KR20220110723A - 암 치료를 위한 TGF-β SIRNA 및 PDL1 SIRNA의 공동 전달 - Google Patents

암 치료를 위한 TGF-β SIRNA 및 PDL1 SIRNA의 공동 전달 Download PDF

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KR20220110723A
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데이비드 엠. 에반스
패트릭 와이. 루
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서나오믹스, 인크.
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Abstract

항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 암을 치료하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

암 치료를 위한 TGF-β SIRNA 및 PDL1 SIRNA의 공동 전달
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 12일에 출원된 미국 가출원 제 62/899,535호에 대해 35 U.S.C. §119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자의 조성물이 암(cancer)을 치료하기 위해 본 조성물을 사용하는 방법과 함께 제공된다.
암의 성장과 진행은 유기체의 면역계의 억제를 포함한다. 악성 세포(malignant cell)는 다양한 기전을 통해 면역 감시를 회피한다.
성장하는 종양의 존재 하에, 종종, 종양 성장에 대한 염증 반응에 의해 유도되어 종양 부위 주변에 TGF-β 수준이 상향조절된다. 증가된 TGF-β는 T 세포가 종양 근처의 조직과 종양 자체로 침투하는 것을 막는 장벽으로 작용한다. (문헌[Tauriello et al., Nature 554:538-543 (2018); Mariathasan et al., Nature 554:544-548 (2018)] 참조). 결과적으로, T-세포는 종양 세포를 인식하고 사멸시키도록 항원적으로 프라이밍 (priming)될 수 없다.
종양 세포는 또한 항종양 면역 반응을 억제하는 면역 체크포인트 경로(immune checkpoint pathway)를 활성화한다. 이러한 경로의 예는 PD-L1/PD1 축이다. PD1 수용체는 T 세포의 표면에 존재하고 PD-L1 단백질은 많은 종양 세포의 표면에 존재한다. PD1에 의한 PD-L1의 결합은 종양 세포를 분해하고 사멸시키는 효소 (그랜자임 B 및 기타)를 방출하는 T 세포의 활성화를 방지한다. 이 효소에 의한 종양 세포의 분해는 종양에 대한 T 세포 매개 면역을 촉진할 수 있는 많은 다른 종양 항원을 방출한다.
면역 체크포인트 억제제는 체크포인트 경로에서 표적을 차단한다. (문헌[Darvin et al., Experimental & Molecular Medicine 50:165 (2018)] 참조). 예를 들어, PDL1 또는 PD1에 결합하고 PDL1과 PD1 사이의 결합을 차단하는 항체는 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma) 및 흑색종 (melanoma)과 같은 여러 종양 적응증에서 암 환자의 개선된 결과를 나타내었다. 그러나 간암에 영향을 미치는 이러한 항체의 능력은 훨씬 더 낮다.
RNA 간섭 (RNAi)은 상동 서열을 포함하는 임의의 유전자를 녹다운 (knockdown) 또는 침묵화(silencing)시키는 방법을 제공하는 서열 특이적 RNA 분해 공정이다. 천연 발생 RNAi에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)는 RNase III/헬리카제 (helicase) 단백질인 Dicer에 의해 3' 말단에 2nt 오버행이 있는 19 내지 27개 뉴클레오타이드 (nt)의 dsRNA인 작은 간섭 RNA (siRNA) 분자로 절단된다. 이 후, siRNA는 RNA-유도-침묵화-복합체 (RISC)라고 하는 다성분 리보뉴클레아제에 혼입된다. siRNA의 한 가닥은 RISC와 결합된 채로 유지되어 RISC의 가이더 ss-siRNA에 상보적인 서열을 갖는 동족 RNA로 복합체를 유도한다. 이 siRNA 유도 엔도뉴클레아제는 RNA를 분해하여 표적화된 RNA의 절단 및 불활성화를 초래한다. 최근 연구에 따르면 포유류 세포에서 RNAi 효과를 나타내는 화학적으로 합성된 21-27-nt siRNA의 유용성이 밝혀졌으며 siRNA 혼성화의 열역학적 안정성 (말단 또는 중간)이 분자의 기능을 결정하는데 중요 역할을 한다는 것이 입증되었다.
중요하게도, 현재로서는 유전자의 mRNA 서열을 잠재적으로 표적화하는 많은 가능한 후보 siRNA 서열 중 어느 것이 효과적인 RNAi 활성을 나타낼 것인지 높은 신뢰도로 예측하는 것이 불가능하다. 대신, 개별적으로 특정한 후보 siRNA 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 서열을 생성하고 포유류 세포 배양에서 시험하여 표적화된 유전자의 발현에 의도된 간섭이 발생했는지를 결정해야 한다.
TGF β에 대한 siRNA 분자 및 PDL1에 대한 siRNA 분자를 포함하는 siRNA 분자의 조합이 제공되며, 이러한 조합을 사용하여 암 세포에 의한 인간 또는 다른 포유류의 면역억제를 감소시키는 방법이 제공된다.
