TW202345869A - 用於抑制ｐｎｐｌａ３表現的ｒｎａｉ 構建體及其使用方法 - Google Patents

用於抑制ｐｎｐｌａ３表現的ｒｎａｉ 構建體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露關於用於降低PNPLA3基因表現的RNAi構建體，例如siRNA。還描述了使用此類RNAi構建體治療或預防肝病，例如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之方法。

Description

用於抑制PNPLA3表現的RNAI構建體及其使用方法
本揭露關於用於調節含patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）的肝表現的組成物和方法。特別地，本揭露關於通過RNA干擾降低PNPLA3表現的基於核酸的治療劑、及利用這類基於核酸的治療劑來治療或預防肝病，例如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之方法。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）構成一系列肝病變，為世界上最常見的慢性肝病，其患病率在過去20年中翻倍，且如今據估計影響了約20%世界人口（Sattar等人 (2014) BMJ [英國醫學雜誌] 349:g4596；Loomba和Sanyal (2013) Nature Reviews Gastroenterology & hepatology [自然評論，胃腸病學和肝病學] 10(11):686-690；Kim和Kim (2017) Clin Gastroenterol Hepatol [臨床胃腸病學和肝病學] 15(4):474-485；Petta等人 (2016) Dig Liver Dis [消化病和肝病] 48(3):333-342）。NAFLD開始於肝中的三酸甘油脂積累，且定義為個體中超過5%肝細胞中存在細胞質脂滴，該個體1) 無明顯飲酒史且2) 其中其他類型肝病的診斷已被排除在外（Zhu等人 (2016) World J Gastroenterol [世界胃腸病學雜誌] 22(36):8226-33；Rinella (2015) JAMA [美國醫學會雜誌] 313(22):2263-73；Yki-Jarvinen (2016) Diabetologia [糖尿病學] 59(6):1104-11）。在一些個體中，肝中異位脂肪的積累（稱為脂肪變性）引發炎症和肝細胞損傷，導致更晚期疾病，稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）（Rinella, 同上）。截至2015年，預計有7500萬-1億美國人患有NAFLD，其中NASH約占NAFLD診斷的10%-30%（Rinella, 同上; Younossi等人 (2016) Hepatology [肝病學] 64(5):1577-1586）。
含Patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3），以前稱為脂聯素（ADPN）和鈣非依賴性磷脂酶A2-ε（iPLA(2)ε），為一種II型跨膜蛋白（Wilson等人 (2006) J Lipid Res [脂類研究雜誌] 47(9):1940-9；Jenkins等人 (2004) J Biol Chem [生物化學雜誌] 279(47):48968-75）。最初在脂肪細胞中鑒定為在小鼠脂肪形成期間誘導的膜相關性脂肪富集蛋白，其現在已充分表徵為在其他組織（包括肝）中表現（Wilson等人, 同上；Baulande等人 (2001) J Biol Chem [生物化學雜誌] 276(36):33336-44；Moldes等人 (2006) Eur J Endocrinol [歐洲內分泌學雜誌] 155(3):461-8；Faraj等人 (2006) J Endocrinol [內分泌雜誌] 191(2):427-35；Liu等人 (2004) J Clin Endocrinol Metab [臨床內分泌與代謝雜誌] 89(6):2684-9；Lake等人 (2005) J Lipid Res [脂類研究雜誌] 46(11) :2477-87）。在無細胞生化系統中，重組PNPLA3蛋白可以表現出三醯甘油脂肪酶或轉醯基化活性（Jenkins等人, 同上；Kumari等人 (2012) Cell Metab [細胞代謝] 15(5):691-702；He等人 (2010) J Biol Chem [生物化學雜誌] 285(9):6706-15）。在肝細胞中，PNPLA3在內質網和脂質膜上表現，且主要表現出三醯甘油水解酶活性（He等人, 同上；Huang等人 (2010) Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊] 107(17):7892-7；Ruhanen等人 (2014) J Lipid Res [脂類研究雜誌] 55(4):739-46；Pingitore等人 (2014) Biochim Biophys Acta [生物化學與生物物理學報] 1841(4):574-80）。儘管PNPLA3缺乏分泌訊息，但數據表明它得以分泌且可在人血漿中作為二硫鍵依賴性多聚體出現（Winberg等人 (2014) Biochem Biophys Res Commun [生物化學和生物物理學研究通訊] 446(4):1114-9）。
目前，NAFLD症狀係通過減肥和治療任何繼發性病症來控制的，因為尚未批准任何藥物治療。因此，需要治療受影響個體的NAFLD的組成物和方法。
本揭露提供了包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中該反義股包含具有與PNPLA3 mRNA序列（例如如表1所示的PNPLA3 mRNA序列）互補的序列的區域，並且其中該RNAi構建體抑制PNPLA3的表現。在某些實施方式中，RNAi構建體包含區域，該區域具有與選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。在一些實施方式中，反義股與表1中列出的PNPLA3 mRNA序列雜交。
在一些實施方式中，本文所述之RNAi構建體的有義股包含與反義股的序列充分互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙鏈體區的序列。在該等和其他實施方式中，有義股和反義股的長度各自為約15至約30個核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個鈍端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。此類核苷酸突出端可包含至少1至6個未配對核苷酸，且可位於有義股3'端、反義股3'端、或有義股和反義股兩者的3'端。在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股3'端和反義股3'端處包含兩個未配對核苷酸的突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含在反義股3'端處的兩個未配對核苷酸突出端和有義股3'端/反義股5'端的鈍端。
本揭露的RNAi構建體可包含一或多種經修飾的核苷酸，包括對核糖環、核鹼基或磷酸二酯主鏈具有經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含一或多種經2'-修飾的核苷酸。此類經2'-修飾的核苷酸可包括經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、雙環核酸（BNA）、乙二醇核酸（GNA）、反向鹼基（例如反向腺苷）或其組合。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。在一些實施方式中，RNAi構建體的有義股和反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個主鏈修飾，例如經修飾的核苷酸間或核苷間鍵。在某些實施方式中，本文所述之RNAi構建體包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在特定實施方式中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵可位於有義股和/或反義股的3'或5'端。
在一些實施方式中，本揭露的RNAi構建體的反義股和/或有義股可包含來自圖1或2中列出的反義和有義序列的序列或由其組成。在某些實施方式中，RNAi構建體可以包含含有反義股和有義股的雙鏈體化合物，其中該反義股包含選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的序列，並且該有義股包含選自SEQ ID NO: 61-564和SEQ ID NO: 1069-2328的序列。
本揭露還提供了包含上述RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑的組成物，以及在有需要的患者中降低PNPLA3表現之方法，該等方法包括向該患者投與上述RNAi構建體或組成物。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2022年3月23日提交的美國臨時申請案號63/322,845的權益。
本揭露部分地基於靶向PNPLA3基因並以非序列特異性方式降低肝臟細胞中PNPLA3表現的RNAi構建體的設計和生成。PNPLA3表現的非序列特異性抑制可用於治療或預防與PNPLA3表現相關的病症，包括肝相關疾病，例如單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（肝的不可逆的、晚期瘢痕形成）、或PNPLA3相關性肥胖。
本揭露提供了用於調節含Patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）基因的表現的組成物和方法。在一些實施方式中，基因可處於細胞或受試者內，例如哺乳動物（例如人）。在一些實施方式中，本揭露的組成物包含靶向PNPLA3 mRNA且降低細胞或哺乳動物中的PNPLA3表現的RNAi構建體。此類RNAi構建體可用於治療或預防各種形式的肝相關疾病，例如單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（肝的不可逆的、晚期瘢痕化）、或PNPLA3相關性肥胖。
在2008年，一項探索與NAFLD相關的非同義序列變異或單核苷酸多態性（SNP）的全基因組關聯研究（GWAS）將PNPLA3中的變異體（rs738409[G]，編碼I148M；可稱為PNPLA3-rs738409、PNPLA3-ma或PNPLA3-次要等位基因）鑒定為與肝脂肪含量顯著相關。自該初始報告以來，隨後的GWAS確認PNPLA3 rs738409為NAFLD的主要遺傳決定因素，其與以下顯著相關：1) 肝損傷的血清生物標誌物丙胺酸轉胺酶（ALT）的水平升高，2) NAFLD發病率、進展和嚴重程度，3) 肥胖和瘦型個體，以及 4) 顯示與所有NAFLD階段：脂肪變性、NASH、肝硬化和肝細胞癌顯著相關的唯一已知SNP。許多GWAS的共識表明PNPLA3 rs738409與NAFLD的關聯性與年齡、性別、種族、代謝綜合症、體重指數、胰島素抗性和血清脂質無關。此外，來自多個來源的統計分析估計大約50% NAFLD患者攜帶PNPLA3 rs738409突變。對於PNPLA3 rs738409突變，患者可為純合的或雜合的。另外地，已發現具有PNPLA3 rs738409突變的患者通常還攜帶3個鹼基對的rs738408突變（Tian等人 (2010) Nature Genetics [自然遺傳學] 42:21-23）。因此，患者可具有PNPLA3-rs738409次要等位基因、PNPLA3-rs738408次要等位基因或PNPLA3-rs738409-rs738408雙重次要等位基因突變（PNPLA3-dma）。
研究人員已開發用於在體內探索PNPLA3功能的小鼠模型。迄今為止，尚無可檢測的代謝表型被鑒別為PNPLA3缺陷或PNPLA3過表現的結果。相比之下，PNPLA3I148M在轉基因小鼠和敲入小鼠中的表現導致肝三酸甘油脂水平增加，類似於NAFLD。因此，體內小鼠模型數據表明突變體PNPLA3I148M蛋白的表現，而非野生型蛋白質的過表現，為疾病表型的驅動因素。除了受NAFLD影響的個體中的次要等位基因的高頻率和與疾病的主要關聯之外，該等發現還強調PNPLA3 rs738409作為NAFLD的主要治療靶標。
RNA干擾（RNAi）為將外源RNA導入細胞，導致編碼靶向蛋白的mRNA特異性降解，從而導致蛋白質表現降低的過程。RNAi技術和肝遞送兩者的進展以及用其他基於RNAi的療法的不斷增長的積極結果表明，RNAi係藉由直接靶向PNPLA3來治療學上治療NAFLD的有力手段。
如本文所用，術語「RNAi構建體」係指包含RNA分子的試劑，該RNA分子在被引入細胞時能夠通過RNA干擾機制下調靶基因（例如PNPLA3）的表現。「RNA干擾」係核酸分子以序列特異性方式（例如，藉由RNA誘導的緘默複合物（RISC）途徑）誘導靶RNA分子（例如，傳訊RNA或mRNA分子）切割和降解的過程。在一些實施方式中，RNAi構建體包含雙股RNA（dsRNA）分子，其包含連續核苷酸的兩條反平行股，其彼此充分互補以雜交形成雙鏈體區。雙股RNAi構建體也可稱為RNAi「觸發器」。術語「雜交（hybridize）」或「雜交（hybridization）」係指互補多核苷酸的配對，典型地是通過在兩個多核苷酸中的互補鹼基之間的氫鍵合（例如Watson-Crick氫鍵合、Hoogsteen氫鍵合、或反向Hoogsteen氫鍵合）而配對。包含具有與靶序列（例如靶mRNA）基本上互補的序列的區域的股被稱為「反義股」。「有義股」係指包括與反義股的區域基本上互補的區域的股。在一些實施方式中，有義股可包含具有與靶序列基本上相同的序列的區域。
在某些實施方式中，雙股RNA的有義股和反義股可為兩個單獨的分子，這兩個分子雜交而形成雙鏈體區，否則是未連接的。由兩條單獨股形成的這類雙股RNA分子被稱為「小干擾RNA」或「短干擾RNA」（siRNA）。siRNA係一類非編碼雙股RNA分子，通常約有20-27個鹼基對，係RNAi的核心。因此，在一些實施方式中，本揭露的RNAi構建體包含siRNA。在其他實施方式中，RNAi構建體可為微小RNA（也稱為「miRNA」或「成熟miRNA」）。miRNA很小（長度約為18-24個核苷酸），存在於植物、動物和某些病毒中的非編碼RNA分子。miRNA類似於siRNA，但miRNA源自髮夾mRNA結構。miRNA藉由與靶mRNA的互補區域進行鹼基配對來調節基因表現。
在一些實施方式中，本揭露提供了針對PNPLA3的RNAi構建體。在一些實施方式中，RNAi構建體係包含有義股和反義股的siRNA，其中反義股包含與PNPLA3 mRNA序列互補的區域。RNAi反義股的區域可以與PNPLA3 mRNA序列的任何合適區域互補。例如，反義股可包含與PNPLA3 mRNA序列的編碼區或3'非翻譯區（UTR）互補的區域。編碼區內的示例性PNPLA3靶序列（參考序列GenBank登錄號NM_025225.2）和3’ UTR列於表1中。RNAi構建體的反義股理想地與表1中列出的PNPLA3 mRNA序列雜交。 [表1]. PNPLA3 siRNA靶位點
PNPLA3 靶區域 23mer 靶位點 PNPLA3 位置（參考序列 NM_025225.2 ） SEQ ID NO:
編碼區 CTGCAGGTCCTCTCAGATCTTGT 391 1
編碼區 GAGAGATATGCCTTCGAGGATAT 899 2
編碼區 CGCGGCTGGAGCTTGTCCTTCGC 211 3
編碼區 AGATATGCCTTCGAGGATATTTG 902 4
編碼區 TGCAGGTCCTCTCAGATCTTGTG 392 5
編碼區 GGTCCAAAGACGAAGTCGTGGAT 593 6
編碼區 CCTTCTACAGTGGCCTTATCCCT 641 7
編碼區 TTTGCAACTTGCTACCCATTAGG 1220 8
編碼區 GTGACAACGTACCCTTCATTGAT 704 9
編碼區 CGACGCGCGCATGTTGTTCGGCG 309 10
編碼區 AGATTTGCAACTTGCTACCCATT 1217 11
編碼區 GGGAGAGATATGCCTTCGAGGAT 897 12
編碼區 CTCCTTCCTTCAGAGGCGTGCGA 662 13
編碼區 TGACAACGTACCCTTCATTGATG 705 14
編碼區 GACAACGTACCCTTCATTGATGC 706 15
編碼區 TACGACATCTGCCCTAAAGTCAA 766 16
編碼區 ACTTGCTACCCATTAGGATAATG 1226 17
編碼區 CTATGGGGAGTACGACATCTGCC 756 18
編碼區 TGGAATCTGCCATTGCGATTGTC 1280 19
編碼區 ACGACATCTGCCCTAAAGTCAAG 767 20
編碼區 TATGCCTTCGAGGATATTTGGAT 905 21
編碼區 TGAGCTGCTAGACCACCTGCGTC 1092 22
編碼區 GCAACTTGCTACCCATTAGGATA 1223 23
編碼區 CAACTTGCTACCCATTAGGATAA 1224 24
編碼區 TGCACTGCGTCGGCGTCCTCTCC 347 25
編碼區 AGCTTGTCCTTCGCGGGCTGCGG 220 26
編碼區 TTCCAGATATGCCCGACGATGTC 1322 27
編碼區 GATGGGGAAAACGTTCTGGTGTC 562 28
編碼區 ATGGGGAAAACGTTCTGGTGTCT 563 29
編碼區 CCCCGGATCTCAAGGTGCTGGGA 878 30
編碼區 TCAGAGGCGTGCGATATGTGGAT 671 31
編碼區 CGCCTCTGCACAGGGAACCTCTA 832 32
編碼區 CGACATCTGCCCTAAAGTCAAGT 768 33
編碼區 GGTGGATACATGAGCAAGATTTG 1201 34
編碼區 AGCAAGATTTGCAACTTGCTACC 1213 35
編碼區 TGCTGGGAGAGATATGCCTTCGA 893 36
編碼區 GTCCAGAGACTGGTGACATGGCT 1300 37
編碼區 GAAAACGTTCTGGTGTCTGACTT 568 38
編碼區 TTCGGTCCAAAGACGAAGTCGTG 590 39
編碼區 ATTTGCAACTTGCTACCCATTAG 1219 40
編碼區 GAGTGAGTGACAACGTACCCTTC 698 41
編碼區 GCTGGGAGAGATATGCCTTCGAG 894 42
編碼區 CTGGGAGAGATATGCCTTCGAGG 895 43
編碼區 ATGAAAGACAAAGGTGGATACAT 1189 44
編碼區 TGAGTGACAACGTACCCTTCATT 701 45
編碼區 CTCCACCTTTCCCAGTTTTTCAC 1602 46
編碼區 TCCACCTTTCCCAGTTTTTCACT 1603 47
編碼區 AGTACGACATCTGCCCTAAAGTC 764 48
3’UTR AGAACACCTTTTTCACCTAACTA 2197 49
3’UTR CCTCTGAGCTGAGTTGGTTTTAT 1760 50
3’UTR CTGAGCTGAGTTGGTTTTATGAA 1763 51
3’UTR TGAGCTGAGTTGGTTTTATGAAA 1764 52
3’UTR AGTTGGTTTTATGAAAAGCTAGG 1771 53
3’UTR TGCAGAGGGTCCCTTACTGACTG 1890 54
3’UTR GAACACCTTTTTCACCTAACTAA 2198 55
3’UTR AACACCTTTTTCACCTAACTAAA 2199 56
3’UTR ACACCTTTTTCACCTAACTAAAA 2200 57
3’UTR CACCTTTTTCACCTAACTAAAAT 2201 58
3’UTR ACCTTTTTCACCTAACTAAAATA 2202 59
3’UTR CTTTTTCACCTAACTAAAATAAT 2204 60
所揭露的RNAi構建體不需要與特定的PNPLA3 SNP雜交。在該等方面，RNAi構建體可以結合PNPLA3的3' UTR。如上所述，非序列特異性PNPLA3 RNAi可能對與PNPLA3表現相關的疾病具有更廣泛的治療應用，包括例如單純性脂肪肝（脂肪變性）非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（肝的不可逆的、晚期瘢痕形成）、或PNPLA3相關性肥胖。在一些實施方式中，RNAi構建體係siRNA分子，其包含圖1或圖2中所示的任何序列（例如，包含選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的序列的反義股和/或包含選自SEQ ID NO: 61-564和SEQ ID NO: 1069-2328的序列的有義股）。
雙股RNAi分子可包括對核糖核苷酸的化學修飾，包括對核糖核苷酸的核糖、鹼基或主股組分的修飾，例如本文所述或本領域已知那些。為了本揭露之目的，術語「雙股RNA」涵蓋在雙股RNA分子（例如siRNA、shRNA等）中所採用的任何這類修飾。
如本文所用，如果包含第一序列的多核苷酸可以在某些條件（如生理條件）下與包含第二序列的多核苷酸雜交形成雙鏈體區，則第一序列與第二序列為「互補」。其他該等條件可包括熟悉該項技術者已知的中等或嚴格雜交條件。若在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上包含第一序列的多核苷酸與包含第二序列的多核苷酸鹼基配對而無任何錯配，則認為第一序列與第二序列完全互補（100%互補）。若序列與靶序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補，則序列與靶序列「基本上互補」。互補百分比可以藉由將第一序列中與第二或靶序列中相應位置處的鹼基互補的鹼基數除以第一序列的總長度來計算。若在兩個序列雜交時在30個鹼基對的雙鏈體區上存在不多於5個、4個、3個、2個或1個錯配，則還可說序列與另一個序列基本上互補。通常，若存在如本文所定義的任何核苷酸突出端，則在確定兩個序列之間的互補程度時不考慮該等突出端的序列。舉例而言，長度為21個核苷酸的有義股和長度為21個核苷酸的反義股雜交形成在各股3'端具有2個核苷酸突出端的19個鹼基對雙鏈體區，這兩條股將被認為是完全互補，如該術語在本文中所使用。
在一些實施方式中，反義股的區域包含與靶RNA序列（例如PNPLA3 mRNA）的區域完全互補的序列。在此類實施方式中，有義股可包含與反義股的序列完全互補的序列。在其他此類實施方式中，有義股可包含與反義股的序列基本上互補的序列，例如，在由有義股和反義股形成的雙鏈體區中有1、2、3、4或5個錯配。在某些實施方式中，較佳的是在末端區域內發生任何錯配（例如在股5'端和/或3'端的6、5、4、3、2或1個核苷酸內）。在一個實施方式中，由有義股和反義股形成的雙鏈體區中的任何錯配理想地發生在反義股5'端的6、5、4、3、2或1個核苷酸內。
