KR20170041277A - 항종양 조성물 및 방법 - Google Patents

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토마스 프리미아노
베이-디 창
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펩타임드, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 종양으로의 전달시 종양 내 세포에서 선천성 면역을 생성하는 올리고누클레오티드 서열에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 이들 올리고누클레오티드는 나노입자가 종양 세포 표면 상에서 수용체와 특이적으로 결합하게 하고 나노입자가 종양 세포에 흡수되게 하는 표적화 펩티드를 나타내는 나노입자를 통해 종양에 특이적으로 전달된다.

Description

항종양 조성물 및 방법 {ANTI-TUMOR COMPOSITIONS AND METHODS}
본 발명은 대체로 의약 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양에 표적화되는 경우 인간 또는 동물에서 항종양 선천성 면역 반응을 활성화시키는 올리고누클레오티드, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
소정의 작은 간섭(small interfering) RNA(siRNA)는 인터페론 및 사이토 카인 생성의 자극, 단백질 합성의 전역 정지, mRNA의 비특이적 분해, 및 유전자 발현의 비특이적 감소를 초래하는 오프-타겟 효과(off-target effect)를 포함하는 다양한 비특이적인 부작용을 야기할 수 있다(Robbins et al., 2009). 다수의 siRNA 적용에 대해, 특이적 유전자 침묵(specific gene silencing)이 바람직하고, siRNA의 투여 후 피검체에서의 선천성 면역의 활성화는 원치않는 부작용인 것으로 간주된다.
그러나, 암 치료에 있어서, 이들 면역자극성 siRNA, 또는 "isRNA"는 암세포에서 바람직한 증식 차단, 분화 및 아폽토시스(apoptosis)를 포함하는 유익한 효과를 활성화하기 위한 강력한 면역 조절제로 사용될 수 있다. 따라서, 선천성 면역계는 종양 억제제의 역할을 할 수 있으며(Shankaran et al., 2001; Bui and Schreiber, 2007; Koebel et al., 2007), 면역 자극제는 항종양 치료에 사용될 수 있다.
그러나, 인간 또는 동물에서 종양 세포에 대한 선천성 면역 반응의 isRNA 활성화를 제한할 수 있고 일반적으로 비종양 세포에서는 그렇지 않은 효과적인 기술이 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 출원인은 본원에서 인간 또는 동물에서의 종양 세포에 특이적으로 isRNA 복합체를 전달하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 이들 복합체가 종양 세포에 전달되면, isRNA 복합체는 종양 세포에서 특이적으로 피검체의 선천성 면역 반응을 활성화시키고, 이에 따라 특히 증식 차단, 분화 및 아폽토시스를 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 유익한 효과를 유도한다.
일 양태에서, 본원에는 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하는 조성물이 기술된다. 특정 구체예에서, 조성물은 종양 내 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 분리된 올리고누클레오티드; 종양 세포-표적화 모이어티(tumor cell-targeting moiety); 및 이의 약제학으로 허용되는 염을 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 종양 내 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 분리된 올리고누클레오티드를 포함하는, 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하는 조성물이 기술된다. 일 구체예에서, 조성물의 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드는 이중 가닥이다. 일 구체예에서, 올리고누클레오티드는 이중 가닥이고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 올리고누클레오티드는 이중 가닥이고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 올리고누클레오티드는 이중 가닥이고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함하고, 한 가닥은 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 조성물의 올리고누클레오티드는 하나 이상의 UG 모티프(motif)를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 조성물의 올리고누클레오티드의 핵산 서열은 하나 이상의 UG 모티프를 포함하거나 UG-풍부이다.
다른 구체예에서, 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 기술되는 조성물의 올리고누클레오티드는 세포에서 선천성 면역계의 활성화를 촉진하는 적어도 하나의 변형된 누클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 변형된 누클레오티드는 변형된 리보스(ribose)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 누클레오티드는O-메틸 또는 플루오로 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 누클레오티드는 기술되는 조성물의 올리고누클레오티드의 5' 말단으로부터 두번째 위치에 있다.
또 다른 양태에서, 본원에는 종양 세포-표적화 모이어티를 포함하는, 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 조성물이 기술된다. 특정 구체예에서, 종양 세포-표적화 모이어티는 단백질, 펩티드, 또는 앱타머(aptamer)이다. 특정 구체예에서, 종양 세포-표적화 모이어티는 본원에서 모든 목적상 그 전문이 참조로 포함되는, 미국 특허 제8,680,045호에 기술된 바와 같은 세포-표적화 모이어티 또는 도메인 중 어느 하나를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 조성물은 나노입자를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 지질, 사이클로덱스트린, 키토산, 탄수화물 폴리머, 엘라스틴-유사 폴리머(elastin-like polymer)(ELP), 칼슘 포스페이트 폴리머, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 나노입자는 페길화(PEGylate)된다. 일 특정 구체예에서, 나노입자는 ELP-L이다.
또 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 조성물은 리포좀으로 캡슐화된다. 일 구체예에서, 리포좀은 페길화된다.
또 다른 양태에서, 본원에는 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 기술되는 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 기술된다. 특정 구체예에서 약제학적 조성물은 본원에서 기술되는 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 애주번트(adjuvant)를 포함한다. 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 본원에서 기술되는 조성물 및 화학치료 약물 또는 제제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 본원에서 기술되는 조성물 및 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에는 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 방법이 기술된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 종양 세포에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 종양 세포를, 종양 세포 성장을 억제시키기에 충분한 양의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 본원에서 기술된 바와 같은 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 조성물이다.
또 다른 양태에서, 본원에는 피검체의 종양 세포에서 특이적으로 피검체의 선천성 면역 반응을 활성화시키는 방법이 기술된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 종양 세포에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드를 얻고; 올리고누클레오티드를 종양 세포-표적화 모이어티와 접촉시켜 피검체의 종양 세포에 올리고누클레오티드를 특이적으로 전달할 조성물을 형성시키고; 약제학적 유효량의 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 기술되는 방법 중 어느 하나의 종양 세포는 인간의 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간세포, 인간 폐 세포, 인간 신경 모세포종 세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포 또는 인간 피부 세포이다.
도 1은 톨형 수용체(toll-like receptor)(TLR)와의 siRNA 상호작용 및 RNA 간섭 유전자 침묵 경로를 도시한 것이다. 다양한 TLR가 묘사된다. TLR7 및 TLR8은 단일-가닥 RNA (ssRNA) 모티프를 인식하지만, 이중 가닥 RNA (dsRNA) 내 특정 모티프도 인식할 수 있다. TLR3는 dsRNA와 결합하고, TLR7 및 TLR8로부터의 상이한 경로를 통해 신호를 보낸다. RIG-1는 트리포스페이트 함유 RNA를 인식한다. 엔도좀(endosome)을 빠져 나오는 siRNA는 RNAi 경로에 들어갈 수 있으며, 이때 두 가닥 중 하나가 가이드 가닥(guide strand)으로서 선택되고, 상보적 RNA의 서열 특이적 메시지 분해를 지시한다.
도 2는 DF4 또는 ELP-L와 복합체화되는 경우, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로의 siGLO의 흡수를 도시한 것이다. PBMC는 16시간 동안 DharmaFECT (DF4) 또는 ELP-L 나노입자를 사용하여 50 nM에서 siGLO 대조군으로 트랜스펙션되었다.