항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 항-TGF-β siRNA 분자는 항-TGF-β1 siRNA 분자를 포함할 수 있다. 하나 또는 두 분자 모두 19개 염기쌍(base pair) 내지 25개 염기쌍의 길이의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 하나 또는 둘 모두는 이의 안정성을 증가시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다.
항-TGF-β1 siRNA 분자는 약 0.1 nM 내지 10 nM의 IC50 값을 가질 수 있고/거나, 표 1에서 확인되는 siRNA 분자로부터 선택될 수 있다. 항-TGF-β1 siRNA 분자는 25량체의 평활 말단 분자(25 mer blunt-end-ended molecule)를 포함할 수 있다. 항-TGF-β1 siRNA 분자는 표 1에서 확인된 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개 위치에서 동일할 수 있고 나머지 위치에서 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다.
항-PDL1 siRNA 분자는 약 0.1 nM 내지 10 nM의 IC50 값을 가질 수 있고/거나, 표 2에서 확인되는 siRNA 분자로부터 선택될 수 있다. 항-PDL1 siRNA 분자는 3' 말단에 2-염기 dTdT 오버행을 갖는 19량체 분자 또는 25량체의 평활 말단 분자를 포함할 수 있다. 항-PDL1 siRNA 분자는 표 2에서 확인된 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개 위치에서 동일할 수 있고 나머지 위치에서 적어도 90% 또는 95% 동일할 수 있다.
항-TGF-β1 siRNA 분자는 5' r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3'을 포함할 수 있고, 항-PDL1 siRNA 분자는 5'-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3' (PDL1 siRNA 센스 가닥 서열)을 포함할 수 있다.
또한 2개 이상의 동일하지 않은 항-TGF-β1 siRNA 분자 및 2개 이상의 동일하지 않은 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체는 가용성 전달제 또는 나노입자-형성제를 포함할 수 있고, 담체는 예를 들어, 식염수 용액, 당 용액, 중합체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 지질, 크림, 겔, 미셀 물질 (micellar material), 실리카 나노입자, 금속 나노입자, 플라스미드, 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 또한 글루코스 용액, 다가양이온 결합제, 양이온 지질, 양이온 미셀, 양이온 폴리펩타이드, 친수성 중합체 그래프트 중합체 (hydrophilic polymer grafted polymer), 비천연 양이온 중합체, 양이온 폴리아세탈, 친수성 중합체 그래프트 폴리아세탈, 리간드 작용성 양이온 중합체, 리간드 작용성-친수성 중합체 그래프트 중합체, 및 리간드 작용성 리포솜 (liposome)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 담체는 생분해성 히스티딘-리신 중합체, 생분해성 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머 (dendrimer), 양이온 지질, 예컨대 DOTAP, DOPE, DC-Chol/DOPE, DOTMA, 및 DOTMA/DOPE, 또는 PEG화된 PEI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 유리하게는, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 히스티딘-리신 공중합체 (HKP)를 포함한다.
HKP는 구조 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 포함할 수 있고, R =KHHHKHHHKHHHKHHHK, K = 리신, 및 H = 히스티딘이다. 담체는 또한 분지형 히스티딘-리신 공중합체일 수 있다. 예를 들어, 분지형 히스티딘-리신 중합체는 화학식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)을 가질 수 있고, R=KHHHKHHHKHHHKHHHK, R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK 또는 R=KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C (O)NH2, K=리신, H=히스티딘, 및 N=아스파라긴이다.
추가의 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 스페르민 (Spermine)-지질 접합체 (SLiC) 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 화학식 Kp{[(H)n(K)m]}y 또는 Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z 또는 화학식 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y 또는 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z의 펩타이드를 포함할 수 있고, K는 리신이고, H는 히스티딘이고, C는 시스테인이고, x는 링커이고, Z는 포유류 세포-표적화 리간드이고, p는 0 또는 1이고, n은 1 내지 5의 정수이고, m은 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, 및 d는 3 또는 4이고, y는 3 내지 10의 정수이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 펩타이드 절단 가능한 결합을 통해 가교결합(cross-link)된 것 중 적어도 2개를 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 조성물은 나노입자를 포함할 수 있고, 나노입자는 예를 들어, 약 40 nm 내지 약 150 nm의 직경일 수 있으며, 약 25 mV 내지 약 45 mV의 제타 전위(Zeta potential)를 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 항-TGF-β siRNA 분자 및 PDL1의 소분자 억제제 또는 PDL1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 항-TGF-β siRNA 분자는 상기에 기재된 바와 같은 항-TGF-β siRNA 분자 또는 항-TGF-β1 siRNA 분자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 담체를 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 항-PDL1 siRNA 분자 및 TGF-β 또는 TGF-β1의 소분자 억제제, 또는 TGF-β 또는 TGF-β1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 항-PDL1 siRNA 분자는 상기 기재된 바와 같은 항-PDL1 siRNA 분자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 담체를 포함할 수 있다.
