CN108779464B - 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病 - Google Patents

使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病 Download PDF

Info

Publication number
CN108779464B
CN108779464B CN201780015900.5A CN201780015900A CN108779464B CN 108779464 B CN108779464 B CN 108779464B CN 201780015900 A CN201780015900 A CN 201780015900A CN 108779464 B CN108779464 B CN 108779464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna complex
subject
pharmaceutical composition
rna
asirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780015900.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108779464A (zh
Inventor
D·K·李
S·W·弘
T·Y·李
S·L·O·李
H·李
D·于
J·严
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olix Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Olix Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olix Pharmaceuticals Inc filed Critical Olix Pharmaceuticals Inc
Publication of CN108779464A publication Critical patent/CN108779464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108779464B publication Critical patent/CN108779464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

在某些方面，本文提供抑制ANGPT2和/或PDGFB表达的RNA复合物(例如，不对称RNA复合物，如asiRNA或细胞穿透asiRNA)，并且因此对于治疗血管生成相关性疾病(如癌症、AMD和DME)是有用的。

Description

使用靶向ANGPT2和PDGFB的RNA复合物治疗血管生成相关性 疾病
相关申请
本申请要求于2016年2月2日提交的美国临时专利申请序列号62/290,330的优先权权益，其通过引用被整体并入本文。
背景
血管生成是用于描述新的血管的生长的术语。血管的生长和增殖在许多生物学过程中发挥重要作用。一个实例是肿瘤形成，其中肿瘤内血管的生长允许肿瘤通过对氧气和营养物的增加的获取而生长，增加肿瘤存活，以及便利肿瘤转移。靶向血管生成是具有前景的治疗癌症的途径。
眼中的血管生成通常在向眼供应充足的氧气和其他必需营养物以及正常组织的发育中发挥重要作用。然而，当发生过度的和异常的血管生长时，可以诱发眼部疾病，如湿性老年性黄斑变性(湿性AMD)和糖尿病黄斑水肿(DME)，并且在一些情况下，甚至可以造成失明。
老年性黄斑变性(AMD)是由眼的黄斑中的视网膜色素上皮衬里的变性造成的疾病，所述疾病导致视力丧失。黄斑是视网膜中的一个小区域，由排列在眼的后部的感光组织组成，并且在中央视觉中发挥关键作用。AMD是全世界失明的主要原因之一。AMD以“湿性”和“干性”形式发生。湿性AMD是视网膜中异常的血管生长的结果。在湿性AMD中，增加量的血管内皮生长因子(VEGF)有助于此新血管形成，因此治疗选择包含使用VEGF抑制剂。然而，许多用VEGF抑制剂治疗的患者在治疗的几年内发展为地图样萎缩(GA)，地图样萎缩是晚期干性黄斑变性的主要症状。糖尿病黄斑水肿(DME)是由于来自黄斑内的血管的液体的渗漏而由糖尿病中视网膜的肿胀造成的疾病。糖尿病患者中差的血液循环可以加速黄斑中新的血管生长，并且视网膜水肿可以由具有薄的或脆弱的壁的血管的渗漏造成。DME是患有糖尿病的患者中失明的主要原因，并且10％的糖尿病患者患有黄斑水肿。
概述
在某些方面，本文提供RNA复合物，所述RNA复合物靶向ANGPT2(血管生成素2)或PDGFB(血小板衍生生长因子β)，并且对于治疗和/或预防血管生成相关性疾病，如AMD(例如，湿性AMD)、DME和癌症是有用的。在某些方面，本文提供RNA复合物，所述RNA复合物抑制血管生成。在某些方面，本文提供包括这样的RNA复合物的药物组合物和使用这样的RNA复合物和药物组合物的方法。
在某些方面，本文提供RNA复合物，所述RNA复合物包括反义链和有义链，所述反义链具有与ANGPT2mRNA序列或PDGFB mRNA序列的序列互补性，所述有义链具有与反义链的序列互补性。在一些实施方案中，RNA复合物能够抑制细胞ANGPT2或PDGFB表达。在一些实施方案中，RNA复合物是不对称较短双链体小干扰RNA(asymmetric shorter-duplex smallinterfering RNA)(asiRNA)。在一些实施方案中，RNA复合物是表1、表2、表3、表4、表5或表6中列出的RNA复合物。在一些实施方案中，本文提供的RNA复合物包括化学修饰，其中在不存在递送运载体的情况下，修饰便利穿透细胞膜。在一些实施方案中，修饰是2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或疏水部分。在一些实施方案中，化学修饰是疏水部分。在一些实施方案中，疏水部分是胆甾醇部分。在一些实施方案中，RNA复合物是表2、表3、表5或表6中列出的经修饰的RNA复合物。在某些实施方案中，RNA复合物不是细胞毒性的。
在某些方面，本文提供包括本文提供的RNA复合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物被配制用于肠胃外递送。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于口服递送。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内递送。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于玻璃体内递送。在其他实施方案中，药物组合物被配制作为滴眼剂。
在某些方面，本文提供抑制细胞ANGPT2或PDGFB表达的方法，所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物接触。
在某些方面，本文提供在人受试者中抑制基因表达ANGPT2或PDGFB的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的RNA复合物或药物组合物。在某些方面，本文提供在人受试者中抑制血管生成的方法，所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物接触。在某些方面，本文提供治疗人受试者的血管生成相关性疾病(如，老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿或癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的RNA复合物或药物组合物。
附图简要说明
图1示出靶向ANGPT2的100种示例性asiRNA的基因沉默效率。用0.1nM的asiRNA转染SK-N-SH细胞。
图2示出靶向ANGPT2的27种示例性asiRNA的基因沉默效率。
图3示出靶向ANGPT2的14种示例性asiRNA的基因沉默效应。
图4示出靶向ANGPT2的14种示例性asiRNA对ANGPT2蛋白表达的抑制。
图5示出示例性ANGPT2-靶向细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA或cp-asiANGPT2)的基因沉默效率，各种各样的化学修饰已经被应用于所述ANGPT2-靶向细胞穿透asiRNA。
图6示出示例性cp-asiRNA对ANGPT2mRNA表达的抑制。
图7示出示例性cp-asiRNA对ANGPT2蛋白表达的抑制。
图8示出具有不同反义链长度(19或21个核苷酸)的6种cp-asiRNA的基因沉默效率。