도 3은 DF4 또는 ELP-L로 복합체화된 isRNA 또는 siGLO로의 처리 후 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 공동 배양된 SKOV-3 GL3 세포(루시퍼라제를 안정하게 발현하는 난소암 세포주)의 생존률을 도시한 것이다. SK-OV-3 GL3 세포의 루시퍼라제 활성(RLU; 상대적 발광 단위(relative light unit))이 PBMC를 SKOV-3 GL3 세포에 첨가한 후(공동-배양) 4일간 측정되었다(도 3, 그래프 A). 대조군으로서, SK-OV-3 GL3 세포의 루시퍼라제 활성이 PBMC 세포가 첨가되지 않은 동일 조건 하에 측정되었다(도 3, 그래프 B). *siGLO 및 isRNA 처리된 공동-배양물의 평균 생존률 간의 유의성을 P = 0.05로 4일 시점에서 T-시험에 의해 결정하였다. **siGLO 및 isRNA로 처리된 공동 배양물의 평균 생존률 사이의 유의성을 P = 0.0005로 4일 시점에서 T- 시험에 의해 결정하였다.
도 4는 DF4 또는 ELP-L로 복합체화된 isRNA 또는 siGLO로의 처리 후 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 공동-배양된 Panc1 GL3 세포(루시퍼라제를 안정하게 발현하는 췌장암 세포주)의 생존률을 도시한 것이다. Panc1 GL3 세포의 루시퍼라제 활성(RLU; 상대적 발광 단위)을 PBMC를 Panc1 GL3 세포에 첨가한 후(공동-배양) 4일간 측정하였다(도 4, 그래프 A). 대조군으로서, Panc1 GL3 세포의 루시퍼라제 활성을 PBMC 세포의 첨가 없이 동일한 조건 하에서 측정하였다(도 4, 그래프 B).
도 5는 isRNA 또는 siGLO 복합체로 처리된 PBMC를 사용하는 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)(RT-PCR) 실험을 도시한 것이다. RNA를 공동 배양된 SK-OV-3 GL3/PBMC 세포로부터 정제하고, INF-α 및 IL-6 발현을 각 샘플에 대해 측정하였다. ß-액틴을 표준화 대조군으로서 측정하였다.
도 6은 마우스 모델의 난소 종양의 성장에 대한 isRNA:ELP-L 나노복합체의 효능을 입증한 것이다. 주입 된 SK-OV-3 GL3 세포로부터 형성되는 무균 마우스 (Balb/c)에서의 종양의 성장을 비히클(VEH, 5 % 덱스트로스) 또는 2 mg/kg 또는 10 ㎎/㎏의 isRNA/ELP-L(isRNA, n = 10)로 4주 동안 주 2회 투여된 마우스에서 생체 발광(bioluminescence)에 의해 측정하였다. 파트 A는 2 mg/kg 투여 프로토콜의 28일에 생존 마우스에서의 종양의 생체발광을 나타낸다. 파트 B는 2 mg/kg 투여 프로토콜에 대한 7일마다의 평균 생체발광의 그래프를 나타낸다. 표시된 데이터는 각 포인트에 대해 n = 10의 평균이다. *VEH과 isRNA간의 유의성을 P = 0.005로 28일 시점에서 T-시험에 의해 결정하였다. **VEH과 isRNA간의 유의성을 P = 0.001로 28일 시점에서 T-시험에 의해 결정하였다.
도 7은 비히클(VEH), 2 mg/kg 또는 10 mg/kg isRNA:ELP-L을 투여한 마우스에서 절제한 종양의 무게(그래프 A) 및 갯수(그래프 B)를 나타낸 것이다.
도 8은 isRNA:ELP-L 또는 5% 덱스트로스(비히클)로 처리된 마우스 종양 샘플로부터의 사이토카인 발현의 RT-PCR을 나타낸다. 종양 샘플을 주입후 28일에 마우스로부터 절제하고, INF-α 및 IL-6의 발현을 각 샘플에 대해 측정하였다. ß-액틴을 표준화 대조군으로서 측정하였다.
상세한 설명
일 양태에서, 본원에는 종양 세포에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드가 기술된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "선천성 면역 반응"은 인간 또는 동물의 세포 및 조직에서의, 바람직하게는 차별적으로 또는 우선적으로 종양 세포에서 유도되는, 비항원-특이적 반응을 나타낸다. 또한, 세포가 항원-제공 세포로서 작용하고/거나 항원 특이적 적응 면역 반응을 조절할 수 있는 능력에 영향을 미치는 세포 변화를 나타낸다. 일 구체예에서, 선천성 면역 반응은 자연 살해(NK) 세포 활성의 활성화를 포함한다. NK 세포는 병원체에 대한 첫번째 방어선에 관련된다. 또 다른 구체예에서, 선천성 면역 반응은 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자, 예컨대 비제한적 예로, IFN-α, IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, 및 TNF-α의 생성 및/또는 분비를 포함한다. 선천성 면역은 마크로파지(macrophage), 수지상 세포 및 단핵구의 개입을 추가로 포함할 수 있다.
면역계는 세포 스트레스에 의해 유도된 종양 특이적 항원 또는 분자의 발현에 기초하여 종양 세포의 확인 및 제거가 가능하다. 그러나, 종양 세포는 종양의 면역 감시에서 벗어날 수 있으며, 항종양 면역 강화를 목표로 하는 치료법이 현재 개발 중에 있다(Swann and Smyth 2007).
본원에서 기술되는 isRNA 올리고누클레오티드는 특정 구체예에서, 화학적으로 합성되는 올리고리보누클레오티드의 듀플렉스(duplex)이다. 이들 isRNA 듀플렉스는 면역계에 유익한 효과를 갖는다. 어떠한 특정 이론 또는 메커니즘에 의해 결부되고자 하지 않지만, 본원에서 기술되는 올리고누클레오티드는 종양 세포 상의, 그리고 종양 세포 내의 톨형 수용체(TLR)를 활성화시킴으로써 선천성 면역 반응을 활성화시키는 것으로 여겨진다. 활성화되면, 사이토카인 및 그 밖의 세포독성 효소가 수지상 세포, 단핵구/마크로파지, 및 자연 살해 세포로부터 방출된다. 일반적으로, 이러한 효과는 특히 치료제로서의 통상적인 siRNA 분자의 투여를 포함하는 임상 시험에서 부작용으로 간주된다.
포유동물 선천성 면역계는 잠재적 병원체의 징후로서 핵산 종의 수를 인식한다. 특정 TLR은 인간 및 마우스 둘 모두에서 이중 가닥 RNA (TLR3) (Alexopoulou, Holt et al. 2001) 및 단일-가닥 RNA (ssRNA) (TLR7 및 TLR8) (Diebold, Kaisho et al. 2004; Heil, Hemmi et al. 2004; Lund, Alexopoulou et al. 2004)를 인식하는 것이 확인되었다. 이들 핵산-감지 TLR은 세포내로 국한되며, 활성화시 IFN-α 및 염증성 사이토카인과 같은 타입 I 인터페론을 유도한다. TLR7은 전형적으로 형질세포양(plasmacytoid) 수지상 세포 및 B 세포에 의해 발현되고, 구아노신 및 우리딘이 풍부한 합성 ssRNA 및 ssRNA 바이러스에 의해 활성화된다. TLR7 및 TLR8는 전형적으로 독특한 면역 세포 유형에서 발현되지만, 이들 TLR은 유사한 핵산을 인식한다. 뮤린 TLR8은 통상적인 TLR7/8 리간드에 반응하지 않으며, 최근까지 마우스에서 비작용성인 것으로 여겨졌었다(Diebold, Kaisho et al. 2004). 또한, RNA는 세포질 RNA 수용체 RIG-1 및 Mda-5를 포함하는 TLR- 및 dsRNA-의존성 단백질 키나제 (PKR)-의존성 메커니즘을 통해 인터페론 반응을 생성할 수 있다(Yoneyama, Kikuchi et al. 2004).
