CN114980903A - 共递送TGF-β SIRNA和PDL1 SIRNA用于治疗癌症 - Google Patents

共递送TGF-β SIRNA和PDL1 SIRNA用于治疗癌症 Download PDF

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Abstract

提供包含抗TGF‑β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子的组合物。还提供使用这些组合物用于治疗癌症的方法。所述抗TGF‑β的siRNA分子可包含抗TGF‑βI的siRNA分子。一种或两种分子可包含长度为19个碱基对至25个碱基对的寡核苷酸，以及一种或两种可以经化学修饰以增加其稳定性。

Description

共递送TGF-βSIRNA和PDL1 SIRNA用于治疗癌症
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年9月12日提交的美国临时专利申请系列第62/899,535号的优先权，其整体内容通过引用并入本文。
技术领域
提供了抗TGF-β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子的组合物，以及使用该组合物以治疗癌症的方法。
背景技术
癌的生长和进展涉及生物体的免疫系统的抑制。恶性细胞通过不同的机制逃避免疫监视。
在存在生长的肿瘤时，由于针对肿瘤生长的炎症反应的诱导，肿瘤部位周围的TGF-β水平通常上调。升高的TGF-β作为屏障防止T细胞渗透到肿瘤附近组织和进入肿瘤本身。(参见Tauriello等人，Nature 554:538–543(2018)；Mariathasan 等人，Nature 554:544–548(2018))。因此，T细胞不能被抗原性启动(prime)以识别肿瘤细胞并杀伤(kill)它们。
肿瘤细胞还激活抑制抗肿瘤免疫反应的免疫检查点通路。这种通路的一个示例是PD-L1/PD1轴(axis)。PD1受体存在于T细胞的表面，PD-L1蛋白存在于许多肿瘤细胞的表面。PD1与PD-L1的结合阻止了T细胞激活，从而不释放降解并杀伤肿瘤细胞的酶(颗粒酶B和其他酶)。这些酶对肿瘤细胞的消化释放出一些其他肿瘤抗原，这些抗原可以促进T细胞介导的针对肿瘤的免疫。
免疫检查点抑制剂封闭检查点通路中的靶标。(参见Darvin等人，Experimental &Molecular Medicine 50:165(2018))。例如，结合PDL1或PD1从而阻断PDL1 和PD1之间结合的抗体已证明在许多肿瘤适应症(如霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤) 的癌症患者中结果有所改善。然而，这些抗体对肝癌产生影响的能力要低得多。
RNA干扰(RNAi)是序列特异性RNA降解方法，其提供敲除(knockdown) 或沉默任何包含同源序列的基因的途径。在天然存在的RNAi中，双链RNA (dsRNA)被RNase III/解旋酶蛋白Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)分子，即在3’端具有2-nt突出(overhang)的19-27个核苷酸(nt)的dsRNA。然后，siRNA 整合至称为RNA诱导沉默复合物(RNA-induced-silencing-complex，RISC)的多组分核糖核酸酶中。siRNA的一条链保持与RISC相关联以将复合物引导至同源 RNA，该同源RNA具有与RISC中的向导(guider)ss-siRNA互补的序列。这种siRNA引导(direct)的核酸内切酶消化RNA，导致目标RNA被截短和失活。最近的研究揭示了采用化学合成的21-27nt的siRNA在哺乳动物细胞中表现出RNAi 的效果，并证明了siRNA杂交(在末端或中间)的热力学稳定性在决定分子功能方面起着核心作用。
重要的是，目前不可能高度可信地预测在许多可能的潜在靶向基因的mRNA 序列的候选siRNA序列中，哪些实际上会表现出有效的RNAi活性。相反，必须生成个体特异性的候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列，并将其在哺乳动物细胞培养物中测试，以确定是否发生对目标基因表达的预期干扰。
提供包含针对TGFβ的siRNA分子和针对PDL1的siRNA分子的siRNA分子的组合，以及使用这些组合来降低癌细胞对人或其他哺乳动物的免疫抑制的方法。
发明内容
提供的是包含抗TGF-β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子的组合物。抗 TGF-β的siRNA分子可以包含抗TGF-β1的siRNA分子。一种或两种分子可以包含长度为19个碱基对至25个碱基对的寡核苷酸，以及一种或两种分子可以经化学修饰以增加其稳定性。
抗TGF-β1的siRNA分子可以具有在约0.1nM至10nM之间的IC50值，和/ 或可以选自表1中限定的siRNA分子。抗TGF-β1的siRNA分子可以包含25mer 的以平末端结尾的分子。抗TGF-β1的siRNA分子可以与在表1中限定的siRNA 分子的前7个位置中的6个相同，并且在其余位置也至少90％或95％相同。