图9示出6种示例性cp-asiRNA对ANGPT2蛋白表达的抑制。
图10示出人ANGPT2变体1的mRNA序列。
图11示出靶向PDGFB的100种示例性asiRNA的基因沉默效率。
图12示出靶向PDGFB的22种示例性asiRNA的基因沉默效率。
图13示出靶向PDGFB的12种示例性asiRNA的基因沉默效应。
图14示出靶向PDGFB的12种示例性asiRNA对PDGFB蛋白表达的抑制。
图15示出示例性cp-asiRNA对PDGFB mRNA表达的抑制。
图16示出示例性cp-asiRNA对PDGFB蛋白表达的抑制。
图17示出不同反义链长度(19或21个核苷酸)或化学修饰的11种cp-asiRNA对PDGFB蛋白表达的抑制。
图18示出人PDGFB变体2的mRNA序列。
详细说明
综述
在某些方面，本文提供不对称RNA复合物(例如，asiRNA或cp-asiRNA)，所述不对称RNA复合物抑制ANGPT2或PDGFB，并且因此对于血管生成相关性疾病，如AMD(例如，湿性AMD或干性AMD)、DME和癌症的治疗是有用的。在一些实施方案中，RNA复合物被化学修饰以能够在不需要转染运载体的情况下穿透细胞。在一些实施方案中，RNA复合物为表1、表2、表3、表4、表5或表6中列出的RNA复合物。在某些方面，本文提供包括这样的RNA复合物的药物组合物，和使用这样的RNA复合物和药物组合物的方法。
在一些实施方案中，本文所描述的RNA复合物是asiRNA或cp-asiRNA。如本文所使用的，术语asiRNA指双链不对称较短双链体小干扰RNA分子，所述双链不对称较短双链体小干扰RNA分子具有19-21nt的反义链和13-17nt的有义链。asiRNA上的附加的信息可以在美国专利公布号2012/0238017和Chang et al.,Mol.Ther.17:725-732(2009)中找到，其中的每个以引用的方式被整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所描述的RNA复合物使用递送运载体(如脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)被递送至细胞。在一些实施方案中，本文所描述的RNA复合物被化学修饰以便不需要使用这样的递送运载体介导细胞中的ANGPT2或PDGFB抑制。这样的RNA复合物在本文中被称为细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)。
定义
为了方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
本文中使用冠词“一(a)”和“一(an)”指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物，并且包含，但不限于由医疗技术人员施用和自我施用。
如本文所使用的，术语“免疫调节剂”指弱化、刺激或以另外的方式调节免疫系统的化合物或组合物。实例包含但不限于白三烯受体激动剂、免疫抑制剂(例如，FK-506)或细胞因子。
如本文所使用的，术语“干扰核酸”和“抑制核酸”可互换地被使用。干扰核酸通常包含环状亚基的序列，每个具有碱基配对部分，通过亚基间连锁连接，所述亚基间连锁允许碱基配对部分与核酸(通常RNA)中的靶标序列通过Watson-Crick碱基配对杂交，以形成核酸：靶标序列内的寡聚体异源双链体。干扰RNA分子包含，但不限于，反义分子、siRNA分子、asiRNA分子、cp-asiRNA分子、单链siRNA分子、miRNA分子和shRNA分子。这样的干扰核酸可以被设计以阻断或抑制mRNA的翻译或抑制天然前体mRNA拼接加工，或诱导被靶向的mRNA的降解，并且可以被称作“被指向”或“被靶向针对”靶标序列，所述干扰核酸与所述靶标序列杂交。干扰核酸可以包含，例如，肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基寡核苷酸和RNA干扰剂(siRNA剂)。RNAi分子通常通过与靶标分子形成异源双链体起作用，所述靶标分子被选择性地降解或“解体”，由此使靶标RNA失活。在一些情况下，干扰RNA分子也可以通过抑制转录本翻译和/或抑制转录本的转录使靶标转录本失活。当干扰核酸以上文所描述的方式靶向针对靶标的核酸时，干扰核酸更普遍地被称作“被靶向针对”生物学相关的靶标(如蛋白质)。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地被使用。它们指核苷酸的聚合体形式，不论任何组合和任何长度的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体(vector)、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后被赋予。多核苷酸可以被进一步修饰，如通过与标记组件偶联。在本文提供的全部核酸序列中，U核碱基与T核碱基是可互换的。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或运载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。
如本文所使用的，“预防”紊乱或病况的治疗剂指化合物，当在紊乱或病况发作之前被施用至统计样品时，相对于未经处理的对照样品，所述化合物降低经处理的样品中的紊乱或病况的发生，或相对于未经处理的对照样品，所述化合物延迟紊乱或病况的一种或更多种症状的发作或降低紊乱或病况的一种或更多种症状的严重度。
如果寡聚体在生理条件下与靶标杂交，则寡核苷酸与靶标多核苷酸“特异性杂交”，并且Tm大幅度大于45℃，或至少50℃，或至少60℃-80℃或更高。这样的杂交对应于严格的杂交条件。在给定的离子强度和pH，Tm是温度，在所述温度下，50％的靶标序列与互补多核苷酸杂交。此外，这样的杂交可以以反义寡聚物与靶标序列的“近似的”或“大体上的”互补以及精确的互补发生。
如本文所使用的，术语“受试者”意为被选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
如本文所使用的，短语“治疗有效的量”和“有效量”意为对于以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比率在受试者中的至少亚群体的细胞中产生期望的治疗效果是有效的药剂的量。
“治疗”受试者中的疾病或“治疗”患有疾病的受试者指使受试者经受药物治疗(例如，药物的施用)，使得疾病的至少一种症状被减轻或防止恶化。
RNA复合物
在某些方面，本文提供RNA复合物，所述RNA复合物分别靶向ANGPT2mRNA和/或PDGFB mRNA并且分别抑制细胞ANGPT2和/或PDGFB表达。在一些实施方案中，细胞是A549细胞。在一些实施方案中，细胞是SK-N-SH细胞。在一些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。人ANGPT2mRNA和PDGFB mRNA的核酸序列分别在图10和图18中被提供。
在某些方面，本文提供包括反义链和有义链的RNA复合物，所述反义链具有与ANGPT2和/或PDGFB mRNA序列(例如，人ANGPT2或PDGFB mRNA序列)的序列互补性，所述有义链具有与反义链的序列互补性。在一些实施方案中，RNA复合物能够抑制细胞ANGPT2或PDGFB表达。在一些实施方案中，RNA复合物是不对称较短双链体小干扰RNA(asiRNA)。在一些实施方案中，RNA复合物是表1、表2、表3、表4、表5或表6中列出的RNA复合物。本文所描述的RNA复合物可以含有RNA碱基、非RNA碱基或RNA碱基和非RNA碱基的混合物。例如，本文提供的某些RNA复合物可以主要由RNA碱基组成，但是也含有DNA碱基或非天然存在的核苷酸。
在一些实施方案中，反义链的长度为至少19个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，反义链的长度为19至21nt(即，长度为19、20或21nt)。在一些实施方案中，反义链的至少13、14、15、16、17、18、19、20或21nt与ANGPT2或PDGFB mRNA序列互补。完美的互补性不是必需的。在一些实施方案中，反义链与ANGPT2或PDGFB mRNA序列完美地互补。
在一些实施方案中，反义链的长度为至少24nt(例如，长度为至少25nt、长度为至少26nt、长度为至少27nt、长度为至少28nt、长度为至少29nt、长度为至少30nt或长度为至少31nt)。在一些实施方案中，反义链的长度不大于124nt(例如，长度不大于100nt、长度不大于90nt、长度不大于80nt、长度不大于70nt、长度不大于60nt、长度不大于50nt或长度不大于40nt)。在一些实施方案中，反义链的长度为31nt。在一些实施方案中，反义链的至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30或31nt与ANGPT2或PDGFB mRNA序列互补。完美的互补性不是必需的。在一些实施方案中，反义链与ANGPT2或PDGFB mRNA序列完美地互补。