리간드가 TLR와 결합하는 경우, 신호가 핵에 전달되고, 세포내 조절성 분자의 유전자 엔코딩 합성이 발현된다(Ulevitch 2004). TLR를 통한 면역계의 활성화는 감염에 대한 선천적이고 적응성 있는 면역 반응을 조율하는 친염증성 사이토카인 및 인터페론의 신속한 생성을 야기한다. 이들 경로의 이상 또는 과도한 자극은 많은 염증성 및 자가 면역 질환의 근본 원인으로 여겨진다. 예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스에서 RNA 및 DNA 관련 자가항원은 TLR7 및 TLR9 활성화를 통해 병리학 적 자가항체 및 인터페론 생성을 촉진시키는 것으로 나타났다(Lau, Broughton et al. 2005; Vollmer, Tluk et al. 2005; Christensen, Shupe et al. 2006; Pisitkun, Deane et al. 2006; Subramanian, Tus et al. 2006).
TLR3은 이중 가닥 RNA에 대한 공지된 수용체이다. TLR3는 수지상 세포, 섬유아세포, 마크로파지, 및 상피 세포에서 발현된다(Matsumoto, Funami et al. 2004). TLR3의 어댑터(adaptor) 분자는 TICAM-I이며, TICAM-I에 대한 TLR3의 결합은 궁극적으로 타입 I 인터페론 (IFN-αβ)의 생성을 유도하는 다중 신호전달 캐스케이드(cascade)를 유도한다(Matsumoto, Funami et al. 2004). 인터페론은 RNA를 분해할 수 있고, 이에 따라 바이러스 복제를 방지할 수 있는 효소를 생성하는 비감염된 세포를 유도하는 사이토카인이다. 또한, 인터페론은 세포독성 T-림프구, 마크로파지, 및 NK 세포를 포함하는 방어에 중요한 다양한 세포를 활성화시킨다.
단일 가닥 RNA 인식은 마우스에서 톨형 수용체 7에 의해, 그리고 인간에서 TLR-8에 의해 매개된다. 마우스에서, TLR7는 어댑터 MyD88에 결합하고, IFN-α의 활성화를 유도한다. 디에볼드(Diebold) 등(Diebold, Kaisho et al. 2004)은 인플루엔자 바이러스 RNA, 폴리우리딜산, 및 시험관내 합성된 mRNA가 전부 형질세포양 수지상 세포에서 IFN-α 생성을 유도하였음을 보여주었다. Heil 등(Heil, Hemmi et al. 2004)은, 포스포로티오에이트 말단(phosphorothioate termini)을 지닌 20개 잔기의 구아닌- 및 우리딘 풍부 RNA 올리고누클레오티드가 수지상 세포 및 마크로파지를 자극하여 INF-α 및 전염증성 및 조절성 사이토카인을 분비하였음을 나타냈다. TLR-결핍 마우스를 사용하여, 상기 저자들은 또한 마우스 TLR-7 및 인간 TLR-8이 단일 가닥 RNA로의 결합에 관여함을 나타냈다. 또한, 인간 TLR-7은 구아닌 누클레오티드 유사체에 의해 활성화된다(Lee, Chuang et al. 2003).
또한, 이중 가닥 RNA는 편재적으로-발현된 세린/트레오닌 단백질 키나제, 소위 PKR와의 상호작용을 통해 선천성 면역계를 활성화시킬 수 있다. PKR는 박테리아 LPS의 TLR4 결합에 의해 활성화된 TLR4 캐스케이드의 일부이다. PKR은 인터페론에 의해 유도되고 dsRNA, 사이토카인, 성장 인자 및 스트레스 신호에 의해 활성화된다. PKR은 dsRNA에 결합시 자가포스포릴화되고 활성화된다. 활성화는 eIF2a 포스포릴화를 통한 단백질 합성의 억제를 초래하고, 또한 상이한 전사 인자의 활성화에 대한 PKR-의존 신호전달에 의한 염증 유전자의 전사를 유도한다(Williams 1999). PKR은 이의 억제제 IkB의 포스포릴화를 통해 NF-κB 발현을 상향 조절한다(Kumar, Haque et al., 1994). dsRNA의 11개 정도로 적은 염기 쌍이 PKR에 결합하여 활성을 유도할 수 있지만, 최대 활성화에는 적어도 30개의 염기 쌍이 필요하다(Manche, Green et al. 1992).
본원에 기술된 isRNA 제제는 핵산 또는 누클레오티드 유사체에 결합하는 것으로 알려져 있는 수용체 중 하나를 통해 선천성 면역계를 활성화시킬 수 있다. siRNA 듀플렉스는 특정 조건 하에서 사람 세포에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 것으로 보고되어 있다. 슬레즈(Sledz) 등(Sledz 및 Williams 2003)은 시험된 6개의 상이한 siRNA 듀플렉스 각각으로의 인터페론 시스템의 유도를 보고하였다. 브릿지(Bridge) 등(Bridge, Pebernard et al. 2003)은 바이러스 벡터를 사용하여 전달된 일부 shRNA가 인터페론-자극 유전자의 발현을 유도하였음을 보고하였다. 이 두 보고서는 siRNA 듀플렉스가 PKR을 활성화시킨다는 것을 보여 주었다. 대조적으로, 카리코(Kariko) 등으로부터의 데이터는 TLR3 경로와 관련이 있고 TLR3 활성화는 농도 의존적이었다(Kariko, Bhuyan et al. 2004).
선천성 면역 반응의 활성화는 바이러스 감염에서 암에 이르는 질병에 유리하다(Whitmore, DeVeer et al. 2004). isRNA 제제는 선천성 면역을 활성화시켜야 하고, 또한 적응 면역 반응을 형성해야 한다. 일부 isRNA 서열 및 변형은 다른 것들보다 선천성 면역 반응을 더 잘 활성화시킬 수 있다. 이 활성화는 핵산에 결합하는 것으로 알려져 있는 톨형 수용체 경로: 이중 가닥 RNA에 대한 수용체인 TLR3; 단일 가닥 RNA에 대한 수용체인 TLR8; 또는 dsRNA에 의해 활성화되는 단백질 키나제인 PKR 중 하나를 통해 이루어질 수 있다. 이들 각각의 단백질은 기술된 isRNA 제제와 유사한 분자에 결합하는 것으로 알려져 있다.
본원에 추가로 기술되는 것은 피검체의 면역계에 영향을 미치도록 또는 피검체의 면역계에 대한 영향을 특이적으로 피하도록 변형되거나 변형되지 않은 isRNA 올리고누클레오티드 제제이다. 이론에 결부되기를 바라지는 않지만, 면역계 활성의 조절은 isRNA 제제가 면역계의 성분과 상호작용함으로써 생길 수 있으며, 여기서 상호 작용은 성분의 활성을 방해하거나 자극하는 것으로 여겨진다. 이러한 효과는 RNAi 적용을 위한 siRNA 분자의 전통적인 용도에서와 같이, RISC 매개 유전자 침묵과는 무관하다. 대조적으로, 본원에서 기술되는 isRNA 분자는 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA와 면역계의 단백질 성분의 상호작용을 통해 작용하는 것으로 여겨진다.