또한, 포유류에서 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 포유류에게 치료 유효량의 상기 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 포유류에서 암 세포를 포함하는 종양으로의 T-세포 침투를 향상시키는 방법으로서, 포유류에게 치료적 유효량의 상기 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
포유류에서 암 세포를 인식하여 사멸시키기 위해 T 세포를 항원적으로 프라이밍하는 방법으로서,포유류에게 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
포유류에서 암에 대한 T-세포 매개 면역을 촉진하기 위한 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 포유류에게 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
이들 방법 중 어느 하나에서, 암 세포 주변의 미세환경에서 TGF-β1의 수준이 증가되고 본 조성물은 증가된 수준의 TGF-β1을 감소시킨다.
이들 방법 중 임의의 것에서, 암 세포 주변의 미세환경에서 TGF-β1의 수준이 증가될 수 있고, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 증가된 수준의 TGF-β1을 감소시킨다.
이러한 방법에서, 암은 예를 들어, 간암 (liver cancer), 결장암 (colon cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 또는 요로 암종 (urothelial carcinoma)일 수 있다. 간암은 간세포 암종, 전이성 결장암, 또는 전이성 췌장암일 수 있다.
이들 방법 중 임의의 것에서, 포유류는 실험실 동물일 수 있거나 유리하게는 인간일 수 있다.
이러한 방법에서, 상기 기재된 바와 같은 조성물은 암 세포를 포함하는 종양에 직접 주사될 수 있고, 독립적으로 또는 동시에 전달될 수 있다.
도 1은 SK-Hep1 세포에서 시험된 다양한 siRNA 서열에 의한 PDL1 침묵화를 도시한다.
도 2는 Hepa 1-6 간암 세포에서 PDL1 침묵화에 대한 PDL1에 대한 siRNA 노출 시간의 효과를 도시한다.
도 3은 SK-Hep1 세포에서 PDL1 siRNA 스크리닝을 도시한다.
표 1은 TGF-β1에 대한 siRNA의 목록에 대한 siRNA 서열을 나타낸다.
표 2는 PDL1에 대해 시험된 siRNA의 목록에 대한 siRNA 서열을 보여준다.
항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 인간 및 다른 포유류에서 암 세포를 사멸시키기 위해 본 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 일 실시형태에서, 본 조성물은 히스티딘-리신 공중합체와 같은 약제학적으로 가능한 담체를 추가로 포함한다. 항-TGF-β siRNA 분자의 특정 예를 표 1에 나타내었다. 항-PDL1 siRNA 분자의 특정 예를 표 2에 나타내었다.
항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물은 인간 또는 다른 포유류에서 암 세포를 사멸시켜 암을 치료하는데 유용하다. 치료적 유효량의 조성물은 암을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유류에게 투여된다. 이러한 암에는 간암, 결장암 및 췌장암이 포함된다.
정의
항-TGF-β siRNA 또는 TGF-β siRNA: 포유류 세포에서 TGF-β 단백질 합성을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 siRNA 분자.
항-TGF-β1 siRNA 또는 TGF-β1 siRNA: 포유류 세포에서 TGF-β1 단백질 합성을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 siRNA 분자.
항-PDL1 siRNA 또는 PDL1 siRNA: 포유류 세포에서 PDL1 단백질의 합성을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 siRNA 분자.
siRNA 분자: 짧은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드로, 분자가 세포에 도입된 후 세포에서 유전자의 발현을 간섭하는 이중체 올리고뉴클레오타이드. 예를 들어, 이는 단일 가닥 표적 RNA 분자에서 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고 결합한다. SiRNA 분자는 당업자에게 공지된 기술에 의해 화학적으로 합성되거나 그렇지 않으면 작제된다. 이러한 기술은 미국 특허 제 5, 898,031호, 제 6,107,094호, 제 6,506,559호, 제 7,056,704호, 제 RE46,873 E호 및 제 9,642,873 B2호 및 유럽 특허 제 1214945호 및 제 1230375호에 기재되어 있으며, 상기 문헌 모두는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 이 분야의 관례에 따르면, siRNA 분자가 특정 뉴클레오타이드 서열로 확인될 때, 그 서열은 이중체 분자의 센스 가닥을 지칭한다. 분자를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 개별 뉴클레오타이드 수준에서 변형되는 것 외에도, 올리고뉴클레오타이드의 골격이 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용한 화학적 변형에 의해, 예를 들어 2'-OMe 및/또는 2'-F 및/또는 포스포로티오에이트 변형의 사용에 의해 뉴클레아제 분해에 대해 안정화될 수 있다. 추가 변형에는 siRNA 분자에 접합하기 위한 소분자 (예를 들어, 당 분자), 아미노산, 펩타이드, 콜레스테롤 및 기타 큰 분자의 사용이 포함된다.
암은 임의의 악성 종양이다.