在一些实施方案中，有义链的长度为15至17nt(即，长度为15nt、长度为16nt或长度为17nt)。在一些实施方案中，有义链的至少15nt、至少16nt或至少17nt与反义链的序列互补。在一些实施方案中，有义链与反义链的序列完美地互补。
在一些实施方案中，反义链和有义链形成复合物，其中所述反义链的5’端和所述有义链的3’端形成平端。在一些实施方案中，反义链和有义链形成复合物，其中所述反义链的5’端悬突于所述有义链的3’端(例如，通过1、2、3、4或5nt)。在一些实施方案中，反义链和有义链形成复合物，其中所述有义链的5’端悬突于所述反义链的3’端(例如，通过1、2、3、4或5nt)。
在一些实施方案中，RNA复合物的反义链和/或有义链具有选自表1、表2、表3、表4、表5或表6中列出的序列的有义链序列和/或反义链序列。在一些实施方案中，本文提供的RNA复合物包括化学修饰，其中所述修饰便利在不存在递送运载体的情况下穿透细胞膜。
在一些实施方案中，修饰是2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或疏水部分。在一些实施方案中，本文提供的RNA复合物包括疏水部分。在一些实施方案中，疏水部分可以是具有疏水特性的任何化学结构。例如，在一些实施方案中，疏水部分是脂类、亲脂性肽和/或亲脂性蛋白质。在一些实施方案中，疏水部分是脂类，如胆甾醇、生育酚、或具有10个或更多个碳原子的长链脂肪酸(例如，硬脂酸或棕榈酸)。在一些实施方案中，疏水部分是胆甾醇。在一些实施方案中，疏水部分是胆甾醇部分。在一些实施方案中，RNA复合物是表2、表3、表5或表6中列出的经修饰的RNA复合物。在某些实施方案中，RNA复合物不是细胞毒性的。
本文所描述的RNA复合物可以采用各种各样的寡核苷酸化学成分。寡核苷酸化学成分的实例包含(不限于)肽核酸(PNA)、联核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2’O-Me-修饰的寡核苷酸和吗啉代化学成分，包含前述中任何的组合。通常，由于相对于2’O-Me寡核苷酸，PNA化学成分的相对高的靶标结合强度，其可以利用较短的靶标序列。硫代磷酸酯和2’O-Me-修饰的化学成分经常被结合以生成2’O-Me-修饰的寡核苷酸，所述2’O-Me-修饰的寡核苷酸具有硫代磷酸酯主链。参见，例如，PCT公布号WO/2013/112053和WO/2009/008725，其中的每个以引用方式被整体并入本文。
肽核酸(PNA)是DNA的类似物，其中主链与脱氧核糖主链在结构上是同形的，由N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成，嘧啶和嘌呤碱基被附连到所述N-(2-氨乙基)甘氨酸单元。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA遵从Watson-Crick碱基配对规则与互补寡核苷酸杂交，并且根据碱基对识别模拟DNA。PNA的主链由肽键而不是硫代磷酸酯键形成，使其非常适合反义应用(参见以下结构)。主链是不带电荷的，引起PNA/DNA或PNA/RNA双链体展现出大于正常的热稳定性。PNA不被核酸酶或蛋白酶识别。
尽管天然结构发生彻底的结构变化，但是PNA能够以螺旋形式与DNA或RNA序列特异性结合。PNA的特性包含对互补DNA或RNA的高的结合亲和力、由单碱基错配引起的失稳作用、对核酸酶和蛋白酶的耐受性、不依赖于盐浓度与DNA或RNA的杂交以及与同型嘌呤DNA形成三股螺旋。PANAGENE.TM.已经开发了其专利的Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基基团)和专利的寡聚工艺。使用Bts PNA单体的PNA寡聚由脱保护、偶联和加帽的重复循环组成。PNA可以使用任何本领域已知的技术被合成生产。参见，例如，美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。也参见用于PNA制备的美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen etal.,Science,254:1497-1500,1991中找到。前述中的每个通过引用被整体并入。
干扰核酸也可以含有“锁核酸”亚基(LNAs)。“LNAs”是被称为桥接核酸(BNA)的一类修饰的成员。BNA的特征在于共价键，所述共价键锁定了C3-内(北)糖折叠中的核糖环的构象。对于LNA，桥由2’-O和4’-C位置之间的亚甲基组成。LNA增强主链预组织和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。
LNA的结构可以在例如Wengel,et al.,Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54:3607和Accounts of Chem.Research(1999)32:301；Obika,et al.,Tetrahedron Letters(1997)38:8735；(1998)39:5401以及Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16:9230中找到。本文提供的化合物可以并入一种或更多种LNA；在一些情况下，化合物可以完全由LNA组成。用于个体LNA核苷亚基的合成及其并入寡核苷酸的方法在例如美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中被描述，其中的每个通过引用被整体并入。典型的亚基间连接体包含磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；可替代地，可以采用不含磷的连接体。一个实施方案是含LNA化合物，其中每个LNA亚基被DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基组成，其中亚基间连接体是硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，RNA复合物被连接至胆甾醇部分。在一些实施方案中，胆甾醇部分被附连至有义链的3’末端。在一些实施方案中，胆甾醇部分被附连至反义链的3’末端。在一些实施方案中，胆甾醇部分被附连至有义链的5’末端。在一些实施方案中，胆甾醇部分被附连至反义链的5’末端。
在一些实施方案中，RNA复合物包括2’-O-甲基化核苷。2’-O-甲基化核苷在核糖分子的2’-OH残基处带有甲基基团。2’-O-Me-RNA显示出与RNA相同的(或相似的)行为，但被保护免受核酸酶降解。也可以将2’-O-Me-RNA与硫代磷酸寡核苷酸(PTO)组合用于进一步稳定化。可以根据本领域的常规技术合成2’-O-Me-RNA(磷酸二酯或硫代磷酸)(参见，例如，Yooet al.,Nucleic Acids Res.32:2008-16,2004，其以引用方式被并入本文)。
在一些实施方案中，2’-O-甲基核苷被定位于有义链的3’末端。在一些实施方案中，有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如，3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中，2’-O-甲基核苷被定位于反义链的3’末端。在一些实施方案中，反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷(例如，3’末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2’-O-甲基化核苷)。在一些实施方案中，有义链的3’末端区和反义链的3’末端区两者都包括多个2’-O-甲基化核苷。在一些实施方案中，有义链包括2’-O-甲基化核苷，所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中，有义链包括2、3、4、5、6、7或8个2’-O-甲基化核苷的连续序列，所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中，反义链包括2’-O-甲基化核苷，所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。在一些实施方案中，反义链包括2、3、4、5、6、7或8个2’-O-甲基化核苷的连续序列，所述2’-O-甲基化核苷与未经修饰的核苷交替。