본 기재의 또 다른 양태에서, 종양 내 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드는 특정 누클레오티드 서열을 포함한다. 종양 세포로의 isRNA 듀플렉스의 특이적 전달 효과를 입증하기 위해 사용된 올리고누클레오티드 서열이 하기 표 1에 기재되며, 여기서 표 1의 서열에 나타나 있는 "m"은 지시된 누클레오티드 염기의 2' 리보스 위치의 변형을 나타내고, dT는 데옥시리보티미딘을 나타낸다.
표 1. isRNA 올리고누클레오티드 서열
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특정 구체예에서, 본원에 기술되는 올리고누클레오티드는 어닐링되어 isRNA의 이중 가닥 듀플렉스를 형성한다. 일 구체예에서, 본원에 기술되는 이중 가닥 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는 가닥 및 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술되는 이중 가닥 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는 가닥 및 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함한다. 또 다른 구체 예에서, 본원에서 기술되는 이중 가닥 올리고누클레오티드 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함하는 가닥 및 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함한다.
본원에서 기술되는 분리된 올리고누클레오티드 및 isRNA 듀플렉스는 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 피검체 dsRNA (예를 들어, siRNA)의 생성은 화학적 합성 방법 또는 재조합 핵산 기법에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "dsRNA"는 RNA 간섭(RNAi)이 가능한 이중 가닥 RNA 분자, 예를 들어 siRNA를 나타낸다. 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하는 방법 및및 그 밖의 isRNA 제조 기술은 문헌(Judge 2006)에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 처리되는 세포의 내인성 RNA 중합효소는 생체내 전사를 매개할 수 있거나, 클로닝된 RNA 중합효소는 시험관내 전사에 대하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 출원의 dsRNA 또는 siRNA 분자는 RNA 만을 포함하는 분자로 제한될 필요는 없고, 화학적으로 변형된 누클레오티드 및 비누클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 dsRNA는 포스페이트-당 골격 또는 누클레오시드에 대한 변형을 포함하여, 예컨대 세포 누클레아제에 대한 민감성을 감소시키고, 생체이용률(bioavailability)을 개선시키고, 제형 특징을 개선시키고/거나 그 밖의 약동학 특성을 변경시킬 수 있다. 예시를 위하여, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 변형되어 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서 특이적인 유전적 억제를 가능하게 하도록 조정될 수 있다. 마찬가지로, 염기는 특히 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase) 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. dsRNA는 효소적으로 또는 부분적 또는 전체적 유기 합성에 의해 생성될 수 있으며, 어떠한 변형된 리보누클레오티드는 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자를 화학적으로 변형하는 방법은 dsRNA를 변형하기 위해 조정될 수 있다. 단지 예시하기 위하여, dsRNA 또는 siRNA의 골격은 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 포스포디티오에이트, 키메라 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변형(예컨대, 2'-치환 리보누클레오시드, a-배열)으로 변형될 수 있다. 특정 경우에, 본 출원의 dsRNA는 누클레오티드를 함유하는 2'-하이드록시 (2'-OH)가 없다. 특정 구체예에서, siRNA 분자는 포스포로티오에이트 센스(sense) 가닥을 포함한다. 특정 구체예에서, siRNA 분자는 포스포디에스테르 안티센스(antisense) 가닥을 포함한다. 변형된 RNA 분자를 생성하는 한 가지 예시적인 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌(Robbins, 2008)에 기술되어 있다.
달리 명시되지 않을 경우, 본원에서 기재되는 서열은 관례를 따라, 단일 가닥 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 방향으로의 첨가는 전사 방향으로서 지칭되며; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥 상의 서열 영역으로서 RNA 전사체의 5' 말단에 대한 5'인 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 가닥 상의 서열 영역으로서 RNA 전사체의 3' 말단에 대하여 3'인 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리누클레오티드"는 길이가 적어도 10개 염기인 누클레오티드의 폴리머 형태를 의미한다. 특정 구체예에서, 염기는 리보누클레오티드 또는 데옥시리보누클레오티드, 또는 어느 한 유형의 누클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고누클레오티드"는 자연적으로 발생되는 누클레오티드, 및 자연적으로 발생되고/거나 비자연적으로 발생되는 올리고누클레오티드 연결에 의해 함께 연결되는 변형된 누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 누클레오티드를 포함하는 폴리누클레오티드 서브세트이다. 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드는 10 내지 60개 길이의 누클레오티드이다. 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 30 내지 40개 길이의 염기이다.
올리고누클레오티드는, 예컨대 안티센스 RNA로서 사용하기 위한 단일 가닥이거나, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 작은(또는 짧은) 헤어핀 RNA(shRNA)로서 사용하기 위한 이중 가닥일 수 있다.
올리고누클레오티드는 검출가능한 표지, 예를 들어 방사능 표지, 형광 표지, 항원 표지 또는 합텐(hapten)을 포함할 수 있다.
용어 "얻음"은 생리학적 시편을 물리적으로 취득하는 것을 의미한다. 물질이 획득되는 방식은 어떠한 구체적인 공정으로 제한되지 않는다.
용어 "자연적으로 발생하는 누클레오티드"는 데옥시리보누클레오티드 및 리보누클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 누클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 기(sugar group) 등을 가지는 누클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드 연결"은 올리고누클레오티드 연결, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예컨대, 문헌[LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design 6: 539; Zon et al., 1991, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, (F. Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford England, pp. 87-108; Stec et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543]을 참조하며, 이들 참조문헌 각각의 개시 내용은 본원에 어떠한 목적을 위하여 참조로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "분리된 폴리누클레오티드" 또는 "분리된 올리고누클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리누클레오티드 또는 이의 조합을 의미하며, 이의 공급원으로 인하여 "분리된 폴리누클레오티드"는 (1) "분리된 폴리누클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리누클레오티드의 전부 또는 부분과 결합되어 있지 않고, (2) 자연에서 연결되어 있지 않은 폴리누클레오티드와 연결되며, (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는다.
용어 "트랜스펙션(transfection)"은 세포에 의해 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 나타내는데 사용되며, 외인성 DNA가 세포 내로 도입될 때 세포는 "트랜스펙션"되었다. 다수의 트랜스펙션 기법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다. 예컨대, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier); and Chu et al., 1981, Gene 13: 197]을 참조한다.
특정 구체예에서, 본원에서 기술되는 올리고누클레오티드는 피검체에 투여하기 위한 전달 비히클, 예를 들어 리포좀 및 나노입자; 담체 및 희석제 및 이의 염을 포함할 수 있으며; 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, isRNA는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,680,045호에 기술된 바와 같이 ELP-L 나노입자와 함께 전달된다. 핵산 분자의 전달 방법은 예를 들어 문헌[Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2:139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol. 16:129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol, 137:165-192; 및 Lee et al., 2000, ACS Symp . Ser . 752:184-192]에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다. 베이젤맨(Beigelman) 등의 미국 특허 제6,395,713호 및 설리반(Sullivan) 등의 PCT 제WO 94/02595호는 세포 및 조직으로의 핵산 분자의 전달을 위한 일반적인 방법을 추가로 기술한다. 이들 프로토콜은 세포로 사실상 어떠한 핵산 분자의 전달을 위해 이용될 수 있다. 핵산 분자는 당업자에게 알려진 다양한 방법, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 리포좀 내 캡슐화, 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해, 또는 그 밖의 전달 비히클, 예를 들어 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생접착성 마이크로스피어로의 혼입에 의해, 또는 단백질 벡터(예를 들어, O'Hare and Normand, 국제 PCT 공개 제WO 00/53722호 참조)에 의해 세포로 투여될 수 있다.