當dsRNA的兩條基本上互補的股由單獨RNA分子組成時，那些分子不需要但可以共價連接。如果兩條股藉由以除了在一條股的3'端與相應的另一條股的5'端之間的不間斷核苷酸股以外的方式共價連接從而形成一條雙鏈體結構，則該連接結構被稱為「連接子」。RNA股可具有相同或不同數量的核苷酸。雙鏈體中鹼基對的最大數目為dsRNA的最短股中的核苷酸數減去雙鏈體中存在的任何突出端。除雙鏈體結構外，RNAi可包含一或多個核苷酸突出端。
在其他實施方式中，雜交形成雙鏈體區的有義股和反義股可為單個RNA分子的一部分，即有義股和反義股為單個RNA分子的自身互補區的一部分。在此類情況下，單個RNA分子包含雙鏈體區（還稱為莖區）和環區。有義股的3'端藉由將形成環區的連續未配對核苷酸序列與反義股的5'端連接。環區典型地具有足夠的長度以允許RNA分子自身向後折疊，使得反義股可以與有義股鹼基配對以形成雙鏈體或莖區。環區可包含從約3至約25、從約5至約15、或從約8至約12個未配對核苷酸。如本文所述，具有至少部分地自我互補區的這類RNA分子被稱為「短髮夾RNA」（shRNA）。在一些實施方式中，環區可包含至少1、2、3、4、5、10、20或25個未配對核苷酸。在其他實施方式中，環區可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或更少未配對核苷酸。在某些實施方式中，本揭露的RNAi構建體包含shRNA。單個的至少部分自我互補的RNA分子的長度可為約35個核苷酸至約100個核苷酸、約45個核苷酸至約85個核苷酸、或約50至約60個核苷酸，並且包含雙鏈體區和環區，各區具有本文所列舉的長度。
在一些實施方式中，本揭露的RNAi構建體包含有義股和反義股，其中反義股包含具有與PNPLA3傳訊RNA（mRNA）序列基本上或完全互補的序列的區域。如本文所用，「PNPLA3 mRNA序列」係指任何傳訊RNA序列，包括編碼PNPLA3蛋白的剪接變異體，包括來自任何物種（例如小鼠、大鼠、非人靈長類動物、人）的PNPLA3蛋白變異體或同種型。PNPLA3蛋白還稱為脂聯素（ADPN）和鈣非依賴性磷脂酶A2-ε（iPLA(2)ε）。
PNPLA3 mRNA序列還包括表現為其互補DNA（cDNA）序列的轉錄物序列。cDNA序列係指表現為DNA鹼基（例如鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）而非RNA鹼基（例如鳥嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶）的mRNA轉錄物的序列。因此，本揭露的RNAi構建體的反義股可以包含具有與靶PNPLA3 mRNA序列或PNPLA3 cDNA序列基本上或完全互補的序列的區域。PNPLA3 mRNA或cDNA序列可包括但不限於任何PNPLA3 mRNA或cDNA序列，例如可衍生自NCBI參考序列NM_025225.2。
反義股的區域可以與PNPLA3 mRNA序列的至少15個連續核苷酸基本上互補或完全互補。在一些實施方式中，反義股所包含互補區的PNPLA3 mRNA序列的靶區域範圍可為從約15至約30個連續核苷酸、從約16至約28個連續核苷酸、從約18至約26個連續核苷酸、從約17至約24個連續核苷酸、從約19至約25個連續核苷酸、從約19至約23個連續核苷酸、或從約19至約21個連續核苷酸。在某些實施方式中，包含與PNPLA3 mRNA序列基本上或完全互補的序列的反義股區域在一些實施方式中可以包含來自選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的反義序列的至少15個連續核苷酸（見圖1或2）。在其他實施方式中，反義序列包含來自選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的反義序列的至少16個、至少17個、至少18個或至少19個連續核苷酸。在一些實施方式中，有義和/或反義序列包含來自圖1或2中列出的序列且具有不多於1、2或3個核苷酸錯配的至少15個核苷酸。
RNAi構建體的有義股典型地包含與反義股的序列充分互補，使得兩條股在生理條件下雜交以形成雙鏈體區的序列。「雙鏈體區」係指在兩個互補或基本上互補的多核苷酸中的區域，該等多核苷酸藉由沃森-克裡克鹼基配對或其他氫鍵合相互作用而相互形成鹼基對，從而在兩個多核苷酸之間形成雙鏈體。RNAi構建體的雙鏈體區應具有足夠的長度以允許RNAi構建體進入RNA干擾途徑，例如藉由使用Dicer酶和/或RISC複合物（如下所述）。例如，在一些實施方式中，雙鏈體區的長度為約15至約30個鹼基對。在該範圍內的雙鏈體區的其他長度亦為合適的，例如約15至約28個鹼基對、約15至約26個鹼基對、約15至約24個鹼基對、約15至約22個鹼基對、約17至約28個鹼基對、約17至約26個鹼基對、約17至約24個鹼基對、約17至約23個鹼基對、約17至約21個鹼基對、約19至約25個鹼基對、約19至約23個鹼基對、約20至約25個鹼基對、或約19至約21個鹼基對。在一個實施方式中，雙鏈體區的長度為約17至約24個鹼基對。在另一個實施方式中，雙鏈體區的長度為約19至約21個鹼基對。
在一些實施方式中，本揭露的siRNA構建體包含約18至約30個核苷酸的雙鏈體區，該雙鏈體區與靶RNA序列（例如，PNPLA3靶mRNA序列）相互作用以指導靶RNA的切割。例如，siRNA可包含約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苷酸的雙鏈體區域，其與PNPLA3靶mRNA序列相互作用。不希望受理論束縛，引入細胞內的長雙股RNA可藉由稱為Dicer的III型內切核酸酶分解為siRNA（Sharp等人 (2001) Genes Dev.[基因與發育] 15:485）。Dicer為一種核糖核酸酶-III樣酶，將dsRNA加工成具有特徵性兩個鹼基3'突出端的19-23個鹼基對短干擾RNA（Bernstein等人, (2001) Nature [自然] 409:363）。然後將siRNA併入到RNA誘導緘默複合物（RISC）中，其中一或多種解旋酶解開siRNA雙鏈體，使得互補反義股能夠指導靶識別（Nykanen等人, (2001) Cell [細胞] 107:309）。在與適當的靶mRNA結合後，RISC內的一或多種內切核酸酶使靶裂解，以誘導緘默（Elbashir等人 (2001) Genes Dev. [基因與發育] 15:188）。
對於其中有義股和反義股為兩個單獨分子（例如，siRNA RNAi構建體）的實施方式，有義股和反義股的長度不需要與雙鏈體區的長度相同。例如，一條或兩條股可能長於雙鏈體區，且具有側接雙鏈體區的一或多個未配對核苷酸或錯配。因此，在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。如本文所用，「核苷酸突出端」係指延伸超過在股末端的雙鏈體區的未配對的一或多個核苷酸。當一條股的3'端延伸超出另一條股的5'端或當一條股的5'端延伸超出另一條股的3'端時，通常產生核苷酸突出端。核苷酸突出端的長度通常是在1與6個核苷酸之間、1與5個核苷酸之間、1與4個核苷酸之間、1與3個核苷酸之間、2與6個核苷酸之間、2與5個核苷酸之間、或2與4個核苷酸之間。在一些實施方式中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一個特定實施方式中，核苷酸突出端包含1至4個核苷酸。在某些實施方式中，核苷酸突出端包含2個核苷酸。突出端中的核苷酸可為如本文所述之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，突出端包含5'-尿苷尿苷-3'（5'-UU-3'）二核苷酸。在此類實施方式中，UU二核苷酸可包含核糖核苷酸或經修飾的核苷酸，例如經2'-修飾的核苷酸。在其他實施方式中，突出端包含5'-去氧胸苷-去氧胸苷-3'（5'-dTdT-3'）二核苷酸。
核苷酸突出端可位於一條或兩條股的5'端或3'端。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含反義股的5'端和3'端處的核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體在有義股的5'端和3'端處包含核苷酸突出端。在一些實施方式中，RNAi構建體包含有義股的5'端和反義股的5'端的核苷酸突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含有義股的3'端和反義股的3'端處的核苷酸突出端。
RNAi構建體可以在雙股RNA分子的一端處包含單個核苷酸突出端且在另一個末端包含平端。「平端」意味著有義股與反義股在分子末端完全地鹼基配對，並且不存在延伸超出雙鏈體區的未配對核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含有義股3'端的核苷酸突出端和有義股5'端和反義股3'端的鈍端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含反義股3'端處的核苷酸突出端和反義股5'端和有義股3'端的鈍端。在某些實施方式中，RNAi構建體在雙股RNA分子兩端處包含平端。在此類實施方式中，有義股和反義股具有相同長度，且雙鏈體區的長度與有義股和反義股相同（即，該分子在其整個長度上為雙股的）。
有義股和反義股可各自獨立地具有任何合適的長度，例如約15至約30個核苷酸長度、約18至約28個核苷酸長度、約19至約27個核苷酸長度、約19至約25個核苷酸長度、約19至約23個核苷酸長度、約20至約25個核苷酸長度、或約21至約23個核苷酸長度。在某些實施方式中，有義股和反義股的長度各自為約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、或約25個核苷酸。在一些實施方式中，有義股和反義股具有相同的長度，但形成短於該等股使得RNAi構建體具有兩個核苷酸突出端的雙鏈體區。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為21個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為19個鹼基對的雙鏈體區、和 (iii) 在有義股3'端和反義股3'端有2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為23個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為21個鹼基對的雙鏈體區、和 (iii) 在有義股3'端和反義股3'端有2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在其他實施方式中，有義股和反義股具有相同長度且在其整個長度上形成雙鏈體區，使得在雙股分子的任一端上不存在核苷酸突出端。在一個此類實施方式中，RNAi構建體為鈍端的且包含 (i) 其長度各自為21個核苷酸的有義股和反義股和 (ii) 長度為21個鹼基對的雙鏈體區。在另一個實施方式中，RNAi構建體為鈍端的且包含 (i) 其長度各自為23個核苷酸的有義股和反義股和 (ii) 長度為23個鹼基對的雙鏈體區。
在其他實施方式中，有義股或反義股長於另一條股，且兩條股形成長度等於較短股長度使得RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端的雙鏈體區。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為19個核苷酸的有義股、(ii) 長度為21個核苷酸的反義股、(iii) 長度為19個鹼基對的雙鏈體區、和 (iv) 在反義股3'端處的2個未配對核苷酸的單核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為21個核苷酸的有義股、(ii) 長度為23個核苷酸的反義股、(iii) 長度為21個鹼基對的雙鏈體區、和 (iv) 在反義股3'端處的2個未配對核苷酸的單核苷酸突出端。
本揭露的RNAi構建體的反義股可以包含圖1或圖2中列出的任何一個反義序列（例如，SEQ ID NO: 565-816或SEQ ID NO: 2329-2958中的任何一個）的序列，或任何該等反義序列的核苷酸1-21的序列。SEQ ID NO: 565-816和SEQ ID NO: 2329-2958的各反義序列包含20或21個連續核苷酸的序列（自5'末端開始計數之前20或21個核苷酸），其與PNPLA3 mRNA序列加上視需要的兩個核苷酸突出端序列互補。因此，在一些實施方式中，反義股包含SEQ ID NO: 565-816或SEQ ID NO: 2329-2958中任一個的核苷酸1-20或1-21的序列。 經修飾的核苷酸
本揭露的RNAi構建體可包含一或多種經修飾的核苷酸。「經修飾的核苷酸」係指具有針對核苷、核鹼基、戊糖環、或磷酸酯基團的一或多個經化學修飾的核苷酸。如本文所用，經修飾的核苷酸不涵蓋含有腺苷一磷酸、鳥苷一磷酸、尿苷一磷酸和胞苷一磷酸的核糖核苷酸，以及含有去氧腺苷一磷酸、去氧鳥苷一磷酸、去氧胸苷一磷酸和去氧胞苷一磷酸的去氧核糖核苷酸。然而，RNAi構建體可包含經修飾的核苷酸、核糖核苷酸和去氧核糖核苷酸的組合。將經修飾的核苷酸併入雙股RNA分子的一條或兩條股中，可以例如藉由降低分子對核酸酶和其他降解過程的敏感性來改善RNA分子的體內穩定性。還可藉由摻入經修飾的核苷酸來增強RNAi構建體降低靶基因表現的效力。
在某些實施方式中，經修飾的核苷酸具有核糖的修飾。該等糖修飾可包括戊糖環的2'和/或5'位置處的修飾以及雙環糖修飾。經2'-修飾的核苷酸係指具有戊糖環的核苷酸，該戊糖環在2'位置具有除H或OH以外的取代基。此類2'修飾包括但不限於2'-O-烷基（例如O-C1-C10或O-C1-C10取代的烷基）、2'-O-烯丙基（O-CH2CH=CH2）、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-甲基（OCH3）、2'-O-甲氧基乙基（O-(CH2)2OCH3）、2'-OCF3、2'-O(CH2)2SCH3、2'-O-胺基烷基、2'-胺基（例如NH 2）、2'-O-乙胺和2'-疊氮基。在戊糖環的5'位置的修飾包括但不限於：5'-甲基（R或S）；5'-乙烯基和5'-甲氧基。
「雙環糖修飾」係指戊糖環的修飾，其中橋將環的兩個原子連接而形成第二環從而得到雙環糖結構。在一些實施方式中，雙環糖修飾包含戊糖環的4'與2'碳之間的橋。包含具有雙環糖修飾的糖部分的核苷酸在本文中稱為「雙環核酸」或「BNA」。示例性雙環糖修飾包括但不限於α-L-亞甲基氧基（4’-CH 2-O-2’）雙環核酸（BNA）；β-D-亞甲基氧基（4'-CH 2-O-2'）BNA（也稱為鎖核酸或LNA）；伸乙基氧基（4’-(CH 2)2-O-2’）BNA；胺基氧基（4’-CH 2-O-N(R)-2’）BNA；氧基胺基（4’-CH 2-N(R)-O-2’）BNA；甲基(亞甲基氧基)（4’-CH(CH 3)-O-2’）BNA（也稱為受限乙基或cEt）；亞甲基-硫代（4’-CH 2-S-2’）BNA；亞甲基-胺基（4’-CH 2-N(R)-2’）BNA；甲基碳環（4’-CH 2-CH(CH3)-2’）BNA；丙烯碳環（4’-(CH 2)3-2’）BNA；和甲氧基(乙烯氧基)（4’-CH(CH 2OMe)-O-2’）BNA（也稱為受限MOE或cMOE）。可以併入本揭露的RNAi構建體中的該等和其他經糖修飾的核苷酸描述於例如美國專利9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761以及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology [化學和生物學], 19: 937-954 (2012)。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、雙環核酸（BNA）、或其組合。在某些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
RNAi構建體的有義股和反義股均可包含一或多個經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經修飾的核苷酸。在其他實施方式中，反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在某些其他實施方式中，有義股中的所有核苷酸和反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在該等和其他實施方式中，經修飾的核苷酸可為經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
在一些實施方式中，有義股和/或反義股中腺苷核苷酸之前的所有嘧啶核苷酸係經修飾的核苷酸。例如，當序列5'-CA-3'或5'-UA-3'出現在任一股中時，胞苷和尿苷核苷酸為經修飾的核苷酸，較佳的是經2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有嘧啶核苷酸均為經修飾的核苷酸（例如經2'-O-甲基修飾的核苷酸），且在反義股中的序列5'-CA-3'或5'-UA-3'的所有出現中的5'核苷酸為經修飾的核苷酸（例如經2'-O-甲基修飾的核苷酸）。在其他實施方式中，雙鏈體區中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在此類實施方式中，經修飾的核苷酸較佳的是為經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
在RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，突出端中的核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾的核苷酸。在一個實施方式中，突出端中的核苷酸為去氧核糖核苷酸，例如去氧胸苷。在另一個實施方式中，突出端中的核苷酸為經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，突出端中的核苷酸為經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。
本揭露的RNAi構建體還可以包含一或多個經修飾的核苷酸間鍵。如本文所用，術語「經修飾的核苷酸間鍵」係指除天然3'至5'磷酸二酯鍵外的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為含磷核苷酸間鍵，例如磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、膦酸烷基酯（例如膦酸甲酯、3'-伸烷基膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（例如，3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫代磷酸酯（P=S）、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一個實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為2'至5'磷酸二酯鍵。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為不含磷核苷酸間鍵，且因此可稱為經修飾的核苷間鍵。此類不含磷的鍵包括但不限於𠰌啉鍵（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷鍵（-O-Si(H) 2-O-）；硫化物、亞碸和碸鍵；甲醯基和硫代甲醯基鍵；含烯的骨架；胺基磺酸鹽骨架；亞甲基甲亞胺基（-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-）和亞甲基肼鍵；磺酸鹽和磺醯胺鍵；醯胺鍵；以及具有混合的N、O、S和CH 2組成部分的其他。在一個實施方式中，經修飾的核苷間鍵為產生肽核酸或PNA的基於肽的鍵（例如胺基乙基甘胺酸），例如美國專利5,539,082、5,714,331、和5,719,262中所述的那些。可以在揭露的RNAi構建體中使用的其他合適的經修飾的核苷酸間和核苷間鍵描述於美國專利6,693,187和9,181,551，美國專利公開案號2016/0122761，以及Deleavey和Damha，見上文。
在某些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。硫代磷酸酯核苷酸間鍵可以存在於RNAi構建體的有義股、反義股或兩條股中。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在仍其他實施方式中，兩條股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。RNAi構建體可以在有義股、反義股或兩條股的3'-端、5'-端或3'-端和5'-端處包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股、或兩條股的3'端包含約1至約6或更多個（例如約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股或兩條股的5'端處包含約1至約6或更多（例如約1、2、3、4、5、6或更多）個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一個實施方式中，RNAi構建體包含在有義股3'端處的單個硫代磷酸酯核苷酸間鍵和在反義股3'端的單個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股3'端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即在反義股3'端處的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3'端和5'端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在又另一個實施方式中，RNAi構建體包含反義股的3'端和5'端處的兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵和有義股5'端處的兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含反義股3'端和5'端處的兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵和有義股3'端和5'端處的兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即，在反義股5'端和3'端處的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵和在有義股5'端和3'端處的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在一條或兩條股包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的任何實施方式中，股內其餘核苷酸間鍵可為天然3'至5'磷酸二酯鍵。例如，在一些實施方式中，有義股和反義股的各核苷酸間鍵選自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一個核苷酸間鍵為硫代磷酸酯。
在RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，突出端中的兩個或更多個未配對核苷酸可藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在某些實施方式中，反義股和/或有義股的3'端處的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在其他實施方式中，反義股和/或有義股的5'端處的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在仍其他實施方式中，任何核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。
在某些實施方式中，摻入本揭露的RNAi構建體的一條或兩條股中的經修飾的核苷酸具有核鹼基（在本文中還稱為「鹼基」）的修飾。「經修飾的核鹼基」或「經修飾的鹼基」係指除天然存在的嘌呤鹼基腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）和嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）以外的鹼基。經修飾的核鹼基可為合成的或天然存在的修飾，包括但不限於通用鹼基、5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤（X）、次黃嘌呤（I）、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、和腺嘌呤和鳥嘌呤的其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵素、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵素，特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤、和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
在一些實施方式中，經修飾的鹼基為通用鹼基。「通用鹼基」係指在不改變所得到的雙鏈體區的雙螺旋結構的情況下，與RNA和DNA中的全部天然鹼基不加選擇地形成鹼基對的鹼基類似物。通用鹼基對於熟悉該項技術者而言係已知的，包括但不限於：肌苷、C-苯基、C-萘基和其他芳香族衍生物、唑醯胺類、和硝基唑衍生物（如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚）。
可以併入揭露RNAi構建體中的其他合適的經修飾鹼基包括在例如Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. [反義核酸藥物開發], 10: 297-310 (2000)和Peacock等人, J. Org. Chern.[有機化學雜誌], 76: 7295-7300 (2011)中所述的鹼基。熟悉該項技術者充分瞭解到鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可被其他核鹼基替代，例如上述經修飾的核鹼基，而基本上不改變包含攜帶此置換核鹼基的核苷酸的多核苷酸的鹼基配對特性。
在一些實施方式中，所揭露的RNAi構建體的有義股、反義股或者反義股和有義股兩者的5ʹ端均包含磷酸酯部分。如本文所用，術語「磷酸酯部分」係指包含未修飾的磷酸酯（-O-P=O)(OH)OH）以及經修飾的磷酸酯的末端磷酸酯基團。經修飾的磷酸酯包括如下的磷酸酯，其中一或多個O和OH基被H、O、S、N(R)或烷基所替代，其中R係H、胺基保護基或者未經取代或經取代的烷基。示例性的磷酸酯部分包括但不限於：5'-單磷酸酯；5'-二磷酸酯；5'-三磷酸酯；5'-鳥苷帽（7-甲基化的或非甲基化的）；5'-腺苷帽或任何其他經修飾的或未經修飾的核苷酸帽結構；5'-單硫代磷酸酯（硫代磷酸酯）；5'-單二硫代磷酸酯（二硫代磷酸酯）；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯、5'-胺基磷酸酯；5'-乙烯基膦酸酯；5'-烷基膦酸酯（其中「烷基」可為甲基、乙基、異丙基、丙基等）；5'-烷基醚膦酸酯（其中「烷基醚」可為甲氧基甲基、乙氧基甲基等）。
可摻入本揭露的RNAi構建體中的經修飾的核苷酸可具有本文所述之多於一種化學修飾。例如，經修飾的核苷酸可以具有對核糖的修飾以及對核鹼基的修飾。舉例而言，經修飾的核苷酸可包含2'糖修飾（例如2'-氟基或2'-甲基）且包含經修飾的鹼基（例如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶）。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸可以包含糖修飾以及對5'磷酸的修飾，當經修飾的核苷酸摻入多核苷酸時，該等修飾將產生經修飾的核苷酸間或核苷間鍵。例如，在一些實施方式中，經修飾的核苷酸可包含糖修飾，例如2'-氟修飾、2'-O-甲基修飾、或雙環糖修飾、以及5'硫代磷酸酯基團。因此，在一些實施方式中，本揭露的RNAi構建體的一條或兩條股包含經2'修飾的核苷酸或BNA與硫代磷酸酯核苷酸間鍵的組合。在某些實施方式中，本揭露的RNAi構建體的有義股和反義股均包含經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的組合。包含經修飾的核苷酸和核苷酸間鍵的示例性siRNA構建體顯示在圖1和圖2中。
本揭露的RNAi構建體的反義股可以包含圖1或圖2中列出的任何一個經修飾的反義序列（例如，SEQ ID NO: 817-1068或SEQ ID NO: 2959-3588中的任何一個）的序列，或任何該等反義序列的核苷酸1-21的序列。在一些實施方式中，反義股包含SEQ ID NO: 817-1068或SEQ ID NO: 2959-3588中任一個的核苷酸1-20或1-21的序列。 RNAi 構建體的功能
所揭露的RNAi構建體理想地降低或抑制PNPLA3在細胞，特別是肝臟細胞中的表現。因此，在一個實施方式中，本揭露提供一種藉由使細胞與本文所述之任何RNAi構建體接觸來降低細胞中的PNPLA3表現之方法。該細胞可為體外或體內的。PNPLA3表現可以藉由測量PNPLA3 mRNA、PNPLA3蛋白或與PNPLA3表現相關的另一種生物標誌物的量或水平來評估。可以相對於未用RNAi構建體處理或用對照RNAi構建體處理的細胞或動物中的PNPLA3表現來確定用本揭露的RNAi構建體處理的細胞或動物中的PNPLA3表現的降低。例如，在一些實施方式中，藉由以下步驟來評估PNPLA3表現的降低：(a) 測量用本揭露的RNAi構建體處理的肝臟細胞中的PNPLA3 mRNA的量或水平、(b) 測量用對照RNAi構建體（例如，針對未在肝臟細胞中表現的RNA分子的RNAi構建體或具有無義或亂序序列的RNAi構建體）處理或不用構建體處理的肝臟細胞中的PNPLA3 mRNA的量或水平、和 (c) 比較來自 (a) 中的經處理細胞的經測量PNPLA3 mRNA水平與來自 (b) 中的對照細胞的經測量PNPLA3 mRNA水平。在比較之前，可以將處理細胞和對照細胞中的PNPLA3 mRNA水平歸一化至對照基因（例如18S核糖體RNA）的RNA水平。PNPLA3 mRNA水平可藉由多種方法測量，包括RNA印跡分析、核酸酶保護測定、螢光原位雜交（FISH）、反轉錄酶（RT）-PCR、即時RT-PCR、定量PCR等。
在其他實施方式中，藉由以下步驟來評估PNPLA3表現的降低：(a) 測量用本文描述的RNAi構建體處理的肝臟細胞中的PNPLA3蛋白質的量或水平、(b) 測量用對照RNAi構建體（例如，針對未在肝臟細胞中表現的RNA分子的RNAi構建體或具有無義或亂序序列的RNAi構建體）處理或不用構建體處理的肝臟細胞中的PNPLA3蛋白質的量或水平、和 (c) 比較來自 (a) 中的經處理細胞的經測量PNPLA3蛋白質水平與來自 (b) 中的對照細胞的經測量PNPLA3蛋白質水平。PNPLA3蛋白水平可以使用熟悉該項技術者已知的任何合適的方法來測量，包括但不限於西方墨點法、免疫測定（例如，ELISA）和流式細胞術。可以使用任何合適的測量PNPLA3 mRNA或蛋白質的方法來評估本文所述之RNAi構建體的功效。
在一些實施方式中，評估PNPLA3表現水平的方法在體外在天然表現PNPLA3的細胞（例如肝臟細胞）或已經工程化以表現PNPLA3的細胞中進行。在某些實施方式中，該等方法在體外在肝臟細胞中進行。合適的肝臟細胞包括但不限於：原代肝細胞（例如人、非人靈長類動物或齧齒動物的肝細胞）、HepAD38細胞、HuH-6細胞、HuH-7細胞、HuH-5-2細胞、BNLCL2細胞、Hep3B細胞或HepG2細胞。在一個實施方式中，肝臟細胞為Hep3B細胞。在另一個實施方式中，肝臟細胞為HepG2細胞。
在其他實施方式中，評估PNPLA3表現水平的方法在體內進行。例如，RNAi構建體和任何對照RNAi構建體可以投與至動物（例如齧齒動物或非人靈長類動物）且在處理後，可以在自動物收穫的肝組織中評估PNPLA3 mRNA或蛋白質水平。可替代地或另外地，可以在經處理的動物中評估與PNPLA3表現相關的生物標誌物或功能表型。
在某些實施方式中，藉由本文所述之RNAi構建體，使PNPLA3的表現在肝臟細胞中降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或至少50%。在一些實施方式中，藉由本文所述之RNAi構建體，使PNPLA3的表現在肝臟細胞中降低至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、或至少85%。在其他實施方式中，藉由本文所述之RNAi構建體，使PNPLA3的表現在肝臟細胞中降低約90%或更多，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多。PNPLA3表現的降低百分比可藉由本文所述之任何方法或本領域已知的其他方法測量。例如，在某些實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在Hep3B細胞（含有野生型PNPLA3）中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少60%。在相關實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在Hep3B細胞中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%。在其他實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在Hep3B細胞中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在某些實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在HepG2細胞（含有野生型PNPLA3）中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少60%。在相關實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在HepG2細胞中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%。在其他實施方式中，本文所述之RNAi構建體在體外在HepG2細胞中以5 nM將PNPLA3表現抑制至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。PNPLA3的減少可以使用多種技術來測量，包括例如RNA FISH或微滴式數字PCR（參見，例如，Kamitaki等人, Digital PCR. Methods in Molecular Biology[分子生物學中的數字PCR方法], 1768: 401-422 (2018). doi:10.1007/978-1-4939-7778-9_23）。
在一些實施方式中，計算IC 50值以評估本文所述之RNAi構建體抑制肝臟細胞中PNPLA3表現的效力。「IC 50值」為實現50%生物或生物化學功能抑制所需的劑量/濃度。任何物質或拮抗劑的IC 50值可以藉由構建劑量-反應曲線且在任何測定中檢查不同濃度的物質或拮抗劑對表現水平或功能活性的影響來確定。給定拮抗劑或物質的IC 50值可以藉由確定抑制一半最大生物反應或天然表現水平所需的濃度來計算。因此，任何RNAi構建體的IC 50值可以藉由在任何測定中確定抑制肝臟細胞中的一半天然PNPLA3表現水平（例如對照肝臟細胞中的PNPLA3表現水平）所需的RNAi構建體的濃度來計算，該等測定例如免疫測定、RNA FISH測定或微滴式數字PCR測定。本文所述之RNAi構建體可以抑制肝臟細胞（例如Hep3B細胞或HepG2細胞）中的PNPLA3表現，其中IC 50小於約40 nM（例如，小於約35 nM、30nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、5 nM或1 nM）。例如，所揭露的RNAi構建體可以以約0.001 nM至約40 nM、約0.001 nM至約30 nM、約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC 50抑制肝臟細胞中的PNPLA3表現。
本文所述之RNAi構建體可以使用本領域已知的技術容易地製備，例如常規的核酸固相合成。RNAi構建體的多核苷酸可使用標準核苷酸或核苷先質（例如亞磷醯胺）在合適的核酸合成儀上組裝。自動核酸合成儀係由若干供應商商業銷售，包括來自應用生物系統公司（Applied Biosystems）（福斯特城，加利福尼亞州）的DNA/RNA合成儀、來自生物自動化公司（BioAutomation）（歐文市，德克薩斯州）的MerMade合成儀、和來自GE保健生命科學公司（GE Healthcare Life Sciences）（匹茲堡市，賓夕法尼亞州）的OligoPilot合成儀。
2'矽基保護基團可與核糖核苷的5'位酸不穩定性二甲氧基三苯甲基（DMT）結合使用，以通過亞磷醯胺化學合成寡核苷酸。已知最終去保護條件不會顯著降解RNA產物。所有合成均可在任何自動或手動合成儀中以大、中、小規模進行。合成還可以在多個孔板、柱或載玻片中進行。
2'-O-矽基可以經由暴露於氟離子來除去，氟離子可以包括任何氟離子源，例如含有與無機相對離子配對的氟離子的那些鹽，例如氟化銫和氟化鉀，或含有與有機相對離子配對的氟離子的那些鹽，例如四烷基氟化銨。冠醚催化劑可以與無機氟化物組合用於去保護反應中。示例性的氟離子源包括但不限於四丁基氟化銨或胺基氫氟化物（例如，將HF水溶液與三乙胺組合在偶極非質子溶劑如二甲基甲醯胺中）。
選擇用於亞磷酸三酯和磷酸三酯上的保護基團可以改變三酯對氟化物的穩定性。磷酸三酯或亞磷酸三酯的甲基保護可以穩定與氟離子的鍵聯且改進過程產率。
由於核糖核苷具有反應性2'羥基取代基，因此可能需要用與5'-O-二甲氧基三苯甲基保護基正交的保護基團（例如對用酸處理穩定的保護基團）保護RNA中的反應性2'位置。矽基保護基團符合該標準，且可以在最終的氟化物去保護步驟中容易地除去，這可以導致最少RNA降解。
四唑催化劑可用於標準亞磷醯胺偶合反應。示例性催化劑包括例如：四唑、S-乙基-四唑、苄基巰基四唑和對硝基苯基四唑。
合成本文所述之RNAi構建體的其他方法對於普通熟悉該項技術者而言為顯而易見的。另外地，各種合成步驟可以交替序列或順序進行，以得到所需化合物。其他合成化學轉化、保護基團（例如，對於鹼基上存在的羥基、胺基等）和可用於合成本文所述RNAi構建體的保護基團方法（保護和去保護）為本領域已知的且包括例如以下中描述的那些：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations [全面有機轉換], VCH Publishers [VCH出版社] (1989)；T. W. Greene和P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第2版,John Wiley and Sons [約翰威立父子公司], (1991)；L. Fieser和M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis [費塞爾和用於有機合成的費塞爾試劑], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1994)；以及L. Paquette編輯, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis [有機合成試劑百科全書], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1995)，及其後續版本。RNAi構建體的定制合成還可自若干商業供應商處獲得，包括Dharmacon公司（Dharmacon, Inc.）（拉斐特，科羅拉多州）、Axo實驗室股份有限公司（AxoLabs GmbH）（庫爾姆巴赫，德國）和Ambion公司（Ambion, Inc.）（福斯特城，加利福尼亞州）。
本文所述之RNAi構建體可包含配體。如本文所用，「配體」係指可以與另一種化合物或分子直接或間接相互作用的任何化合物或分子。配體與另一種化合物或分子的相互作用可引發生物反應（例如，啟動訊息傳遞級聯反應，誘導受體介導的內吞作用）或者可僅為物理締合。配體可以修改所附接的雙股RNA分子的一或多種特性，例如RNA分子的藥效學、藥動學、結合、吸收、細胞分佈、細胞攝取、電荷和/或清除特性。
配體可包含血清蛋白（例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白）、膽固醇部分、維生素（例如，生物素、維生素E、維生素B12）、葉酸部分、類固醇、膽汁酸（例如膽酸）、脂肪酸（例如棕櫚酸、肉豆蔻酸）、碳水化合物（例如葡聚糖、聚三葡萄糖、幾丁質、聚葡萄胺糖、菊粉、環糊精或透明質酸）、糖苷、磷脂、或抗體或其結合片段（例如，將RNAi構建體靶向特定細胞類型，例如肝臟細胞的完整抗體或結合片段）。配體的其他實例包括染料、嵌入劑（例如吖啶）、交聯劑（例如補骨脂素、絲裂黴素C）、卟啉（例如TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin）、多環芳烴（例如吩𠯤、二氫吩𠯤）、人工內切核酸酶（例如EDTA）、親脂性分子（例如金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪酮、1,3-二O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、03-(油醯基)石膽酸、03-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩㗁𠯤）、肽（例如，觸角肽、Tat肽、RGD肽）、烷化劑、聚合物（例如，聚乙二醇（PEG）、PEG-40K））、聚胺基酸和多胺（諸如精胺、亞精胺）。
在某些實施方式中，配體具有內體溶解特性。內體溶解配體促進內體的裂解和/或將本文所述之RNAi構建體或其組分從內體轉運至細胞的細胞質。內體溶解配體可為顯示pH依賴性膜活性和融合性的多聚陽離子肽或擬肽。在一個實施方式中，內體溶解配體在內體pH下呈現其活性構形。「活性」構像係其中內體溶解配體促進內體裂解和/或本文所述之RNAi構建體或其組分從內體到細胞的細胞質的轉運的構形。示例性內體溶解配體包括GALA肽（Subbarao等人, Biochemistry [生物化學], 第26卷: 2964-2972, 1987）、EALA肽（Vogel等人, J. Am. Chern. Soc.[美國化學學會雜誌], 第118卷: 1581-1586, 1996），以及它們的衍生物（Turk等人, Biochem. Biophys. Acta, 第1559卷: 56-68, 2002）。在一個實施方式中，內體溶解組分可含有化學基團（例如胺基酸），其響應於pH的變化將經歷電荷或質子化的變化。內體溶解組分可為直鏈或支鏈的。
在一些實施方式中，配體包含脂質或其他疏水分子。在一個實施方式中，配體包含膽固醇部分或其他類固醇。據報導經膽固醇軛合的寡核苷酸較其未經軛合對應物更具活性（Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development [反義核酸藥物開發], 第12卷: 103-228, 2002）。包含膽固醇部分的配體和用於軛合至核酸分子的其他脂質也已經描述於美國專利7,851,615；7,745,608；和7,833,992。在另一個實施方式中，配體可包含葉酸部分。與葉酸部分軛合的多核苷酸可以經由經受體介導的胞吞作用途徑被細胞攝取。此類葉酸-多核苷酸軛合物描述於例如美國專利8,188,247中。
鑒於PNPLA3在肝臟細胞（例如肝細胞）中表現，在某些實施方式中，期望將RNAi構建體特異性遞送至肝臟細胞。在一些實施方式中，RNAi構建體可以藉由使用與肝臟細胞表面上表現的蛋白質結合或相互作用的配體而特異性靶向肝臟。例如，在某些實施方式中，配體可以包含一或多個特異性結合肝細胞上表現的受體的抗原結合蛋白（例如抗體或其結合片段（例如Fab、scFv））。
在某些實施方式中，配體包含碳水化合物。「碳水化合物」係指由一或多個具有至少6個碳原子（可為直鏈、支鏈或環狀）和與各碳原子鍵合的氧、氮或硫原子的單糖單元構成的化合物。碳水化合物包括但不限於糖（例如，單糖、二糖、三糖、四糖和含有約4、5、6、7、8或9個單糖單元的寡糖）和多糖，例如澱粉、糖原、纖維素和多糖膠。在一些實施方式中，摻入配體中的碳水化合物為選自戊糖、己糖或庚糖的單糖和包括此類單糖單元的二糖和三糖。在其他實施方式中，摻入配體中的碳水化合物為胺基糖，例如半乳糖胺、葡糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺和N-乙醯葡糖胺。
在一些實施方式中，配體包含己糖或己糖胺。己糖可選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或果糖。己糖胺可選自果糖胺、半乳糖胺、葡糖胺或甘露糖胺。在某些實施方式中，配體包含葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺或葡糖胺。在一個實施方式中，配體包含葡萄糖、葡糖胺或N-乙醯葡糖胺。在另一個實施方式中，配體包含半乳糖、半乳糖胺或N-乙醯基-半乳糖胺。在特定實施方式中，配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。包含葡萄糖、半乳糖和N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）的配體在將化合物靶向肝臟細胞方面特別有效（參見，例如，D’Souza and Devarajan, J. Control Release [控釋雜誌], 第203卷: 126-139, 2015）。可以摻入本文所述之RNAi構建體中的含GalNAc或半乳糖的配體之實例描述於美國專利7,491,805；8,106,022；和8,877,917；美國專利公開案號2003/0130186；和WIPO公開案號WO 2013/166155。
