KR101713886B1

KR101713886B1 - ＰＲＫ２를 표적으로 하는 Ｃ형 간염 바이러스 치료제 ｓｉＲＮＡ

Info

Publication number: KR101713886B1
Application number: KR1020130159000A
Authority: KR
Inventors: 오종원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2017-03-10
Also published as: US20170002361A1; US9732346B2; WO2015093886A1; KR20150071893A; EP3088523A4; EP3088523B1; EP3088523A1

Abstract

본 발명은 PRK2를 표적으로 하는 C형 간염 바이러스 치료제 siRNA에 관한 것으로, 숙주 PRK2 유전자를 표적으로 하는 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA 또는 이의 지질 제형을 통해 생체내 특히 간세포로의 전신 전달이 가능하여 효과적으로 C형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

Description

ＰＲＫ２를 표적으로 하는 Ｃ형 간염 바이러스 치료제 ｓｉＲＮＡ{Therapeutic PRK2-silencing siRNA for the treatment of hepatitis C virus infection}

본 발명은 PRK2를 표적으로 하는 새로운 siRNA를 이용하여 C형 간염을 치료하는 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 비-A형, 비-B형 간염의 주요 병인 제제이다. 현재, 전 세계적으로 1억 7천만 명 이상이 HCV에 만성감염되어 있다. 지속적인 HCV 감염은 간경화와 간세포성 암종으로 이끌 수 있는 만성 간염을 유발한다. HCV-특이적이고 효과적인 치료제는 오히려 제한적이다. 만성 C형 간염 환자들에 대한 현재 표준 치료법은 페길화된 인터페론(pegylated interferon, 이하, 'IFN'라 함)과 뉴클레오사이드 아날로그인 리바비린이다. 그러나, IFN과 리바비린과 함께 투여하거나, 단독 투여할 경우 종종 다양한 부작용을 일으키며, 특정 HCV 유전자형에 대한 IFN의 지속적인 바이러스 반응율은 50% 미만이다. 현재, RNA 복제효소의 필수 바이러스 성분들인 비구조 단백질(NS)3/NS4A 프로테아제 및 NS5B RNA-dependent RNA 중합효소(RdRp)를 포함한 HCV 효소들의 몇몇 억제제들은 임상 시험 중이거나 임상 적용을 승인 받았다. HCV 효소-특이적인 치료제의 개발은 바이러스 RdRp의 오류-수복 특성에 의해 유발되는 내성 돌연변이의 빠른 출현으로 인해 방해를 받아 왔다. 그리하여, 바이러스 효소 표적뿐만 아니라, 숙주 표적은 항-HCV 약물 개발을 위한 매혹적인 방안으로 떠올랐다. siRNA에 의해 매개되는 RNAi(RNA interference)는 바이러스 RNA 유전자를 사일런싱(silencing) 하는 데 있어 효과적이고 특이적인 치료제이다. 몇몇 선행 보고들에서, siRNA를 HCV 게놈의 다양한 영역으로 향하게 함으로써 HCV 치료법으로서의 합성 siRNA 및 벡터 기반 siRNA(short hairpin RNAs; shRNAs)의 잠재적 이용을 입증하였다.

그러나, 개선된 전달 매체의 부재 외에도, 내성 돌연변이의 빠른 출현은 바이러스 게놈으로 표적화된 siRNA의 치료적 이용에 주요 장애가 되었다. 숙주 표적 mRNA는 RNAi 사일런싱으로부터 탈출 기회가 더 낮기 때문에, HCV 복제 및 증식에 필요한 숙주 인자들은 항-HCV siRNA 치료를 위한 전도유망한 표적이 될 것이다. 본 발명자들은 이미 HCV NS5B RdRp가 단백질 키나아제 C 패밀리에 속하는 Thr/Ser 키나아제인 PRK2(Protein kinase C-related kinase 2)에 의해 인산화됨을 보여준바 있다. HCV 복제는 PRK2 과발현에 의해 긍정적으로 조절되고, PRK2 억제제인 HA1077 및 Y27632을 이용한 PRK2의 약제학적 억제에 의해 억제됨을 보여주었다.

최근 발전에도, 전신 전달은 안전하고 효과적인 siRNA 기반 치료의 발전을 위한 주요 걸림돌이 되고 있다. HCV 복제 또는 보급에 필요한 다양한 세포성 인자들의 사일런싱에 이용되는 siRNA의 항바이러스 효능은 효율적인 간-표적화, 보다 구체적으로 간세포-표적화, siRNA 전달 매체의 부족으로 인해, 또는 siRNA의 낮은 안정성 및/또는 중요한 숙주 인자들의 사일런싱에 의해 유도되는 독성으로 인해 어느 정도 생체내에서 아직까지는 평가되고 있지 않았다.

본 발명은 활성적인 PRK2 siRNA를 개발하고, PRK2 유전자를 사일런싱하는 siRNA가 HCV를 위한 또 다른 치료 방안으로 이용될 수 있는 지를 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제2006-0099558호 (2006.09.20)

Seong-Jun Kim et al. The Journal of Biological Chemistry, vol.279(48), pp.50031-50041 (2004.09.13) Bert M Klebl et al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 16:2, pp.69-90 (2005)