본원에서 기술되는 나노입자는 전형적으로 누클레오티드 또는 약물 제제를 결합시키고 혈액 중 분자를 안정화시키는 쉘 구조에 화학적으로 기반을 둔다. 나노입자는 종종 당, 엑스트란, 칼슘 포스페이트, 키노산, 펩티드 및/또는 플라스틱 폴리머를 포함한다. 암 약물 전달을 위한 약물 제제-로딩된(drug agent-loaded) 나노입자는 바람직하게 다음의 특성을 가진다: 1) 수율과 순도가 높은 몇 단계로 합성하기 용이함; 2) 크기가 100㎚ 미만인 단분산 약물-로딩된 나노입자로 집합함; 3) 다양한 약물의 캡슐화를 가능하게 함; 4) 유리한 약동학 및 종양 축적을 나타냄; 5) 제어되고 조정가능한 반응속도로 약물을 방출함; 6) 치료 반응을 유도함; 7) 비독성 성분으로 분해되어 불리한 독성이 없이 신체로부터의 소거를 가능하게 함. 수많은 상이한 나노규모 전달 시스템이 암 치료법에 대하여 제안되었지만, 대부분은 이들 시스템을 임상 시험으로 옮기는데 중요한 이들 기준에 충족되지 않는다.
ELP 약물 전달 나노입자는 향상된 투과도 및 보유(enhanced permeability and retention, EPR) 효과로 인해 특이적으로 종양에 진입하는데, 이는 비정상적인 종양 혈액 및 림프 혈관 구조(lymphatic vasculature)에 기인하는 것으로 여겨진다. 본원에서 기술되는 ELP 나노입자를 사용함으로써, 선천성 면역계가 종양 내에서만 활성화되고, 선천성 면역계의 전신 활성화는 억제된다. 그러나, 본 발명은 ELP-나노입자로 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구체예는, (1) 누클레오티드 분자를 전달할 수 있고, (2) 통상적인 화학치료제를 운반할 수 있거나 운반하지 않을 수 있고, (3) 특이적인 종양 유형을 표적화하는 펩티드 분자를 수용할 수 있는 리포좀, 폴리덱스트란, 또는 그 밖의 폴리머를 이용할 수 있다.
대안적으로, 핵산/비히클 조합은 직접 주사에 의해 또는 주입 펌프를 사용함으로써 국소적으로 전달될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 직접 주사는 피하, 근육내, 또는 피내 인지와 상관없이 표준 바늘 및 주사기 방법을 사용하여, 또는 무바늘 방법, 예를 들어 문헌[Corny et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5:2330-2337 및 Barry et al., 국제 PCT 공개 제WO 99/31262호]에 기술된 방법에 의해 일어날 수 있다. 당업계에서의 많은 예는 삼투 펌프(문헌[Chun et al., 1998, Neuroscience Letters 257:135-138, D'Aldin et al., 1998, Mol. Brain Research 55:151-164, Dryden et al., 1998, J. Endocrinol. 157:169-175, Ghirnikar et al., 1998, Neuroscience Letters 247:21-24] 참조), 또는 직접 주입(Broaddus et al., 1997, Neurosurg. Focus 3, article 4)에 의한 올리고누클레오티드의 전달 방법을 기술하고 있다. 그 밖의 전달 경로는 경구 전달(예를 들어 정제 또는 환제 형태) 및/또는 척추 강내 전달(Gold, 1997, Neuroscience 76:1153-1158)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 핵산 전달 및 투여의 보다 상세한 기술은 문헌[Sullivan 등의 PCT 제WO 94/02595호, Draper 등의 PCT 제WO93/23569호, Beigelman 등의 PCT 제WO99/05094호, 및 Klimuk 등의 PCT 제WO99/04819호]에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 모두 본원에 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물은 올리고누클레오티드 및 세포-표적화 모이어티(cell-targeting moiety) (또한, 세포 표적화 도메인 또는 CTD로서 지칭됨)를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 표적화 모이어티는 폴리펩티드이다. 예시적인 세포 표적화 폴리펩티드는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,680,045호에 기술되어 있다.
CTD는 어떠한 특정 폴리펩티드 서열로 제한되지 않는다. CTD는 어떠한 요망하는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 특정 구체예에서, 생물학적 분자는 요망하는 세포 유형으로 특이적으로 발현된다. 어떠한 세포가 표적화를 위해 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 세포는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이며, 가장 바람직하게는 설치류 또는 인간 세포이다. 특정 구체예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 본 발명에 의해 고려되는 종양 세포의 비제한적인 예는 인간 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 신경 모세포종 세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포, 또는 인간 피부 세포를 포함한다. 추가적으로, 표적 세포는 본 발명의 방법에 의해 치료되어야 하는 환자에 영향을 미치는 질환 또는 병태에 기초하여 선택될 수 있다.
일 양태에서, CTD는 종양 세포에서 발현되지만 비종양 세포(예를 들어, 종양 세포 표적화 모이어티)에서 발현되지 않는 생물학적 분자를 표적화하도록 설계되었다. 본원에서 기술되는 올리고누클레오티드는 세포 표적화 모이어티를 나타내는 나노입자를 사용하여 종양에 특이적으로 전달되도록 설계된다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드의 CTD는 종양 세포에 대하여 특이적인 펩티드 리간드를 포함한다. 이들 세포 표적화 모이어티는 종양 세포 표면 상의 수용체 나노입자의 특이적 결합을 부여하고, 엔도사이토시스(endocytosis), 피노사이토시스(pinocytosis), 또는 그 밖의 세포막-관련 메커니즘에 의해 종양 세포에 특이적으로 나노입자의 흡수를 허용할 수 있다. 일 구체예에서, CTD는 L1 세포 부착 분자(L1CAM)에 결합하는 펩티드 리간드를 포함한다. 특이적 종양 세포를 표적화하는 것은 종양-탐색 ELP 나노입자로 전달되는 약물의 특이적인 표적화에 의한 암 치료법의 부작용의 감소로 인하여 유리하다. 본원에서 기술되는 바와 같이 isRNA 분자를 지닌 CTD를 사용하는 것은 비종양 세포의 선천성 면역 반응의 활성화를 감소시킬 수 있고, 이에 따라 isRNA가 투여된 피검체의 원치않는 부작용을 감소시킬 수 있다 .
또 다른 구체예에서, 나노입자는 나노입자가 세포막을 투과할 수 있도록 응축될 수 있다. 이와 같은 대안적인 구체예에서, 나노입자는 세포 내부의 생물학적 분자, 예컨대 엔도좀 내 TLR 및 세포질 내 그 밖의 선천성 면역 활성제와 접촉할 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 추가적인 표적화 리간드는 약물 제제를 포함하는 리포좀 또는 나노입자와 결합되어 아포토시스 파괴에 대하여 지정된 종양 세포 상의 수용체를 표적화한다. 리포좀은 또한 폴리에틸렌글리콜로 코팅되어(즉, 페길화되어) 순환시 리포좀의 수명을 연장시킬 수 있다. 유사하게, 나노입자는 이와 같이 코팅될 수 있다.