在某些實施方式中，配體包含多價碳水化合物部分。如本文所用，「多價碳水化合物部分」係指包含能夠獨立地與其他分子結合或相互作用的兩個或更多個碳水化合物單元的部分。例如，多價碳水化合物部分包含兩個或更多個由碳水化合物組成的結合結構域，其可以結合兩個或更多個不同分子或同一分子上的兩個或更多個不同位點。碳水化合物部分的化合價表示該碳水化合物部分內的單個結合結構域的數目。例如，關於碳水化合物部分的術語「一價」、「二價」、「三價」和「四價」分別係指具有一個、兩個、三個和四個結合域的碳水化合物部分。多價碳水化合物部分可包含多價乳糖部分、多價半乳糖部分、多價葡萄糖部分、多價N-乙醯基-半乳糖胺部分、多價N-乙醯基-葡糖胺部分、多價甘露糖部分、或多價岩藻糖部分。在一些實施方式中，配體包含多價半乳糖部分。在其他實施方式中，配體包含多價N-乙醯基-半乳糖胺部分。在該等和其他實施方式中，多價碳水化合物部分為二價、三價或四價的。在此類實施方式中，多價碳水化合物部分可為雙觸角或三觸角的。在一個特定實施方式中，多價N-乙醯基-半乳糖胺部分為三價或四價的。在另一個特定實施方式中，多價半乳糖部分為三價或四價的。用於摻入RNAi構建體中的示例性含三價和四價GalNAc的配體在下文詳細描述。
配體可以直接或間接地附接或軛合到RNAi構建體至RNA分子上。例如，在一些實施方式中，配體直接共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。在其他實施方式中，配體經由連接子共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。配體可以附接到本文所述之RNAi構建體的多核苷酸（例如有義股或反義股）的核鹼基、糖部分或核苷酸間鍵。與嘌呤核鹼基或其衍生物的軛合或附接可發生在包括環內和環外原子在內的任何位置。在某些實施方式中，嘌呤核鹼基的2位置、6位置、7位置或8位置附接至配體。與嘧啶核鹼基或其衍生物的軛合或附接還可發生在任何位置處。在一些實施方式中，嘧啶核鹼基的2位置、5位置和6位置可以附接至配體。與核苷酸的糖部分的軛合或附接可以發生在任何碳原子處。糖部分的可附接至配體的示例性碳原子包括2'、3'和5'碳原子。1'位置也可以附接至配體，如在鹼性殘基中。核苷酸間鍵還可以支持配體附接。對於含磷鍵（例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等），配體可直接附接至磷原子或與磷原子鍵合的O、N或S原子上。對於含胺或醯胺的核苷間鍵（例如PNA），配體可附接至胺或醯胺的氮原子或附接至相鄰碳原子。
在某些實施方式中，配體可以附接有義股或反義股的3'端或5'端。在某些實施方式中，配體共價附接至有義股的5'端。在其他實施方式中，配體共價附接至有義股的3'端。例如，在一些實施方式中，配體附接至有義股的3'末端核苷酸。在某些這樣的實施方式中，配體附接在有義股的3'末端核苷酸的3'位置處。在替代性實施方式中，配體附接在有義股的3'端附近，但在一或多個末端核苷酸之前（即在1、2、3或4個末端核苷酸之前）。在一些實施方式中，配體附接在有義股的3'末端核苷酸的糖的2'位置處。
在某些實施方式中，配體經由連接子附接至有義股或反義股。「連接子」係使配體共價連接至RNAi構建體的多核苷酸組分的原子或基團。連接子可為從約1至約30個原子長度、從約2至約28個原子長度、從約3至約26個原子長度、從約4至約24個原子長度、從約6至約20個原子長度、從約7至約20個原子長度、從約8至約20個原子長度、從約8至約18個原子長度、從約10至約18個原子長度、和從約12至約18個原子長度。在一些實施方式中，連接子可包含雙官能連接部分，其通常包含具有兩個官能基的烷基部分。選擇一個官能基以結合目的化合物（例如RNAi構建體的有義股或反義股），且選擇另一個官能基以基本上結合任何選定基團，例如本文所述之配體。在某些實施方式中，連接子包含重複單元，例如乙二醇或胺基酸單元的鏈結構或寡聚物。典型地用於雙官能連接部分的官能基之實例包括但不限於用於與親核基團反應的親電子試劑和用於與親電子基團反應的親核試劑。在一些實施方式中，雙官能連接部分包括胺基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和度（例如，雙鍵或三鍵）等。
可用於將配體附接至本文所述之RNAi構建體中的有義股或反義股的連接子包括但不限於：吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯、6-胺基己酸、經取代的C 1-C 10烷基、經取代的或未經取代的C 2-C 10烯基、或者取代的或未取代的C 2-C 10炔基。此類連接子的較佳的取代基包括但不限於羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些實施方式中，連接子為可切割的。可切割連接子為在細胞外足夠穩定，但是在進入靶細胞後經切割以釋放連接子保持在一起的兩個部分的連接子。在一些實施方式中，可切割連接子在靶細胞中或在第一參考條件下（其可以例如經選擇以模擬或代表細胞內條件）中比在受試者血液中或在第二參考條件下（其可以例如經選擇以模擬或代表在血液或血清中發現的條件）切割快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多、或至少100倍。
可切割連接子易受切割劑影響，例如pH、氧化還原電位或降解分子的存在。通常，切割劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被發現。此類降解劑之實例包括：經選擇用於特定底物或不具有底物特異性的氧化還原劑，包括例如存在於細胞中的氧化或還原酶或還原劑，諸如硫醇，其可藉由還原來使氧化還原可切割連接子降解；酯酶；可形成酸性環境的內體或藥劑，例如產生pH 5或更低的那些；藉由充當一般酸來使酸可切割連接子水解或降解的酶、肽酶（可為底物特異性的）、和磷酸酶。
可切割的連接子可包含對pH敏感的部分。人血清的pH為7.4，而平均細胞內pH略低，範圍為從約7.1-7.3。內體具有更高酸性pH，在5.5-6.0範圍內，且溶酶體具有約5.0的甚至更高酸性pH。一些連接子將具有可切割基團，其在較佳的是pH下切割，從而將RNA分子自配體釋放到細胞內，或進入細胞的所需區室。
連接子可包括可由特定酶切割的可切割基團。摻入連接子中的可切割基團的類型可取決於待靶向的細胞。例如，肝靶向配體可以通過包括酯基的連接子連接至RNA分子。肝臟細胞富含酯酶，且因此該連接子在肝臟細胞中將比在不富含酯酶的細胞類型中更有效地裂解。富含酯酶的其他類型的細胞包括肺、腎皮質和睪丸的細胞。當靶向富含肽酶的細胞（例如肝臟細胞和滑膜細胞）時，可以使用含有肽鍵的連接子。
通常，可以藉由測試降解劑（或條件）切割候選連接子的能力來評估候選可切割連接子的適用性。還期望還測試候選可切割連接子在血液中或當與其他非靶組織接觸時抵抗切割的能力。因此，可以確定第一條件與第二條件之間對切割的相對易感性，其中第一條件經選擇為指示靶細胞中的切割，而第二條件經選擇為指示其他組織或生物流體（例如血液或血清）中的切割。評估可以在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物或整個動物中進行。在無細胞或培養條件下進行初步評估且藉由對整個動物進行進一步評估來確認可能是有用的。在一些實施方式中，有用候選連接子在細胞中（或者在被選擇用於模擬細胞內條件的體外條件下）的裂解，與在血液或血清中（或者在模擬細胞外條件的體外條件下）相比，至少快2、4、10、20、50、70或100倍。
在其他實施方式中，使用氧化還原可切割連接子。氧化還原可切割連接子在還原或氧化時切割。還原性可切割基團之實例為二硫鍵連接基團（-S-S-）。為了確定候選可切割連接子是否是合適的「可還原切割連接子」或者例如是否適合與特定RNAi構建體和特定配體一起使用，可以採用本文所述之一或多種方法。例如，可以藉由與二硫蘇糖醇（DTT）或本領域已知的其他還原劑一起孵育來評估候選連接子，其模擬將在細胞（例如靶細胞）中觀察到的切割速率。也可以在選擇模擬血液或血清條件的條件下評估候選連接子。在特定實施方式中，候選連接子在血液中裂解至多10%。在其他實施方式中，有用候選連接子在細胞中（或在經選擇以模擬細胞內條件的體外條件下）與血液（或在經選擇以模擬細胞外條件的體外條件下）相比，降解快至少2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、70倍或100倍。
在又其他實施方式中，基於磷酸酯的可切割連接子藉由降解或水解磷酸基團的試劑來切割。水解細胞中的磷酸酯基團的試劑之實例為酶，例如細胞中的磷酸酶。基於磷酸酯的可切割基團之實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。具體實施方式包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-SP(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。另一具體實施方式為-O-P(O)(OH)-O-。該等候選連接子可以使用與上述那些類似的方法評估。
在其他實施方式中，連接子可包含酸可切割基團，該等基團為在酸性條件下切割的基團。在一些實施方式中，酸可切割基團在pH為約6.5或更低（例如，約6.0、5.5、5.0或更低）的酸性環境中切割，或藉由試劑諸如可充當一般酸的酶切割。在細胞中，特定的低pH細胞器，例如內體和溶酶體，可以為酸可切割基團提供切割環境。酸可切割連接基團之實例包括但不限於腙、酯和胺基酸酯。酸可切割基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。一特定實施方式為當附接至酯（烷氧基）的氧的碳為芳基、經取代的烷基或三級烷基諸如二甲基、戊基或三級丁基時。該等候選物可以使用與上述那些類似的方法評估。
在其他實施方式中，連接子可包含基於酯的可切割基團，該等基團藉由細胞中的酶，例如酯酶和醯胺酶來切割。基於酯的可切割基團之實例包括但不限於伸烷基、亞烯基和亞炔基的酯。酯可切割基團具有通式-C(O)O-或-OC(O) -。該等候選連接子可以使用與上述那些類似的方法評估。
在其他實施方式中，連接子可以包含基於肽的可切割基團，該等基團藉由細胞中的酶，例如肽酶和蛋白酶來切割。基於肽的可切割基團為在胺基酸之間形成的肽鍵，以產生寡肽（例如，二肽、三肽等）和多肽。基於肽的可切割基團不包括醯胺基團（-C(O)NH-）。醯胺基團可以在任何伸烷基、亞烯基或亞炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸之間形成的特殊類型的醯胺鍵，以產生肽和蛋白質。基於肽的切割基團通常限於在產生肽的胺基酸和蛋白質之間所形成的肽鍵（即，醯胺鍵），並且不包括整個醯胺官能基。基於肽的可切割連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB為兩個相鄰胺基酸的R基團。該等候選物可以使用與上述那些類似的方法評估。
適合於將配體附接到本文所述之RNAi構建體中的有義股或反義股的其他類型的連接子為本領域已知的，且可以包括以下中描述的連接子：例如美國專利7,723,509；8,017,762；8,828,956；8,877,917；和9,181,551。
在某些實施方式中，共價附接至本文所述之RNAi構建體的有義股或反義股的配體包含GalNAc部分，例如多價GalNAc部分。在一些實施方式中，多價GalNAc部分為三價GalNAc部分且附接至有義股的3'端。在其他實施方式中，多價GalNAc部分為三價GalNAc部分且附接至有義股的5'端。在又其他實施方式中，多價GalNAc部分為四價GalNAc部分且附接至有義股的3'端。在其他實施方式中，多價GalNAc部分為四價GalNAc部分且附接至有義股的5'端。
在一些實施方式中，可以藉由投與編碼和控制RNAi構建體的細胞內表現的載體，將本文所述之RNAi構建體遞送至目標細胞或組織。「載體」（在本文中也稱為「表現載體」）係可用於將目的核酸遞送至細胞內部的物質的組成物。許多載體在本領域中係已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子化合物或兩親化合物相關的多核苷酸、質體、以及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。載體可以在活細胞中複製，或者可以合成製成。
通常，用於表現本文所述之RNAi構建體的載體將包含一或多個與編碼RNAi構建體的序列可操作地連接的啟動子。短語「可操作連接」、「可操作地連接」或「在轉錄控制下」可在本文中互換使用，以指示以下情況：啟動子相對於多核苷酸序列處於正確位置和方向，以控制RNA聚合酶的轉錄起始和多核苷酸序列的表現。「啟動子」係指由啟動基因序列特異性轉錄所需的細胞合成機制或經引入的合成機制識別的序列。合適的啟動子包括但不限於RNA pol I、pol II、HI或U6 RNA pol III、和病毒啟動子（例如人巨細胞病毒（CMV）立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子、和勞斯氏肉瘤病毒長末端重複）。在一些實施方式中，使用HI或U6RNA pol III啟動子。啟動子可為組織特異性或誘導型啟動子。令人特別感興趣的係肝特異性啟動子，諸如來自人α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、血紅素結合蛋白基因、和肝脂酶基因的啟動子序列。誘導型啟動子包括，例如，由蛻皮激素、雌激素、助孕素、四環素、和異丙基-PD1-硫代半乳糖苷（IPTG）調節的啟動子。
當RNAi構建體包含siRNA時，兩條單獨股（有義股和反義股）可以自單個載體或兩個單獨載體表現。例如，在一些實施方式中，編碼有義股的序列與第一載體上的啟動子可操作地連接，且編碼反義股的序列與第二載體上的啟動子可操作地連接。在此實施方式中，第一載體和第二載體例如藉由感染或轉染共同引入靶細胞，使得有義股和反義股一旦轉錄，將在細胞內雜交以形成siRNA分子。在另一個實施方式中，有義股和反義股由位於單一載體中的兩個單獨啟動子轉錄。在此類實施方式中，編碼有義股的序列與第一啟動子可操作地連接，且編碼反義股的序列與第二啟動子可操作地連接，其中第一啟動子和第二啟動子位於單個載體中。在一個實施方式中，載體包含與編碼siRNA分子的序列可操作地連接的第一啟動子和在相反方向上與相同序列可操作地連接的第二啟動子，使得自第一啟動子轉錄序列使得siRNA分子的有義股得以合成，且自第二啟動子轉錄序列使得siRNA分子的反義股得以合成。
當RNAi構建體包含shRNA時，編碼單個至少部分自身互補的RNA分子的序列與啟動子可操作地連接以產生單個轉錄物。在一些實施方式中，編碼shRNA的序列包含藉由連接子多核苷酸序列連接的反向重複序列，以在轉錄後產生shRNA的莖和環結構。
在一些實施方式中，編碼本文所述之RNAi構建體的載體係病毒載體。適合表現本文所述RNAi構建體的各種病毒載體系統包括但不限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體（例如慢病毒載體、莫洛尼氏鼠白血病病毒）、腺相關病毒載體；單純皰疹病毒載體；SV40載體；多瘤病毒載體；乳頭狀瘤病毒載體；微小核糖核酸病毒載體；和痘病毒載體（例如牛痘病毒）。在某些實施方式中，病毒載體為反轉錄病毒載體（例如慢病毒載體）。
適用於本揭露的各種載體、將編碼siRNA或shRNA分子的核酸序列插入載體的方法、以及將載體遞送至目的細胞的方法係本領域已知的（參見，例如，Dornburg , Gene Therap.[基因療法], 第2卷: 301-310, 1995；Eglitis, Biotechniques [生物技術], 第6卷: 608-614, 1988；Miller, HumGene Therap.[人類基因療法], 第1卷: 5-14, 1990；Anderson, Nature [自然], 第392卷: 25-30, 1998；Rubinson D A等人, Nat. Genet.[自然遺傳學], 第33卷: 401-406, 2003；Brummelkamp等人, Science [科學], 第296卷: 550-553, 2002；Brummelkamp等人, Cancer Cell [癌細胞], 第2卷: 243-247, 2002；Lee等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 500-505, 2002；Miyagishi等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 497-500, 2002；Paddison等人, GenesDev [基因發育], 第16卷: 948-958, 2002；Paul等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 505-508, 2002；Sui等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 第99卷: 5515-5520, 2002；和Yu等人, Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊], 第99卷: 6047-6052, 2002）。 組成物
本揭露還提供組成物和配製物，其包含本文所述之RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。這類組成物和配製物可用於在有需要的受試者中降低PNPLA3的表現。當考慮臨床應用時，將以適合於預期應用的形式製備藥物組成物和配製物。通常，這將需要製備基本上不含熱原以及可能對人或動物有害的其他雜質的組成物。
短語「藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」係指在投與於動物或人類時不產生不良反應、過敏反應或其他不利反應的分子實體和組成物。如本文所用，「藥學上可接受的載劑、賦形劑、或稀釋劑」包括可接受的用於配製藥物（如適合於向人投與的藥物）的溶劑、緩衝劑、溶液、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。該等介質和試劑用於藥物活性物質的用途為本領域熟知的。除非任何常規介質或試劑與本文所述之RNAi構建體不相容，否則考慮其在治療組成物中之用途。補充活性成分還可摻入組成物中，條件係它們不會使組成物的載體或RNAi構建體失活。
用於配製藥物組成物的組成物和方法取決於一些標準，包括但不限於投與途徑、待治療的疾病或障礙的類型和程度以投與劑量。在一些實施方式中，基於預期遞送途徑配製藥物組成物。例如，在某些實施方式中，配製藥物組成物以用於腸胃外遞送。腸胃外遞送形式包括靜脈內、動脈內、皮下、鞘內、腹膜內或肌內注射和輸注。在一個實施方式中，配製藥物組成物以用於靜脈內遞送。在此實施方式中，藥物組成物可包括基於脂質的遞送媒介物。在另一個實施方式中，配製藥物組成物以用於皮下遞送。在此實施方式中，藥物組成物可包括靶向配體（例如，本文所述之含有GalNAc的配體）。
在一些實施方式中，藥物組成物包含有效量的本文所述RNAi構建體。「有效量」係足以產生有益或期望的臨床結果的量。在一些實施方式中，有效量為足以降低受試者肝細胞中的PNPLA3表現的量。在一些實施方式中，有效量可為足以僅部分降低PNPLA3表現的量，例如，降低至與人雜合子中野生型PNPLA3等位基因的表現相當的水平。據報導，與非攜帶者相比，功能喪失的PNPLA3變異體等位基因的人雜合子攜帶者具有較低非HDL膽固醇血清水平和較低冠狀動脈疾病和心肌梗塞風險（Nioi等人, New England Journal of Medicine [新英格蘭醫學雜誌], 第374卷第22期:2131-2141, 2016）。因此，不受理論束縛，據信PNPLA3表現的部分降低可足以實現血清非HDL膽固醇的有益降低和冠狀動脈疾病和心肌梗塞的風險降低。
RNAi構建體的有效量可為從約0.01 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重至約75 mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 mg/kg至約30 mg/kg體重、約2.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重或約5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重。在某些實施方式中，RNAi構建體的單一有效劑量可為約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg。包含有效量的RNAi構建體的藥物組成物可以每週、每兩週、每月、每季度或每半年投與。準確確定有效量和投與頻率可以基於若干因素，包括患者體型、年齡、性別、待治療的障礙類型（例如心肌梗塞、心臟衰竭、冠狀動脈疾病、高膽固醇血症）、使用的特定RNAi構建體和投與途徑。可以使用常規方法和/或在合適的動物模型中測試來確定本文所述之任何特定RNAi構建體的有效劑量和體內半衰期的估計值。
膠體分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒、和基於脂質的系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束、和脂質體，可以用作本文所述之RNAi構建體或編碼此類結構的載體的遞送媒介物。適用於遞送本文所述核酸的市售脂肪乳液包括INTRALIPID®、LIPOSYN®、LIPOSYN®II、LIPOSYN®III、NUTRILIPID和其他類似的脂質乳液。用作體內遞送媒介物的較佳的膠體系統係脂質體（即，人工膜囊）。本文所述之RNAi構建體可以封裝在脂質體中，例如陽離子脂質體。可替代地，RNAi構建體可以與脂質複合，例如陽離子脂質。合適的脂質和脂質體包括中性（例如，二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE）、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼（DMPC）和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC））、二硬脂醯磷脂醯膽鹼）、及陰性（例如，二豆蔻醯磷脂醯甘油基甘油（DMPG）、和陽離子型（例如，二油醯基四曱基胺基丙基（DOTAP）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOTMA））。此類膠體分散系統的製備和使用為本領域熟知的。示例性配製物也揭露於例如美國專利5,783,565；5,837,533；5,981,505；6,127,170；6,217,900；6,379,965；6,383,512；6,747,014；7,202,227；和WO 03/093449。
在一些實施方式中，RNAi構建體完全封裝於脂質配製物中，例如，以形成SPLP、pSPLP、SNALP、或其他核酸-脂質顆粒。如本文所用，術語「SNALP」係指穩定的核酸-脂質顆粒，包括SPLP。如本文所用，術語「SPLP」係指包含封裝於脂質囊泡內的質體DNA的核酸-脂質顆粒。SNALP和SPLP典型地含有陽離子脂質、非陽離子脂質、和防止顆粒聚集的脂質（例如，PEG-脂質軛合物）。SNALP和SPLP對於全身應用特別有用，因為它們在靜脈注射後展現出循環壽命延長，並且在遠端部位（例如，與投與部位物理分離的部位）累積。SPLP包括「pSPLP」，其包括PCT公開案號WO 00/03683中所述之經封裝縮合劑-核酸複合物。核酸-脂質顆粒典型地具有約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、或約70 nm至約90 nm的平均直徑，且基本上無毒。另外，存在於核酸-脂質顆粒中的核酸在水溶液中理想地對用核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂質顆粒及其製備方法揭露於例如美國專利5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；和6,815,432；和PCT公開案號WO 96/40964。