본 발명의 목적은 숙주의 PRK2 유전자의 사일런싱(silencing)을 통해 생체 내에서 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 PRK2 mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며, 가이드 가닥과 패신저 가닥으로 이루어지고, 상기 가이드 가닥은 상기 표적이 되는 염기서열 내 연속하는 15 bp 이상의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 30 bp의 이중가닥 siRNA(small interfering RNA)을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA를 포함하는 C형 간염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 숙주 PRK2 유전자를 표적으로 하는 항-HCV 활성을 나타내는 siRNA를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 siRNA의 지질 제형을 통해 생체내 특히 간세포로의 전신 전달이 가능하여 효과적으로 C형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 인 비트로에서 HCV RNA 복제를 특이적으로 억제하는 PRK2의 사일런싱 및 이의 효과를 나타낸 것으로, (A)는 사람 PRK2 mRNA 서열에서 siRNA의 다양한 표적 영역을, (B)는 HCV 서브게놈 레플리콘 RNA의 도식도를 나타내고(?C 및 Neo는 각각 HCV 코어 단백질의 N-말단 일부와 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 나타내고, NS 단백질은 HCV 복제에 필수적인 비구조적 단백질임), HCV 서브게놈 레플리콘이 탑재된 Huh7 세포(R-1)에 PRK2-특이 siRNA를 10nM(C) 및 농도별(D)로 트랜스펙션 시킨 후 HCV 서브게놈 RNA 타이터의 mock-siRNA 처리된 대조군의 비율로 표현한 실시간 qRT-PCR 측정값(반복으로 3회 독립 실험한 측정값, *p <0.01)과, 100 nM siPRK2-1 또는 1 ㎍/ml poly(I:C)로 트랜스펙션 시킨 HEK293 세포에서 IFN-β 프로모터 활성 분석 결과(Mock-처리된 세포의 표준화된 루시퍼라아제 활성(Fluc/Rluc)을 100으로 정하고, 데이터는 2회 독립 실험에서 얻은 6개 측정값의 평균±SD로 나타냄; Rluc, 바다팬지의 루시퍼라아제; Fluc, 반딧불이의 루시퍼라아제)(E), siRNAs(50 nM)를 처리한 Huh7 세포에서 세포주기 분석 결과(G1기 블록을 유도하는 P13K 억제제인 LY294002(50μM)를 양성 대조군으로 사용함)(F), siRNAs(50 nM)과 듀얼 리포터 벡터를 트랜스펙션 시킨 Huh7 세포에서 HCV IRES를 매개로 한 번역 수준 평가 결과(2개의 루시퍼라아제 리포터 유전자들은 황록색과 황색 박스로 표시함; Mock-처리된 세포의 표준화된 루시퍼라아제 활성(Fluc/Rluc)을 100으로 정하고, 2개의 독립 실험 중 하나의 데이터를 표시함)(G)를 나타낸 것이다.
도 2는 PRK2 이소폼 또는 다른 관련 키나아제의 사일런싱과 HCV 복제의 관련성을 평가한 결과로, (A)는 PRK2-특이 siRNA, siPRK2-1(10 nM)을 트랜스펙션 시킨 HCV 서브게놈 레플리콘(R-1)이 탑재된 Huh7 세포에서 트랜스펙션 후 48시간째에 수행한 PRK2 및 HCV NS5B의 웨스턴 블랏 분석 결과이고(항-튜불린 항체를 이용한 면역 블랏팅은 내부 로딩 대조군으로 사용), (B) 및 (C)는 더 높은 농도(50 nM)의 siRNA를 PRK1 및 PRK3의 사일런싱에 사용하는 것을 제외하고는 (A)에서 언급한 단백질들에 대한 웨스턴 블랏 분석에 의해 PRK1- 또는 PRK3를 표적으로 하는 siRNAs의 사일런싱 효과를 분석한 결과이며(PRK3 mRNA 수준은 실시간 RT-PCR로 정량함), R-1 세포에 ROCK1 또는 ROCK2 중 어느 하나를 표적으로 하는 50 nM siRNAs를 트랜스펙션 시키고, 웨스턴 블랏 분석(D)에 의해 ROCK 및 NS5B 단백질 수준을 측정하고, 실시간 qRT-PCR에 의해 HCV RNA 수준을 측정한 결과(E)를 나타낸 것이다.
도 3은 HCV NS5B과 PRK2의 특이 상호작용을 나타낸 결과로, (A)는 HCV NS5B에 결합하는 파지에 의해 표시되는 펩타이드의 아미노산 서열의 배열 및 PRK 이소자임의 상응하는 상동 영역을 나타낸 것이고(PRK2는 HCV NS5B 에 결합하는 펩타이드 서열과 매우 유사한 서열 NGRLVRRAI-C를 포함함; PRK2에 있는 동일한 아미노산과 선택된 펩타이드는 밑줄로 표시), (B)는 R-1 세포 용해물을 항-PRK2 또는 항-PRK1 항체를 이용하여 면역침전시키고, 웨스턴 블랏 분석한 결과로, 레인 1은 공-면역침전 실험에 사용된 세포 용해물의 주입량의 10%을 나타낸다.
도 4는 siPRK2-1의 농도를 증가시키면서 트랜스펙션 시킨 Huh7 세포에서 siPRK2-1의 세포독성 결과를 나타낸 것이다(수치는 3반복 측정값의 평균±SD임).
도 5는 리피도이드 ND98에 의해 전달된 siPRK2-1의 인 비트로 및 인 비보 사일런싱 효능을 나타낸 것으로, (A)는 리피도이드 ND98의 화학적 구조를 나타내고(아크릴아마이드(검은색으로 표시)에 아민(적색으로 표시)을 컨쥬게이션하여 제조), (B)는 트랜스펙션 제제를 이용하여 10 nM siPRK2-1 또는 스크램블드 siRNA를 R-1 세포에 트랜스펙션시키고, 도 1C과 같이 정량한 HCV 게놈 타이터를 나타내며, (C)는 BALB/c 마우스(1 그룹 당 5마리)에 l mg/kg 체중의 용량으로 siPRK2-1 LNP를 주사하고, qRT-PCR를 이용하여 간세포에서 PRK2 mRNA 수준을 분석한 결과이며, PRK2 mRNA 수준은 GAPDH로 표준화하였으며, 데이터는 2개의 독립 실험의 대표값을 나타낸 것이다(*p < 0.05).
도 6은 감염성 HCV 입자를 생산하는 이종이식 마우스 모델에서 siPRK2-1 LNPs의 항-HCV 활성을 나타낸 것으로, (A)는 이종이식 후 7일째 및 14일째에 비-트랜스펙션된 Huh7(Huh7/mock) 또는 HCV(유전자형 2a, JFH1) 인 비트로 전사체 RNA 게놈(Huh7/HCV)을 전기천공한 Huh7 세포가 도입된 이종이식 마우스의 혈청에서 실시간 qRT-PCR를 이용하여 측정된 HCV 게놈 타이터를 나타낸 것이고, (B)는 이종이식 후 4주째에 회수된 이종이식 조직에서 HCV 플러스- 및 마이너스-가닥 RNA 카피 수를 나타낸 것이며(ND, 검출 안됨), (C)는 HCV 코어 항원 검출을 위한 이종이식체(이종이식 후 4주째)의 H&E 염색 및 면역조직학적 분석 결과이고(H&E, 해마톡실린 및 에오신; DAPI, 핵 염색. 스케일 바, 50 ㎛), (D) 및 (F)는 약물 투여 또는 siRNA 주사 후 시간대 별로 혈청에서 측정된 HCV 타이터를 측정한 결과(PRK2 억제제인 HA1077(25 mg/kg)의 종양내 1회 주사(D) 또는 1 mg/kg 체중의 용량으로 LNP에 캡슐화된 siPRK2-1 또는 스크램블드 siRNA의 정맥내 주사(이하, 'i.v. 주사'라 함) 후 회수된 이종이식 마우스(1 그룹 당 3마리)에서 혈청 HCV 게놈 타이터를 나타낸 것이다((F)에서 화학적으로 변형된 siPRK2-1(PS1_siPRK2-1)는 (E)에서와 같이 투여됨; *p < 0.01; **p < 0.05).
도 7은 hPBMC에서 siPRK2-1/리피도이드 또는 siPRK2-1 리피도이드 나노입자는 IFN-α 및 TNF-α의 생산을 유도하지 않음을 나타내는 결과로 hPBMCs에 리피도이드 ND98 또는 리피도이드 나노입자(LNP)를 이용하여 10 nM siPRK2-1 또는 스크램블드 siRNA(Sc) 또는 1 ㎍/well의 poly(I:C)를 트랜스펙션 시키고, 선택적으로, 배지에 50 ㎍/ml의 poly(I:C)를 직접적으로 부가하여 세포를 자극한 후 자극을 받은 세포에서 분비된 IFN-α(A, C) 및 TNF-α(B, D)의 ELISAs 측정값을 나타내고, 이 결과는 유사한 결과를 갖는 2개의 독립 실험 중 하나에서 얻은 데이터를 보여준다.
도 8은 HCV-감염된 세포에서 화학적으로 변형된 siPRK2-1 유도체의 항-HCV 활성을 나타낸 것으로, (A)는 45% 인간 혈장에서 변형되지 않은 siPRK2-1(2μM)의 혈청 안정성 평가 결과(일정 시간 동안 siRNA를 인큐베이션한 후, 각 시료에서 추출된 RNA를 변성 15% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하고, 노던 블랏 분석을 통해 siPRK2-1 가이드-가닥(화살표로 표시)을 측정하며, 시그널의 상대 강도는 SigmaPlot를 이용하여 siPRK2-1 가이드-가닥의 반감기를 측정함; 유사한 결과를 갖는 2개 독립 실험의 대표 실험 중 하나의 결과를 보여줌)이고, (B)는 본 발명에서 이용된 siPRK2-1 유도체의 변형된 가이드- 및 패신저-가닥의 서열을 나타내며, (C)는 화학적으로 변형된 PRK2 siRNAs의 안정성을 (A)에서와 같이 인간 혈장에서 평가한 결과이며, (D) 및 (E)는 HCV(유전자형 2a, JFH1)-감염된 Huh7 세포에서 평가한 선택한 변형 PRK2-1 siRNAs의 항-HCV 활성을 나타낸 것이다(HCV(multiplicity of infection: 0.25)로 4시간 동안 세포를 감염시키거나, 미처리 상태로 남겨두거나(Ctrl), lipofectamine RNAiMAX를 이용하여 PRK2를 표적으로 하는 siRNAs 또는 스크램블드 siRNA(Sc)(10 nM)를 트랜스펙션시키고, 4시간 후 세포를 세척하고, 신선한 완전 배지에서 48시간 동안 추가로 인큐베이션하며(D), 선택적으로, Huh7 세포를 siRNAs(10 nM)로 미리 트랜스펙션시키고, 4시간 후 세척하고 HCV로 4시간 동안 감염시킨 다음 추가로 신선한 완전 배지에서 48시간 동안 인큐베이션 하여(E) 평가함; HCV 게놈 카피 수는 qRTPCR로 측정하고, 3반복 측정으로 3개의 독립 실험을 수행함. *p < 0.01).
도 9는 인간화된 간을 갖는 키메라 마우스에서 gs_PS1 siPRK2-1 및 그것의 항-HCV 활성의 장기간 사일런싱 효능을 나타낸 것으로, (A) 및 (B)는 트랜스펙션 후 3일, 6일 및 9일째에 10 nM 변형되지 않은 siPRK2-1, PS-변형된 siPRK2-1(gs_PS1), 또는 스크램블드 대조군 siRNA(Sc)(리피도이드 ND98을 이용)로 트랜스펙션된 마우스 프라이머리 간세포에서 siPRK2-1 가이드-가닥(A) 및 PRK2 mRNA(B) 수준을 나타낸 것이고, (C)는 1 mg/kg 용량으로 마우스에 i.v. 주사된 gs_PS1 siPRK2-1 LNPs과, 각 기관 및 4개의 다른 간엽에서 siPRK2-1 가이드-가닥 수준을 노던 블랏팅에 의해 분석한 결과 및 총 RNA 추출에 사용된 간 부분들(각 간엽의 중량%가 표시됨)을 하단 패널에서 도식적으로 나타내며(대조군 마우스(마지막 레인)의 RML에서 얻은 총 RNA는 대조군으로 포함되고, 5S rRNA 밴드는 RNA의 동량 로딩을 입증하기 위해 에티디움 브로마이드 염색을 통해 시각화 하였으며, 데이터는 유사한 결과를 갖는 2개의 독립 실험의 대표값임; RUL, right upper lobe; LUL, left upper lobe; LLL, left lower lobe; RML, right middle lobe; RLL, right lower lobe; OL, omental lobe; PV, portal vein), (D) 및 (E)는 인간화된 간을 갖는 키메라 면역-결핍 SCID 마우스(uPA/SCID)를 HCV(유전자형 1b)로 감염시킨 후 gs_PS1 siPRK2-1 LNP 또는 PBS를 i.v. 주사하여 실험 동안 키메라 마우스의 혈청 HCV RNA 타이터(D) 및 체중의 변화(E)를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 PRK2 mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며, 가이드 가닥과 패신저 가닥으로 이루어지고, 상기 가이드 가닥은 상기 표적이 되는 염기서열 내 연속하는 15 bp 이상의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 30 bp의 이중가닥 siRNA(small interfering RNA)에 관한 것이다.