抗PDL1的siRNA分子可具有在约0.1nM和10nM之间的IC50值和/或可选自表2中限定的siRNA分子。抗PDL1的siRNA分子可以包含3'末端有2碱基dTdT 突出的19mer分子，或25mer的平末端分子。抗PDL1的siRNA分子与在表2中限定的siRNA分子的前7个位置中的6个可以相同，并且在其余位置也至少90％或95％相同。
抗TGF-β1的siRNA分子可以包含5'r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUU CU)-3’，抗PDL1的siRNA分子可以包含5’-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3’ (PDL1 siRNA有义链序列)。
还提供包含含有两种或更多种不同抗TGF-β1的siRNA分子以及两种或更多种不同抗PDL1的siRNA分子的组合物。
该组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。载体可以包含可溶性递送剂或纳米颗粒形成剂，以及载体可以包含，例如，选自盐水溶液、糖溶液、聚合物、肽、多肽、脂质、乳膏、凝胶、胶束材料、二氧化硅纳米颗粒、金属纳米颗粒、质粒和病毒载体的一种或多种组分。药学上可接受的载体还可以选自：葡萄糖溶液、聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物、配体官能化-亲水聚合物接枝聚合物和配体官能化脂质体。在其他实施方案中，载体可以包含一种或多种组分，其选自可生物降解的组氨酸-赖氨酸聚合物、可生物降解的聚酯(例如，聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA) 和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物、阳离子脂质(例如DOTAP、DOPE、DC-Chol/DOPE、DOTMA和DOTMA/DOPE)、或聚乙二醇化的PEI。有利地，药学上可以接受的载体包含组氨酸-赖氨酸共聚物 (HKP)。
HKP可以包含结构(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝ KHHHKHHHKHHHKHHHK、K＝赖氨酸和H＝组氨酸。载体也可以是分支组氨酸- 赖氨酸共聚物。例如，分支组氨酸-赖氨酸聚合物可具有式(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK、R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK或 R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN、X＝C(O)NH2、K＝赖氨酸、H＝组氨酸和N＝天冬酰胺。
在进一步的实施方案中，药学上可接受的载体可以包含含有精胺-脂质偶联物(SLiC)和胆固醇的脂质体。
药学上可接受的载体可以包含肽，其具有式Kp{[(H)n(K)m]}y或 Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z、或式Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y或 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z，其中K是赖氨酸，H是组氨酸， C是半胱氨酸，x是接头，Z是靶向哺乳动物细胞的配体，p是0或1，n是介于1 至5之间的整数、m是介于0至3之间的整数，a、b、c和d是3或4以及y是介于3至10之间的整数。药学上可接受的载体可以包含多肽，其含有通过可切割键交联的这些肽中的至少两种。
该组合物可以包含纳米颗粒，该纳米颗粒的直径可以，例如在约40nm至约 150nm之间，以及可以具有在约25mV至约45mV之间的ζ电位。
在进一步的实施方案中，提供组合物，其包含抗TGF-β的siRNA分子以及 PDL1的小分子抑制剂或PDL1的反义寡核苷酸抑制剂两者中的一个。抗TGF-β的 siRNA分子可以包含如上所述的抗TGF-β的siRNA分子或抗TGF-β1的siRNA分子。这些组合物可以包含药学上可接受的载体，例如，如上所述的载体。
在仍进一步的实施方案中，提供组合物，其包含抗PDL1的siRNA分子以及 TGF-β或TGF-β1的小分子抑制剂、或者TGF-β或TGF-β1的反义寡核苷酸抑制剂两者中的一个。抗PDL1的siRNA分子可以包含如上所述的抗PDL1的siRNA分子。这些组合物可以包含药学上可以接受的载体，例如，如上所述的载体。
还提供了杀伤哺乳动物中癌细胞的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的如上所述的组合物。
还提供了用于在哺乳动物中增强T细胞渗透到含有癌细胞的肿瘤中的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的如上所述的组合物。
一种用于在哺乳动物中抗原性启动T细胞以识别和杀伤癌细胞的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的如上所述的组合物。
还提供在哺乳动物中用于促进T细胞介导的针对癌症的免疫力的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的如上所述的组合物。