適於注射的藥物組成物包括例如無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。通常，該等製劑為無菌的且流動到易於注射的程度。製劑在製造和儲存條件下應保持穩定，且應防止微生物諸如細菌和真菌的污染作用。合適的溶劑或分散介質可包含例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、其合適的混合物、和植物油。可以藉由例如使用包衣（例如卵磷脂）、藉由保持所需的粒度（在分散體的情況下）和/或藉由使用界面活性劑來保持適當的流動性。對微生物作用的防止可以藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑來實現，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，等滲劑（例如糖或氯化鈉）可包含在組成物中。可藉由包括吸收延遲劑例如單硬脂酸鋁和明膠來延長可注射組成物的吸收。
可藉由將適量的RNAi構建體（單獨或與配體複合）與所需的任何其他成分（例如以上所述）一起摻入溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，藉由將各種滅菌活性成分摻入無菌媒介物中來製備分散液，該無菌媒介物含有基礎分散介質和所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，合適的製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，其產生一或多種活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液的任何其他所需成分的粉末。
本文提供的組成物可以配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括例如衍生自無機酸（例如鹽酸或磷酸）或衍生自有機酸（例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等）的酸加成鹽（由游離胺基形成）。用游離羧基形成的鹽還可衍生自無機鹼（例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵）或有機鹼（例如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因等）。
例如，對於水溶液中的腸胃外投與，通常將溶液進行適當地緩衝並且首先用例如足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。此類水溶液可用於例如靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內投與。如熟悉該項技術者已知的，理想地使用無菌水性介質。舉例說明，可將單劑量溶於1 ml等滲NaCl溶液中，且添加到1000 ml皮下注射液中或在所建議輸注部位注射（參見例如「Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓製藥科學]」第15版, 第1035-1038頁和第1570-1580頁）。對於人類投與，製劑應符合FDA標準所要求的無菌、產熱原性、一般安全性和純度標準。在某些實施方式中，本文所述之藥物組成物包含無菌鹽水溶液和本文所述之RNAi構建體或由其組成。在其他實施方式中，本文所述之藥物組成物包含本文所述之RNAi構建體和無菌水（例如注射用水，WFI）或由其組成。在仍其他實施方式中，本文所述之藥物組成物包含本文所述之RNAi構建體和磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或由其組成。
在一些實施方式中，藥物組成物與用於投與的裝置一起包裝或儲存於該裝置內。用於可注射配製物的裝置包括但不限於注射口、預填充注射器、自動注射器、注射泵、體內注射器、和注射筆。用於霧化或粉末配製物的裝置包括但不限於吸入器、吹入器、吸氣器等。因此，本揭露包括投與裝置，其包含本文所述之用於治療或預防一或多種本文所述障礙的藥物組成物。 抑制 PNPLA3 表現之方法
本揭露還提供抑制細胞中PNPLA3基因表現之方法。該方法包括將細胞與有效抑制該細胞內的PNPLA3表現的量的RNAi構建體如雙股RNAi構建體接觸，從而抑制PNPLA3於該細胞內的表現。細胞與RNAi構建體例如雙股RNAi構建體的接觸可在體外或體內進行。使細胞在體內與RNAi構建體接觸包括使受試者（例如，人受試者）內的細胞或細胞群與RNAi構建體接觸。接觸細胞的體外和體內方法的組合也在本揭露的範圍內。
本揭露提供用於在有需要的受試者中降低或抑制PNPLA3表現之方法以及治療或預防與PNPLA3表現或活性相關的病症、疾病或障礙之方法。「與PNPLA3表現相關的病症、疾病或障礙」係指其中PNPLA3表現水平發生改變或PNPLA3表現水平升高與發展病症、疾病或障礙的風險增加相關的病症、疾病或障礙。
如上所述，接觸細胞可為直接的或間接的。此外，可以經由靶向配體實現與細胞接觸，該靶向配體包括本文所述或本領域已知的任何配體。在較佳的實施方式中，靶向配體為碳水化合物部分，例如GalNAc3配體或將RNAi構建體引導至目標位點的任何其他配體。
在一個實施方式中，使細胞與RNAi接觸包括藉由促進或實現攝取或吸收入細胞來將該RNAi「引入」或「遞送到該細胞」。吸收或攝取RNAi可以通過無協助擴散過程或主動細胞過程或借助助劑或裝置發生。例如，對於體內引入，可以將RNAi注射到組織部位或全身投與。體外引入細胞可以使用本領域已知的方法完成，例如電穿孔和脂質體轉染。另外的方法在下文中描述和/或在本領域中為已知的。
如本文所用，術語「抑制」可與「降低」、「緘默」、「下調」、「阻抑」和其他類似術語互換使用，且包括任何水平的抑制。
短語「抑制PNPLA3表現」旨在係指抑制任何PNPLA3基因（例如小鼠PNPLA3基因、大鼠PNPLA3基因、猴PNPLA3基因、或人PNPLA3基因）以及PNPLA3基因的變異體或突變體的表現。因此，PNPLA3基因可為野生型PNPLA3基因、突變體PNPLA3基因（例如產生澱粉樣蛋白沈積的突變體PNPLA3基因）、或遺傳操作細胞、細胞群、或有機體背景下的轉基因PNPLA3基因。
「抑制PNPLA3基因的表現」包括任何水平的PNPLA3基因抑制，例如，至少部分阻抑PNPLA3基因的表現。可以基於與PNPLA3基因表現相關的任何變量的水平或水平變化，例如PNPLA3 mRNA水平、PNPLA3蛋白水平、或澱粉樣沈積物的數量或程度來評估PNPLA3基因的表現。可以在單個細胞或細胞群中評估該水平，包括例如衍生自受試者的樣本。
可以藉由與PNPLA3表現相關的一或多個變量的絕對或相對水平與對照水平相比的降低來評估抑制。對照水平可為本領域中使用的任何類型的對照水平，例如，給藥前基線水平、或由未經處理或用對照（例如僅緩衝對照或非活性劑對照）處理的類似受試者、細胞或樣本確定的水平。在一些實施方式中，PNPLA3基因的表現被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
PNPLA3基因表現的抑制可藉由減少由第一細胞或細胞群（這類細胞可存在於例如源自受試者的樣本中）所表現mRNA的量來表現，在該等細胞中PNPLA3被轉錄並且已經經過處理（例如，藉由使一或多個細胞與本文所述之RNAi構建體接觸，或者藉由向正存在或已存在該等細胞的受試者投與本文所述之RNAi構建體），使得與基本上與第一細胞或細胞群相同但尚未經過如此處理的第二細胞或細胞群（對照細胞）相比，PNPLA3基因的表現被抑制。可以藉由使用下式將經處理細胞中的mRNA水平表示為對照細胞中的mRNA水平的百分比來評估抑制：
可替代地，可以根據與PNPLA3基因表現功能性相關的參數的減小來評估PNPLA3基因表現的抑制，該參數例如PNPLA3蛋白表現或Hedgehog途徑蛋白活性。PNPLA3基因緘默可以藉由本領域已知的任何測定在內源性地或重組地表現PNPLA3的任何細胞中確定。
PNPLA3蛋白表現的抑制可以藉由細胞或細胞群表現的PNPLA3蛋白水平（例如，從受試者獲得的樣本中表現的蛋白水平）的降低來證明。如上所述，為評估mRNA阻抑，經處理細胞或細胞群中蛋白質表現水平的抑制可以類似地表示為對照細胞或細胞群中蛋白質水平的百分比。
可用於對PNPLA3基因表現的抑制進行評估的對照細胞或細胞群包括尚未與本文所述之RNAi構建體接觸的細胞或細胞群。例如，在用RNAi構建體對受試者進行治療之前，對照細胞或細胞群可來源於單獨受試者（例如，人或動物受試者）。
可以使用本領域已知用於評估mRNA表現的任何方法（例如上面提到的那些）確定由細胞或細胞群表現的PNPLA3 mRNA水平或循環PNPLA3 mRNA水平。在一些實施方式中，藉由檢測經轉錄多核苷酸或其部分，例如PNPLA3基因的mRNA來確定樣本中的PNPLA3表現水平。在這方面，例如，可以使用RNA提取技術自細胞中提取RNA，該等提取技術包括例如使用酸性酚/異硫氰酸胍提取（RNAzol B；生物起源公司（Biogenesis））、RNeasy RNA製備套組（kit）（凱傑公司（Qiagen））或PAXgene（瑞士普裡阿勒蒂克斯公司（PreAnalytix，Switzerland））。利用核糖核酸雜交的典型測定形式包括核連續測定、RT-PCR、RNA酶保護測定（Melton等人, Nuc. Acids Res.[核酸研究] 12:7035）、RNA印跡、原位雜交、和微陣列分析。可以使用WO 2012/177906中描述的方法檢測循環PNPLA3 mRNA。
在一個實施方式中，使用核酸探針確定PNPLA3表現水平。如本文所用，術語「探針」係指能夠選擇性結合特定PNPLA3序列的任何分子。探針可由熟悉該項技術者合成，或衍生自適當生物製劑。探針可以經專門設計以用於標記。可用作探針的分子之實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體、和有機分子。
經分離的mRNA可用於雜交或擴增測定，該等測定包括但不限於DNA印跡或RNA印跡分析、聚合酶鏈反應（PCR）分析和探針陣列。一種用於確定mRNA水平之方法包括使經分離的mRNA與可與PNPLA3 mRNA雜交的核酸分子（探針）接觸。在一個實施方式中，將mRNA固定於固體表面上且與探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠上運行經分離的mRNA且將mRNA自凝膠轉移至膜，例如硝酸纖維素。在替代性實施方式中，將一或多個探針固定於固體表面上，且使mRNA與一或多個探針接觸，例如在Affymetrix基因晶片陣列中。技術者可以容易地使用適用於確定PNPLA3 mRNA水平的已知mRNA檢測方法。
用於確定樣本中的PNPLA3表現水平的替代性方法包括對樣本中的例如mRNA進行核酸擴增和/或反轉錄酶（以製備cDNA）的過程，例如藉由RT-PCR（參見例如美國專利4,683,202）、連接酶鏈反應（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 88: 189-193）、自我持續序列複製（Guatelli等人 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 87: 1874-1878）、轉錄擴增系統（Kwoh等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 86: 1173-1177）、Q-β複製酶（Lizardi等人 (1988) Bio/Technology [生物技術] 6: 1197）、滾環複製（Lizardi等人, 同上；和美國專利5,854,033）或者任何其他核酸擴增方法，然後使用熟悉該項技術者熟知的技術檢測經擴增的分子。若該等分子以極低數量存在，則該等檢測方案尤其可用於檢測核酸分子。在本揭露的一些方面，PNPLA3的表現水平可以藉由定量螢光RT-PCR（即，TAQMAN™系統）來確定。可以使用膜印跡（例如用於雜交分析，例如RNA印跡、DNA印跡、斑點等）或微孔、樣本管、凝膠、珠粒或纖維（或包含結合核酸的任何固體支持物）來監測PNPLA3 mRNA的表現水平（參見例如美國專利5,445,934；5,677,195；5,770,722；5,744,305；和5,874,219）。PNPLA3表現水平的確定還可包括在溶液中使用核酸探針。在某些實施方式中，使用分支DNA（bDNA）測定或即時PCR（qPCR）評估mRNA表現水平。
可以使用本領域已知用於測量蛋白質水平的任何方法來確定PNPLA3蛋白質表現水平。該等方法包括例如電泳、毛細管電泳、高效液相層析（HPLC）、薄層層析（TLC）、超擴散層析、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色測定、分光亮度測定、流式細胞術、免疫擴散（單或雙）、免疫電泳、西方墨點法、放射免疫測定（RIA）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫螢光測定、電化學發光測定等。
在一些實施方式中，可以藉由檢測或監測PNPLA3疾病症狀的減輕來監測本文所述之方法的功效，例如四肢、面部、喉、上呼吸道、腹部、軀幹、和生殖器的水腫腫脹，前驅徵象；喉腫脹；非瘙癢性皮疹；噁心；嘔吐；或腹痛的減輕。可以使用本領域已知的任何方法在體外或體內評估該等症狀。
在一些實施方式中，將RNAi構建體或包含RNAi構建體的組成物投與於受試者，從而將RNAi構建體遞送至在受試者內的特定部位。可以使用來自受試者內特定部位的液體或組織的樣本中的PNPLA3 mRNA或PNPLA3蛋白水平或水平變化的測量結果來評估PNPLA3表現的抑制。在一些實施方式中，可將RNAi構建體遞送至諸如肝、脈絡叢、視網膜和胰臟的部位。該部位還可為來自任一上述部位的細胞的小部分或子組。該部位還可包括表現特定類型受體的細胞。 治療或預防 PNPLA3 相關疾病之方法
本揭露提供治療和預防方法，包括將RNAi構建體、包含RNAi構建體的組成物（例如藥物組成物）、或包含本文所述之RNAi構建體的載體投與給患有PNPLA3相關疾病、障礙和/或病症或者易於發展PNPLA3相關疾病、障礙和/或病症的受試者。PNPLA3相關疾病的非限制性實例包括例如脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化、肝中的脂肪積累、肝炎症、肝細胞壞死、肝纖維化、肥胖、和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。在一個實施方式中，PNPLA3相關疾病為NAFLD。在另一個實施方式中，PNPLA3相關疾病為NASH。在另一個實施方式中，PNPLA3相關疾病為脂肪肝（脂肪變性）。在另一個實施方式中，PNPLA3相關疾病為胰島素抗性。在另一個實施方式中，PNPLA3相關疾病並非胰島素抗性。
在某些實施方式中，本揭露提供一種用於在有需要患者中降低PNPLA3表現之方法，其包括向患者投與本文所述之任何RNAi構建體。如本文所用，術語「患者」係指哺乳動物，包括人，且可與術語「受試者」互換使用。與未接受RNAi構建體的患者中的PNPLA3表現水平相比，患者肝細胞中的PNPLA3表現水平理想地在投與RNAi構建體後降低。
本文所述之方法可用於治療患有PNPLA3相關疾病的受試者，例如受益於PNPLA3基因表現和/或PNPLA3蛋白產生得以降低的受試者。在一方面中，本揭露提供降低患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的受試者中含Patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）基因表現水平之方法。在另一方面中，本揭露提供降低患有NAFLD的受試者中的PNPLA3蛋白水平之方法。本揭露還提供降低患有NAFLD的受試者中的hedgehog途徑的活性水平之方法。
本文所述之治療方法（和用途）包括向受試者（例如人）投與治療有效量的所揭露的靶向PNPLA3基因的RNAi構建體、包含該RNAi構建體的藥物組成物或包含該RNAi構建體的載體。
在一方面，本揭露提供預防患有NAFLD的受試者中的至少一種症狀之方法，該等症狀例如存在hedgehog傳訊途徑升高、疲勞、虛弱、體重減輕、食慾不振、噁心、腹痛、蜘蛛樣血管、皮膚和眼睛發黃（黃疸）、瘙癢、腿部液體積聚和腫脹（水腫）、腹部腫脹（腹水）、和精神錯亂。該方法包括向受試者投與預防有效量的RNAi構建體，例如dsRNA，包含RNAi構建體的藥物組成物，或編碼RNAi構建體的載體，從而預防患有將受益於PNPLA3基因表現降低的障礙的受試者中的至少一種症狀。「預防有效量」係指在必要的劑量和時間段下有效實現期望的預防結果（例如，預防疾病發作）的量。
在另一方面中，本揭露提供了治療有效量的本文所述之RNAi構建體用於治療受試者（例如將受益於PNPLA3基因表現的降低和/或抑制的受試者）之用途。在另一方面中，本揭露提供靶向PNPLA3基因的RNAi構建體例如dsRNA或包含靶向PNPLA3基因的RNAi構建體的藥物組成物在製備用於治療受試者的藥物中之用途，該受試者例如受益於PNPLA3基因表現和/或PNPLA3蛋白產生的降低和/或抑制的受試者，例如患有將受益於PNPLA3基因表現降低的障礙例如PNPLA3相關疾病的受試者。
本揭露提供RNAi構建體（例如dsRNA）用於預防患有可受益於PNPLA3基因表現和/或PNPLA3蛋白質產生的降低和/或抑制的障礙的受試者中的至少一種症狀之用途。例如，本揭露提供本文所述之RNAi構建體、包含其的組成物和包含其的載體在治療NAFLD中之用途。
在另一方面，本發明提供所揭露的RNAi構建體、包含其的組成物或包含其的載體在製備藥物中之用途，該藥物用於預防患有受益於PNPLA3基因表現和/或PNPLA3蛋白質產生的降低和/或抑制的障礙例如PNPLA3相關疾病的受試者中的至少一種症狀。
在一個實施方式中，將靶向PNPLA3的RNAi構建體投與至患有PNPLA3相關疾病（例如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））的受試者，使得當將RNAi構建體投與至受試者時，PNPLA3基因例如在受試者的細胞、組織、血液或其他組織或液體中的表現降低至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%、或更多。
本文提供的方法和用途包括投與本文所述之組成物，以使靶PNPLA3基因的表現降低持續任何合適的時間量，例如持續約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或約80小時。在一個實施方式中，靶PNPLA3基因的表現降低延長的持續時間，例如至少約兩天、三天、四天、五天、六天、七天或更多天，例如約一週、兩週、三週、或約四週或更長時間。
根據本文所述之方法和用途的RNAi構建體的投與，可導致在患有PNPLA3相關疾病（例如NAFLD）的患者的這類疾病或障礙的嚴重性、體征、症狀和/或標誌物的降低。在這種情況下，「降低」係指此水平的統計學顯著降低。降低可為例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。可以例如藉由測量疾病進展、疾病緩解、症狀嚴重程度、疼痛減輕、生活品質、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標誌物或適用於所治療或靶向預防的特定疾病的任何其他可測量參數的水平來評估疾病的治療或預防功效。藉由測量該等參數中的任一個或任何參數組合來監測治療或預防功效為在熟悉該項技術者的能力範圍內。例如，可以例如藉由定期監測NAFLD症狀、肝脂肪水平或下游基因的表現來評估NAFLD治療功效。後續讀數與初始讀數的比較為醫生提供治療是否有效的指示。藉由測量該等參數中的任一個或任何參數組合來監測治療或預防功效為在熟悉該項技術者的能力範圍內。與靶向PNPLA3的RNAi或其藥物組成物的投與結合，「有效對抗」PNPLA3相關疾病表明以臨床上適當的方式投與至少對患者的統計學顯著部分產生有益效果，例如改善症狀、治癒、疾病減輕、生命延長、生活品質改善、或熟悉治療NAFLD和/或PNPLA3相關疾病和相關病因的醫生普遍認為是積極的其他效果。
當疾病症態的一或多個參數得到統計學顯著改善時，或者由於未能惡化或在其他情況下預期會出現症狀時，治療或預防效果明顯。例如，在可測量疾病參數中，至少10%，較佳的是至少20%、30%、40%、50%或更多有利變化可以指示有效治療。還可以使用本領域已知的針對給定疾病的實驗動物模型來判斷給定RNAi藥物或該藥物的配製物的功效。當使用實驗動物模型時，當觀察到標誌物或症狀的統計學顯著降低時，證明了治療功效。
可以向受試者投與任何治療有效量的RNAi構建體。RNAi構建體的示例性治療有效量包括但不限於0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.3 mg/kg、0.35 mg/kg、0.4 mg/kg、0.45 mg/kg、0.5 mg/kg、0.55 mg/kg、0.6 mg/kg、0.65 mg/kg、0.7 mg/kg、0.75 mg/kg、0.8 mg/kg、0.85 mg/kg、0.9 mg/kg、0.95 mg/kg、1.0 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、1.6 mg/kg、1.7 mg/kg、1.8 mg/kg、1.9 mg/kg、2.0 mg/kg、2.1 mg/kg、2.2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.4 mg/kg、2.5 mg/kg、2.6 mg/kg、2.7 mg/kg、2.8 mg/kg、2.9 mg/kg、3.0 mg/kg、3.1 mg/kg、3.2 mg/kg、3.3 mg/kg、3.4 mg/kg、3.5 mg/kg、3.6 mg/kg、3.7 mg/kg、3.8 mg/kg、3.9 mg/kg、4.0 mg/kg、4.1 mg/kg、4.2 mg/kg、4.3 mg/kg、4.4 mg/kg、4.5 mg/kg、4.6 mg/kg、4.7 mg/kg、4.8 mg/kg、4.9 mg/kg、5.0 mg/kg、5.1 mg/kg、5.2 mg/kg、5.3 mg/kg、5.4 mg/kg、5.5 mg/kg、5.6 mg/kg、5.7 mg/kg、5.8 mg/kg dsRNA、5.9 mg/kg、6.0 mg/kg、6.1 mg/kg、6.2 mg/kg、6.3 mg/kg、6.4 mg/kg、6.5 mg/kg、6.6 mg/kg、6.7 mg/kg、6.8 mg/kg、6.9 mg/kg、7.0 mg/kg、7.1 mg/kg、7.2 mg/kg、7.3 mg/kg、7.4 mg/kg、7.5 mg/kg、7.6 mg/kg、7.7 mg/kg、7.8 mg/kg、7.9 mg/kg、8.0 mg/kg、8.1 mg/kg、8.2 mg/kg、8.3 mg/kg、8.4 mg/kg、8.5 mg/kg、8.6 mg/kg、8.7 mg/kg、8.8 mg/kg、8.9 mg/kg、9.0 mg/kg、9.1 mg/kg、9.2 mg/kg、9.3 mg/kg、9.4 mg/kg、9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg、9.0 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg或約50 mg/kg。在一個實施方式中，可以向受試者投與0.5 mg/kg的RNAi構建體。所述值的中間值和範圍也包括在本揭露中。