본 발명의 또한 상기 siRNA를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 포하는 C형 간염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 사람을 포함하는 포유 동물의 PRK2 mRNA, 이의 선택적 스플라이싱 형태(alternative splice form), 돌연변이 형태, 또는 같은 계통의 PRK2 유전자의 발현을 저해하는 기술과 관련된 것이며, 이는 본 발명에서 제공되는 siRNA의 특정 용량을 환자에게 투여했을 때 타겟 mRNA가 감소함으로써 성취되는 것일 수 있다.

상기 PRK2는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 PRK2 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 PRK2 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로, 구체적으로, 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, PRK2를 코딩하는 mRNA에 해당하는 센스 가닥의 cDNA 서열은 SEQ ID NO: 1 일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 siRNA는 사람 PRK2 mRNA 내부의 527-545 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하며, SEQ ID NO: 1은 이 부위를 언급한다. 이 표적 부위는 마우스의 mRNA 내에 보존되어 있어 역시 이 부위를 표적으로 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '표적 mRNA'라 함은 사람의 PRK2 mRNA, 사람과 같은 계통의 PRK2 mRNA, 이의 돌연변이체, 또는 선택적 스플라이싱 구조체를 지칭한다. 구체적으로, NM_006256, NM_178654 등일 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA은 사람 또는 사람과 같은 계통의 PRK2 mRNA나 이의 선택적 스플라이싱 형태, 돌연변이 형태를 표적으로 하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 'mRNA 영역을 표적으로 한다'고 함은 siRNA가 상기 mRNA 영역 염기서열 중의 전부 또는 일부, 예컨대 염기서열의 85-100%와 상보적인 염기서열을 가져서, 상기 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서, '상보적'이라 함은 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥이 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보적 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥은 왓슨-크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중가닥을 형성한다. 본 발명에서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 T로 치환가능하다.

본 발명의 siRNA는 RNAi 메카니즘에 의해 PRK2 mRNA 분해를 일으켜 PRK2 단백질의 발현을 유발하지 않거나 감소시키는 기능을 한다.

siRNA는 RNA interference (RNAi) 경로를 유발하는 작은 저해 RNA 이중가닥 (small inhibitory RNA duplexes)을 의미한다. 구체적으로, siRNA는 센스 RNA 가닥과 그에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며, 양 가닥이 15-30 bp, 구체적으로는 19-25 bp, 더 구체적으로는 19-21 bp를 포함하는 RNA 이중가닥이다. siRNA는 이중가닥 영역을 포함하며 단일 가닥이 헤어핀(hairpin) 또는 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성하는 구조이거나, 2개의 분리된 가닥의 이중가닥일 수 있다. 패신저 RNA 가닥은 표적 유전자의 mRNA 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 서열을 가지며, 패신저 가닥과 이에 상보적인 가이드 가닥이 서로 왓슨과 크릭의 상보적인 염기서열 결합에 의해서 이중 가닥을 이루고 있다. siRNA의 가이드 가닥은 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)에 포집되어 RISC가 가이드 가닥과 상보적인 목표 mRNA를 확인한 후 절단 또는 번역(translational) 저해를 유도하게 한다.

일 구현예에서, siRNA는 패신저 가닥과 가이드 가닥을 포함하며, 패신저 가닥과 가이드 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없는 평활 말단(blunt end)을 갖는 대칭 구조, 또는 적어도 하나 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지는 비대칭 구조일 수 있다. 돌출부 뉴클레오타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(deoxythymidine, 디옥시티미딘) 2개를 붙일 수 있다.

상기 가이드 가닥은 생리학적 조건에서 SEQ ID NO: 1의 mRNA의 표적 영역에 혼성화한다. '생리학적 조건에서의 혼성화'라 함은 siRNA의 가이드 가닥이 인 비보에서 mRNA의 특정 표적 영역과 혼성화하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 가이드 가닥은 mRNA의 표적 영역, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 염기서열과 85% 이상의 서열 상보성을 가질 수 있으며, 더 구체적으로 상기 가이드 가닥은 SEQ ID NO: 1의 염기서열 내의 연속하는 15 bp 이상, 바람직하게는 18 bp의 염기서열에 완전 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 siRNA는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥 서열과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 siRNA는 변형되지 않고 자연에 존재하는 리보핵산 단위구조를 가지고 있는 것이거나, 또는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조나 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.

또한, siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.

상기 화학적 변형을 통해, RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 예컨대 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화 향상, 안정성 증가, 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 표적 이외의(off-target) 효과 감소 등, siRNA의 다양한 특성을 변형되지 않은 siRNA 보다 향상시킬 수 있다. siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120).

siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 패신저 및 가이드 가닥의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 치환하는 방법이 있으며, 이를 통해 뉴클레아제(nuclease)의 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 일례로, siRNA 패신저와 가이드 양쪽 가닥의 3’-말단 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변경할 수 있다. 다른 일례로, siRNA 패신저와 가이드 가닥의 5' 말단, 3’말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 또는 LNA(Locked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있다. 또 다른 일례로, 리보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH₂(아미노기), -C-allyl(알릴기), -F(플루오로기), 또는 -O-Me(또는 CH3, 메틸기)로 치환하는 화학적 변형을 가할 수 있다. 예컨대, 패신저 가닥의 1번 및 2번 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 2’-O-Me로 치환하거나, 가이드 가닥의 2번 핵산의 리보스 환에서 2‘-OH를 2’-O-Me로 치환, 또는 구아닌(G) 또는 유리딘(U)을 포함하는 일부 뉴클레오타이드에서 리보스 환의 2‘-OH를 2‘-O-Me(메틸기) 또는 2‘-F(플루오로기)로 치환할 수 있다.