在这些方法中的任一种中，癌细胞周围微环境中的TGF-β1的水平升高，而组合物使升高的TGF-β1水平得到降低。
在这些方法中的任一种中，癌细胞周围微环境中的TGF-β1的水平升高，而抗 TGF-β1的siRNA分子使升高的TGF-β1水平得到降低。
在这些方法中，癌可以是，例如，肝癌、结肠癌、胰腺癌或尿路上皮癌。肝癌可以是肝细胞癌、转移性结肠癌或转移性胰腺癌。
在这些方法的任何一种中，哺乳动物可以是实验动物，或者有利地是人。
在这些方法中，可以将如上所述的组合物直接注射到包含癌细胞的肿瘤中，并且可以单独或同时地递送。
附图说明
图1显示在SK-Hep1细胞中测试的各种siRNA序列对PDL1的沉默。
图2显示暴露于针对PDL1的siRNA的时间对Hepa 1-6肝癌细胞中PDL1沉默的影响。
图3显示在SK-Hep1细胞中对PDL1 siRNA的筛选。
表1显示了针对TGFβ1的siRNA的列表中的siRNA序列。
表2显示了针对PDL1测试的siRNA列表中的siRNA序列。
具体实施方式
提供包含抗TGF-β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子的组合物。还提供了使用该组合物杀伤人和其他哺乳动物中的癌细胞的方法。在一个实施方案中，该组合物还包括药学上可接受的载体，例如组氨酸-赖氨酸共聚物。抗TGF-β的 siRNA分子的具体示例如表1所示。抗PDL1的siRNA分子的具体示例如表2所示。
本文所述的包含抗TGF-β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子的组合物可用于杀伤人或其他哺乳动物中的癌细胞，从而治疗癌症。将治疗有效量的组合物施用于患癌的人或其他哺乳动物。这些癌包括肝癌、结肠癌和胰腺癌。
定义
抗TGF-β的siRNA或TGF-βsiRNA：siRNA分子，其降低或阻止哺乳动物细胞中编码用于TGF-β蛋白合成的基因的表达。
抗TGF-β1的siRNA或TGF-β1siRNA：siRNA分子，其降低或阻止哺乳动物细胞中编码用于TGF-β1蛋白合成的基因的表达。
抗PDL1的siRNA或PDL1 siRNA：siRNA分子，其降低或阻止哺乳动物细胞中编码用于PDL1蛋白合成的基因的表达。
siRNA分子：双链体寡核苷酸，其是短的、双链多核苷酸，在该分子引入细胞中后干扰该细胞中基因的表达。例如，其靶向并结合单链目标RNA分子中的互补核苷酸序列。通过本领域技术人员已知的技术经化学合成或以其他方式构建 siRNA分子。此类技术描述在美国专利Nos.5,898,031、6,107,094、6,506,559、 7,056,704、RE46,873E和9,642,873B2以及欧洲专利Nos.1214945和1230375中，所有这些都通过引用整体并入本文。按照本领域的惯例，当通过具体的核苷酸序列标识siRNA分子时，该序列是指双链体分子的有义链。可以通过本领域已知的技术化学修饰包含该分子的一种或多种核糖核苷酸。除了在其一个或多个个体核苷酸的水平上修饰之外，也可以修饰寡核苷酸的主链。例如，siRNA可以使用本领域已知的方法通过化学修饰(例如通过使用2’-OMe和/或2’-F和/或硫代磷酸修饰)得到稳定，免于核酸酶降解。其他修饰包括使用小分子(例如，糖分子)、氨基酸、肽、胆固醇和其他大分子与siRNA分子偶联。
癌是任何恶性肿瘤。
恶性肿瘤是一团赘生细胞。
肝癌：肝脏内的任何原发性癌，即起源于肝脏中的癌；或肝脏内的任何继发性癌，即从哺乳动物体内另一组织转移至肝脏的癌。原发性肝癌的一个示例是肝细胞癌。继发性肝癌的一个示例是结肠癌。
治疗(treating/treatment)：杀伤一些或全部癌细胞，减小癌的大小，抑制癌的生长或降低癌的生长速率。
组氨酸-赖氨酸共聚物：由组氨酸和赖氨酸氨基酸组成的肽或多肽。此类共聚物描述在美国专利Nos.7,070,807B2、7,163,695B2和7,772,201B2，其公开通过引用其整体并入本文。
免疫检查点抑制剂：小分子药物或抗体，其阻断一些类型的免疫系统细胞(如 T细胞)和一些癌细胞产生的某些蛋白。这些检查点蛋白帮助保持免疫反应受控制，并可以防止T细胞杀伤癌细胞。当阻断这些检查点蛋白时，免疫系统的“刹车 (brake)”得到释放，T细胞能够更好地杀伤癌细胞。在T细胞/癌细胞上发现的检查点蛋白的示例分别包括PD-1/PD-L1。
增强抗肿瘤疗效：是指提供在肿瘤细胞生长速率上的更多降低，提供在杀伤肿瘤细胞和/或减少肿瘤质量上的更好效果，并最终通过延长肿瘤患者的寿命产生更好的治疗效果。这种作用可能是由对肿瘤细胞本身的直接作用、或由T细胞活性的增强或由以下机制介导：在初始治疗后，无论T细胞识别肿瘤细胞的能力增加或不增加，T细胞能更好地接近肿瘤细胞和/或被激活以促进针对肿瘤的更强免疫反应。
增强T细胞对肿瘤的渗透：是指在瘤体(tumor mass)内观察到大量T细胞的观察结果。通常，渗透是朝向肿瘤中心并避开周围组织。在距离正常组织的任何深度上，在该深度观察到的特异性T细胞的数量相对于未处理的样本都是增加的。
TGF-β的小分子抑制剂：化合物，通常分子量低于1000道尔顿，其能够与 TGF-β结合和/或以其他方式导致TGF-β的功能受抑制—很可能是通过抑制TGF-β与其任何受体的结合或通过抑制由TGF-β与目标受体结合诱导的下游酶活性或信号传导。此类抑制剂在本领域中是已知的。参见，例如，Huynh等人，Biomolecules 9:743(2019)。