投與RNAi構建體或包含其的組成物可以將例如在患者的細胞、組織、血液、尿液或其他隔室中的PNPLA3蛋白水平的存在降低至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%或更多。
在投與全劑量RNAi之前，可以向患者投與較小劑量，例如5%輸注，且監測不良反應，例如過敏反應。在另一實例中，可以監測患者的不想要的免疫刺激效果，例如提高的細胞介素（例如，TNF-α或INF-α）水平。
由於對PNPLA3表現的抑制作用，根據本揭露的組成物或由其製備的藥物組成物可以提高生活品質。
本文所述之RNAi可以「裸」形式投與，其中經修飾或未經修飾的RNAi構建體直接懸浮在水性或合適緩衝溶劑中，作為「游離RNAi」。在不存在藥物組成物的情況下投與游離RNAi。游離RNAi可以處於合適的緩衝溶液中。緩衝溶液可包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、穀醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽、或其任何組合。在一個實施方式中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。可以調節含有RNAi的緩衝溶液的pH和重量莫耳滲透壓濃度，使其適合投與至受試者。
可替代地，本文所述之RNAi可以作為藥物組成物，例如dsRNA脂質體配製物投與。
受益於PNPLA3基因表現的降低和/或抑制的受試者為患有如本文所述之非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和/或PNPLA3相關疾病或障礙的受試者。
對受益於PNPLA3基因表現的降低和/或抑制的受試者的治療包括治療性和預防性治療。
本揭露進一步提供用於治療受益於PNPLA3基因表現的降低和/或抑制的受試者（例如，患有PNPLA3相關疾病的受試者）之方法和RNAi構建體或其藥物組成物與其他藥物和/或其他治療方法（例如與已知藥物和/或已知治療方法，例如目前用於治療該等障礙的那些藥物和/或方法）組合以用於治療受益於PNPLA3基因表現的降低和/或抑制的受試者之用途。
例如，在某些實施方式中，靶向PNPLA3基因的RNAi與例如可用於治療PNPLA3相關疾病的藥劑組合投與。例如，適用於治療受益於PNPLA3表現降低的受試者，例如患有PNPLA3相關疾病的受試者的其他治療劑和治療方法，包括靶向PNPLA3基因的不同部分的RNAi構建體、治療劑、和/或用於治療PNPLA3相關疾病的程序、或任何前述的組合。
在某些實施方式中，靶向PNPLA3基因的第一RNAi構建體與靶向PNPLA3基因的不同部分的第二RNAi構建物組合投與。例如，第一RNAi構建體可包含形成雙股區的第一有義股和第一反義股，其中所述第一有義股的基本上全部的核苷酸和第一反義股的基本上全部的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中所述第一有義股軛合至在3'-末端所附接的配體，並且其中該配體係經由二價或三價分支狀連接子而附接的一或多種GalNAc衍生物；並且第二RNAi構建體可包含形成雙股區的第二有義股和第二反義股，其中第二有義股的基本上全部的核苷酸和第二反義股的基本上全部的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中第二有義股軛合至在3'-末端所附接的配體，並且其中配體係經由二價或三價分支狀連接子而附接的一或多種GalNAc衍生物。在一個實施方式中，第一和第二有義股的所有核苷酸和/或第一和第二反義股的所有核苷酸均包含修飾。經修飾的核苷酸可為本文所述之經修飾的核苷酸中的任何一種或組合。
在其他實施方式中，靶向PNPLA3基因的第一RNAi構建體與靶向不同於PNPLA3基因的基因的第二RNAi構建物組合投與。例如，靶向PNPLA3基因的RNAi構建體可以與靶向SCAP基因的RNAi構建體組合投與。SCAP（SREBP切割激活蛋白）係SREBP家族的轉錄因子的僅有的已知調控因子。SREBP（固醇反應元件結合蛋白）家族在對於從頭脂肪生成和三酸甘油脂（TG）在肝內累積的調控中發揮了重要作用。靶向PNPLA3基因的第一RNAi構建體和靶向不同的基因（例如SCAP基因）的第二RNAi構建物可以作為同一藥物組成物的一部分投與。可替代地，靶向PNPLA3基因的第一RNAi構建體和靶向不同的基因（例如SCAP基因）的第二RNAi構建物可以作為不同藥物組成物的一部分投與。
RNAi構建體和另外的治療劑和/或治療可在相同時間和/或以相同組合例如進行腸胃外投與，或者可以將另外的治療劑作為單獨組成物的一部分或者在單獨的時間和/或利用本領域中已知或本文所描述的另一種方法而投與。
本揭露還提供使用RNAi構建體和/或含有RNAi構建體的組成物來降低和/或抑制細胞中PNPLA3表現（基因或蛋白質表現）之方法。在其他方面，提供RNAi構建體和/或包含RNAi構建體的組成物在製備用於降低和/或抑制細胞中PNPLA3基因表現的藥物中之用途。在其他方面，本揭露提供本文所述之RNAi和/或包含本文所述之RNAi構建體的組成物，用於減少降低和/或抑制細胞中PNPLA3蛋白的產生。在其他方面，提供RNAi構建體和/或包含RNAi構建體的組成物在製備用於降低和/或抑制細胞中PNPLA3蛋白產生的藥物中之用途。該等方法和用途包括使細胞與RNAi構建體（例如dsRNA）接觸，且將細胞維持足夠時間以獲得PNPLA3基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制PNPLA3基因的表現或抑制細胞中的PNPLA3蛋白質產生。基因表現的降低可以藉由本領域已知的或本文所述之用於確定mRNA或蛋白質水平的任何方法來評估。
在本文所述之方法和用途中，可以在體外或體內接觸細胞，即細胞可以在受試者外部（例如，在細胞培養物中）或在受試者體內。適用於使用本文所述之方法進行處理的細胞可為表現PNPLA3基因的任何細胞，例如來自患有NAFLD的受試者的細胞或包含含有PNPLA3基因或PNPLA3基因的部分的表現載體的細胞。用於所揭露的方法中的合適細胞包括例如哺乳動物細胞，例如靈長類動物細胞（例如人細胞或非人靈長類動物細胞，例如猴細胞或黑猩猩細胞）、非靈長類細胞（如牛細胞、豬細胞、駱駝細胞、美洲駝細胞、馬細胞、山羊細胞、兔細胞、綿羊細胞、倉鼠、豚鼠細胞、貓細胞、狗細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、獅子細胞、老虎細胞、熊細胞、或水牛細胞）、鳥類細胞（例如鴨細胞或鵝細胞）、或鯨細胞。在一個實施方式中，細胞係人細胞。
PNPLA3基因表現可在細胞中被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
PNPLA3蛋白產生可以在細胞中被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
本文所述之體內方法和用途可以包括向受試者投與含有RNAi構建體的組成物，其中RNAi構建物包括與受試者的PNPLA3基因的RNA轉錄物的至少一部分互補的核苷酸序列。當待治療的生物體為人時，該組成物可以藉由本領域已知的任何方式投與，包括但不限於皮下、靜脈內、口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內（例如，腦室內、實質內和鞘內）、肌內、透皮、氣道（氣溶膠）、鼻腔、直腸和局部（包括口腔和舌下）投與。在某些實施方式中，組成物藉由皮下或靜脈內輸注或注射投與。在一個實施方式中，組成物藉由皮下注射投與。
在一些實施方式中，經由長效注射投與。長效注射可以在延長的時間段內以一致方式釋放RNAi構建體。因此，長效注射可減少獲得所需效果，例如所需PNPLA3抑制或治療或預防效果所需要的給藥頻率。長效注射還可以提供更一致的血清濃度。長效注射可包括皮下注射或肌內注射。在一些實施方式中，長效注射為皮下注射。
在一些實施方式中，通過泵投與。泵可為外部泵或外科植入泵。在某些實施方式中，泵為皮下植入滲透泵。在其他實施方式中，泵為輸注泵。輸注泵可用於靜脈內、皮下、動脈或硬膜外輸注。在較佳的實施方式中，輸注泵為皮下輸注泵。在其他實施方式中，泵為將RNAi遞送至受試者的外科植入泵。
可以基於是否需要局部或全身治療且基於待治療的區域來選擇投與方式。可以選擇投與途徑和投與部位以增強靶向。
該等方法和用途包括向哺乳動物（例如人）投與包含靶向哺乳動物細胞中的PNPLA3基因的RNAi構建體（例如siRNA）的組成物且維持哺乳動物足夠時間以獲得PNPLA3基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制哺乳動物中的PNPLA3基因的表現。基因表現和/或蛋白質表現的降低可以藉由本領域已知或本文所述之任何方法在獲自投與RNAi構建體的受試者的樣本中評估。在一個實施方式中，組織樣本用作組織材料，用於監測PNPLA3基因和/或蛋白質表現的減少。在另一個實施方式中，血液樣本用作組織材料，用於監測PNPLA3基因和/或蛋白質表現的減少。
在一些實施方式中，可以藉由執行5'-RACE或本領域中已知方案的修改來評估在投與RNAi構建體後RISC介導的靶mRNA（例如，PNPLA3 mRNA）體內切割的驗證（Lasham A等人, (2010) Nucleic Acid Res.[核酸研究], 38 (3) p-el9; 和Zimmermann等人 (2006) Nature[自然] 441: 111-4）。
應當理解，本文揭露的所有核糖核酸序列可以藉由用胸腺嘧啶鹼基取代序列中的尿嘧啶鹼基而轉化為去氧核糖核酸序列。同樣地，本文揭露的所有去氧核糖核酸序列可以藉由用尿嘧啶鹼基取代序列中的胸腺嘧啶鹼基而轉化為核糖核酸序列。本揭露涵蓋去氧核糖核酸序列、核糖核酸序列和含有本文揭露的所有序列的去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的序列。
另外地，本文揭露的任何核酸序列可以用化學修飾的任何組合進行修飾。熟悉該項技術者將容易理解，在某些情況下，描述經修飾的多核苷酸的命名諸如「RNA」或「DNA」為任意的。例如，包含在核糖上具有2'-OH取代基的核苷酸和胸腺嘧啶鹼基的多核苷酸可以被描述為具有經修飾的糖的DNA分子（對於DNA的天然2'-H為2'-OH）或具有經修飾的鹼基的RNA分子（對於RNA的天然尿嘧啶為胸腺嘧啶（甲基化尿嘧啶））。
因此，本文提供的核酸序列（包括但不限於序列表中所示的核酸序列）旨在涵蓋含有天然或經修飾RNA和/或DNA的任何組合的核酸，包括但不限於具有經修飾核苷鹼基的該等核酸。作為另一個實例且為非限制性，具有序列「ATCGATCG」的多核苷酸涵蓋具有經修飾或未經修飾的此序列的任何多核苷酸，包括但不限於包含RNA鹼基的化合物，例如具有序列「AUCGAUCG」的那些化合物、和具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基的那些化合物（例如「AUCGATCG」）、和具有其他經修飾鹼基的多核苷酸（例如「ATmeCGAUCG」），其中meC表示在5-位包含甲基的胞嘧啶鹼基。
以下實例，包括所進行的實驗和所實現的結果，僅用於說明目的，且不應解釋為限制所附申請專利範圍的範疇。 實例
本文描述的所有動物實驗均經過美商安進公司的動物保護和使用委員會（IACUC）批准，並根據實驗室動物護理和使用指南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）第8版（美國國家研究委員會（National Research Council (U.S.)））進行護理。實驗室動物護理與使用指南更新委員會、美國實驗室動物研究所、和美國國家科學院出版社 (2011) Guide for the care and use of laboratory animals [實驗室動物的護理與使用指南].第8版, 國家科學院出版社, 華盛頓特區。將小鼠在有12小時光照；12小時黑暗週期（0600-1800小時）的22°C±2°C空調房內單獨收容。除非另有說明，否則動物可隨意獲得常規食物（Envigo公司，2920X；或另外規定的食物）且通過自動澆水系統獲得水（反滲透純化）。在結束時，在深度麻醉下藉由心臟穿刺收集血液，且然後根據實驗室動物護理評估和認證協會（AAALAC）指南，藉由二次物理方法實施安樂死。 實例 1 ：經修飾的 PNPLA3 siRNA 分子的選擇、設計和合成
使用人PNPLA3轉錄物（GenBank登錄號NM_025225.2）的生物資訊學分析進行鑒定，鑒定和選擇靶向含patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）的治療性siRNA分子的最佳序列。生物資訊學分析在整個PNPLA3轉錄物中鑒定了超過450個合適的人/石蟹獼猴觸發器，並揭示了大約4,500 bp的延伸3’ UTR，其仍有待探索。表1列出了被鑒定為具有治療特性的PNPLA3 mRNA靶序列。
合成了超過600個針對表1中所列序列的siRNA分子，並對該等序列進行了修飾以包括單一化學修飾，以提高PNPLA3 siRNA序列的效力和體內穩定性。每個未修飾和經修飾的PNPLA3 siRNA的有義和反義序列如圖1和圖2所示。
生成了一組194種對人和石蟹獼猴（人/石蟹獼猴）PNPLA3跨編碼區（CDR）和注釋的3' UTR具有選擇性的siRNA分子（或「觸發器」），以及另外162個靶向延伸的3’ UTR的人/石蟹獼猴觸發器和64個人/絨猿觸發器。還製備了靶向編碼區域的僅人觸發器。 實例 2 ：所選擇 PNPLA3 siRNA 分子在 RNA FISH 測定中的功效
在實例1中合成的具有單一修飾模式的siRNA分子（如圖1所示）在體外siRNA轉染測定中進行篩選，隨後進行靶向核糖核酸分子的螢光原位雜交測定（RNA FISH）以確定IC 50和最大活性值。HepG2細胞（購自ATCC）在補充有10%胎牛血清（FBS，西格瑪公司（Sigma））和1%青黴素-鏈黴素（P-S，康寧公司（Corning））的ATCC最低必需培養基EMEM中培養。
siRNA轉染如下進行：藉由Bravo Automated Liquid Handling（安捷倫公司（Agilent）），將1 μL測試siRNA和4 μL普通EMEM添加到PDL塗層的CellCarrier-384 Ultra測定板（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））中。然後，藉由Multidrop Combi試劑分配器（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）），將在EMEM中預稀釋的5 μL的Lipofectamine RNAiMAX（賽默飛世爾科技公司）（具體地在5 μL EMEM中的0.06 μL的RNAiMAX）分配入測定板中。在室溫（RT）下孵育siRNA/RNAiMAX混合物20分鐘後，使用Multidrop Combi試劑分配器，將補充有10% FBS和1% P-S的EMEM中的30 μL HepG2細胞（每孔2000個細胞）添加至轉染複合物中。將測定板在RT下孵育20分鐘，然後置於培養箱中。然後將細胞在37°C和5% CO 2下孵育72小時。
使用Affymetrix QUANTIGENE® View RNA HC篩選測定套組（QVP0011）、Affymetrix View HC信號擴增套組3-plex（QVP0213）、和以下Affymetrix基因特異性探針進行RNA FISH測定：人PNPLA3（VA6-20279-01）和人PPIB（VA1-10148-01），遵循製造商的協議，使用內部組裝的自動化FISH檢測平臺進行液體處理。
簡言之，將細胞在4%甲醛（賽默飛世爾科技公司）中在RT下固定15分鐘，在RT下用洗滌劑透化3分鐘，且然後在RT下用蛋白酶溶液處理10分鐘。PNPLA3和PPIB探針對的孵育進行3小時，而對於預擴增子、擴增子和標記探針各為1小時。所有雜交步驟均在40°C下在Cytomat 2 C-LIN自動培養箱（賽默飛世爾科技公司）中進行。在雜交反應後，將細胞用Hoechst和CellMask Blue（賽默飛世爾科技公司）染色30分鐘。
在Opera Phenix高含量篩選系統（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））上，使用針對Hoechst 33342和Cell Mask Blue的UV通道、針對PPIB探針的488通道、和針對PNPLA3探針的647通道，對所有板成像。
使用Columbus圖像數據存儲和分析系統（珀金埃爾默公司）分析圖像以獲得平均斑點計數/細胞。使用高（含有磷酸鹽緩衝鹽水，康寧公司）和低（無靶探針對）對照孔對斑點計數進行歸一化。繪製相對於總siRNA濃度的歸一化值，且將數據擬合到Genedata Screener（基因子據公司（Genedata））中的四參數S形模型以獲得IC 50和最大活性。生成的所有siRNA的結果如表2所示。表3顯示了跨PNPLA3 CDR和注釋的3' UTR的194個人/石蟹獼猴siRNA分子的組的結果。表4顯示了162個人/石蟹獼猴siRNA分子的組的結果，該等分子靶向延伸的3' UTR，表5顯示了64個人/絨猿siRNA分子的組的結果。
PNPLA3敲低提供與對照相比的敲低百分比。負值表示PNPLA3水平下降。22個siRNA觸發器實現了＞ 75%的mRNA敲低。相比之下，針對PNPLA3 I148M的次要等位基因特異性siRNA（描述於WO 2020/123508）將PNPLA3 mRNA的表現降低了約81%。前48個觸發器作為GalNAc-siRNA軛合物被合成。 [表2]
雙鏈體編號 PNPLA3 位置 % 平均最大活性 平均 IC 50 （ nM ）
44956-1 1233 -97.0 1.61
45212-1 571 -90.8 16.80
44928-1 1367 -90.5 1.39
44912-1 449 -88.2 1.99
45207-1 1564 -87.8 9.98
45221-1 1379 -86.7 38.80
44911-1 445 -85.8 1.37
41946-1 844 -85.8 1.59
44957-1 1234 -84.3 0.33
42048-1 1561 -83.6 1.92
41955-1 909 -82.8 3.84
37781-1 698 -82.7 2.69
44939-1 991 -82.5 17.70
42064-1 1240 -82.3 1.21
44908-1 396 -82.3 2.88
41921-1 574 -81.9 2.43
37893-1 768 -81.8 5.28
41932-1 692 -81.1 5.52
37600-1 347 -80.9 1.77
37930-1 1219 -80.9 2.11
38215-1 2198 -80.2 1.78
45218-1 1184 -79.8 19.00
37785-1 704 -79.6 1.85
37744-1 391 -79.6 2.68
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41293-1 6637 -44.7 0.72
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37856-1 1320 -42.6 3.47
45264-1 197 -42.5 未定義
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37857-1 1321 -40.7 1.62
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45248-1 1439 -39.7 45.30
45236-1 402 -39.7 未定義
42053-1 985 -39.6 未定義
37879-1 1857 -39.6 未定義
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41286-1 6670 -33.6 0.38
40808-1 4186 -33.5 未定義
40780-1 3794 -33.1 1.49
40878-1 4484 -33.1 7.66
40785-1 3851 -33.0 3.36
41297-1 6613 -32.9 0.39
45209-1 1038 -32.6 未定義
40875-1 4402 -32.2 3.47
41173-1 2639 -32.2 4.98
41051-1 6157 -32.1 1.39
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41415-1 5774 -31.6 0.93
41154-1 722 -31.4 1.72
40805-1 4139 -31.3 2.89
41044-1 5692 -31.3 0.33
37780-1 679 -31.1 40.40
41306-1 4097 -31.0 1.16
41159-1 1137 -30.9 0.30
37855-1 1319 -30.8 ＞100
40797-1 4020 -30.7 1.24
41160-1 1162 -30.6 2.11
41045-1 5705 -30.5 未定義
41068-1 6575 -30.4 1.82
44941-1 1003 -30.3 18.20
40902-1 5569 -30.1 1.05
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40896-1 4965 -29.9 未定義
41054-1 6201 -29.3 0.76
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41033-1 5668 -29.0 2.21
37590-1 334 -28.3 ＞100
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45237-1 448 -28.2 未定義
41292-1 6638 -28.0 0.44
45240-1 1006 -27.9 未定義
37898-1 866 -27.7 ＞100
41411-1 5823 -27.5 未定義
45222-1 194 -27.3 未定義
40803-1 4137 -27.2 2.73
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40880-1 4488 -26.2 1.92
40816-1 4259 -25.9 4.50
41302-1 6158 -25.8 1.97
37596-1 340 -25.5 ＞100
37914-1 904 -25.2 未定義
41032-1 5641 -25.1 2.63
40881-1 4491 -25.1 1.40
37598-1 343 -24.8 ＞100
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41416-1 5773 -24.5 ＞100
41038-1 5673 -23.7 ＞33.3