상술한 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며, 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.

다만 상기 변형에 있어서, siRNA 이중가닥 구조를 안정화시키는 동시에 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않도록, 바람직하게는 최소한의 변형이 이루어지도록 하는 것이 좋다.

바람직한 구현예에서, 상기 화학적으로 변형된 siRNA는,

SEQ ID NO: 4로 표시되는 가이드 가닥 서열과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥 서열로 이루어진 siRNA; 또는

SEQ ID NO: 5로 표시되는 가이드 가닥 서열과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥 서열로 이루어진 siRNA일 수 있다.

일 구현예에 따르면, 화학적으로 변형된 siRNA는 변형이 가해지지 않는 siRNA 대비 향상된 안정성을 나타낸다.

또한, siRNA에 콜레스테롤, 비오틴, 세포 침투 성질을 가지는 펩타이드(cell penetrating peptide)와 같은 리간드(ligand)를 패신저 가닥의 5' 또는 3'- 말단에 붙이는 것도 가능하다.

본 발명의 siRNA는 화학적 합성, 인 비트로 전사 또는 다이서(Dicer)나 기타 유사한 활성을 가지는 뉴클리에이즈로 긴 이중 가닥 RNA를 절단하여 제조할 수 있다. 또는, siRNA를 플라즈미드나 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아바이러스, 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 등의 바이러스성 발현 벡터 등을 통하여 발현시켜 사용할 수 있다.

따라서, 상기 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 벡터(발현 벡터) 형태를 모두 포함하는 개념이다.

siRNA 특정 서열이 인터페론을 유도하는지 여부를 수지상 세포를 포함하는 사람의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에서 실험적으로 확인한 후 면역반응을 유발하지 않는 서열을 선별하여 후보 siRNA 서열로 선정할 수 있다.

이하, 상기 siRNA의 전달을 위한 약물전달시스템(DDS)을 설명한다.

siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)이 활용될 수 있다. 세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체에는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등이 있다. 상기 바이러스성 벡터(viral vector)는 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있다. 상기 바이러스성 벡터에는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함된다. 비바이러스성 벡터(nonviral vector)는 플라즈미드를 포함할 수 있다. 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI(polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온(cyclodextrin-based polycation), 덴드리머(dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함된다.

상기 지질 나노입자는 siRNA와 함께 핵산-지질 입자를 형성한다. 핵산-지질 입자는 보통 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 스테롤, 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예컨대, PEG-지질 콘쥬게이트)을 포함한다. 핵산-지질 입자는 이들이 i.v. 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위(예컨대 투여 부위와 물리적으로 떨어진 부위)에 축적되므로, 전신 적용에 있어 극히 유용하다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 중에 존재하는 경우 이들은 수용액 중에서 핵산 분해효소로의 분해에 내성을 띈다. 핵산-지질 입자 및 이들의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 번호 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964에 개시되어 있다.

핵산-지질 입자는 또한 하나 이상의 추가 지질 및/또는 기타 성분, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 기타 지질은 다양한 목적, 예컨대 지질 산화를 방지하거나 또는 리포좀 표면 상에 리간드를 부착하기 위해 리포좀 조성물 중에 포함될 수 있다. 양친매성, 중성, 양이온성, 및 음이온성 지질을 포함하여 임의 수의 지질이 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

핵산-지질 입자 중에 존재할 수 있는 추가 성분에는 이중층 안정화 성분, 예컨대 폴리아미드 올리고머(예컨대 미국 특허 제6,320,017호 참고), 펩티드, 단백질, 세제, 지질-유도체, 예컨대 포스파티딜에탄올아민에 콘쥬게이트된 PEG 및 세라마이드에 콘쥬게이트된 PEG(미국 특허 번호　5,885,613 참고)가 포함된다. 핵산-지질 입자는 하나 이상의 제 2 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 및 형성 동안 하전 유도 응집을 방지하는 입자의 구조적 안정화에서 기여할 수 있는, 형성 동안 지질 입자의 응집을 감소시키기 위해 선택되는 지질을 포함할 수 있다.

상기 핵산-지질 입자는 압출 방법 또는 인-라인 혼합 방법을 통하여 만들 수 있다. 압출 방법(또는 배취(batch) 공정이라고도 함)은 비어있는 리포좀(가령, 핵산이 없는)을 먼저 만들고, 빈 리포좀에 핵산을 추가하는 방법으로 미국 특허 제5,008,050호; 제4,927,637호; 제4,737,323호; Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19; 557(1):9-23; Biochim Biophys Acta. 1980 Oct 2; 601(3):559-7; Biochim Biophys Acta. 1986 Jun 13; 858(1):161-8; 및 Biochim . Biophys . Acta 1985 812, 55-65에 설명되어 있으며, 이들의 전문을 참조할 수 있다.

인라인(in-line) 혼합 방법은 지질 및 핵산을 나란하게 혼합 쳄버에 추가하는 방법이다. 혼합 쳄버는 단순한 T-커넥터이거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 기타 혼합 쳄버일 수 있다. 이러한 방법들은 미국 특허 제6,534,018호 및 미국 특허 제6,855,277호; US 공개특허 제2007-0042031호 및 Pharmaceuticals Research, Vol. 22, No. 3, Mar. 2005, p. 362-372에 공개되어 있으며, 이들의 전문을 참조할 수 있다.

본 발명의 제형은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법으로 제조할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 핵산-지질 입자들은 지방성물질(리피도이드) ND98 (MW 1487)(도 5A 참조), 콜레스테롤 및 PEG-세라마이드 C16를 이용하여 합성될 수 있다. 리피도이드 ND98 133 mg/ml; 콜레스테롤 25 mg/ml, PEG-세라마이드 C16 100 mg/ml. ND98, 콜레스테롤, 그리고 PEG-세라마이드 C16 비축 용액은 가령, 42:48:10 몰 비율로 복합될 수 있다. 복합된 지질 용액은 최종 에탄올 농도가 약 35-45%이며, 그리고 최종 아세테이트 나트륨의 농도가 약 100-300 mM이 되도록 수성 siRNA(가령, pH 5의 아세테이트 나트륨내)과 혼합될 수 있다. 지질-siRNA 나노입자들은 일반적으로 혼합시 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들면, Lipex Extruder (Northern Lipid, Inc)와 같은 열통(thermobarrel) 압출기를 이용하여 폴리카르보네이트 막(가령, 100 nm 컷-오프)을 통하여 압출될 수 있다. 일부 경우에, 압출 단계가 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시 완충액 교환은 투석 또는 접선 흐름 여과 방식(tangential flow filtration)에 의해 이루어질 수 있다. 완충액은 약 pH 7, 가령, 약 pH 6.9, 약 pH, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서 인산염 완충된 염(PBS)으로 교체될 수 있다.

상기 siRNA가 핵산 전달체와의 복합체 형태로 인 비보 또는 인 비트로 상에서 세포 내로 도입될 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA에 의한 PRK2의 사일런싱은 HCV를 복제하는 세포에서 HCV 게놈 타이터를 현저히 감소시키고, 항 바이러스 효과는 세포주기와 HCV IRES를 매개로 한 번역 과정을 간섭하거나, 인터페론-α 또는 TNF-α를 유도하지도 않았다. 또한 siRNA의 간 특이 전달은 간세포의 PRK2 mRNA 수준을 현저히 감소시킨다.