분자를 표적화하는 것은 표적 세포의 표면 상의 수용체에 특이적으로 결합하는 앱타머를 지칭하는 유기 화학적 링커일 수 있다. 앱타머는 나노입자의 리포좀 또는 폴리머의 지질과 공유적으로 연결될 수 있다. 리포좀 또는 나노입자를 종양 세포에 대하여 표적화하는데 사용될 수 있는 그 밖의 분자는 종양 세포의 표면 상의 특이적인 수용체로 보내지는 펩티드, 단백질 또는 항체이다.
특정 구체예에서, 본원에서 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 애주번트와 함께 본 명세서에서 제공되는 바와 같이 치료적 유효량의 올리고누클레오티드, 나노입자 및/또는 약물 제제를 포함하는 약제학적 조성물이 기술된다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은, 환자에게 적절하게 투여될 때 요망하는 치료 효과를 유도할 수 있는, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제 및 본원에서 기술된 바와 같은 화학적 화합물, 펩티드, 또는 조성물을 포함하는 조성물을 나타낸다. 용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 치료 반응을 생성하는 것으로 결정된 본 발명의 스크리닝 방법에서 확인된 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물의 양을 말한다. 이와 같은 치료적 유효량은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 당업자에게 용이하게 확인된다.
본 발명은 본원에서 제공되는 바와 같은 올리고누클레오티드, 폴리펩티드, 나노입자, 또는 약물 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 특히, isRNA 올리고누클레오티드 및 그 밖의 약물 제제는 ELP 나노입자, 예를 들어 ELP-L 나노입자와 함께 전달된다.
허용가능한 제형 물질은 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 것이 바람직하다. 약제학적 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투압농도(osmolarity), 점성, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해율 또는 방출률, 흡착 또는 침투성을 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다. 적당한 제형 물질은 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로겐-설파이트); 완충제(예를 들어, 보레이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 그 밖의 유기산); 팽화제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류, 이당류, 및 그 밖의 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 착향제 및 희석제; 유화제; 친수성 폴리머(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예를 들어, 나트륨); 방부제(예를 들어, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜); 당알코올(예를 들어, 만니톨 또는 솔비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들어, 플루로닉(pluronic) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 솔비탄에스테르, 폴리솔베이트(polysorbate), 예를 들어, 폴리솔베이트 20 및 폴리솔베이트 80, 트리톤(Triton), 트라이메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 또는 틸록사팔(tyloxapal)); 안정성 향상제(예를 들어, 수크로스 또는 솔비톨); 긴장성 향상제(tonicity enhancing agent)(예를 들어, 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨, 또는 솔비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 애주번트를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.sup.th Edition, (A. R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company]을 참조한다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 isRNA 올리고누클레오티드는 또한 화학치료제, 항생제 또는 제2 RNA 제제일 수 있는 제2 치료제와 함께 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에서 기술되는 isRNA 올리고누클레오티드는 면역 체크포인트 억제제와 함께 약제학적 조성물에 사용된다. 이러한 약물 조합은 면역 체크포인트 억제제에 의해 부여되는 면역 반응의 종양 세포에서의 차단을 제거할 수 있고, 본원에서 기술되는 isRNA는 선천성 면역계를 활성화시킨다. 이와 같이, 면역 반응 활성화에 대한 상승 효과가 이러한 제제들의 조합을 사용하여 관찰될 수 있다. 예시적인 면역 체크포인트 표적이 하기 표 2에 열거된다.
표 2. 면역 체크포인트 표적
Figure pct00002
면역 체크포인트 억제제는 예를 들어, 치료용 항체, 억제성 누클레오티드, 또는 소분자 억제제일 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제로서 작용하는 다수의 항체, 예컨대 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(MK-3475, Merck), 니볼루맙(nivolumab)(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb), 피딜리주맙(pidilizumab)(CT-011, CureTech Ltd.), AMP-224(Merck), MDX-1105(Medarex), MEDI4736(MedImmune), MPDL3280A(Genentech), BMS-936559(Bristol-Myers Squibb), 이필리무맙(ipilimumab)(Bristol-Myers Squibb) 및 트레멜리무맙(tremelimumab)(Pfizer)이 당해 공지되어 있다. PKR 경로의 중단을 포함하여 암을 치료하는데 면역계를 억제하는 그 밖의 화합물이 또한 유용할 수 있다(Pikarsky et al., Nature, 2004, 431, 461-466; Huber et al., J. Clin. Invest., 2004, 114, 569-581).
추가적인 약제학적 조성물, 예를 들어 지속되는 또는 제어되는 전달 제형에 본 발명의 나노입자 또는 화합물을 포함하는 제형은 당업자에게 명백하다. 다양한 그 밖의 지속되는 또는 제어되는 전달 수단, 예를 들어 리포좀 담체, 생체침식성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제를 제형화하는 기법은 또한 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, PCT 출원 제PCT/US93/00829호를 참조하며, 이는 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 폴리머 마이크로입자의 제어된 방출을 기술한다. 서방형 제조물은 형상화된 물품의 형태인 반투과성 폴리머 매트릭스, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐, 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제058,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머(Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트)(Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., id.) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산(EP 제133.988호)을 포함할 수 있다. 서방형 방출 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 여러 가지 방법 중 어떠한 것에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌[Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; EP 제036,676호; EP 제088,046호 및 EP 제143,949호]을 참조한다.
실시예
본 발명은 추가로 제한하는 것으로 간주되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전반에 인용된 서열목록, 도면, 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.
추가로, 본 발명에 따르면, 당 기술 내에 있는 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); 핵산 Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized 세포 And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994))을 참조하라.
실시예 1: 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell) ( PBMC )의 isRNA 전달 및 흡수 평가
전혈로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 구입하고(Allcells, Alameda, CA), 6개의 웰 플레이트에서 배양하였다. 일반적으로, PBMC는 림프구(T-세포, B-세포, NK 세포 등 포함) 및 단핵구로 이루어졌다.
isRNA의 PBMC로의 흡수를 평가하기 위해, 형광 표지된 비표적화된 siGLO 대조군 siRNA (Dharmacon)을 상업적 리포좀 제형인 DharmaFect 4 (DF4) (Dharmacon), 또는 어떠한 목적으로도 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제8,680,045호에 기술되어 있는 폴리펩티드-기반 나노입자인 ELP-L로 응축시켰다.
실온에서 30분 동안 ELP-L 단백질의 농도를 증가시키면서 100 pmol (1.33 μg)의 isRNA를 인큐베이팅함으로써 isRNA:ELP-L 나노복합체(nanocomplex)를 확인하였다. 이후, 생성물을 120V에서 30분 동안 1X TAE 완충액 중 1 % 아가로스 겔 상에서 전기영동 분리로 처리하였다. ELP-L 나노입자로의 isRNA의 특이적 결합이 그것의 크기를 35,000 달톤으로부터 500배 증가시켰다. 따라서, isRNA/ELP-L 나노복합체 형성이 그것의 고분자량(데이타 미기재)을 인해 아가로스 겔의 웰 내에서 관찰된 나노복합체 보유로 확인되었다. isRNA/ELP-L의 나노복합체를 이러한 방식으로 모든 시험관내 및 생체내 연구에 대해 제형화하였다.