TGF-β1的小分子抑制剂：化合物，通常分子量低于1000道尔顿，能够与 TGF-β1结合和/或以其他方式导致抑制TGF-β1的功能—很可能是通过抑制 TGF-β1与其受体的结合、或通过抑制由TGF-β1与其目标受体结合诱导的下游酶活性或信号传导。
TGF-β的反义寡核苷酸抑制剂：单链寡核苷酸(通常为11-27个碱基)，其可降低哺乳动物细胞内TGF-β的表达。
TGF-β1的反义寡核苷酸抑制剂：单链寡核苷酸(通常为11-27个碱基)，其可降低哺乳动物细胞内TGF-β1的表达。
PDL1的小分子抑制剂：化合物，通常分子量低于1000道尔顿，其能够与PDL1 结合和/或以其他方式导致抑制PDL1的功能—很可能是通过抑制PDL1与其T细胞上受体(PD1)的结合、或通过抑制由PDL1与其目标受体(PD1)结合诱导的下游酶活性或信号传导。
PDL1的反义寡核苷酸抑制剂：单链寡核苷酸(通常为11-27个碱基)，其可降低哺乳动物细胞内PDL1的表达。
载体组分
组合物有利地包含药学上可接受的载体。合适的载体是本领域已知的并且可以包含可溶性递送剂或纳米颗粒形成剂。载体可以包含，例如，一种或多种组分，如盐水溶液、糖溶液、聚合物、肽、多肽、脂质、乳膏、凝胶、胶束材料、二氧化硅纳米颗粒、金属纳米颗粒、质粒或病毒载体。药学上可接受的载体还可以是，例如，葡萄糖溶液、聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物、配体官能化-亲水聚合物接枝聚合物或配体官能化脂质体。在其他实施方案中，载体可以包含一种或多种组分，其选自可生物降解的组氨酸-赖氨酸聚合物、可生物降解的聚酯(例如，聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))、聚酰胺胺(PAMAM) 树枝状聚合物、阳离子脂质，例如DOTAP、DOPE、DC-Chol/DOPE、DOTMA和 DOTMA/DOPE、或聚乙二醇化的PEI。
有利地，药学上可以接受的载体包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。HKP可以包含结构(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK、K＝赖氨酸和H＝组氨酸。载体也可以是分支组氨酸-赖氨酸共聚物。例如，分支组氨酸- 赖氨酸聚合物可具有式(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中 R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK、R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK或 R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN、X＝C(O)NH2、K＝赖氨酸、H＝组氨酸和N＝天冬酰胺。
例如，药学上可接受的载体还可以包含含有精胺-脂质偶联物(SLiC)和胆固醇的脂质体。
可选择地，或者说除此之外，药学上可接受的载体可以包含，例如肽，其具有式Kp{[(H)n(K)m]}y、或Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z、或式Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y或Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z，其中K是赖氨酸，H是组氨酸，C是半胱氨酸，x是接头，Z是靶向哺乳动物细胞的配体， p是0或1，n是介于1至5之间的整数、m是介于0至3之间的整数，a、b、c 和d是3或4，以及y是介于3至10之间的整数。药学上可接受的载体可以包含多肽，其含有通过可切割键交联的这些肽中的至少两种。
该组合物可以包含纳米颗粒，并且该纳米颗粒的直径可以，例如在约40nm 至约150nm之间，以及可以具有在约25mV至约45mV之间的ζ电位。用于测量此类纳米颗粒的尺寸和ζ电位的方法在本领域中是已知的。
实施例
以下实施例说明了本发明的某些方面，并且不应被解释为限制其范围。
提供了2个siRNA的递送纳米颗粒组合：靶向TGF-β的1个siRNA和靶向 PDL1(存在于肿瘤细胞上)的1个siRNA。在这种方式中，肿瘤部位内及其周围的细胞对该物质的摄取将导致TGF-β(其阻止T细胞渗透)减少，以及肿瘤细胞表面的PD-L1将被沉默掉，导致免疫检查点的丢失，从而导致T细胞杀伤肿瘤细胞。
鉴定可用于沉默TGF-β1的多个siRNA序列。示例包括以下：
表1：抗TGF-β1的SiRNA序列
hmTF-25-1：有义5’-r(GGAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCA)-3’
反义5’-r(UGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCC)-3’
hmTF-25-2：有义5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’
反义5’-r(AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG)-3’
hmTF-25-3：有义5’-r(GAGCCCAAGGGCUACCAUGCCAACU)-3’