따라서, 본 발명의 siRNA는 C형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 병용투여를 위한, HCV RNA 복제효소(RNA-dependent RNA polymerase) NS5B, 단백질 분해효소(protease) 활성을 지닌 NS3, 비구조단백질 NS5A, 또는 PRK2 등의 HCV 단백질 또는 효소 타겟 저분자 기능 저해제, 또는 상기 HCV 단백질 코딩 유전자 또는 숙주 타겟 유전자 저해제, 예컨대, 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 등; 또는 IFN-α를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함한다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.

또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명의 siRNA 또는 약학적 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 흰쥐)일 수 있으며, 특히 PRK2 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 사람일 수 있다.

PRK2 억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반응 등의 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도, 또는 사용 또는 처리 농도는, 0.001 내지 1000 nM, 바람직하게는 0.01 내지 100 nM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 nM로 할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물의 치료적 유효량은 질환의 종류, 증상의 정도, 투여되는 siRNA의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 병용투여제 등의 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> siRNA 제조 및 실험방법

(세포주 및 배양)

사람 간세포성 암종 세포주 Huh7는 표준 배양 조건(5% CO₂, 37℃)하에서 10% 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 0.1 mM 비-필수 아미노산이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. HCV 서브게놈 레플리콘 RNA가 탑재된 Huh7 세포(R-1 세포주)는 1 mg/ml G418이 첨가된 완전 DMEM에서 유지되었다. 인간신장배양세포(Human embryonic kidney(HEK) 293 cell)는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 1 mM 소듐 파이루베이트를 포함하는 DMEM에서 배양하였다.

(플라스미드)

바다팬지(Renilla)의 루시퍼라아제(RLuc) 리포터의 cap-의존적인 번역과 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제(FLuc) 리포터의 HCV IRES-매개로 한 번역이 가능한 비시스트로닉 듀얼 루시퍼라아제 발현 벡터는 Kim MG 등의 문헌(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012;421:112-12 118)에 개시되어 있다. 감염성 HCV 입자를 생산하는데 사용된 플라스미드 JFH1은 Dr. Takaji Wakita(National Institute of Infectious Diseases, Japan)으로부터 제공받았다.

(항체 및 시약)

항체는 다음과 같이 얻었다: 토끼 다클론성 항-PRK2 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 마우스 단클론성 항-Rho-associated kinase(ROCK)1(4H247) 및 ROCK2(30-J) 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 마우스 단클론성 항-PRK1 항체(clone 49/PRK1, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 항-α-튜불린 항체(Calbiochem, La Jolla, CA, USA). 토끼 다클론성 항-NS5B 항체는 본 발명자의 실험실에서 생산하였다.

이중가닥 RNA 유사체인, 폴리이노신산:폴리시티딜산(Polyinosinic:polycytidylic acid[poly(I:C)])은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 얻었다. HCV 3'-UTR RNA는 인 비트로 전사에 의해 제조하였다.

(siRNAs)

사람 PRK1, PRK2, PRK3, ROCK1 또는 ROCK2를 표적으로 하는 siRNAs는 GenBank(각각 NM 213560, 006256, 013355, 005406 및 004850)에서 얻은 mRNA 서열에 따라 설계하고, ST Pharm(Seoul, Korea)에서 얻었다. PRK2 mRNA를 표적으로 하는 siRNA 영역은 도 1A에 도시하였다. 각 PRK 아이소폼을 사일런싱하는데 사용된 다른 siRNAs의 가이드 가닥은 다음과 같다: siPRK1-1(5'-GAUGAUGUCAAUCUUGGUCTT-3'), siPRK1-2(5'-GCUGUAGGUCUGGAUCAUGTT-3'), siPRK2-1(5'-UCAAAGAAGGAGCUGAAAAUU- 3'), siPRK3-1(5'-AAGCAGUUUCACCACGUUCTT-3') 및 siPRK3-2(5'-CUCCUGCUUCUUCAGUGCUTT-3'). ROCK1 및 ROCK2를 사일런싱하는데 사용된 siRNAs는 siROCK1-1(5'-GCAGCAGGUUGUCCAUUUUTT-3'), siROCK1-2(5'-GCAAACAAUCCGAAUUCACTT-3'), siROCK2-1(5'-UCCCCGCCCCUCAAUCAGATT-3') 및 siROCK2-2(5'-GCCUGCCUCUAGCUCCGGCTT-3'). 라이보스 당 백본에 있는 2'-OH기를 2'-O-메틸기(2'O-Me) 또는 2'-플루오로(2'F)로 치환하여 siPRK2-1을 변형하였다. 또한 2개의 리보뉴클레오타이드 사이 백본 인산에 있는 1개의 비-가교성 산소 원자를 황원자로 대체하여 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS) 연결을 생성하도록 변형하였다. 화학적으로 변형된 siPRK2-1 유도체들은 도 8B)에 도시하였다.

(정량적 실시간 PCR)

HCV 게놈 카피 수는 HCV 5'-UTR에 특이적인 프라이머 세트와 TaqMan 프로브를 이용하여 실시간, 정량적 RT-PCR(qRT10PCR)로 측정하였다. HCV 마이너스-가닥(minus-strand) RNA 카피 수는 플러스-가닥 게놈 카피 수의 실시간 PCR 정량에 사용된 정방향 프라이머를 사용하여 합성된 cDNA를 사용하고 유사한 방법으로 측정하였다. HCV 5'-UTR의 상보서열을 나타내는 정제된 인 비트로 전사체를 HCV 마이너스-가닥 RNA 카피 수 측정을 위한 표준 RNA로 사용하였다. PRK3 mRNA에 대한 정량적 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머들은 다음과 같다: 센스 프라이머: 5'-ATATGGAGCCTAGGACTCGACGTG- 3'; 안티센스 프라이머: 5'-AGCTAAGCAGCGGAAGTCCTGA-3'.

합성된 cDNA 산물들은 SYBR Premix Ex Taq(Takara, Shiga, Japan)로 증폭하였다. GAPDH에 대해 표준화된 표적 유전자 수준은 컴Ct 방법을 사용하여 측정하였다(Ahn DG, Lee W 등, Antiviral Res. 2011;91:1-10). siPRK2-1 가이드-가닥(guide-strand)의 카피 수는 제조업체(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 설계한 프라이머 세트를 사용하여 Taqman 프로브에 의한 qRT-PCR로 측정하였다.

(면역침전 및 웨스턴 블랏 분석)

PRK1 또는 PRK2의 면역침전은 항-PRK1 또는 PRK2 항체를 사용하여 수행하였다. HCV NS5B 및 키나아제들(PRK1, PRK2, ROCK1 및 ROCK2)에 대한 면역 복합체 및 세포 용해물의 웨스턴 블랏 분석 역시 김 등의 문헌(Biochem . Biophys . Res . Commun. 2012;421:112-118)에 기재된대로 수행하였다.

(MTS 분석 및 세포주기 분석)

siRNA의 세포 독성은 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide] 시약을 이용하여 측정하였다. siRNA(50 nM)로 트랜스펙션되거나, 48시간 동안 LY294002(50 μM)로 처리된 Huh7 세포의 세포주기는 FACSCalibur flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

(듀얼 루시퍼라아제 리포터 분석)

바다 팬지(Renilla) 루시퍼라아제 리포터의 cap-의존적 번역 및 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제의 HCV IRES를 매개로 한 번역을 하도록 하는 비시스트로닉 듀얼 루시퍼라아제 벡터(The bicistronic dual luciferase vector)를 siRNA (50 nM) 처리된 Huh7 세포에 트랜스펙션 시켰다. 리포터 플라스미드의 트랜스펙션 48시간째에 Dual-Glo luciferase assay system(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 정량하였다.