在一些实施方案中，RNA复合物包括硫代磷酸酯键。“硫代磷酸酯”(或S-oligos)是正常DNA的变体，其中非桥接氧中的一个被硫代替。核苷酸间键的硫化减少核酸内切酶和核酸外切酶的作用，所述核酸内切酶和核酸外切酶包含5’至3’和3’至5’DNA POL 1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两个主要途径被制造：通过二硫化碳中的元素硫的溶液对氢膦酸酯的作用，或通过用二硫化四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法(参见，例如，Iyer et al.,J.Org.Chem.55,4693-4699,1990)。后面的方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶性和二硫化碳的毒性问题。TETD和BDTD方法也产生较高纯度的硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，RNA复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的键全部为硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，RNA复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，RNA复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的键全部为硫代磷酸酯键。
可以将本文所描述的RNA复合物与细胞接触或者施用至有机体(例如，人)。可替代地，可以将编码RNA复合物的构建体和/或载体(vector)与细胞或有机体接触或引入细胞或有机体。在某些实施方案中，使用病毒、逆转录病毒或慢病毒载体(vector)。
本文所描述的RNA复合物可以通过本领域中已知的任何合适的方法制备。例如，在一些实施方案中，本文所描述的RNA复合物通过化学合成或体外转录被制备。
药物组合物
在某些方面，本文提供药物组合物，所述药物组合物包括本文提供的RNA复合物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，药物组合物被配制用于递送至眼(例如，作为滴眼剂或可注射植入物或溶液)。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内递送。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于瘤内递送。在一些实施方案中，药物组合物被瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于口服递送或肠胃外递送。
在一些实施方案中，药物组合物还包括用于治疗AMD或DME的第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂是雷珠单抗。在一些实施方案中，第二药剂是哌加他尼(pegaptanib)。在一些实施方案中，第二药剂是阿柏西普(afibercept)。在一些实施方案中，第二药剂是贝伐单抗。
在一些实施方案中，药物组合物还包括用于治疗癌症的第二药剂。在某些实施方案中，第二治疗剂是化学治疗剂(例如，烷基化剂或具有烷基化作用的药剂，如环磷酰胺(CTX；例如，
Figure BDA0001792390440000101
)、苯丁酸氮芥(CHL；例如，
Figure BDA0001792390440000102
)、顺铂(Cis P；例如
Figure BDA0001792390440000103
)、白消安(例如，
Figure BDA0001792390440000104
)、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、链唑霉素(streptozotocin)、三亚胺嗪(TEM)、丝裂霉素C等；抗代谢物，如甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP16；例如，
Figure BDA0001792390440000105
)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(例如
Figure BDA0001792390440000106
)、达卡巴嗪(DTIC)等；抗生素，如放线菌素D、阿霉素(DXR；例如，
Figure BDA0001792390440000107
)、柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、普卡霉素等；生物碱，如长春花生物碱(如长春新碱(VCR)、长春花碱等)；以及其他抗肿瘤药剂，如紫杉酚(例如，
Figure BDA0001792390440000108
)和紫杉酚衍生物、细胞生长抑制剂(cytostatic agent)、糖皮质激素(如地塞米松(DEX；例如，
Figure BDA0001792390440000109
))和皮质类固醇(如泼尼松(prednisone))、核苷酶抑制剂(如羟基脲)、氨基酸消耗酶(如门冬酰胺酶)、亚叶酸和其他叶酸衍生物以及相似的不同种类的抗肿瘤药剂。下列药剂也可以被用作附加的药剂：阿米福汀(arnifostine)(例如，
Figure BDA00017923904400001010
)、放线菌素D(dactinomycin)、二氯甲基二乙胺(氮芥(nitrogen mustard))、链佐星、环磷酰胺、罗氮芥(CCNU)、阿霉素脂(doxorubicin lipo)(例如，
Figure BDA00017923904400001011
)、吉西他滨(gemcitabine)(例如，
Figure BDA00017923904400001012
)、柔红霉素脂(例如，
Figure BDA00017923904400001013
)、甲基苄肼、丝裂霉素、多西他赛(例如，
Figure BDA00017923904400001014
)、阿德斯白细胞素、卡铂、奥沙利铂、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT 11(伊立替康(irinotecan))、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、拓扑替康(topotecan)、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤(mercaptopurine)、普卡霉素、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁、溴丙哌嗪、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊甙、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派、尿嘧啶芥(uracil mustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥。
在一些实施方案中，第二治疗剂是免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制概括地指抑制癌症细胞可以产生的检查点以预防或下调免疫响应。免疫检查点蛋白的实例包含，但不限于，CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA。免疫检查点抑制剂可以是与免疫检查点蛋白结合并且抑制免疫检查点蛋白的抗体或所述抗体的抗原结合片段。免疫检查点抑制剂的实例包含，但不限于，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012和STI-A1010。
在某些实施方案中，药物组合物不包括转染运载体。在一些实施方案中，药物组合物包括递送运载体(例如，脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)。在一些实施方案中，组合物包含本文所描述的多种(例如，两种或更多种)RNA复合物的组合。
制备这些制剂或组合物的方法包含使本文所描述的RNA复合物与载体以及，可选地，一种或更多种辅助成分结合的步骤。通常，制剂通过使本文所描述的药剂与液体载体均匀地且紧密地结合来制备。
治疗方法
