUUCGからなる群より選択される１の配列を有するRNA；
を含んでなる構造を有し、（c）の部分が上記（a）と（b）とがハイブリダイズして二本鎖を形成する際にループ構造をとることを特徴とするRNAであって、マウスTR2を標的として細胞内で該レセプターの発現量を低減させるためのRNAi分子として作用し得る、RNA。
配列番号５または６の配列からなる、請求項５記載のRNA。
請求項１〜６のいずれか1項に記載のRNAをコードするDNA。
配列番号７〜９の配列のいずれかからなる、請求項３または６に記載のRNAをコードするDNA。
請求項７または８に記載のDNAを含み、かつその5’側に該DNAを制御し得る形でプロモーターを含み、該DNAの3’側にターミネーターを含む、転写ユニット。
プロモーターが、tRNAプロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター、ポリメラーゼII系プロモーターおよびCMVプロモータからなる群より選択される、請求項９記載の転写ユニット。
ターミネーターが、チミジン塩基が少なくとも４つ以上連続した配列からなるターミネーターである、請求項９または１０記載の転写ユニット。
請求項９〜１１のいずれか1項に記載の転写ユニットを含む、ベクター。
ベクターが哺乳動物に導入可能であることを特徴とする、請求項１２記載のベクター。
請求項１〜６のいずれか1項に記載のRNA、請求項７または８に記載のDNA、請求項９〜１１のいずれか1項に記載の転写ユニットおよび請求項１２または１３に記載のベクターからなる群より選択される少なくとも1つ以上を含む組成物であって、これが投与された細胞におけるTGFβ１に対するTR2の発現を抑制することを特徴とする、TGFβ１関連疾患を治療するための組成物。
TGFβ１関連疾患が肝硬変または肝炎であり、TR2の発現を抑制することにより、線維化促進、細胞周期のG1期停止、および/または肝細胞死が抑制されることを特徴とする、請求項１４記載の組成物。
請求項３に記載のRNAまたはこれをコードするDNAを少なくとも1つ以上含む組成物を、マウスに投与して、該マウス体内の細胞におけるTGFβ1に対するTR2の発現を抑制することを特徴とする、マウスのTGFβ１関連疾患を治療する方法。
TGFβ1関連疾患が肝硬変または肝炎であり、TR2の発現を抑制することにより、線維化促進、細胞周期のG1期停止、および/または肝細胞死が抑制されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。