(IFN-β 리포터 분석)

IFN-β 프로모터 및 pRL-TK 리포터(Promega)의 조절 하에서 FLuc를 발현하고, 내부 대조군으로 RLuc를 발현하는 IFN-β-pGL3를 사용하여 HEK293 세포를 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 6시간 후 세포를 세척하고, Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)를 이용하여 siRNA(100 nM) 또는 poly(I:C)(1 ㎍/ml)로 트랜스펙션 시키기 전에 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 8시간 후에 세포를 회수하고, 듀얼 루시퍼라아제 분석을 수행하였다.

(siRNA 안정성 테스트)

본 발명은 연세대학교 임상시험심사위원회의 승인을 얻었다. 사람 혈액은 한국 적십자 서부 혈액 센터, 혈액원에서 얻었다. 만일 다른 명기가 없다면 건강한 기증자에게서 얻은 45% 사람 혈장에서 siRNA (2 μM)를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 총 RNA(15 ㎍)는 Trizol LS reagent(Invitrogen)로 추출하고, 15% 폴리아크릴아마이드/7 M 우레아 젤 전기영동으로 분리하며, 노던 블랏 분석을 위해 양하전된 나일론 멤브레인(Roche, Basel, Switzerland)으로 전기적 트랜스퍼를 수행하였다. 상기 멤브레인은 자외선 가교결합되고, siRNA의 가이드-가닥에 상보적인 [γ-³²P] ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Takara)를 이용하여 5'-말단이 표지된 합성 리보올리고뉴클레오타이드를 프로브로 하여 조사하였다. 포스포이미지 분석(Phosphorimage analysis) 및 정량분석은 Fuji BAS-2500 Phorphorimager를 사용하여 수행하였다.

(이식된 세포의 면역조직학적 분석)

이종이식된 조직을 PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드에서 고정하고, Frozen Section Compound(Surgipath FSC22, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)에 끼워 넣고, 표준 조직학적 기술을 이용하여 상기 조직의 5-㎛ 슬라이스를 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin(H&E))으로 염색하거나, 단클론성 항-HCV 코어 항원(clone C7- 50, abcam, Cambridge, MA, USA)과 Alexa fluor 488 염소 항-마우스 IgG 항체(Invitrogen)로 면역염색하였다. DAPI(4',6'-diaamidino-2-phenylindole)로 염색하여 핵을 관찰하였고, LSM 510 META 공초점 레이저 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 영상을 얻었다.

(ELISA에 의한 사이토카인 측정)

사람 말초혈액단핵세포(hPBMCs)를 사용한 실험은 연세대학교 임상시험심사위원회의 승인을 얻었다. hPBMCs는 건강한 지원자(한국적십자 서부 혈액 센터 혈액원에서 얻음)로부터 받은 혈액에서 피콜(ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하였다. 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 씨딩된 hPBMCs(1×10⁶ cells/well)에 리피도이드(lipidoid) ND98를 이용하여 10 nM siPRK2-1 또는 1 ㎍의 poly(I:C)를 트랜스펙션시키거나, 배양배지(200 ㎕)에 직접 부가하여 50 ㎍/ml poly(I:C)를 처리하였다. hPBMCs 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMED에서 hPBMCs를 배양하였다. 16시간 자극 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다. 자극받은 세포에서 분비된 IFN-α 및 TNF-α 함량은 각각 VeriKine human IFN-α(PBL Interferon Source, Piscataway, NJ, USA) 및 TNF-α(ebioscience, San Diego, CA, USA) ELISA 키트를 사용하여 평가하였다. 사람 IFN-α 및 TNF-α의 ELISAs 검출 한계는 각각 15 및 8 pg/ml이었다.

(마우스 간세포 분리)

마우스 간세포는 2-단계 관류 방법을 사용하여 분리하고, 콜라겐-코팅된 배양 플레이트에서 배양하였다.

(동물실험)

모든 동물 실험은 한국 식약처 가이드라인에 따라 수행하였다. 프로토콜은 연세실험동물연구센터(Yonsei Laboratory Animal Research Center(YLARC))(Permit No: 2012-0076)의 검토 및 승인을 얻었다. 마우스는 YLARC의 특별 무균 시설에서 유지하였다.

(통계분석)

별도의 지적이 없는 경우, 데이터는 적어도 3반복 실험에 대해 평균±표준편차로 나타냈다. 유의성은 unpaired Student?s t-test를 이용하여 분석하였다. 0.05보다 작은 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

(siRNAs의 전달)

siRNAs는 제조업체의 설명서에 따라 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 리피도이드 ND98(98N12-5, 도 5A 참조)를 이용하여 세포에 트랜스펙션 시켰다. siRNA-lipidoid ND98 복합체는 Akinc A 등의 논문(Nat Biotechnol 2008;26:561-569)에 기재된 방법에 따라 제조하였다.

siRNA의 인 비보 전달을 위해, ND98, 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), PEG 2000-ceramide C16(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) 및 siRNA로 구성된 siRNA 리피도이드 나노입자(LNPs)를 제조하였고(Akinc A 등, Nat Biotechnol 2008;26:561-569; Akinc A 등, Mol Ther 2009;17:872-879), 꼬리-정맥 주사로 종양내에 또는 i.v. 주사로 투여하였다.

(HCV 감염)

전장 HCV RNA는 HCV JFH1 클론(Wakita T 등, Nat Med 2005;11:791-796)을 이용하여 인 비트로 전사에 따라 제조하고, Huh7 세포에 전기천공하여 HCV 입자를 얻었다. 여과한 배양 배지를 Huh7 세포의 감염에 사용하였다. periodic rocking으로 바이러스 흡착 후, PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세포를 세척하고, 완전 DMEM에서 배양하였다.

(PRK2 siRNA의 인 비보 항-HCV 활성 평가)

HCV(JFH1) RNA를 전기천공한 Huh7 세포(2×10⁶ cells)를 100 ㎕ PBS에서 재현탁하고, 마취시킨 면역결핍 NOD-SCID 수컷 마우스(5주령, 20-25g 체중)의 플랭크 부위에 피하주사하기 전에 100 ㎕의 Matrigel(BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA, USA)과 혼합하였다. 이식 후 3주째에, 확립된 이종이식 마우스에 siPRK2 LNPs(1 mg siRNA/kg)를 종양내 또는 꼬리-정맥 주사로 투여하였다. 또는, 키메라 사람/마우스 간을 갖고 있는 우로키나제 타입 플라스미노겐 액티베이터-트랜스펙션 SCID 마우스(uPA/SCID)(Phoenix Bio Co., Ltd., Hiroshima, Japan)를 HCV(유전자형 1b) 환자 혈청으로 감염시켰다. 대조군(n=3) 및 siRNA-처리군(n=3)에서 HCV-감염된 키메라 마우스에 살린 또는 siPRK2 LNPs를 1-2 mg siRNA/kg의 용량으로 각각 i.v. 주사하였다.

마우스 혈청 내 HCV 타이터(titer)는 실시간 qRT-PCR으로 측정하였다. 동물실험에 대한 프로토콜은 Local Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 얻었다.

<실험예 1> siRNA 이소타입에 의한 PRK2 사일런싱 효과

단백질 키나아제 N(PKN)로 알려진 PRK는 AGC 키나아제의 서브패밀리에서 Ser/Thr 키나아제이며, 3개의 이소폼이 있다: PRK1, PRK2, 및 PRK3. HCV 복제가 PRK2에 의해 특이적으로 조절되는지를 조사하기 위해, PRK1, PRK2 또는 PRK3를 표적으로 하는 siRNAs를 설계하고, 그들의 항-HCV 활성을 평가하였다.

PRK2 mRNA 서열의 다른 영역을 표적화하기 위해 설계한 11개의 siRNAs로부터(도 1A), 10nM의 각 PRK2-특이 siRNA로 트랜스펙션된 세포의 웨스턴 블랏 분석에 의해 실제로 PRK2 수준을 낮추는 siPRK2-1 및 3개의 다른 siRNAs(#4, #7 및 #9)를 포함한 4개의 의약품이 될만한 PRK2 siRNAs를 선택하였다.