응축된 siGLO siRNA의 PBMC로의 흡수를 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 정량화하고, 40X 배율로 Olympus IMT-2 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, DF4에 노출된 세포보다 ELP-L 나노복합체에 노출된 세포에서 siGLO의 흡수가 훨씬 더 컸다.
실시예 2. PBMC에 의해 활성화된 인간 난소암 세포에 대한 isRNA의 효과.
반딧불 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 SKOV-3 세포주(인간 난소암 세포)를 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 pGL-3 플라스미드(Promega)로부터 생성하였다. 이 세포주(SKOV-3 GL3로서 지칭됨)로부터의 루시퍼라제 발현을 하기 연구에서 세포 생존률에 대한 대용으로서 사용하였다.
isRNA 듀플렉스를 Dharmacon (Lafayette, CO)에 의해 생성하였다. 요컨대, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 따른 올리고누클레오티드를 합성하고, 2'-하이드록실 형태로 변환시키고, 어닐링하고, 탈염하고, 투석하고, 멸균 여과함으로써, isRNA 듀플렉스를 생성하였다. 이중 가닥 RNA 듀플렉스의 형성 및 그 밖의 isRNA 제조 기술에 관한 추가의 상세한 사항은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌(Judge 2006)에 기술되어 있다. 듀플렉스의 실체를 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 확인하였다. 이후, isRNA 듀플렉스를 대조군 siRNA 분자로서 siGLO와 함께, 상기 기술된 바와 같이 DF4 또는 ELP-L로 응축시켰다.
PBMC를 DharmaFECT (DF4) 또는 ELP-L 나노입자를 사용하여 16h 동안 50 nM에서 DF4 또는 ELP-L로 복합체화된 isRNA 또는 siGLO로 처리하였다. SKOV-3 GL3 세포를 24 웰 플레이트의 웰당 2000 개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 16시간 동안 인큐베이팅한 후, 처리된 PBMC를 웰당 20,000의 세포 밀도로 첨가하였다. SK-OV-3 GL3 세포의 루시퍼라제 활성을 4일간의 공동-배양 후 측정하였다(도 3, 그래프 A).
대용으로서 루시퍼라제 발현을 사용하여, 이들 연구는 응축된 isRNA 듀플렉스가 PBMC로 공동 배양된 SKOV-3 세포에서 세포의 생존률을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 이들 생존률 감소는, ELP-L 나노입자를 사용하여 전달된 isRNA 올리고누클레오티드가 공동 배양된 종양 세포의 생존률을 감소시키거나 없앨 수 있는 종을 얻는 PBMC를 활성화시킬 수 있음을 시사하였다.
도 3(그래프 A)에 도시된 바와 같이, 16시간 50 nM isRNA 듀플렉스에 노출된 PBMC와 공동 배양된 SK-OV-3 GL-3 세포는 대조군 siGLO siRNA에 노출된 세포보다 현저히 적은 양의 루시퍼라제를 발현하였다. 구체적으로, isRNA:DF4 복합체에 노출된 PBMC로 공동 배양된 SK-OV-3 GL-3 세포는 siGLO:DF4 복합체로 노출된 PBMC로 공동 배양된 SK-OV-3 GL-3 세포보다 RLU를 95% 적게 생성하였고, isRNA:ELP-L 복합체에 노출된 세포는 siGLO:ELP-L 복합체로 노출된 세포보다 RLU 30% 적게 생성하였다. 대조군으로서, PBMC 공동 배양 없이 50 nM isRNA:DF4 또는 50 nM siGLO:DF4 듀플렉스에 노출된 SKOV-3 GL3 세포에서 루시퍼라제 활성에 대한 효과가 없었다(도 3, 그래프 B).
실시예 3. PBMC에 의해 활성화된 인간 췌장암 세포에 대한 isRNA의 효과.
이전 실시예(실시예 2)의 실험을 인간 췌장암 세포주(Panc1)를 사용하여 반복하였다. 반딧불 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 Panc1 세포주를 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 pGL-3 플라스미드(Promega)로부터 생성하고, 이에 따라 본원에서 Panc1 GL3로서 지칭하였다. isRNA 투여 및 PBMC의 공동 배양에 대한 시간 경과는 실시예 2에서 사용된 것과 동일하였다. Panc1 GL3 세포주로부터 루시퍼라제 발현을 실질적으로 실시예 2에서 상기 언급된 바와 같이 수행된 하기 연구에서 세포 생존률에 대한 대용으로서 사용하였다.
도 4(그래프 A)에 도시된 바와 같이, 16시간 동안 50 nM isRNA 듀플렉스에 노출된 PBMC와 공동 배양된 Panc1 GL-3 세포는 50 nM 대조군 siGLO siRNA에 노출된 PBMC와 공동 배양된 Panc1 GL-3 세포보다 현저히 적은 양의 루시퍼라제를 발현하였다. 대조군으로서, PBMC 공동 배양 없이 50 nM isRNA:DF4 또는 50 nM siGLO:DF4 듀플렉스에 노출된 Panc1 GL3 세포에서 루시퍼라제 발현에 대한 효과가 없었다(도 4, 그래프 B).
이들 결과는 본원에서 제시되는 isRNA 시약으로의 처리 후 PBMC에서 유도된 일반적인 종양 세포 치사 능력 및 실시예 2에서 보여진 항암 효과가 인간 난소암 세포에만 제한되지 않음을 확인시켜 주었다.
실시예 4. RT- PCR에 의한 처리된 PBMC에서 사이토카인의 발현 측정
PBMC는 피검체로부터 암 세포를 제거하기 위해 선천성 면역계의 자연 살해(NK), 수지상, 및 단핵구 세포, 세포독성 T-세포를 활성화시키는 사이토카인을 생성하고 방출한다. isRNA 복합체가 PBMC를 활성화시켜 사이토카인을 생성하는 지를 평가하기 위해, 공동 배양된 세포에 대해 RT-PCR를 수행하여 TLR 활성화에 반응하는 대표적인 사이토카인의 생성을 평가하였다. IL-6 및 인터페론 알파 (INF-α)를 RT-PCR 분석을 위한 대표적인 사이토카인으로서 선택하였다.
실시예 2 및 3에서 언급된 바와 같은 isRNA 복합체로 처리된 공동 배양된 PBMC로부터의 RNA를 GeneJET RNA Purification Kit (Fermentas)를 사용하여 정제하고 정량화하였다. 각 샘플로부터 대략 100 ng의 RNA를, Verso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., MA)사용하는 첫번째 가닥 cDNA 합성에 사용하였다. 첫번째 가닥 cDNA의 작은 부분(대략 샘플의 1/25)을, DreamTaq Green Mix (Fermentas)을 사용하여 IL-6 또는 INF-α를 증폭시키는 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR에 사용하였다. 또한, β-Actin의 발현을 증폭시키고, 표준화 대조군으로서 측정하였다. 기술된 바와 같은 RT-PCR을 추가의 대조군으로서 siGLO로 처리된 PBMC에 대해서도 수행하였다. IL-6, INF-α, 및 β-액틴 cDNA의 PCT 증폭에 사용된 프라이머가 하기에서 표 3에 열거된다.