악성 종양은 신생물 세포의 덩어리이다.
간암: 간 내의 임의의 원발성 암, 즉, 간에서 개시되는 암; 또는 간 내의 임의의 이차 암, 즉 포유류 신체의 다른 조직으로부터 간으로 전이되는 암. 원발성 간암의 예는 간세포 암종이다. 이차 간암의 예는 결장암이다.
치료하는/치료: 암 세포의 일부 또는 전부를 사멸시키거나, 암의 크기를 감소시키거나, 암의 성장을 억제하거나, 암의 성장 속도를 감소시키는 것.
히스티딘-리신 공중합체: 히스티딘 및 리신 아미노산으로 구성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드. 이러한 공중합체는 미국 특허 제 7,070,807 B2호, 제 7,163,695 B2호, 및 제 7,772,201 B2호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
면역 체크포인트 억제제: 일부 유형의 면역계 세포, 예컨대 T 세포 및 일부 암 세포에 의해 생성되는 특정 단백질을 차단하는 소분자 약물 또는 항체. 이 체크포인트 단백질은 체크 시 면역 반응을 유지하고 T 세포가 암 세포를 사멸시키도록 유지시킬 수 있다. 이러한 체크포인트 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 해제되고 T 세포는 암 세포를 더 잘 사멸시킬 수 있다. T 세포/암 세포에 존재하는 체크포인트 단백질의 예는 PD-1/PD-L1 (각각)을 포함한다.
항종양 효능 향상: 종양 세포의 성장률을 더 크게 감소시키고, 종양 세포의 사멸에 더 큰 효과를 제공하고/거나 종양 질량을 감소시켜, 궁극적으로 종양 환자의 수명을 연장함으로써 더 나은 치료 효과를 생성하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 종양 세포 자체에 대한 직접적인 작용 또는 T 세포의 활성 증가 또는 T 세포가 종양 세포에 더 잘 접근할 수 있도록 하고/거나 활성화되어 초기 치료 후에도 종양 세포를 인식하는 능력의 증가에 관계없이 종양에 대한 더 강한 면역 반응을 촉진하는 기전에 의해 매개될 수 있다.
종양 내로의 T-세포 침투 향상: 종양 덩어리 내에서 더 많은 수의 T-세포가 관찰된다는 관찰을 의미한다. 일반적으로 침투는 종양의 중심을 향하고 주변 조직으로부터 멀어진다. 정상 조직으로부터 멀리 떨어진 임의의 깊이에서 해당 깊이에서 관찰된 특정 T 세포의 수는 처리되지 않은 샘플에 비해 증가한다.
TGF-β의 소분자 억제제: TGF-β에 결합할 수 있고/거나, 달리는 가장 가능하게는 임의의 수용체와 TGF-β의 결합을 억제하거나, 표적 수용체와 TGF-β의 결합에 의해 유도되는 하류 효소 활성 또는 신호전달을 억제하여 TGF-β 기능의 억제를 초래할 수 있는 일반적으로 1000달톤 미만의 분자량을 갖는 화학적 화합물. 이러한 억제제는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Huynh et al., Biomolecules 9:743 (2019)]을 참조한다.
TGF-β1의 소분자 억제제: TGF-β1에 결합할 수 있고/거나, 달리는 가장 가능하게는 임의의 수용체와 TGF-β1의 결합을 억제하거나, 표적 수용체와 TGF-β1의 결합에 의해 유도되는 하류 효소 활성 또는 신호전달을 억제하여 TGF-β1 기능의 억제를 초래할 수 있는 일반적으로 1000달톤 미만의 분자량을 갖는 화학적 화합물.
TGF-β의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제: 포유류 세포 내에서 TGF-β의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 (통상적으로 11 내지 27개 염기).
TGF-β1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제: 포유류 세포 내에서 TGF-β1의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 (통상적으로 11 내지 27개 염기).
PDL1의 소분자 억제제: PDL1에 결합할 수 있고/거나, 달리는 가장 가능하게는 T 세포 상의 수용체 (PD1)와 PDL1의 결합을 억제하거나, 표적 수용체 (PD1)와 PDL1의 결합에 의해 유도되는 하류 효소 활성 또는 신호전달을 억제하여 PDL1 기능의 억제를 초래할 수 있는 일반적으로 1000달톤 미만의 분자량을 갖는 화학적 화합물.
PDL1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제: 포유류 세포 내에서 PDL1의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 (통상적으로 11 내지 27개 염기).