도 1C에 나타난 바와 같이, 선택된 siRNAs 중 siPRK2-1이 HCV 복제를 억제하는데 가장 효과적이었다; lipofectamine RNAiMAX 제제에 의해 전달된 siRNA(10 nM)는 유전자형 1b HCV 세브게놈 레플리콘 RNA(도 1B)이 탑재된 R-1 세포에서 HCV RNA 수준의 약 55% 정도 감소시켰다.

웨스턴 블랏 분석 또한 PRK2 사일런싱 후 PRK2 및 NS5B의 정상상태 수준을 각각 74% 및 60%로 감소시켰다(도 2A). 같은 조건에서 PRK2 아이소폼 PRK1 및 PRK3에 대한 siRNAs, 또는 관련이 없는 키나아제 ROCK 1 및 ROCK2를 표적으로 하는 siRNAs는 표적 키나아제를 사일런싱하는데 더 높은 농도(50 nM)가 사용되었어도 HCV 복제를 억제하지는 못하였다(도 2B-E).

PRK1 사일런싱이 HCV 복제를 간섭하지 않음을 보여주는 상기 결과와 일치하게(도 2B), 공면역침전 실험 결과, PRK1이 아니라 PRK2가 NS5B와 상호작용하며(도 3), 이는 PRK2 및 NS5B 간의 특이 상호작용을 입증하는 것이다. 더불어, 상기 결과는 HCV 복제에서 PRK2에 대한 이소타입-특이 조절 역할을 입증하는 것이다.

<실험예 2> PRK2 사일런싱의 세포증식 또는 HCV IRES 의존적 번역에 대한 효과

R-1 세포에서 100 nM siPRK2-1는 HCV 복제의 대략 80%를 억제하나, 비특이적 스크램블드 siRNA는 HCV 복제를 유의적으로 억제하지 않았다(도 1D). 이 농도에서 MTS 분석으로 측정된 세포 생존능은 siRNA 처치에 의해 영향을 받지 않았다(도 4). siPRK2-1의 세포내 전달이 IFN-β 프로모터 활성화를 유도하는 지를 리포터 분석으로 평가하였다. 이 리포터 분석에서는 레티노산-유도 유전자 1(retinoic acid-inducible gene 1(RIG-I)) 또는 toll-like receptor 3 경로에 의해 활성화된 IRF3가 루시퍼라아제 리포터의 발현을 유도하는 것을 볼 수 있다.

분석결과 siPRK2-1는 IFN-β 프로모터를 활성화시키지 않는 반면, RIG-I에 의해 인식된다고 알려진 타입-I IFN 반응의 강력한 활성화제인 합성 dsRNA poly(I:C)는 IFN-β 프로모터 활성을 3배 이상 증가시켰다(도 1E).

HCV IRES(internal ribosome entry site)를 매개로 한 번역은 세포주기에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 형광-활성화된 세포 소팅 분석 결과에서 보여준 바와 같이, PRK2의 사일런싱이 Huh7 세포의 세포주기를 바꾸지는 않았다(도 1F). 또한 PRK1 또는 PRK3뿐만 아니라 siRNA에 의한 PRK2의 사일런싱은 HCV IRES 의존적 번역을 억제하지 않았다(도 1G).

종합하면, 상기 결과는 PRK2 사일런싱에 의한 HCV 복제 억제는 IFN-β 생성 유도, 세포주기의 혼란 또는 IRES-의존적 번역의 간섭과는 관련이 없음을 시사한다.

<실험예 3> siPRK2-1 리피도이드 제형의 전신 전달에 의한 간세포 PRK2의 사일런싱 효과

생체 내 siPRK2-1의 항-HCV 활성을 시험하기 위해, 지질-유사 물질, 일명 리피도이드를 이용하였다. 우선, 1세대 리피도이드 ND98(도 5A)이 간세포성 암세포로의 siRNA 전달에 효과적인지를 조사하였다.

도 5B에 나타난 바와 같이, 이 리피도이드는 Lipofectamine RNAiMAX 만큼 효율적으로 siPRK2-1를 전달하여 R-1 세포에서 세포내 HCV RNA 타이터를 감소시킬 수 있었다.

이온성 siRNA 및 리피도이드의 단순 복합체는 생체내 안정성이 없고 응집체를 형성하려는 경향으로 인해 siRNA의 인 비보 전신 투여에는 적합하지 않다. 따라서, 인 비보 전신 전달을 위해, 콜레스테롤을 이용한 siRNA-리피도이드 복합체 및 PEG-지질을 제형화하고, 최종 siPRK2-1 LNP가 간에서 HCV를 일차적으로 복제하는 간세포로 siRNA를 전달할 수 있는지를 시험하였다. 마우스의 꼬리정맥에 1 mg/kg 용량의 siPRK2-1 LNP를 1회 주사하였다. 간세포에서 유전자 사일런싱 효과를 입증하기 위해, siRNA 주사 후 48시간째에 2단계 관류에 의해 마우스 간세포를 분리하고, 오버나이트 동안 성장시켜 qRT-PCR에 의해 PRK2 mRNA 수준을 분석하였다.

그 결과, LNP-제형화된 siPRK2-1를 1회 투여할 경우 PRK2 mRNA 수준은 PBS-주사 또는 스크램블드 siRNA-주사한 대조군 마우스에서 분리한 간세포 대비 30%로 유의적으로 감소하였고(도 5C).

따라서, LNP는 생체내 간세포로 siRNA를 효과적으로 전달함을 알 수 있었다.

<실험예 4> 이종이식 마우스 모델에서 siPRK2-1에 의한 HCV 복제 효과

전기천공에 의해 HCV(유전자형 2a) RNA로 트랜스펙션된 Huh7 세포를 레어 플랭크(rear flank)로 경피적으로 이종이식한 면역-결핍 마우스에서 siPRK2-1 LNP의 항-HCV 활성을 평가하였다.

트랜스펙션된 세포를 이식한 후 1-2주째에 혈청 HCV 타이터는 10⁶-10⁷ copies/ml만큼 높게 검출되었다(도 6A). 이종이식 후 4주째에 마우스로부터 발견된 이종이식 조직에서, HCV 플러스- 및 마이너스-가닥 RNAs 둘 다 검출되었다(도 6B). 따라서, 이종이식체에서 HCV가 복제되었음을 알 수 있었다.

또한, 면역조직학적 분석 결과, HCV 코어 항원이 이종이식 조직에서 발현되었다(도 6C). 25 mg/kg 체중의 용량으로 PRK2 억제제인 HA1077를 이종이식 마우스에 종양내로 1회 주사한 결과, 약물 투여 후 3일 및 5일째에 HCV 게놈 양이 유의적으로 감소하여 이것이 생체내에서 항-HCV 효능을 나타냄을 확인하였다(도 6D). 또한, 상기 결과로부터 몇 주 동안 감염성 HCV 입자들의 높은 타이터를 생산하는 이종이식 마우스가 siPRK2-1의 생체 내 항-HCV 활성을 평가하기 위한 적당한 모델임을 알 수 있었다.

LNP 내에 캡슐화된 변형되지 않은 siPRK2-1를 1 mg siRNA/kg의 용량으로 마우스 종양내로 주사하였다.

PRK2 사일런싱 결과 5일째에 혈청 HCV 타이터는 90% 감소하였고, 7일째에 바이러스 타이터가 점차 증가하기 시작하였다(도 6E). HCV 타이터는 14일째에 초기 HCV 타이터의 37%에 도달하였다.

또한, 변형된 siPRK2-1(ps_siPRK2-1, 도 8B) LNPs를 1 mg/kg의 용량으로 꼬리정맥에 주사하여 전신 전달한 결과, 투여 후 3일 및 7일째에 혈청 HCV RNA 타이터에서 상당히 유의적인 감소가 관찰되었다(도 6F). 이종이식 모델에서 이러한 항바이러스 효과는 비특이적이고, 수동적인 방법에 의해서가 아니라 LNP가 간세포로 표적화됨을 시사한다.