40786-1 3853 -23.4 ＞33.3
41062-1 6280 -23.2 未定義
40811-1 4199 -23.1 ＞100
45235-1 364 -23.0 ＞100
37556-1 115 -22.8 ＞100
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40793-1 3921 -22.5 ＞100
40781-1 3795 -22.4 ＞100
45226-1 317 -22.2 ＞100
44931-1 1435 -21.9 ＞100
40813-1 4203 -21.9 ＞100
45254-1 358 -21.8 ＞100
45255-1 356 -21.5 ＞100
45243-1 1239 -21.4 ＞100
40809-1 4191 -20.7 3.46
41417-1 5772 -20.6 ＞100
40895-1 4963 -20.5 ＞100
40890-1 4905 -20.1 ＞100
45230-1 783 -19.8 ＞100
40799-1 4129 -19.4 ＞33.3
40801-1 4132 -19.4 ＞100
45214-1 792 -19.4 ＞100
41930-1 688 -19.2 ＞100
45234-1 355 -18.7 ＞100
40876-1 4403 -18.7 ＞100
37900-1 868 -18.6 ＞100
41058-1 6267 -18.5 ＞100
41055-1 6202 -18.1 ＞100
41063-1 6503 -17.9 0.69
41165-1 2190 -17.9 ＞100
45206-1 492 -17.8 ＞100
41041-1 5679 -17.5 ＞100
42057-1 1009 -16.9 ＞100
40870-1 4361 -16.8 ＞100
37592-1 336 -16.7 ＞100
37589-1 329 -16.5 ＞100
37854-1 1318 -16.4 ＞100
40897-1 4966 -16.4 ＞100
45242-1 1235 -16.3 ＞100
42058-1 1040 -16.2 ＞100
45238-1 1501 -16.1 ＞100
38207-1 112 -15.7 ＞100
41143-1 269 -15.7 0.43
41423-1 4160 -15.6 ＞100
40807-1 4184 -15.2 ＞100
40905-1 5576 -15.0 ＞100
41061-1 6279 -14.6 ＞100
41056-1 6243 -14.3 ＞100
40778-1 3776 -14.2 ＞100
37591-1 335 -14.2 ＞100
40889-1 4904 -13.7 ＞100
37887-1 757 -13.4 1.18
40901-1 5215 -12.9 ＞100
40802-1 4135 -12.8 ＞100
45260-1 318 -12.6 ＞100
40879-1 4487 -12.5 ＞100
42051-1 1614 -12.3 ＞100
40863-1 4283 -12.3 ＞100
40877-1 4404 -12.1 ＞100
37923-1 1121 -11.5 ＞100
45253-1 395 -11.3 ＞100
40800-1 4130 -11.0 ＞100
41035-1 5670 -10.6 ＞100
45208-1 327 -10.3 ＞100
45251-1 1354 -10.0 ＞100
44934-1 1497 -9.8 ＞100
45245-1 1264 -9.4 ＞100
37577-1 254 -8.7 ＞100
45262-1 315 -8.5 ＞100
40794-1 3923 -8.5 ＞100
41060-1 6271 -7.7 ＞100
41167-1 2193 -7.6 ＞100
41940-1 788 -7.6 ＞100
40886-1 4901 -7.4 ＞100
45261-1 467 -7.3 ＞100
40814-1 4251 -7.2 ＞100
40869-1 4360 -7.1 ＞100
40867-1 4291 -6.6 ＞100
45228-1 601 -6.4 ＞100
37902-1 870 -6.1 ＞100
45227-1 321 -6.1 ＞100
37860-1 1399 -6.0 ＞100
41430-1 21 -5.5 ＞100
40871-1 4362 -4.7 ＞100
44936-1 1520 -4.3 ＞100
41172-1 2274 -4.2 ＞100
44913-1 450 -3.2 ＞100
40908-1 5600 -3.0 ＞100
41429-1 22 -2.6 ＞100
45252-1 446 -2.1 ＞100
37576-1 253 -2.0 ＞100
45223-1 452 -1.8 ＞100
41047-1 5740 -0.9 ＞100
40798-1 4095 -0.8 ＞100
41427-1 257 -0.7 ＞100
45231-1 843 -0.6 ＞100
40815-1 4254 -0.6 ＞100
45205-1 491 -0.5 ＞100
40812-1 4202 -0.4 ＞100
37778-1 673 0.3 ＞100
37573-1 249 0.5 ＞100
42036-1 1417 0.9 ＞100
40904-1 5575 2.2 ＞100
40894-1 4962 2.3 ＞100
37555-1 113 3.6 ＞100
37579-1 281 3.7 ＞100
40872-1 4363 4.2 ＞100
37894-1 769 5.0 ＞100
40819-1 4262 5.4 ＞100
41141-1 143 5.4 ＞100
41938-1 781 5.4 ＞100
41148-1 586 5.5 ＞100
41064-1 6568 5.5 ＞100
41144-1 420 6.9 ＞100
41303-1 6154 8.5 ＞100
45224-1 489 8.7 ＞100
40874-1 4398 9.5 ＞100
45244-1 1248 10.3 ＞100
41140-1 138 10.5 ＞100
40787-1 3854 11.5 ＞100
41036-1 5671 11.6 ＞100
42068-1 1269 12.4 ＞100
44933-1 1451 13.6 ＞100
37575-1 252 13.8 ＞100
40862-1 4263 14.2 ＞100
41929-1 615 15.9 ＞100
41164-1 2189 20.4 ＞100
41428-1 142 21.1 ＞100
41304-1 5691 21.2 ＞100
40804-1 4138 34.1 ＞100
41412-1 5822 34.3 ＞100
41067-1 6574 36.3 ＞100
40873-1 4369 37.6 ＞100
41037-1 5672 38.0 ＞100
41425-1 262 39.7 ＞100
41034-1 5669 40.4 ＞100
41926-1 603 46.7 ＞100
[表3]. 使用人/石蟹獼猴跨PNPLA3 siRNA進行的RNA FISH測定
雙鏈體編號 PNPLA3 位置 PNPLA3 敲低（ % ）
38207-1 112 -15.7
37555-1 113 3.6
37556-1 115 -22.8
37557-1 121 -47.0
37558-1 122 -26.7
37559-1 204 -45.8
37560-1 205 -45.4
37561-1 206 -62.2
37562-1 207 -49.8
37563-1 211 -74.7
37564-1 212 -38.1
37565-1 213 -58.1
37566-1 219 -36.7
37567-1 220 -73.0
37568-1 243 -57.9
37569-1 244 -59.8
37570-1 245 -61.7
37571-1 246 -50.5
37572-1 248 -50.5
37573-1 249 0.5
37574-1 251 -50.2
37575-1 252 13.8
37576-1 253 -2.0
37577-1 254 -4.4
37578-1 272 -54.5
37579-1 281 3.7
37580-1 291 -59.1
37581-1 293 -58.8
37582-1 294 -40.9
37583-1 302 -60.6
37584-1 303 -56.1
37585-1 305 -60.3
37586-1 306 -59.3
37587-1 307 -60.3
37588-1 309 -76.4
37589-1 329 -17.8
37590-1 334 -28.3
37591-1 335 -14.2
37592-1 336 -16.7
37593-1 337 -54.8
37594-1 338 -57.6
37595-1 339 -61.5
37596-1 340 -25.5
37597-1 341 -51.0
37598-1 343 -24.8
37599-1 344 -45.2
37600-1 347 -80.9
37743-1 369 -32.7
37744-1 391 -79.6
37745-1 392 -77.0
37746-1 411 -39.2
37747-1 412 -49.6
37748-1 413 -43.2
37749-1 414 -45.9
37750-1 415 -57.5
37751-1 416 -38.8
37752-1 419 -44.8
37753-1 497 -64.9
37754-1 555 -62.1
37755-1 556 -50.5
37756-1 557 -65.0
37757-1 560 -65.1
37758-1 562 -71.2
37759-1 563 -71.0
37760-1 564 -63.4
37761-1 567 -60.0
37762-1 568 -69.1
37763-1 590 -75.3
37764-1 591 -62.3
37765-1 593 -73.7
37766-1 595 -48.8
37767-1 641 -66.7
37768-1 660 -49.3
37769-1 661 -47.3
37770-1 662 -71.3
37771-1 663 -36.4
37772-1 664 -45.3
37773-1 665 -37.2
37774-1 666 -52.6
37775-1 667 -50.3
37776-1 669 -53.7
37777-1 671 -67.5
37778-1 673 0.3
37779-1 675 -60.1
37780-1 679 -39.6
37781-1 698 -76.0
37782-1 701 -69.3
37783-1 702 -45.7
37784-1 703 -50.3
37785-1 704 -79.6
37786-1 705 -76.4
37787-1 706 -74.2
37788-1 708 -57.5
37789-1 756 -76.5
37887-1 757 -13.4
37888-1 762 -65.0
38208-1 763 -60.4
37889-1 764 -77.7
37890-1 765 -63.3
37891-1 766 -59.8
37892-1 767 -72.3
37893-1 768 -81.8
37894-1 769 5.0
37895-1 770 -53.3
37896-1 805 -59.8
37897-1 832 -67.6
37898-1 866 -27.7
37899-1 867 -48.3
37900-1 868 -18.6
37901-1 869 -42.7
37902-1 870 -6.1
37903-1 878 -66.8
37904-1 886 -40.8
37905-1 887 -63.8
37906-1 889 -56.8
37907-1 893 -75.8
37908-1 894 -72.3
37909-1 895 -66.1
37910-1 896 -59.7
38213-1 897 -67.8
37911-1 898 -59.1
37912-1 899 -66.7
37913-1 902 -70.8
37914-1 904 -25.2
37915-1 905 -67.7
37917-1 939 -45.1
38214-1 1092 -71.3
37919-1 1094 -49.6
38209-1 1095 -51.0
37920-1 1101 -63.5
37921-1 1104 -63.1
37923-1 1121 -11.5
37924-1 1125 -39.0
38210-1 1189 -71.2
37926-1 1200 -45.0
37927-1 1201 -69.1
38211-1 1210 -39.9
37929-1 1213 -67.6
38212-1 1217 -66.6
37930-1 1219 -80.9
37932-1 1220 -72.9
37841-1 1221 -46.5
37842-1 1223 -73.3
37843-1 1224 -74.8
37844-1 1225 -58.0
37845-1 1226 -73.0
37846-1 1280 -74.1
37847-1 1289 -51.0
37848-1 1296 -56.2
37849-1 1300 -67.9
37850-1 1310 -58.4
37851-1 1311 -54.0
37852-1 1312 -59.4
37853-1 1317 -49.8
37854-1 1318 -16.4
37855-1 1319 -30.8
37856-1 1320 -42.6
37857-1 1321 -40.7
37858-1 1322 -70.1
37859-1 1352 -62.5
37860-1 1399 -20.3
37861-1 1402 -50.1
37862-1 1431 -28.2
37863-1 1596 -55.1
37864-1 1602 -76.3
37865-1 1603 -71.2
37866-1 1604 -63.6
37867-1 1666 -50.9
37868-1 1754 -51.1
37869-1 1757 -55.4
37870-1 1760 -65.6
37871-1 1763 -66.6
37872-1 1764 -65.1
37873-1 1765 -55.8
37874-1 1771 -67.0
37875-1 1775 -46.7
37876-1 1851 -50.7
37877-1 1852 -64.5
37878-1 1855 -61.3
37879-1 1857 -39.6
37880-1 1890 -70.5
37881-1 1917 -53.7
37882-1 1918 -46.2
37883-1 2012 -41.5
37884-1 2013 -47.3
37885-1 2014 -56.1
37886-1 2197 -73.6
38215-1 2198 -80.2
38216-1 2199 -79.4
38217-1 2200 -79.4
38218-1 2201 -72.6
38219-1 2202 -66.2
38220-1 2204 -66.9
38221-1 2216 -55.6
[表4]. 使用人/石蟹獼猴PNPLA3延伸的3' UTR siRNA進行的RNA FISH測定
雙鏈體編號 PNPLA3 位置 PNPLA3 敲低（ % ）
41309-1 3773 -35.7
40777-1 3775 -51.4
40778-1 3776 -14.2
40779-1 3793 -45.5
40780-1 3794 -33.1
40781-1 3795 -22.4
40782-1 3796 -43.5
40783-1 3813 -49.7
40784-1 3820 -41.5
40785-1 3851 -33.0
40786-1 3853 -23.4
40787-1 3854 11.5
40788-1 3857 -60.2
40789-1 3858 -66.3
40790-1 3860 -36.0
40791-1 3862 -38.3
40792-1 3920 -34.9
40793-1 3921 -22.5
40794-1 3923 -8.5
40795-1 3958 -42.7
40796-1 4006 -35.8
41308-1 4008 -41.7
40797-1 4020 -30.7
41307-1 4046 -48.3
40798-1 4095 -0.8
41306-1 4097 -31.0
40799-1 4129 -19.4
40800-1 4130 -11.0
40801-1 4132 -19.4
40802-1 4135 -12.8
40803-1 4137 -27.2
40804-1 4138 34.1
40805-1 4139 -31.3
40806-1 4140 -47.1
40807-1 4184 -15.2
40808-1 4186 -33.5
40809-1 4191 -47.8
40810-1 4193 -67.3
40811-1 4199 -23.1
40812-1 4202 -0.4
40813-1 4203 -21.9
40814-1 4251 -7.2
40815-1 4254 -0.6
40816-1 4259 -25.9
40817-1 4260 -50.9
40818-1 4261 -37.9
40819-1 4262 5.4
40862-1 4263 14.2
40863-1 4283 -12.3
40864-1 4286 -37.1
40865-1 4289 -42.4
40866-1 4290 -61.5
40867-1 4291 -6.6
40868-1 4318 -26.4
40869-1 4360 -7.1
40870-1 4361 -16.8
40871-1 4362 -4.7
40872-1 4363 4.2
40873-1 4369 37.6
40874-1 4398 9.5
40875-1 4402 -42.4
40876-1 4403 -18.7
40877-1 4404 -12.1
40878-1 4484 -33.1
40879-1 4487 -12.5
40880-1 4488 -26.2
40881-1 4491 -25.1
40882-1 4495 -52.1
40883-1 4496 -22.6
40884-1 4500 -57.0
40885-1 4543 -47.2
40886-1 4901 -7.4
40887-1 4902 -29.9
40888-1 4903 -35.2
40889-1 4904 -13.7
40890-1 4905 -20.1
40891-1 4906 -34.1
40892-1 4957 -38.1
40893-1 4958 -41.3
40894-1 4962 2.3
40895-1 4963 -20.5
40896-1 4965 -29.9
40897-1 4966 -16.4
40898-1 4968 -42.4
40899-1 5012 -46.0
40900-1 5026 -42.2
40901-1 5215 -12.9
40902-1 5569 -30.1
40903-1 5571 -54.7
40904-1 5575 2.2
40905-1 5576 -15.0
40906-1 5578 -49.9
40907-1 5579 -57.2
40908-1 5600 -3.0
41030-1 5601 -40.8
41031-1 5640 -44.1
41032-1 5641 -25.1
41305-1 5642 -36.0
41033-1 5668 -29.0
41034-1 5669 40.4
41035-1 5670 -10.6
41036-1 5671 11.6
41037-1 5672 38.0
41038-1 5673 -23.7
41039-1 5674 -54.9
41040-1 5676 -46.4
41041-1 5679 -17.5
41042-1 5680 -55.6
41043-1 5681 -26.7
41304-1 5691 21.2
41044-1 5692 -31.3
41045-1 5705 -30.5
41046-1 5736 -49.3
41047-1 5740 -0.9
41048-1 5741 -49.7
41049-1 5967 -36.4
41050-1 6153 -56.7
41303-1 6154 8.5
41051-1 6157 -32.1
41302-1 6158 -25.8
41301-1 6162 -35.8
41052-1 6163 -52.9
41053-1 6199 -57.4
41054-1 6201 -29.3
41055-1 6202 -18.1
41056-1 6243 -14.3
41057-1 6265 -43.7
41058-1 6267 -18.5
41059-1 6268 -26.6
41060-1 6271 -7.7
41061-1 6279 -14.6
41062-1 6280 -23.2
41063-1 6503 -39.8
41064-1 6568 5.5
41065-1 6571 -45.0
41066-1 6573 -56.1
41067-1 6574 36.3
41068-1 6575 -30.4
41069-1 6576 -44.4
41070-1 6594 -44.0
41300-1 6610 -43.8
41299-1 6611 -43.6
41298-1 6612 -38.0
41297-1 6613 -32.9
41296-1 6614 -28.3
41295-1 6635 -54.2
41294-1 6636 -52.8
41293-1 6637 -42.4
41292-1 6638 -28.0
41291-1 6640 -36.8
41290-1 6641 -44.6
41289-1 6643 -45.9
41288-1 6644 -52.3
41287-1 6669 -36.8
41286-1 6670 -33.6
41285-1 6671 -35.5
41284-1 6676 -36.1
41283-1 6683 -30.0
41282-1 6684 -35.0
41281-1 6685 -36.8
41280-1 6686 -38.6
[表5]. 使用人/絨猿PNPLA3 siRNA進行的RNA FISH測定
雙鏈體編號 PNPLA3 位置 PNPLA3 敲低（ % ）
41430-1 21 -5.5
41429-1 22 -2.6
41140-1 138 10.5
41428-1 142 21.1
41141-1 143 5.4
41427-1 257 7.3
41426-1 258 -40.1
41425-1 262 57.8
41142-1 266 -56.7
41143-1 269 -4.0
41144-1 420 19.6
41145-1 422 -55.4
41146-1 423 -52.7
41147-1 424 -30.1
41148-1 586 1.7
41149-1 714 -57.8
41150-1 715 -58.6
41151-1 716 -39.0
41152-1 718 -57.2
41153-1 721 -54.6
41154-1 722 -33.4