담체 조성물
본 조성물은 유리하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 적합한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 가용성 전달제 또는 나노입자-형성제를 포함할 수 있다. 담체는 예를 들어, 하나 이상의 성분 예컨대 식염수 용액, 당 용액, 중합체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 지질, 크림, 겔, 미셀 물질, 실리카 나노입자, 금속 나노입자, 플라스미드, 또는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 또한 예를 들어, 글루코스 용액, 다가양이온 결합제, 양이온 지질, 양이온 미셀, 양이온 폴리펩타이드, 친수성 중합체 그래프트 중합체, 비천연 양이온 중합체, 양이온 폴리아세탈, 친수성 중합체 그래프트 폴리아세탈, 리간드 작용성 양이온 중합체, 리간드 작용성-친수성 중합체 그래프트 중합체, 또는 리간드 작용성 리포솜일 수 있다. 다른 실시형태에서, 담체는 생분해성 히스티딘-리신 중합체, 생분해성 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 양이온 지질, 예컨대 DOTAP, DOPE, DC-Chol/DOPE, DOTMA, 및 DOTMA/DOPE, 또는 PEG화된 PEI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
유리하게는, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 히스티딘-리신 공중합체 (HKP)를 포함한다. HKP는 구조 (R)K(R)-K(R)-(R)K (X)를 포함할 수 있고, R=KHHHKHHHKHHHKHHHK, K = 리신, 및 H = 히스티딘이다. 담체는 또한 분지형 히스티딘-리신 공중합체일 수 있다. 예를 들어, 분지형 히스티딘-리신 중합체는 화학식 (R)K (R)-K (R)- (R)K (X)을 가질 수 있으며, R=KHHHKHHHKHHHKHHHK, R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK 또는 R=KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C (O)NH2, K=리신, H=히스티딘, 및 N=아스파라긴이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 또한 예를 들어, 스페르민-지질 접합체 (SLiC) 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 화학식 Kp{[(H)n (K)m]}y 또는 Kp{[(H)n (K)m]}y-C-x-Z 또는 화학식 Kp{[(H)a (K)m (H)b (K)m (H)c (K)m (H)d (K)m]}y 또는 Kp{[(H)a (K)m (H)b (K)m (H)c (K)m (H)d (K)m]}y-C-x-Z의 펩타이드를 포함할 수 있고, K는 리신이고, H는 히스티딘이고, C는 시스테인이고, x는 링커이고, Z는 포유류 세포-표적화 리간드이고, p는 0 또는 1이고, n은 1 내지 5의 정수이고, m은 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, 및 d는 3 또는 4이고, y는 3 내지 10의 정수이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 펩타이드 절단 가능한 결합을 통해 가교결합된 것 중 적어도 2개를 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 조성물은 나노입자를 포함할 수 있고, 나노입자는 예를 들어 직경이 약 40 nm 내지 약 150 nm일 수 있고 제타 전위가 약 25 mV 내지 약 45 mV일 수 있다. 이러한 나노입자의 크기 및 제타 전위를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시하는 것으로, 그의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
2개의 siRNA의 나노입자 전달 조합이 제공된다: TGF-β를 표적화하는 1개의 siRNA 및 PDL1 (종양 세포 상에 존재)을 표적화하는 1개의 siRNA. 이러한 방식으로 종양 부위 내부 및 주변의 세포가 물질을 흡수하면 TGF-β가 감소하고 (즉, T 세포 침투를 방지함), PD-L1이 종양 세포 표면에서 침묵화되고, 그 결과 면역 체크포인트가 손실되어 T 세포에 의해 종양 세포가 사멸된다.
TGF-β1을 침묵화시키기 위해 사용될 수 있는 다중 siRNA 서열이 확인되었다. 예에는 다음이 포함된다:
Figure pct00001
hmTF-25-1: 센스 5'-r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3'
안티센스 5'-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3'
hmTF-25-2: 센스 5'-r (CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3'
안티센스 5'-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3'
hmTF-25-3: 센스 5'-r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3'
안티센스 5'-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3'
hmTF25-4: 센스, 5'-r(GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU)-3'
안티센스, 5'-r(AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3'
hmTF25-5: 센스, 5'-r(CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA)-3'
안티센스, 5'-r(UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUCGUG)-3'
hmTF25-6: 센스, 5'-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3'
안티센스, 5'-r(CCACCAUUAGCACGCGGGUGACCUC)-3'