在某些方面，本文提供抑制细胞ANGPT2或PDGFB表达的方法，所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物接触。在某些方面，本文提供在细胞中抑制血管生成的方法，所述方法包括使细胞与本文提供的RNA复合物接触。在一些实施方案中，RNA复合物是经修饰的RNA复合物，并且细胞在不存在转染运载体的情况下与RNA复合物接触。在一些实施方案中，细胞在存在递送运载体(例如，脂质体、阳离子聚合物、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导域(PTD)、抗体和/或适配体)的情况下与RNA复合物接触。
在某些方面，本文提供在受试者中抑制血管生成的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的RNA复合物或药物组合物。在某些方面，本文提供治疗人受试者的AMD、DME或癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的RNA复合物或药物组合物。
在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症包括实体肿瘤。在一些实施方案中，RNA复合物在无递送运载体的情况下被施用。在一些实施方案中，RNA复合物或药物组合物被瘤内施用。在一些实施方案中，RNA复合物或药物组合物被静脉内施用。在一些实施方案中，RNA复合物或药物组合物与第二癌症治疗剂施用。在一些实施方案中，第二癌症治疗剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，第二癌症治疗剂是免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，RNA复合物被施用至受试者的眼。在一些实施方案中，受试者患有AMD(例如，湿性AMD或干性AMD)。在一些实施方案中，受试者患有DME。在一些实施方案中，受试者是雌性。在一些实施方案中，受试者是雄性。在某些实施方案中，RNA复合物或药物组合物被施用至人受试者的眼。在某些实施方案中，RNA复合物或药物组合物是滴眼剂。
在某些实施方案中，RNA复合物或药物组合物被施用至人受试者的肿瘤。在一些实施方案中，RNA复合物被瘤内施用。在某些实施方案中，RNA复合物或药物组合物被静脉内施用。
在一些实施方案中，RNA复合物或药物组合物由受试者自我施用。在一些方面，本文提供通过向受试者施用本文所描述的RNA复合物和/或药物组合物来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，本文所描述的方法可以被用于治疗任何癌性肿瘤或癌前期肿瘤。在一些实施方案中，癌症包含实体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤和/或肿瘤的部分具有正常的或增加的血管生成。可以通过本文提供的方法和组合物治疗的癌症包含，但不限于，来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可能具体地是以下组织学类型，但不限于这些：恶性新生物；癌；未分化的癌；巨型梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移形细胞癌；乳头状移形细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞型癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包裹性硬化型癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺派杰氏病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；以及恶性成神经细胞瘤(malignant roblastoma)；塞托利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩张性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性皮肤纤维瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡性横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合肿瘤(mullerianmixed tumor)；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性卵巢纤维上皮瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性甲状腺肿样卵巢瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮细胞瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质型软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑脊膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥散性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；血浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。
在本发明的方法中，本文所描述的RNA复合物可以被施用至受试者，例如，作为无递送运载体情况下的核酸(例如，对于cp-asiRNA)、与递送试剂组合、和/或作为包括表达本文所描述的RNA复合物的序列的核酸。在一些实施方案中，任何本领域已知的核酸递送方法可以被用于本文所描述的方法中。适合的递送试剂包含，但不限于，例如，Mirus TransitTKO亲脂性试剂；转化脂(lipofectin)；阳离子脂质体(lipofectamine)；细胞转染剂(cellfectin)；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、缺端胶原、nanoplexe和脂质体。Minakuchi etal.Nucleic Acids Res.,32(13):e109(2004)；Hanai et al.Ann NY Acad Sci.,1082:9-17(2006)；和Kawata et al.Mol Cancer Ther.,7(9):2904-12(2008)中描述了将缺端胶原用作核酸分子的递送运载体，其中的每个被整体并入本文。美国专利号8,283,461、8,313,772、8,501,930、8,426,554、8,268,798和8,324,366中提供了示例性的干扰核酸递送系统，其中的每个以引用方式被整体并入本文。
在本文所描述方法的一些实施方案中，脂质体被用于将本文所描述的RNA复合物递送至受试者。适用于本文所描述的方法的脂质体可以由标准囊泡形成脂类形成，所述标准囊泡形成脂类通常包含中性的或带负电的磷脂和甾醇(如胆甾醇)。通常由考虑因素(如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期)来指导脂类的选择。已知用于制备脂质体的各种各样的方法，例如，如Szoka et al.(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其的全部公开内容通过引用被并入本文。
用于本发明方法的脂质体也可以被修饰以便避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。这样的经修饰的脂质体具有表面上或被并入到脂质体结构中的调理素作用抑制部分。
用于制备本文所描述的脂质体的调理素作用抑制部分通常是被结合至脂质体膜的大亲水性聚合物。如本文所使用的，当调理素作用抑制部分以化学方法或以物理方法被附连至膜(例如，通过将脂溶性锚定物嵌入膜自身，或通过直接与膜脂的活性基团结合)时，调理素作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理素作用抑制亲水性聚合物形成保护表面层，所述保护表面层通过MMS和RES显著降低脂质体的摄取；例如，如美国专利号4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过引用被并入本文。