사람 말초혈액단핵세포에서 리피도이드 ND98 또는 LNPs로 제형화된 siRNA는 분비된 IFN-α 및 TNF-α의 ELISA 평가 시 선천적인 면역 반응을 실질적으로 유발하지 않았다(도 7).

10 mg/kg 용량의 siPRK2-1 LNP를 처치한 마우스에서 예비 급성 독성 시험 결과, siRNA 주사 후 12시간 내에 완전히 사라지는 약한 부종을 제외하고 두드러진 급성 역 효과는 나타나지 않았다(미도시됨). 이들 결과는 siPRK2 LNP가 낮은 독성 위험을 가지면서 HCV 타이터를 낮추어 치료적 잠재력을 가짐을 시사한다.

<실험예 5> 사람 간세포가 주입된 uPA/SCID 마우스에서 화학적으로 변형된 siRNA를 이용한 PRK2 사일런싱 효과

사람 혈장에서 변형되지 않은 siPRK2-1의 반감기는 44분 미만이었다(도 8A).

개선된 안정성과 강력한 유전자 사일런싱 활성을 유지하는 siRNA를 스크리닝하기 위해 화학적으로 변형된 siRNA를 설계하였다. 도 8B에 도시된 siPRK2-1의 변형된 패신저 가닥(ps) 또는 가이드 가닥(gs)을 이용하여 siRNA 듀플렉스의 제한된 수를 만들고, 그들의 혈청 안정성을 비교하였다. 변형되지 않은 siRNA에 비해 항-HCV 활성의 손실 없이 5배 향상된 안정성을 나타내므로 후술하는 생체내 실험에서 항바이러스 효능을 입증하기 위해, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 gs_PS1 siRNA를 선택하고(도 8C-E), 마우스 프라이머리 간세포에서 gs_PS1 siPRK2-1 및 변형되지 않은 형태의 안정성을 비교하였다. siPRK2-1의 표적 서열은 마우스에서 보존되어 있기 때문에, 리피도이드 ND98을 세포에 전달한 후 9일 이상 분열하지 않는 프라이머리 간세포에서 siPRK2-1의 간에서의 안정성을 시험할 수 있다.

도 9A에 나타난 바와 같이, 간세포에서 남아있는 siRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석 결과, gs_PS1 siPRK2-1의 개선된 세포내 안정성이 확인되었다(6일째에 178배 높은 함량). 표적 유전자 사일런싱의 효능 역시 지속되었다; siRNA의 트랜스펙션 후 9일째에 gs_PS1 siPRK2-1는 변형되지 않은 siRNA와 비교하여 개선된 표적 사일런싱 능력을 나타냈다(도 9B; 변형되지 않은 siRNA 및 gs_PS1 siRNA에 대해 각각 69% 대 50%).

변형된 siRNA를 1mg siRNA/kg의 용량으로 i.v. 주사한 BALB/c 마우스(n=3)에서 siRNA의 생체내 분포 프로파일을 노던 블랏팅에 의해 평가하였고, 대부분의 전달된 siRNA(~ 95%)는 간으로 표적화되는 것으로 관찰되었다(도 9C). 전달된 siRNA는 4개의 주요 간엽에서 간의 총 81%를 나타내면서 균일하게 잘 분포되어 있다.

사람 간세포가 이식된 면역-결핍 키메라 마우스의 간에서 siPRK2-1 LNP의 항-HCV 활성을 시험하였다. gs_PS1 siPRK2-1 LNP는 2mg/kg의 용량으로 꼬리정맥에 i.v. 주사하였다.

도 9D에 나타난 바와 같이, siPRK2-1 LNP를 1회 투여한 결과 2일째에 혈청 HCV 게놈 타이터는 92% 감소하였다. 감소된 HCV 게놈은 siRNA 투여 후 5일 이내에 시작 수준으로 점차 다시 상승하였다. 반면, PBS 처리한 대조군에서는 혈청 HCV RNA 타이터의 감소는 보이지 않았다. 3일 마다 1mg/kg의 용량으로 siRNA 나노입자를 2회 주사한 마우스 한 마리에서, 2일째에 게놈 타이터가 88% 미만 감소하였고, 사일런싱 효과는 6일째까지 지속되었다. 이는 수회 투여 스케줄이 PRK2 사일런싱을 장기간 유지하고, 추가로 항-HCV 효능을 개선함을 시사한다.

siRNA를 처치한 마우스에서는 유의적인 체중 변화가 관찰되지 않았다(도 9E). 이는 이들 투여 스케줄 하에서 적어도 siRNA 제형의 생체내 독성이 거의 없음을 시사한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Therapeutic PRK2-silencing siRNA for the treatment of hepatitis C virus infection <130> P130982 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRK2 mRNA <400> 1 ucaaagaagg agcugaaaa 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siPRK2-1 guide strand <400> 2 uuuucagcuc cuucuuugau u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siPRK2-1 passenger strand <400> 3 ucaaagaagg agcugaaaau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_PS1 siPRK2-1 modified guide strand <220> <221> conflict <222> (18)..(19) <223> Between base G and A, modification is introduced by replacing one non-bridging oxygen atom on the backbone phosphate between two ribonucleotides with a sulfur atom to create a phosphorothioate (PS) linkage. <400> 4 uuuucagcuc cuucuuugau u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_PS2 siPRK2-1 modified guide strand <220> <221> conflict <222> (17)..(19) <223> Between base U and G, and G and A, modification is introduced by replacing one non-bridging oxygen atom on the backbone phosphate between two ribonucleotides with a sulfur atom to create a phosphorothioate (PS) linkage. <400> 5 uuuucagcuc cuucuuugau u 21

Claims

SEQ ID NO: 1로 표시되는 PRK2 mRNA의 뉴클레오타이드 서열 영역을 표적으로 하며, SEQ ID NO: 2로 표시되는 가이드 가닥과 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 패신저 가닥으로 이루어지는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA).
삭제
제1항에 있어서,
siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것이며, 상기 화학적 변형은
a) 3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 변형하는 것;
b) 3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid)를 도입하는 것; 및
c) 라이보스 환(ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH(히드록시기)를 -NH2(아미노기), -C-알릴기, -F(플루오로기), 및 -O-Me(메틸기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 치환하는 것 중 어느 하나 이상인 siRNA.
제3항에 있어서, 화학적으로 변형된 siRNA는
하기 구조식 1의 가이드 가닥 서열과 SEQ ID NO: 3의 패신저 가닥 서열로 이루어진 siRNA; 또는
하기 구조식 2의 가이드 가닥 서열과 SEQ ID NO: 3의 패신저 가닥 서열로 이루어진 siRNA인, siRNA:
[구조식 1]
5‘-uuuucagcuccuucuuugsauu-3’
[구조식 2]
5‘-uuuucagcuccuucuuusgsauu-3’
상기 식에서,
s는 2개의 리보뉴클레오타이드 사이 백본 인산에 있는 1개의 비-가교성 산소 원자를 황원자로 대체하여 생성된 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS) 연결을 나타낸다.
제1항의 siRNA를 포함하는 발현 벡터.
제5항에 있어서,
발현 벡터는 플라즈미드, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 및 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터.
제1항의 siRNA를 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.
제7항에 있어서,
siRNA를 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.
제8항에 있어서,
핵산 전달체는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼 및 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택되는 C형 간염 치료용 조성물.
제8항에 있어서,
복합체는 이중가닥 siRNA, 콜레스테롤 및 PEG 2000-세라마이드 C16로부터 형성된 리피도이드(lipidoid) 제형인 C형 간염 치료용 조성물.
제7항에 있어서,
병용투여를 위한, HCV RNA 복제효소(RNA-dependent RNA polymerase) NS5B, 단백질 분해효소(protease) 활성을 지닌 NS3, 비구조단백질 NS5A 및 PRK2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저해제, 또는 IFN-α를 추가로 포함하는 C형 간염 치료용 조성물.