표 3. 사이토카인 발현의 RT- PCR 측정에 사용되는 서열
Figure pct00003
도 5에 도시된 바와 같이, INF-α 및 IL-6 mRNA의 증가된 발현이 siGLO-처리된 PBMC와 비교하여 isRNA-처리된 PBMC에서 관찰되었다. 이 결과는 isRNA가 PBMC에서 사이토카인 생성을 증가시켰음을 나타내며, 이는 선천성 면역계의 세포, 예컨대 NK, 수지상, 및 단핵구 세포 및 세포독성 T-세포의 증가된 활성화를 나타낸다.
실시예 5. 종양 결절 크기와 수에 대한 isRNA의 효과
생체 내 isRNA의 효과를 시험하기 위해, 무균성 Balb/c 마우스에 SKOV-3 GL3 세포 (루시퍼라제를 발현하는 인간 난소암 세포)를 주사하고, 종양을 4주 동안 성장시켰다. 이후, 2 mg/kg (1회 용량당 ~0.4 mg) 또는 10 mg/kg (1회 용량당 ~1.2 mg)의 농도로 ELP-L로 응축된 isRNA 듀플렉스 또는 비히클(5% 덱스트로스)로 주당 2회씩 4주간 마우스에 투여하였다. isRNA:ELP-L 복합체를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
도 6 (파트 A)에 도시된 바와 같이, 살아있는 마우스에서 루시퍼라제 발광을 측정하였다. 생체발광을 정량화하였으며, 마지막 용량 후 생체발광이 50% 감소율 보다 더 높았음을 나타냈다(도 6, 파트 B).
종양을 마우스에서 절제하고, 계수하고, 칭량하였다. 결과는 표 4 및 도 7에 나타난다. 보여지는 바와 같이, 종양의 무게(도 7, 그래프 A) 및 종양 결절의 수(도 7, 그래프 B)가 용량-의존적 방식으로 감소하였다. 이들 결과는, 실시예 1에서 제조된 바와 같은 ELP-L로 응축된 isRNA 듀플렉스가 생체내에서 항종양 활성을 나타냄을 시사한다.
표 4. 다양한 농도의 isRNA로 투여된 마우스로부터의 종양 결절의 무게 및 수
Figure pct00004
실시예 6. isRNA 듀플렉스로 종양 치료 후 마우스에서의 사이토카인 발현 측정
isRNA 듀플렉스가 마우스에 투여되는 경우 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 지를 알아보기 위해, RT-PCR를 사용하여 10 mg/ml로 isRNA 듀플렉스로 처리된 마우스로부터 절제된 종양 내 IL-6 및 INF-α의 발현을 측정하였다. 비히클(5% 덱스트로스)가 투여된 마우스로부터 절제된 종양 내 IL-6 및 INF-α의 발현을 또한 대조군으로서 측정하였다. 실시예 4에서 앞서 기술된 바와 같이 RT-PCR를 수행하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 10 mg/ml로 isRNA 듀플렉스의 투여 요법을 받은 마우스는 INF-α의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 이 특별한 실험에서 두 그룹 간의 IL-6 발현에는 유의한 차이가 없는 것으로 관찰되었다.
실시예 7. isRNA 처리된 마우스에서의 간 및 신장 손상 평가.
간 및 신장 기능의 통상적인 바이오마커를 측정함으로써 isRNA 및 비히클이 투여된 마우스에서의 간 및 신장 손상 평가를 수행하였다. 결과가 하기 표 5에 기재된다. 10 mg/kg로 isRNA 투여 요법을 받은 마우스는 비히클이 투여된 마우스에 비해 약 67%의 평균 AST 증가 및 약 128%의 평균 ALT 증가를 나타냈다(표 5, 컬럼 1-2 참조). 이러한 증가에도 불구하고, 10 mg/kg로 isRNA가 투여된 마우스에 대한 AST 및 ALT 수치는 정상 허용범위 내에 들었다. 크레아티닌에 대한 혈액 요소 질소(BUN)의 비는 isRNA과 비히클-투여된 그룹 간에 어떠한 유의한 증가를 나타내지 않았다(표 5, 컬럼 3-5 참조). 이러한 간 및 신장 독성 결핍은 isRNA가 종양 세포에 성공적으로 전달되었지만, 정상적인 건강한 세포에는 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 이들 결과는 안전하고 효과적인 항종양제인 ELP-L 나노입자를 사용한 isRNA 전달과 일치한다.
표 5. 28일 투여 요법 후 마우스의 혈액 화학
Figure pct00005
모든 결과는 평균± SEM로서 기재됨.
본 발명을 이의 특정 구체예를 참조하여 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구 범위에서 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 수정 및 변형이 가능하다는 것은 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일부 양태가 본원에서 특히 유리한 것으로 확인되었지만, 본 발명이 반드시 본 발명의 이러한 특정 양태로 한정되는 것은 아닌 것으로 고려되어야 한다.
인용된 참고문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
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Claims (27)

  1. 종양 내에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 분리된 올리고누클레오티드;
    종양 세포-표적화 모이어티(tumor cell-targeting moiety); 및
    이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 종양 세포 성장을 표적화하고 억제하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 올리고누클레오티드가 하나 이상의 UG-풍부 모티프(UG-rich motif)를 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고누클레오티드가 3' 말단 근처에 높은 비율의 구아노신 및 우리딘 잔기를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드가 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드가 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드가 이중 가닥인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 이중 가닥 올리고누클레오티드가
    SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는 가닥, 및
    SEQ ID NO: 2의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 이중 가닥 올리고누클레오티드가
    SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 포함하는 가닥, 및
    SEQ ID NO: 4의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 이중 가닥 올리고누클레오티드가
    SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함하는 가닥, 및
    SEQ ID NO: 6의 핵산 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드가 세포에서 선천성 면역계의 활성화를 촉진하는 적어도 하나의 변형된 누클레오티드를 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 변형된 누클레오티드가 변형된 리보스(ribose)를 포함하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 변형된 누클레오티드가 O-메틸 또는 플루오로 변형을 포함하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 변형된 누클레오티드가 올리고누클레오티드의 5' 말단으로부터 두번째 위치에 있는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포-표적화 모이어티가 단백질, 펩티드, 또는 앱타머(aptamer)인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 나노입자를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 나노입자가 지질, 사이클로덱스트린, 키토산, 탄수화물 폴리머, 엘라스틴-유사 폴리머(elastin-like polymer)(ELP), 칼슘 포스페이트 폴리머, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 나노입자가 페길화되는(PEGylated) 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 나노입자가 ELP-L인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 리포좀으로 캡슐화되는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 리포좀이 페길화되는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물; 및
    약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 애주번트(adjuvant)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 화학치료 약물 또는 제제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제(immunity checkpoint inhibitor)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 방법으로서,
    종양 세포에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하고;
    종양 세포를, 종양 세포 성장을 억제시키기에 충분한 양의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 조성물이 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
  26. 피검체의 종양 세포에서 특이적으로 피검체의 선천성 면역 반응을 활성화시키는 방법으로,
    종양 세포에서 선천성 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 올리고누클레오티드를 얻고;
    올리고누클레오티드를 종양 세포-표적화 모이어티와 접촉시켜 피검체의 종양 세포에 올리고누클레오티드를 특이적으로 전달할 조성물을 형성시키고;
    약제학적 유효량의 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 인간의 방광 세포, 인간 유방 세포, 인간 결장 세포, 인간 간세포, 인간 폐 세포, 인간 신경 모세포종 세포, 인간 난소 세포, 인간 췌장 세포, 인간 전립선 세포 또는 인간 피부 세포인 방법.
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