在一些实施方案中，适于修饰脂质体的调理素作用抑制部分是水溶性聚合物，所述水溶性聚合物具有从约500至约40000道尔顿，或从约2000至约20000道尔顿的数均分子量。这样的聚合物包含聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物(如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮)；线性的、支化的或树枝状的聚酰胺胺；聚丙烯酸；多元醇(例如，聚乙烯醇和聚木糖醇，羧基基团或氨基基团以化学方法被连接至聚乙烯醇和聚木糖醇)，以及神经节苷脂(如神经节苷脂GM1)。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，调理素作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理素作用抑制聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、藻酸、角叉菜胶；胺化多糖或寡糖(线性的或支化的)；或羧基化多糖或寡糖，例如，与碳酸的衍生物反应，生成羧基基团连接。在一些实施方案中，调理素作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
本文公开的药物组合物可以通过任何合适的施用途径被递送，所述施用途径包含静脉内、瘤内、眼内、口服和肠胃外。在某些实施方案中，药物组合物被全身性递送(例如，经由口服或静脉内施用)。在某些其他实施方案中，药物组合物通过注射(例如，玻璃体内)或通过滴眼剂被局部递送至眼。
药物组合物中RNA复合物的实际剂量水平可以变化，以便获得RNA复合物的量，所述RNA复合物的量对实现特定患者、组合物和施用模式的期望的治疗响应是有效的，而对患者没有毒性。
所选择的剂量水平将取决于各种各样的因素，所述因素包含所采用的特定药剂的活性、施用途径、施用时间、正在被采用的特定化合物的排泄或代谢的速率、治疗的持续时间、与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康状况和先前的病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师可以容易地确定和开出所需要的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现期望的治疗效果所需的水平开出和/或施用药物组合物中采用的药剂的剂量，并且逐渐增加剂量，直到实现期望的效果。
通常，本文所描述的RNA复合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的RNA复合物的量。这样的有效剂量将通常取决于上述因素。
示例
实施例1：筛选ANGPT2-靶向的不对称较短双链体小干扰RNA
为了鉴定高效抑制ANGPT2的不对称较短双链体小干扰RNA(asiRNA)，合成并且筛选了100种asiRNA。筛选的asiRNA的核酸序列提供在表1中。
表1：示例性ANGPT2-靶向asiRNA的核酸序列。
Figure BDA0001792390440000151
Figure BDA0001792390440000161
Figure BDA0001792390440000171
Figure BDA0001792390440000181
Figure BDA0001792390440000191
Figure BDA0001792390440000201
将表1中列出的asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(Bioneer Inc.,Korea)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将5×103个SK-N-SH细胞接种在96孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用0.1nM的asiRNA转染SK-N-SH细胞。
转染后24小时，使用实时PCR测量经转染的细胞中的ANGPT2mRNA水平。具体地，根据制造商的说明，使用SuperPrep Cell Lysis&RT kit for qPCR(TOYOBO)提取全部RNA，并且合成cDNA。根据制造商的说明，使用
Figure BDA0001792390440000202
探针qPCR Mix(TOYOBO)进行实时PCR。使用ANGPT2
Figure BDA0001792390440000203
探针(Hs01048042_m1)检测ANGPT2的扩增。使用18S
Figure BDA0001792390440000204
探针(Hs03928985_g1)将18S扩增为内部对照。
图1中提供了100种asiRNA中每种对ANGPT2抑制的水平。asiRNA序列中具有好的RNAi效力(＞30％)的27种(asiANGPT2#15、#16、#18、#19、#20、#23、#24、#31、#37、#38、#39、#44、#50、#54、#55、#58、#61、#63、#71、#72、#80、#81、#83、#87、#93、#94和#95)被选择用于后续研究。
实施例2：使用ANGPT2-靶向asiRNA抑制ANGPT2 mRNA表达
测试asiRNA序列中的27种(asiANGPT2#15、#16、#18、#19、#20、#23、#24、#31、#37、#38、#39、#44、#50、#54、#55、#58、#61、#63、#71、#72、#80、#81、#83、#87、#93、#94和#95)抑制ANGPT2表达的能力。
将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(Bioneer)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，将SK-N-SH细胞(ATCC)在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用asiRNA转染SK-N-SH细胞。
具体地，根据制造商的说明，使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng提取的RNA用于cDNA合成。使用power SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测ANGPT2基因的扩增。GAPDH被扩增作为内部对照。使用以下引物序列：
人GAPDH-正向5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′
人GAPDH-反向5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′
人ANGPT2-正向5′-GCA AGT GCT GGA GAA CAT CA-3′
人ANGPT2-反向5′-CAC AGC CGT CTG GTT CTG TA-3′
图2中提供了27种asiRNA的ANGPT2抑制的水平。
如图2中所示，最有效的14种asiRNA(asiANGPT2#15、#16、#18、#19、#23、#31、#37、#44、#54、#58、#72、#87、#93和#94)被选择用于后续研究。
实施例3：使用ANGPT2-靶向asiRNA抑制ANGPT2mRNA表达
通过以1nM转染测试asiRNA序列中的14种(asiANGPT2#15、#16、#18、#19、#23、#31、#37、#44、#54、#58、#72、#87、#93和#94)抑制ANGPT2表达的能力。
将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(Bioneer)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用asiRNA转染SK-N-SH细胞。
具体地，根据制造商的说明，使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng提取的RNA用于cDNA合成。使用power SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测ANGPT2基因的扩增。GAPDH是内部对照。
图3中提供了14种asiRNA的ANGPT2抑制的水平。
实施例4：使用ANGPT2-靶向asiRNA抑制ANGPT2蛋白表达
测试asiANGPT2对ANGPT2蛋白的抑制的效力。
将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(Bioneer)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用1nM的asiRNA转染SK-N-SH细胞。