hmTF25-7: 센스, 5'-r(GUACAACAGCACCCGCGACCGGGUG)-3'
안티센스, 5'-r(CACCCGGUCGCGGGUGCUGUUGUAC)-3'
hmTF25-8: 센스, 5'-r(GUGGAUCCACGAGCCCAAGGGCUAC)-3'
안티센스, 5'-r(GUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCCAC)-3'
PDL1을 침묵화시키기 위해 사용될 수 있는 다중 siRNA 서열이 확인되었지만, 배양물(culture) 중 세포에서 표적 유전자를 침묵화시키는 효능에 기초하여 다음 서열이 선택되었다:
Figure pct00002
1) 센스 5'-GGAUCCAGUCACCUCUGAACAUGAA-3'
안티센스 5'-UUCAUGUUCAGAGGUGACUGGAUCC-3'
2) 센스 5'-GGUGUUGGAUUUGTAAGGCACUUUA-3'
안티센스 5'-UAAAGUGCCUUACAAAUCCAACACC-3'
3) 센스 5'-GGAUUUGUAAGGCACUUUAUCCCUU-3'
안티센스 5'-AAGGGAUAAAGUGCCUUACAAAUCC-3'
4) 센스 5'-GGUGCACUGAGUCAAUCUAGUCCUA-3'
안티센스 5'-UAGGACUAGAUUGACUCAGUGCACC-3'
5) 센스 5'-CCUCCUUGUGGUGUUGGAUUUGTAA-3'
안티센스 5'-UUACAAAUCCAACACCACAAGGAGG-3'
6) 센스 5'-CCUCAUUCGUUGUGCUUGAACCCUU-3'
안티센스 5'-UUUCAUUUGGAGGAUGUGCCAGAGG-3'
7) 센스 5'-CCTCATTCGTTGTGCTTGAACCCTT-3'
안티센스 5'-AAGGGUUCAAGCACAACGAAUGAGG-3'
8) 센스 5'-CCUUUGUCUCAUGUUUCAUCGUAA-3'
안티센스 5'-CCUUUUGUCUCAUGUUUCAUCGUAA-3'
9) 센스 5'-GCACUGACAUUCAUCUUCCGUUUAA-3'
안티센스 5'-UUAAACGGAAGAUGAAUGUCAGUGC-3'
10) 센스 5'-CCAAGGACCUAUAUGUGGUAGAGUA-3'
안티센스 5'-UACUCUACCACAUAUAGGUCCUUGG-3'
11) 센스 5'-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU dTdT-3'
안티센스 5'-ACAGACUCAAAAUAAAUAG dTdT-3'
12) 센스 5'-UGAAAGUCAAUGCCCCAUA dTdT-3'
안티센스 5'-UAUGGGGCAUUGACUUUCA dTdT-3'
13) 센스 5'-GAAAGUCAAUGCCCCAUAC dTdT-3'
안티센스 5'-GUAUGGGGCAUUGACUUUC dTdT-3'
14) 센스 5'-CAAAAUCAACCAAAGAAUU dTdT-3'
안티센스 5'-AAUUCUUUGGUUGAUUUUG dTdT-3'
15) 센스 5'-GCAAUUCUUUUAUUCAAAAdTdT-3'
안티센스 5'-UUUUGAAUAAAAGAAUUGCdTdT-3'
인간 간 선암종 SK-Hep1 세포를 10% FBS가 보충된 ATCC-조제된 이글 최소 필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium) (Cat. no. 30-2003)에서 배양하였다. 형질감염 전날, 세포를 1x105 세포/웰의 밀도로 12웰 플레이트에 시딩하였다. 제조 프로토콜에 따라 리포펙타민 (Lipofectamine) RNAiMAX 형질감염 시약 (ThermoFisher Sci., cat. No. 13778075)을 사용하여 siRNA를 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 복합 혼합물을 50 nM의 siRNA 농도에서 세포에 첨가하였다.
형질감염 48시간 후에, QIAGEN RNeasy Plus Mini 키트 (Cat # 74134)를 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. cDNA를 RT-qPCR용 Maxima 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (ThermoFisher Sci., cat. No. K1641)을 사용하여 합성하였으며, PDL1 mRNA의 수준을 TaqMan Universal PCR 마스터 믹스 (ThermoFisher Sci., cat.No 4304437)를 사용한 qPCR에 의해 평가하였다.
인간 PDL1에 대한 프라이머 및 프로브(probe)의 서열은 다음과 같다:
5'-GGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCA-3' (정방향),
5'-AACGGAAGATGAATGTCAGTGCTA-3' (역방향), 및
PDL1 FAM 프로브-AGATGGCTCCCAGAATTACCAAGTGAGTCC.
인간 GAPDH에 대한 프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3' (정방향),
5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3' (역방향)
GAPDH FAM 프로브에 대한 것 - AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC.
QuantStudio3 (ThermoFisher)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 증폭 조건은 50℃ 5분, 95℃ 20초로 설정했으며 95℃ 15초 및 60℃ 1분의 40주기를 포함하였다. 표적 유전자의 RNA 수준을 2-△△Ct 방법에 따라 결정하였다. GAPDH 유전자를 샘플 정규화에 사용하였다. PDL1 발현을 비침묵화 siRNA로 처리한 세포와 비교하였다.
확인된 서열 중에서, 표 2의 서열 11은 PDL1 유전자의 마우스 및 인간 형태 둘 모두와 동일성을 갖고 유전자 침묵화에서 약 1 nM의 IC50을 나타낸다. 서열 8, 9 및 10은 인간 유전자를 침묵화시키는데 매우 높은 효능 (1 nM 이하)을 갖는 PDL1의 인간 서열에 고유하지만, 마우스 PDL1 서열에 대한 동일성은 없다 (결과적으로 활성이 없음). 서열 14는 PDL1의 마우스와 인간 서열 사이에 95% 동일성을 나타낸다. 결과적으로, 이들 서열 중 임의의 것은 인간 유래 암에서 PDL1을 침묵화시키는데 사용될 수 있다.