反义5’-r(AGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUC)-3’
hmTF25-4：有义，5’-r(GAUCCACGAGCCCAAGGGCUACCAU)-3’
反义，5’-r(AUGGUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUC)-3’
hmTF25-5：有义，5’-r(CACGAGCCCAAGGGCUACCAUGCCA)-3’
反义，5’-r(UGGCAUGGUAGCCCUUGGGCUCGUG)-3’
hmTF25-6：有义，5’-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3’
反义，5’-r(CCACCAUUAGCACGCGGGUGACCUC)-3’
hmTF25-7：有义，5’-r(GUACAACAGCACCCGCGACCGGGUG)-3’
反义，5’-r(CACCCGGUCGCGGGUGCUGUUGUAC)-3’
hmTF25-8：有义，5’-r(GUGGAUCCACGAGCCCAAGGGCUAC)-3’
反义，5’-r(GUAGCCCUUGGGCUCGUGGAUCCAC)-3’。
鉴定出多个可用于沉默PDL1的siRNA序列，但是基于在培养细胞中沉默目标基因的潜力，以选择以下序列：
表2–抗PDL1的siRNA序列
1)有义5’-GGAUCCAGUCACCUCUGAACAUGAA-3’
反义5’–UUCAUGUUCAGAGGUGACUGGAUCC–3’
2)有义5’–GGUGUUGGAUUUGTAAGGCACUUUA-3’
反义5’–UAAAGUGCCUUACAAAUCCAACACC-3’
3)有义5’-GGAUUUGUAAGGCACUUUAUCCCUU-3’
反义5’-AAGGGAUAAAGUGCCUUACAAAUCC-3’
4)有义5’-GGUGCACUGAGUCAAUCUAGUCCUA-3’
反义5’-UAGGACUAGAUUGACUCAGUGCACC-3’
5)有义5’-CCUCCUUGUGGUGUUGGAUUUGTAA-3’
反义5’-UUACAAAUCCAACACCACAAGGAGG-3’
6)有义5’-CCUCAUUCGUUGUGCUUGAACCCUU-3’
反义5’-UUUCAUUUGGAGGAUGUGCCAGAGG-3’
7)有义5’-CCTCATTCGTTGTGCTTGAACCCTT-3’
反义5’-AAGGGUUCAAGCACAACGAAUGAGG-3’
8)有义5’-CCUUUGUCUCAUGUUUCAUCGUAA-3’
反义5’-CCUUUUGUCUCAUGUUUCAUCGUAA-3’
9)有义5’-GCACUGACAUUCAUCUUCCGUUUAA-3’
反义5’-UUAAACGGAAGAUGAAUGUCAGUGC-3’
10)有义5’-CCAAGGACCUAUAUGUGGUAGAGUA-3’
反义5’-UACUCUACCACAUAUAGGUCCUUGG-3’
11)有义5’-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU dTdT-3’
反义5’-ACAGACUCAAAAUAAAUAG dTdT-3’
12)有义5’-UGAAAGUCAAUGCCCCAUA dTdT-3’
反义5’-UAUGGGGCAUUGACUUUCA dTdT-3’
13)有义5’-GAAAGUCAAUGCCCCAUAC dTdT-3’
反义5’-GUAUGGGGCAUUGACUUUC dTdT-3’
14)有义5’-CAAAAUCAACCAAAGAAUU dTdT-3’
反义5’-AAUUCUUUGGUUGAUUUUG dTdT-3’
15)有义5’-GCAAUUCUUUUAUUCAAAAdTdT-3’
反义5’-UUUUGAAUAAAAGAAUUGCdTdT-3’。
人肝腺癌SK-Hep1细胞培养在ATCC配制的补充有10％FBS的Eagle极限必需培养基(Minimum Essential Medium)(目录号30-2003)中。在转染前一天，将细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中。根据制造商的操作方案，用 Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher Sci.，目录号13778075)将siRNA 转染进细胞。将转染复合混合物以50nM的siRNA浓度加入到细胞中。
在转染后48小时，使用QIAGEN RNeasy Plus Mini试剂盒(目录号74134) 分离总RNA。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(ThermoFisher Sci.，目录号K1641)合成cDNA以用于RT-qPCR，使用TaqMan通用PCR母液(master mix) (ThermoFisher Sci.，目录号4304437)通过qPCR评估PDL1 mRNA的水平。
用于人PDL1的引物和探针的序列如下：
5’-GGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCA-3’(正向)，
5’-AACGGAAGATGAATGTCAGTGCTA-3’(反向)，和
PDL1 FAM探针–AGATGGCTCCCAGAATTACCAAGTGAGTCC。