asiRNA转染后48小时，经由免疫印迹测定ANGPT2蛋白表达的水平。用SDS裂解缓冲液(1％SDS，100mM Tris(pH 8.8))裂解经转染的SK-N-SH细胞。SK-N-SH细胞的10μg的总蛋白质提取物被装载到9％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)预先被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用3％BSA(Bioworld)封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-ANGPT2抗体(SantaCruz)和抗-GAPDH抗体(Santa Cruz)的3％BSA中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在1×TBST中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟，并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对ANGPT2和GAPDH条带成像。
图4中描绘了免疫印迹测定的结果。作为结果，asiANGPT2#54和asiANGPT2#94显示比其他asiANGPT2链更高的抑制效率。这些链被选择用于化学修饰。
实施例5：用于自我递送的asiRNA的化学修饰
将化学修饰应用于选择的asiRNA，并且在不存在其他递送试剂的情况下测试经修饰的asiRNA的细胞递送。如下所述，某些修饰改进asiRNA的内吞作用和稳定性。这样的细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)能够在不存在递送试剂的情况下被递送到细胞中。
筛选了8种潜在的cp-asiRNA(表2)，用于SK-N-SH细胞中的ANGPT2mRNA抑制。将SK-N-SH细胞在无递送试剂的情况下以1μM和3μM与sp-asiRNA孵育，并且通过实时PCR测量ANGPT2mRNA水平。
表2.被测试自我递送和ANGPT2抑制的经修饰的asiRNA序列。
m＝2’-O-甲基RNA，*＝硫代磷酸酯键。
Figure BDA0001792390440000231
Figure BDA0001792390440000241
SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。
将表2中列出的潜在的cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在处理前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。在处理前，用最低必需培养基洗涤SK-N-SH细胞，然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养8小时和24小时，在每个点，用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
asiRNA处理后48小时，使用实时PCR测定ANGPT2mRNA表达的水平。
实施例6：使用ANGPT2-靶向cp-asiRNA抑制ANGPT2 mRNA表达
测试cp-asiRNA对ANGPT2mRNA的抑制。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送试剂的情况下以1μM和3μM与SK-N-SH细胞孵育，并且使用实时PCR测量ANGPT2mRNA水平。
SK-N-SH细胞(ATCC)在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。
将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。在立即处理前，用最低必需培养基(Gibco)洗涤SK-N-SH细胞，然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
asiRNA处理后48小时，通过实时PCR测定ANGPT2mRNA表达的水平。根据制造商的说明，使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng提取的RNA用于cDNA合成。使用power SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)检测ANGPT2基因的扩增。GAPDH被扩增作为内部对照。
实施例7：使用ANGPT2-靶向cp-asiRNA抑制ANGPT2蛋白表达
测试cp-asiRNA对ANGPT2蛋白的抑制。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送试剂的情况下以1μM和3μM与SK-N-SH细胞孵育。SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。
将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。在立即处理前，用最低必需培养基(Gibco)洗涤SK-N-SH细胞，然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
asiRNA处理后48小时，经由免疫印迹测定ANGPT2蛋白表达的水平。简单地说，用SDS裂解缓冲液(1％SDS，100mM Tris(pH 8.8))裂解经处理的SK-N-SH细胞。10μg的总蛋白质提取物被装载到9％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用3％BSA(Bioworld)封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-ANGPT2抗体(Santa Cruz)和抗-GAPDH(Santa Cruz)的3％BSA中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在1×TBST中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟，并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对ANGPT2和GAPDH条带成像。
图7中描绘了免疫印迹测定的结果。作为结果，cp-asiANGPT2#54(在有义链上含有8个2’-O-甲基化和3个硫代磷酸酯键，并且在反义链上含有2个2’-O-甲基化和4个硫代磷酸酯键)、潜在的cp-asiANGPT2#94(在有义链上含有8个2’-O-甲基化和3个硫代磷酸酯键，并且在反义链上含有2个2’-O-甲基化和6个硫代磷酸酯键)展现出最高水平的ANGPT2抑制。
实施例8：使用附加的ANGPT2-靶向cp-asiRNA抑制ANGPT2 mRNA表达
合成多种具有不同链长度以及2’-O-甲基化修饰和硫代磷酸酯键数量的潜在的cp-asiANGPT2结构，并且测试其抑制ANGPT2表达的能力(表3)。
表3.附加的cp-asiRNA序列。m＝2’-O-甲基RNA，*＝硫代磷酸酯键。
Figure BDA0001792390440000261
测试1μM和3μM的表3中列出的每种cp-asiRNA抑制SK-N-SH细胞中ANGPT2mRNA的能力。
SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。将表3中列出的cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。在处理前，用最低必需培养基(Gibco)洗涤SK-N-SH细胞，然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
asiRNA处理后48小时，测定ANGPT2mRNA表达的水平。
如图8中所示，相比其他cp-asiANGPT2，cp-asiANGPT2#54(在有义链上含有8个2’-O-甲基化和4个硫代磷酸酯键，并且在反义链上含有2个2’-O-甲基化和4个硫代磷酸酯键)、潜在的cp-asiANGPT2#94(在有义链上含有8个2’-O-甲基化和3个硫代磷酸酯键，并且在反义链上含有2个2’-O-甲基化和6个硫代磷酸酯键)在ANGPT2抑制能力上展现出较高的效率。
实施例9：使用附加的ANGPT2-靶向cp-asiRNA抑制ANGPT2蛋白
将cp-asiRNA在无递送试剂的情况下以1μM和3μM与SK-N-SH细胞孵育，并且通过免疫印迹测量ANGPT2蛋白水平。SK-N-SH细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的最低必需培养基(Gibco)中被培养，所述最低必需培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。
将cp-asiRNA在OPTI-MEM缓冲液(Gibco)中在95℃孵育5分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。