마우스 및 인간 PDL1과 동일성을 갖는 PDL1 서열 11을 선택하였다. 이 서열은 평활 말단의 19량체 또는 안정성을 위해 말단에 dTdT가 추가된 21량체일 수 있다. 이 서열은 생체내에서 종양 성장을 정지시키는 산물의 효능을 평가하기 위해 동계 (마우스) 동소 HCC 모델의 사용을 가능하게 한다. PDL1을 침묵화시키는 이 서열의 능력을 24h에 약 1 nM에서 IC50을 갖는 Hepa1-6 (마우스 HCC) 세포에서 입증하였다. 이 서열의 장점은 유효성 및 독성 시험에 필요한 마우스와 인간 모델 사이를 이동할 때 서열을 변경할 필요가 없다는 것이다.
시험관내 시험
각각의 siRNA 농도가 최종적으로 0.5 mgs/ml가 되도록 3:1 비율로 2개의 siRNA의 등몰 혼합물과 HKP를 빠르게 혼합함으로써 분지형 폴리펩타이드 - 히스티딘 리신 공중합체 (HKP)로 상기 기재된 2개의 siRNA를 제형화하였다. 그런 다음 이 물질을 동결건조하여 분말을 형성하였다. 분말을 80 μl 주입 부피가 40 μg (농도는 0.5 mg/ml)을 유지하도록 D5W (수중 포도당 5%)에 재용해하였다. 각 바이알을 주위 실온으로 증가시켰다. 주석 캡 커버를 70% 에탄올로 세척하였다. 1회용 주사기를 사용하여 5% 글루코스 주사용액 (또는 주사용 증류수)을 동결건조 분말이 들어 있는 각 바이알에 첨가하였다. 5 내지 10초 동안 간단히 교반한 후, 물질을 실온에서 10분 동안 벤치에 배치한 다음, 약물을 사용하기 전에 얼음 위에 두었고, 이때 적절한 농도로 희석하였다.
참조문헌
추가 참조: 2019년 5월 23일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2019/033829는 핵산 치료제를 위한 제어 가능한 공동 커플링 폴리펩타이드 나노입자 전달 시스템의 조성물 및 방법에 대해 출원되었으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
발행된 특허 및 공개된 특허 출원을 포함하여 본 명세서에서 확인된 모든 간행물, 및 url 주소 또는 등록 번호로 확인된 모든 데이터베이스 항목은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명이 특정 실시형태와 관련하여 기재되고 예시의 목적으로 많은 세부사항이 제시되었지만, 당업자는 본 발명이 추가 실시형태에 의해 쉽게 응용 가능하고, 본 명세서에 기재된 특정 세부 사항은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 변경될 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (63)

  1. 항-TGF-β siRNA 분자 및 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항-TGF-β siRNA 분자는 항-TGF-β1 siRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 또는 2개 분자 모두는 19개의 염기쌍(base pair) 내지 25개의 염기쌍의 길이의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 분자 중 하나 또는 2개 모두는 이의 안정성을 증가시키기 위해 화학적으로 변형된, 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 약 0.1 nM 내지 10 nM의 IC50 값을 갖는, 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 표 1에서 확인되는 siRNA 분자로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 25량체의 평활 말단 분자(25 mer blunt-end-ended molecule)를 포함하는, 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 표 1에서 확인되는 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개에서 동일하고 나머지 위치에서 적어도 90% 동일한, 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 표 1에서 확인되는 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개에서 동일하고 나머지 위치에서 적어도 95% 동일한, 조성물.
  10. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PDL1 siRNA 분자는 약 0.1 nM 내지 10 nM의 IC50 값을 갖는, 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-PDL1 1 siRNA 분자는 표 2에서 확인되는 siRNA 분자로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-PDL1 siRNA 분자는 3' 말단에 2-염기 dTdT 오버행(overhang)을 갖는 19량체 분자 또는 25량체의 평활 말단 분자를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-PDL1 siRNA 분자는 표 2에서 확인되는 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개에서 동일하고 나머지 위치에서 적어도 90% 동일한, 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-PDL1 siRNA 분자는 표 2에서 확인되는 siRNA 분자의 처음 7개 위치 중 6개에서 동일하고 나머지 위치에서 적어도 95% 동일한, 조성물.
  15. 제2항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 5'-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3'을 포함하고, 항-PDL1 siRNA 분자는 5'-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3' (PDL1 siRNA 센스 가닥 서열)을 포함하는, 조성물.