用于人GAPDH的引物和探针的序列是：
5’-ACATCGCTCAGACACCATG-3’(正向)，
5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3’(反向)
以及对于GAPDH FAM的探针–AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC。
使用QuantStudio3(ThermoFisher)执行qRT-PCR。扩增条件设定在50℃持续5分钟，95℃持续20秒，以及包括40个循环(在95℃持续15秒和在60℃持续1分钟)。根据2-ΔΔCt方法测定目标基因的RNA水平。GAPDH基因用于样品的归一化。与用非沉默siRNA处理的细胞比较PDL1表达。
在鉴定出的序列中，表2的序列11与PDL1基因的小鼠和人版本都具有同一性，并显示出在基因沉默中的IC50为约1nM。序列8、9和10)是人PDL1序列独有的，在沉默人基因方面具有非常高的效力(<＝1nM)，但与小鼠PDL1序列没有同一性(因此没有针对小鼠PDL1序列的活性)。序列14在PDL1的小鼠和人序列之间显示出95％的同一性。因此，这些序列中的任一个都可用于在人源性癌中沉默PDL1。
选择与小鼠和人PDL1具有同一性的PDL1序列11。该序列可以是平末端19 mer或在末端添加dTdT以保持稳定性的21mer。该序列允许使用同基因(小鼠) 原位HCC模型来评估产品在体内阻止肿瘤生长的效果。该序列沉默PDL1的能力在Hepa1-6(小鼠HCC)细胞中得到证实，在24小时的IC50为约1nM。该序列的优点是在小鼠和人模型之间切换时，无需根据功效和毒性测试所需而改变序列。
体外测试
上述2种siRNA与分支多肽-组氨酸赖氨酸共聚物(HKP)一起配制，方法是将HKP与2种siRNA的等摩尔混合物以3：1的比例快速混合，使每种siRNA浓度最终为0.5mgs/ml。然后将该材料冻干以形成粉末。将粉末重新溶解在D5W(5％的葡萄糖的水溶液)中，以使80μl注射体积含有40μg粉末(浓度为0.5mg/ml)。让每个小瓶升至环境室温。用70％乙醇清洗锡帽盖。使用一次性注射器，将5％的注射用葡萄糖溶液(或注射用蒸馏水)添加至每个装有冻干粉末的小瓶中。短暂涡旋5-10秒后，将材料在台上于RT放置10分钟，然后在使用前将药物放在冰上，这时将其稀释到所需的浓度。
参考文献
附加参考文献：2019年5月23日提交的PCT申请号PCT/US2019/033829，针对Compositions and Methods of Controllable Co-Coupling Polypeptide NanoparticleDelivery System for Nucleic Acid Therapeutics，其通过引用整体并入本文。
本文中标识的所有出版物，包括已颁发的专利和已发布的专利申请，以及由 url地址或登录号标识的所有数据库条目，均通过引用整体并入本文。
尽管本发明已经结合其某些实施方案进行了描述，并且为了说明的目的已经阐述了许多细节，但对于本领域的技术人员来说，显然本发明可以有其他的实施方案，而且在不背离本发明的基本原则的情况下，可以改变这里描述的某些细节。

Claims (63)

1.一种组合物，其包含抗TGF-β的siRNA分子和抗PDL1的siRNA分子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗TGF-β的siRNA分子包含抗TGF-β1的siRNA分子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中一种或两种分子包含长度为19个碱基对至25个碱基对的寡核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述siRNA分子中的一种或两种已经经化学修饰以增加其稳定性。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子的IC50值介于约0.1nM至10nM之间。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子选自在表1中限定的siRNA分子。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子包含25mer的平末端结尾的分子。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子与表1中限定的siRNA分子的前7个位置中的6个相同，并且在其余位置也至少90％相同。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子与表1中限定的siRNA分子的前7个位置中的6个相同，以及在其余位置也至少95％相同。
10.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述抗PDL1的siRNA分子的IC50值介于约0.1nM至10nM之间。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述抗PDL1 1的siRNA分子选自在表2中限定的siRNA分子。
12.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述抗PDL1的siRNA分子包含在3'末端有2碱基dTdT突出的19mer的分子，或25mer的平末端分子。