41155-1 723 -52.9
41156-1 729 -33.9
41157-1 730 -36.7
41158-1 1136 -25.9
41159-1 1137 -32.9
41160-1 1162 -28.0
41161-1 1858 -53.3
41162-1 1860 -62.0
41163-1 2187 -59.0
41164-1 2189 20.4
41165-1 2190 -17.9
41166-1 2191 -39.5
41167-1 2193 -7.6
41168-1 2267 -29.3
41169-1 2268 -36.5
41170-1 2269 -48.3
41171-1 2273 -49.3
41172-1 2274 -4.2
41173-1 2639 -32.2
41174-1 3893 -61.4
41175-1 4112 -57.5
41176-1 4113 -54.6
41177-1 4115 -41.7
41178-1 4116 -63.4
41179-1 4117 -66.1
41180-1 4118 -30.0
41424-1 4119 -57.0
41423-1 4160 -15.6
41422-1 4441 -26.4
41421-1 4983 -33.6
41420-1 5707 -38.5
41419-1 5770 -37.0
41418-1 5771 -43.1
41417-1 5772 -20.6
41416-1 5773 -24.5
41415-1 5774 -31.6
41414-1 5819 -47.9
41413-1 5820 -51.7
41412-1 5822 35.8
41411-1 5823 -27.5
41410-1 5824 -38.3
41409-1 5857 -24.8
41408-1 6601 -38.2
實例 3 ：在含有人 PNPLA3 序列的基於 AAV 的小鼠模型中進行的選定 PNPLA3 siRNA 分子的功效篩選
將稀釋在磷酸鹽緩衝鹽水（賽默飛世爾科技公司，14190-136）中的腺相關腺病毒（AAV；血清型AAVDJ8；無內毒素，由美商安進公司（Amgen）內部製備）以1 x 10 12個病毒顆粒/動物投與進入C57BL/6NCrl雄性或雌性小鼠（查理斯河實驗室公司（Charles River Laboratories Inc.））的尾靜脈以驅動人PNPLA3序列在肝中的表現。從ENST00000216180.7 PNPLA3轉錄物設計四個AAV構建體用於體內篩選；一個包含PNPLA3 rs738409-rs738408 （AAV-CDS）的全長編碼序列，以及三個增強型綠色螢光蛋白（eGFP）報告構建體包含一段3'非翻譯區（核苷酸（nt）1620-3410（AAV-A）、nt 3310-5100（AAV-B）和nt 5000-6689（AAV-C））。每個AAV構建體還包含基準序列，用於比較siRNA介導的跨AAV和研究的敲低功效。
圖2中所示的GalNAc軛合的siRNA已針對PNPLA3 rs738409-rs738408 、AAV-A、AAV-B或AAV-C進行了測試。圖2還顯示了該等siRNA序列的未修飾版本。AAV注射後兩週，通過皮下注射以0.5、1.0或3.0毫克/公斤動物用稀釋在磷酸鹽緩衝鹽水（賽默飛世爾科技公司，14190-136）中的單劑量siRNA治療小鼠（通常為8-12週齡，每組n = 3-4隻動物）。siRNA注射後28天後，對動物實施安樂死，並從動物身上收集肝並快速冷凍在液氮中。根據製造商的說明，使用QIACube Classic儀器（凱傑公司（Qiagen），9001292）和RNeasy Mini套組（凱傑公司，74106）處理肝的一部分以獲得純化的RNA。使用NanoDroppTM 8000分光光度計（賽默科技公司（Thermo Scientific），ND-8000-GL）分析樣本。用RQ1無RNA酶的DNA酶（普洛麥格公司（Promega），M6101）處理RNA，且使用TAQMAN™ RNA-to-CT™ 1-Step套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems），4392656）製備即時qPCR。即時qPCR在QuantStudio Real-Time PCR機器上運行。結果基於以下的基因表現：人 PNPLA3（英傑公司（Invitrogen），hs00228747_m1）、 GFP1（IDT定制測定：正向引物：CTATGTGCAGGAGAGAACCATC（有義；SEQ ID NO: 3589），反向引物：GCCCTTCAGCTCGATTCTATT（反義；SEQ ID NO: 3590），探針：5’-6FAM-TACAAGACCCGCGCTGAAGTCAAG TAMRA-3’（有義；SEQ ID NO: 3591））、 GFP2（IDT定制測定：正向引物：TCATCTGCACCACTGGAAAG（有義；SEQ ID NO: 3592），反向引物：CTGCTTCATATGGTCTGGGTATC（反義；SEQ ID NO: 3593），探針：5’-6FAM CCAACACTGGTCACTACCCTCACC TAMRA-3’（有義；SEQ ID NO: 3594））和/或牛生長激素聚腺苷酸化（ BghpA，其包含在每個AAV構建體中；IDT定制測定：正向：5’-GCCAGCCATCTGTTGT-3’（SEQ ID NO: 3595），反向：5’-GGAGTGGCACCTTCCA-3’（SEQ ID NO: 3596），探針：5’-6FAM-TCCCCCGTGCCTTCCTTGACC TAMRA-3’（SEQ ID NO: 3597）），歸一化為小鼠TATA結合蛋白（Tbp）（IDT，Hex Mm.PT.39a.22214839），並表示為與媒劑處理的對照動物相比歸一化為小鼠 Tbp的人 PNPLA3、 GFP和/或 BghpAmRNA表現的相對敲低百分比。對於一些組，將快速冷凍的肝的另一部分在包含1x HALT™蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（賽默科技公司，78441）的Pierce IP緩衝液（賽默科技公司，87787）中均質化，製成50 mg組織/ml裂解緩衝溶液。使用DIRECT DETECT™紅外光譜儀（密理博公司（Millipore））測定蛋白質濃度。GFP蛋白質分析使用12-230 kDa PEGGY SUE或SALLY SUE分離模組（簡單蛋白公司（Protein Simple），SM-S001）在PEGGY SUE™ Simple Western系統（簡單蛋白公司，004-800）上，或使用12-230 kDa Jess或Wes分離模組，8 x 25毛細管柱（簡單蛋白公司，SM-W004）在WES™ Simple Western系統（簡單蛋白公司，004-600）上進行。所有β-肌動蛋白檢測均使用WES™ Simple Western系統和元件進行。該等實驗的結果如圖3（AAV-CDS）和圖4（AAV-A、AAV-B和AAV-C）所示。
為了評估PNPLA3 siRNA分子對人PNPLA3轉錄物內源水平的相對敲低百分比，使用了純合h PNPLA3 I148M敲入（h PNPLA3 I148MKI）小鼠模型（由美商安進公司開發；在查理斯河實驗室公司維持的集落）。在此模型中，野生型小鼠 Pnpla3基因被人 PNPLA3 I148M基因的全長編碼區替代，同時利用小鼠轉錄調節啟動子區來驅動表現。
單獨飼養的雄性h PNPLA3 I148MKI小鼠，通常為8-10週齡，在研究開始之前隨意維持標準食物飲食，研究開始時它們被轉化為改良的齧齒動物肥胖飲食，其中補充氫化植物油、添加果糖和富含0.2%添加的膽固醇（Envigo，TD.190883或TD.200212；後者係前者的輻照版本）。該飲食兩週後，記錄體重，並根據均勻的體重分佈將小鼠隨機分為5-6隻一組。給小鼠以1或3 mg/kg動物皮下注射在磷酸鹽緩衝鹽水（賽默飛世爾科技公司，14190-136）中稀釋的單劑量PNPLA3 siRNA分子或僅鹽水。處理後28天後，對小鼠實施安樂死，並從動物身上收集肝並快速冷凍在液氮中。肝的一部分被處理用於純化RNA，並且對於一些組，一部分被處理用於蛋白質分析。
由於 PNPLA3轉錄物的內源性表現相對較低，如前所述準備了KI小鼠肝的mRNA分析，但藉由以下進行分析：用高容量cDNA反轉錄套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems），4368813）處理，並在比傳統qPCR更靈敏的QIAcuity八平臺數字PCR系統（凱傑公司，911056）上運行。
為了靶向測量hPNPLA3蛋白，將來自每隻小鼠的大約100至200 mg冷凍肝組織在冷PIERCE™ IP裂解緩衝液（賽默科技公司，87787）中獨立地均質化。樣本用1X PIERCE™蛋白酶抑制劑片劑（賽默科技公司，A32963）和BENZONASE®核酸酶（密理博-西格瑪公司（Millipore-Sigma），E1014）處理。將人PNPLA3蛋白（肽：VSDGENVLVSDFR（SEQ ID NO: 3598）；新英格蘭肽公司（New England Peptide））使用免疫親和（IA）技術和抗人PNPLA3 mAb（由美商安進公司開發）捕獲，在珠上進行胰蛋白酶消化，並藉由液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS；賽默飛世爾公司，Orbitrap FUSION™ LUMOS™ TRIBRID™質譜儀）進行分析。無試劑LC MS/MS用於測量從每隻動物回收的肝組織中的小鼠甘油醛3-磷酸脫氫酶（mGAPDH；肽：LISWYDNEYGYSNR（SEQ ID NO: 3599）；新格蘭肽公司）（管家蛋白）。使用LC-MS數據分析軟體ANALYST®（SCIEX，v1.6.2）確定所有樣本中的肽信號。敲入實驗的結果如圖5所示。
聚簇在PNPLA3編碼序列的某些區域內並在體內證明了功效的siRNA觸發器被選中用於進一步研究。兩個選定的siRNA分子（圖5中的「PNPLA3-T704_M1282_3G3-5’」（雙鏈體編號43806-1）和「PNPLA3-T706-g.1g＞a_M867_3G3-5'」（雙鏈體編號41321-1））選擇性地靶向人和石蟹獼猴PNPLA3 mRNA，而另外兩個選定的siRNA分子（「PNPLA3(僅人)-T1234_M867_3G3-5’」（雙鏈體編號52317-1）和「PNPLA3(僅人)-T1240_M867_3G3-5’」（圖5中的雙鏈體編號52307-1））僅靶向人PNPLA3 mRNA。每個選定的siRNA分子的有義股和反義股序列列於表6中。 [表6]
siRNA 雙鏈體編號 PNPLA3 位置 有義 SEQ ID NO: （未修飾的） 反義 SEQ ID NO: （未修飾的） 有義 SEQ ID NO: （經修飾的） 反義 SEQ ID NO: （經修飾的）
PNPLA3-T704_M1282_3G3-5' 43806-1 704 151 655 403 907
PNPLA3-T706-g.1g＞a_M867_3G3-5' 41321-1 706 90 594 342 846
PNPLA3(僅人)-T1234_M867_3G3-5' 52317-1 1234 263 767 515 1019
PNPLA3(僅人)-T1240_M867_3G3-5 52307-1 1240 253 757 505 1009
本說明書中所提及的所有公開、專利以及專利申請藉由引用併入本文，達到如同每一個單獨的公開、專利或專利申請被專門地並且單獨地指示藉由引用併入的相同的程度。然而，本文對參考文獻的引用不應解釋為承認此類參考文獻為本發明之先前技術。在藉由引用併入的參考文獻中所提供的任何定義或術語與在本文中所提供的術語和討論不同的情況下，以本發明術語和定義為準。
認為前述書面說明係足以能夠使熟悉該項技術者來實踐本發明。前述描述和實例詳述本發明的某些較佳的實施方式，且描述由發明人所考慮的最佳模式。然而，將理解的是無論前述內容如何詳細地出現在文本中，本發明可以按多種方式實施，並且本發明應該根據所附申請專利範圍及其任何等同物來解釋。
無
[圖1]的表列出了針對在實例2中描述的體外實驗中測試的PNPLA3的未修飾和經修飾的siRNA序列。所有序列均以5'-3'方向顯示。
[圖2]的表列出了針對在實例3中描述的體內研究中測試的PNPLA3的未修飾和經修飾的siRNA序列。所有序列均以5'-3'方向顯示。
[圖3]的表顯示了在包含完整人PNPLA3編碼序列（CDS）的基於AAV的小鼠模型中PNPLA3的siRNA抑制的結果。
[圖4]的表顯示了在含有人PNPLA3的3’非翻譯區（UTR）部分的基於AAV的小鼠模型中PNPLA3的siRNA抑制的結果。
[圖5]的表顯示了在純合h PNPLA3 I148M敲入（h PNPLA3 I148MKI）小鼠模型中PNPLA3的siRNA抑制的結果。
[圖1-5]和本申請其他部分中的核苷酸序列根據以下符號列出：A、U、G、和C = 相應的核糖核苷酸；dT = 去氧胸苷；dA = 去氧腺苷；dC = 去氧胞苷；dG = 去氧鳥苷；invAb=反向的A鹼基；invDT = 反向的去氧胸苷；invDA = 反向的去氧腺苷；invDC = 反向的去氧胞苷；invDG = 反向的去氧鳥苷；a、u、g、和c = 相應的2'-O-甲基核糖核苷酸；Af、Uf、Gf、和Cf = 相應的2'-去氧-2'-氟（「2'-氟」）核糖核苷酸；Ab = 無鹼基；MeO-I = 2'-甲氧基肌苷；GNA = 二醇核酸；sGNA = 具有3'硫代磷酸酯的二醇核酸；LNA = 鎖核酸。在序列中「s」的插入指示兩個相鄰的核苷酸經由硫代磷酸二酯基（例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵）而連接。除非另有說明，否則所有其他核苷酸藉由3'-5'磷酸二酯基團連接。
無
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Claims (45)

  1. 一種RNAi構建體，其包含有義股和反義股，其中該反義股包含與包含SEQ ID NO: 1-60中任一個的含Patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）mRNA序列互補的區域，並且其中該RNAi構建體抑制PNPLA3的表現。
  2. 如請求項1所述之RNAi構建體，其包含具有與選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域。
  3. 如請求項1或請求項2所述之RNAi構建體，其中該反義股與包含SEQ ID NO: 1-60中任一個的PNPLA3 mRNA序列雜交。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之RNAi構建體，其中該有義股包含與該反義股的序列充分地互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙鏈體區的序列。
  5. 如請求項4所述之RNAi構建體，其中該雙鏈體區的長度為約17至約24個鹼基對。
  6. 如請求項4所述之RNAi構建體，其中該雙鏈體區的長度為約19至約21個鹼基對。
  7. 如請求項6所述之RNAi構建體，其中該雙鏈體區的長度為19個鹼基對。
  8. 如請求項6所述之RNAi構建體，其中該雙鏈體區的長度為20個鹼基對。
  9. 如請求項6所述之RNAi構建體，其中該雙鏈體區的長度為21個鹼基對。
  10. 如請求項4-10中任一項所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約15至約30個核苷酸。
  11. 如請求項10所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約19至約27個核苷酸。
  12. 如請求項10所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約20至約25個核苷酸。
  13. 如請求項12所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約20至約23個核苷酸。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之RNAi構建體，其包含至少一個鈍端。
  15. 如請求項1至13中任一項所述之RNAi構建體，其包含至少一個具有1至4個未配對核苷酸的核苷酸突出端。
  16. 如請求項15所述之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端具有兩個未配對核苷酸。
  17. 如請求項15或16所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該有義股的3'端、該反義股的3'端、或者該有義股和該反義股兩者的3'端包含核苷酸突出端。
  18. 如請求項15-17中任一項所述之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端包含5'-UU-3'二核苷酸或5'-dTdT-3'二核苷酸。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含至少一個經修飾的核苷酸。
  20. 如請求項19所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2'-修飾的核苷酸。
  21. 如請求項19所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、雙環核酸（BNA）、二醇核酸、反向鹼基、或其組合。
  22. 如請求項21所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  23. 如請求項19所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。
  24. 如請求項23所述之RNAi構建體，其中該等經修飾的核苷酸係經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  25. 如請求項1-24中任一項所述之RNAi構建體，其包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  26. 如請求項25所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股的3'端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  27. 如請求項25所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股的3'端和5'端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且在該有義股的5'端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  28. 如請求項1-27中任一項所述之RNAi構建體，其中該反義股包含選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的序列。
  29. 如請求項28所述之RNAi構建體，其中該有義股包含選自SEQ ID NO: 61-564和SEQ ID NO: 1069-2328的序列。
  30. 如請求項1 -29中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體係包含反義股和有義股的雙鏈體化合物，其中該反義股包含選自SEQ ID NO: 565-1068和SEQ ID NO: 2329-3588的序列，並且該有義股包含選自SEQ ID NO: 61-564和SEQ ID NO: 1069-2328的序列。
  31. 如請求項30所述之RNAi構建體，其包含： a.     包含SEQ ID NO: 594的反義股和包含SEQ ID NO: 90的有義股； b.     包含SEQ ID NO: 846的反義股和包含SEQ ID NO: 342的有義股； c.     包含SEQ ID NO: 655的反義股和包含SEQ ID NO: 151的有義股； d.     包含SEQ ID NO: 907的反義股和包含SEQ ID NO: 403的有義股； e.     包含SEQ ID NO: 757的反義股和包含SEQ ID NO: 253的有義股； f.     包含SEQ ID NO: 1009的反義股和包含SEQ ID NO: 505的有義股； g.     包含SEQ ID NO: 767的反義股和包含SEQ ID NO: 263的有義股；或者 h.     包含SEQ ID NO: 1019的反義股和包含SEQ ID NO: 515的有義股。
  32. 如請求項1-31中任一項所述之RNAi構建體，其中與已經與對照RNAi構建體一起孵育的肝臟細胞中的PNPLA3表現水平相比，在與該RNAi構建體一起孵育之後，該RNAi構建體降低肝臟細胞中的PNPLA3表現水平。
  33. 如請求項32所述之RNAi構建體，其中該等肝臟細胞係Hep3B或HepG2細胞。
  34. 如請求項1-33中任一項所述之RNAi構建體，其中在體外Hep3B細胞中，該RNAi構建體在5 nM下抑制至少60%的PNPLA3表現。
  35. 如請求項1-34中任一項所述之RNAi構建體，其中在體外HepG2細胞中，該RNAi構建體在5 nM下抑制至少60%的PNPLA3表現。
  36. 如請求項1-35中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體抑制Hep3B細胞中的PNPLA3表現，IC 50小於約1 nM。
  37. 如請求項1-36中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體抑制HepG2細胞中的PNPLA3表現，IC 50小於約1 nM。
  38. 如請求項1-37中任一項所述之RNAi構建體，其進一步包含與肝臟細胞表面上表現的一或多種蛋白質結合的配體。
  39. 一種組成物，其包含如請求項1-38中任一項所述之RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。
  40. 一種用於降低有需要的患者中的PNPLA3表現之方法，該方法包括向該患者投與如請求項1-39中任一項所述之RNAi構建體。
  41. 一種用於降低有需要的患者中的PNPLA3表現之方法，該方法包括向該患者投與如請求項39所述之組成物。
  42. 如請求項40或請求項41所述之方法，其中與未接受該RNAi構建體的患者中的PNPLA3表現水平相比，在投與該RNAi構建體之後該患者肝細胞中的PNPLA3表現水平降低。
  43. 如請求項40-42中任一項所述之方法，其中該患者患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該患者患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
  45. 如請求項1-38中任一項所述之RNAi構建體或如請求項39所述之組成物，用於治療NAFLD。
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