  16. 2개 이상의 동일하지 않은 항-TGF-β1 siRNA 분자 및 2개 이상의 동일하지 않은 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 가용성 전달제(soluble delivering agent) 또는 나노입자-형성제(nanoparticle-forming agent)를 포함하는, 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수 용액, 당 용액(sugar solution), 중합체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 지질, 크림, 겔, 미셀 물질 (micellar material), 실리카 나노입자, 금속 나노입자, 플라스미드, 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는, 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 글루코스 용액, 다가양이온 결합제(polycationic binding agent), 양이온 지질, 양이온 미셀, 양이온 폴리펩타이드, 친수성 중합체 그래프트 중합체 (hydrophilic polymer grafted polymer), 비천연 양이온 중합체, 양이온 폴리아세탈, 친수성 중합체 그래프트 폴리아세탈, 리간드 작용성 양이온 중합체, 리간드 작용성-친수성 중합체 그래프트 중합체, 및 리간드 작용성 리포솜 (liposome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는, 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생분해성 히스티딘-리신 중합체, 생분해성 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머 (dendrimer), 양이온 지질, 예컨대 DOTAP, DOPE, DC-Chol/DOPE, DOTMA, 및 DOTMA/DOPE, 또는 PEG화된(PEGylated) PEI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는, 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 히스티딘-리신 공중합체 (HKP)를 포함하는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, HKP는 구조 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 포함하고, R =KHHHKHHHKHHHKHHHK, K = 리신, 및 H = 히스티딘인, 조성물.
  24. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 분지형(branched) 히스티딘-리신 공중합체를 포함하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 분지형 히스티딘-리신 중합체는 화학식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)을 갖고, R=KHHHKHHHKHHHKHHHK, R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK 또는 R=KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C (O)NH2, K=리신, H=히스티딘, 및 N=아스파라긴인, 조성물.
  26. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 스페르민 (Spermine)-지질 접합체 (SLiC) 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜을 포함하는, 조성물.
  27. 제17항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 화학식 Kp{[(H)n(K)m]}y 또는 Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z 또는 화학식 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y 또는 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z을 갖는 펩타이드를 포함하고, K는 리신이고, H는 히스티딘이고, C는 시스테인이고, x는 링커(linker)이고, Z는 포유류 세포-표적화 리간드이고, p는 0 또는 1이고, n은 1 내지 5의 정수이고, m은 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, 및 d는 3 또는 4이고, y는 3 내지 10의 정수인, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 절단 가능한 결합을 통해 가교결합(cross-link)된 제27항의 펩타이드 중 적어도 2개를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 나노입자를 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 나노입자는 약 40 nm 내지 약 150 nm의 직경이고, 약 25 mV 내지 약 45 mV의 제타 전위를 갖는, 조성물.
  31. 포유류에서 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 포유류에서 암 세포를 포함하는 종양(tumor)으로의 T 세포 침투를 향상시키는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 포유류에서 암 세포를 인식하여 사멸시키기 위해 T 세포를 항원적으로 프라이밍 (priming)하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 포유류에서 암에 대한 T 세포 매개 면역(T-cell mediated immunity)을 촉진하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 주변의 미세환경에서 TGF-β1의 수준이 증가하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 항-TGF-β1 siRNA 분자는 TGF-β1의 증가된 수준을 감소시키는, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 간암 (liver cancer), 결장암 (colon cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 및 요로 암종 (urothelial carcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 간암은 간세포 암종, 전이성 결장암, 또는 전이성 췌장암을 포함하는, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 실험실 동물인, 방법.
  40. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 인간인, 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포를 포함하는 종양에 직접 주사되는, 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포에 독립적으로 전달되는, 방법.
  43. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포에 동시에 전달되는, 방법.
  44. 항-TGF-β siRNA 분자 및 PDL1의 소분자 억제제 또는 PDL1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는, 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 항-TGF-β siRNA 분자는 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-TGF-β siRNA 분자 또는 항-TGF-β1 siRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  46. 항-PDL1 siRNA 분자 및 TGF-β의 소분자 억제제 또는 TGF-β의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는, 조성물
  47. 항-PDL1 siRNA 분자 및 TGF-β1의 소분자 억제제 또는 TGF-β1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 항-PDL1 siRNA 분자는 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항-PDL1 siRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에서 확인되는 약제학적으로 허용 가능한 담체 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  51. 포유류에서 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 포유류에서 암 세포를 포함하는 종양으로의 T 세포 침투를 향상시키는 방법으로서, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 포유류에서 암 세포를 인식하여 사멸시키기 위해 T 세포를 항원적으로 프라이밍하는 방법으로서, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 포유류에서 암에 대한 T 세포 매개 면역을 촉진하는 방법으로서, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 주변의 미세환경에서 TGF-β1의 수준이 증가하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 조성물은 TGF-β1의 증가된 수준을 감소시키는, 방법.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 간암, 결장암, 췌장암, 및 요로 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 간암은 간세포 암종, 전이성 결장암, 또는 전이성 췌장암을 포함하는, 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 실험실 동물인, 방법.
  60. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 인간인, 방법.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포를 포함하는 종양 내로 직접 주사되는, 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포에 독립적으로 전달되는, 방법.
  63. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 세포에 동시에 전달되는, 방법.
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