13.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述抗PDL1的siRNA分子与表2中限定的siRNA分子的前7个位置中的6个相同，并且在其余位置也至少90％相同。
14.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述抗PDL1的siRNA分子与表2中限定的siRNA分子的前7个位置中的6个相同，并且在其余位置也至少95％相同。
15.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子包含5’-r(CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU)-3’，以及抗PDL1的siRNA分子包含5’-CUAUUUAUUUUGAGUCUGU-3’(PDL1的siRNA有义链序列)。
16.一种组合物，其包含两种或更多种不同的抗TGF-β1的siRNA分子以及两种或更多种不同的抗PDL1的siRNA分子。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含可溶性递送剂或纳米颗粒形成剂。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含一种或多种组分，其选自盐水溶液、糖溶液、聚合物、肽、多肽、脂质、乳膏、凝胶、胶束材料、二氧化硅纳米颗粒、金属纳米颗粒、质粒和病毒载体。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含一种或多种组分，其选自葡萄糖溶液、聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物、配体官能化-亲水聚合物接枝聚合物和配体官能化脂质体。
21.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含一种或多种组分，其选自可生物降解的组氨酸-赖氨酸聚合物、可生物降解的聚酯(例如，聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物、阳离子脂质(例如DOTAP、DOPE、DC-Chol/DOPE、DOTMA和DOTMA/DOPE)、或聚乙二醇化的PEI。
22.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含组氨酸-赖氨酸共聚物(HKP)。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述HKP包含结构(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK、K＝赖氨酸和H＝组氨酸。
24.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含分支组氨酸-赖氨酸共聚物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述分支组氨酸-赖氨酸聚合物具有式(R)K(R)-K(R)-(R)K(X)，其中R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK、R＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK或R＝KHHHKHHHNHHHNHHHN、X＝C(O)NH2、K＝赖氨酸、H＝组氨酸和N＝天冬酰胺。
26.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含含有精胺-脂质偶联物(SLiC)和胆固醇的脂质体。
27.根据权利要求17所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含肽，其具有式Kp{[(H)n(K)m]}y或Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z或式Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y或Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z，其中K是赖氨酸，H是组氨酸，C是半胱氨酸，x是接头，Z是靶向哺乳动物细胞的配体，p是0或1，n是介于1至5之间的整数、m是介于0至3之间的整数，a、b、c和d是3或4以及y是介于3至10之间的整数。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含多肽，其含有通过可切割键交联的权利要求27所述的肽中的至少两种。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含纳米颗粒。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述纳米颗粒的直径在约40nm至约150nm之间，以及具有在约25mV至约45mV之间的ζ电位。
31.一种在哺乳动物中杀伤癌细胞的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至30中任一项所述的组合物。
32.一种用于在哺乳动物中增强T细胞渗透到包含癌细胞的肿瘤中的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至30中任一项所述的组合物。
33.一种用于在哺乳动物中抗原性启动T细胞以识别和杀伤癌细胞的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至30中任一项所述的组合物。
34.一种用于在哺乳动物中促进T细胞介导的针对癌症的免疫力的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至30中任一项所述的组合物。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中在所述癌细胞周围的微环境中TGF-β1的水平升高。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗TGF-β1的siRNA分子使升高的TGF-β1水平得到降低。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述癌选自肝癌、结肠癌、胰腺癌和尿路上皮癌。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述肝癌包括肝细胞癌、转移性结肠癌或转移性胰腺癌。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是实验动物。
40.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的方法，其中所述组合物直接注射到包含所述癌细胞的肿瘤中。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的方法，其中所述组合物单独递送到所述癌细胞。
43.根据权利要求31至41中任一项所述的方法，其中所述组合物同时递送到所述癌细胞。
44.一种组合物，其包含抗TGF-β的siRNA分子以及PDL1的小分子抑制剂或PDL1的反义寡核苷酸抑制剂两者中的一种。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述抗TGF-β的siRNA分子包含权利要求2至9中任一项所述的抗TGF-β的siRNA分子或抗TGF-β1的siRNA分子。
46.一种组合物，其包含抗PDL1的siRNA分子以及TGF-β的小分子抑制剂或TGF-β的反义寡核苷酸抑制剂两者中的一种。
47.一种组合物，其包含抗PDL1的siRNA分子以及TGF-β1的小分子抑制剂或TGF-β1的反义寡核苷酸抑制剂两者中的一种。
48.根据权利要求46或权利要求47中任一项所述的组合物，其中所述抗PDL1的siRNA分子包含权利要求10至15中任一项所述的抗PDL1的siRNA分子。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含在权利要求18至28中限定的任一种药学上可接受的载体。
51.一种用于在哺乳动物中杀伤癌细胞的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求44至50中任一项所述的组合物。
52.一种用于在哺乳动物中增强T细胞渗透到包含癌细胞的肿瘤中的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求44至50中任一项所述的组合物。
53.一种用于在哺乳动物中抗原性启动T细胞以识别和杀伤癌细胞的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求44至50中任一项所述的组合物。
54.一种用于在哺乳动物中促进T细胞介导的针对癌症的免疫力的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求44至50中任一项所述的组合物。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中在所述癌细胞周围的微环境中的TGF-β1的水平升高。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述组合物使升高的TGF-β1水平得到降低。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述癌选自肝癌、结肠癌、胰腺癌和尿路上皮癌。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述肝癌包括肝细胞癌、转移性结肠癌或转移性胰腺癌。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是实验动物。
60.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中所述组合物直接注射到包含所述癌细胞的肿瘤中。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的方法，其中所述组合物单独递送到所述癌细胞。
63.根据权利要求51至61中任一项所述的方法，其中所述组合物同时递送到所述癌细胞。
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