在转染前一天，将2.5×104个SK-N-SH细胞接种在24孔板中。在立即处理前，用最低必需培养基(Gibco)洗涤SK-N-SH细胞，然后在OPTI-MEM缓冲液中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有asiRNA的OPTI-MEM培养基。
asiRNA处理后48小时，经由免疫印迹测定ANGPT2蛋白表达的水平。用SDS裂解缓冲液(1％SDS，100mM Tris(pH 8.8))裂解经处理的SK-N-SH细胞。10μg的总蛋白质提取物被装载到9％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用3％BSA(Bioworld)封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-ANGPT2抗体(Santa Cruz)和抗-GAPDH抗体(Santa Cruz)的3％BSA中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在1×TBST中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟，并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对ANGPT2和GAPDH条带成像。
图9中描绘了免疫印迹测定的结果。作为结果，cp-asiANGPT2#54-PS4/19(2，4)展现出最高水平的ANGPT2抑制。
实施例10：筛选PDGFB-特异性不对称较短双链体小干扰RNA
为了鉴定高效抑制PDGFB的不对称较短双链体小干扰RNA(asiRNA)，合成并且筛选了100种asiRNA。筛选的asiRNA的核酸序列提供在表4中。
表4：示例性PDGFB-靶向asiRNA的核酸序列。
Figure BDA0001792390440000281
Figure BDA0001792390440000291
Figure BDA0001792390440000301
Figure BDA0001792390440000311
Figure BDA0001792390440000321
Figure BDA0001792390440000331
Figure BDA0001792390440000341
将表4中列出的asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，使用A549细胞(ATCC)，所述A549细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将5×103个A549细胞接种在96孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用0.1nM的asiRNA转染A549细胞。
转染后24小时，使用qRT-PCR测量经转染的细胞中的PDGFB mRNA水平。具体地，使用TOYOBO裂解试剂提取全部RNA，并且然后使用TOYOBO RT试剂(TOYOBO SuperPrep)，将1/5体积的反应混合物用于cDNA合成。稀释合成的cDNA并且然后使用
Figure BDA0001792390440000342
探针qPCR Mix(TOYOBO)进行定量RT-PCR。使用PDGFB
Figure BDA0001792390440000343
探针(Hs00966522_m1)和18S
Figure BDA0001792390440000344
探针(Hs03928985_g1)检测目标基因的扩增。
图11中提供了100种asiRNA中每种对PDGFB表达水平抑制。靶向PDGFB mRNA的asiRNA序列中的22种(asiRNA(17)、asiRNA(24)、asiRNA(42)、asiRNA(43)、asiRNA(47)、asiRNA(53)、asiRNA(63)、asiRNA(64)、asiRNA(65)、asiRNA(66)、asiRNA(67)、asiRNA(72)、asiRNA(73)、asiRNA(79)、asiRNA(80)、asiRNA(84)、asiRNA(85)、asiRNA(92)、asiRNA(93)、asiRNA(94)、asiRNA(95)、asiRNA(99))被选择用于后续研究。
实施例11：使用PDGFB-靶向asiRNA抑制PDGFB mRNA表达
测试靶向PDGFB mRNA的asiRNA序列中的22种(asiRNA(17)、asiRNA(24)、asiRNA(42)、asiRNA(43)、asiRNA(47)、asiRNA(53)、asiRNA(63)、asiRNA(64)、asiRNA(65)、asiRNA(66)、asiRNA(67)、asiRNA(72)、asiRNA(73)、asiRNA(79)、asiRNA(80)、asiRNA(84)、asiRNA(85)、asiRNA(92)、asiRNA(93)、asiRNA(94)、asiRNA(95)、asiRNA(99))在不同的浓度下抑制PDGFB表达的能力。将asiRNA在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，使用A549细胞(ATCC)，所述A549细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将2.5×104个A549细胞接种在24孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用asiRNA转染A549细胞。
转染后24小时，使用实时PCR测量经转染的细胞中的PDGFB mRNA水平。具体地，根据制造商的说明，使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng提取的RNA用于cDNA合成。根据制造商的说明，稀释合成的cDNA，并且然后使用StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。使用power SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测PDGFB基因的扩增。GAPDH被扩增作为内部对照。使用以下引物序列：
人GAPDH-正向5′-GAG TCAACG GAT TTG GTC GT-3′
人GAPDH-反向5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′
人PDGFB-正向5′-CAA GGG ACC TGC TCA TCA TAT T-3′
人PDGFB-反向5′-TAC CAC AGT CTC CCT CCT ATT T-3′
图12中提供了不同浓度的22种asiRNA对PDGFB抑制的水平。靶向PDGFB mRNA的asiRNA序列中的12种(asiRNA(24)、asiRNA(42)、asiRNA(47)、asiRNA(64)、asiRNA(65)、asiRNA(66)、asiRNA(67)、asiRNA(73)、asiRNA(80)、asiRNA(94)、asiRNA(95)、asiRNA(99))被选择用于后续研究。
实施例12：使用PDGFB-特异性asiRNA抑制PDGFB蛋白表达
将asiRNA中的12种在1×siRNA双链体缓冲液(STpharm)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。经由凝胶电泳确认适当的链退火。使用A549细胞(ATCC)，所述A549细胞(ATCC)已经在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)中被培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Gibco)含有10％胎牛血清(Gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素。在转染前一天，将9.0×104个A549细胞接种在6孔板中。根据制造商的说明，使用RNAiMAX(Invitrogen)用0.3nM的asiRNA转染A549细胞。
asiRNA转染后48小时，使用实时PCR测量经转染的细胞中PDGFB mRNA水平，并且经由免疫印迹测定PDGFB蛋白表达的水平。
具体地，根据制造商的说明，使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng提取的RNA用于cDNA合成。根据制造商的说明，稀释合成的cDNA，并且然后使用StepOne实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行定量实时PCR。使用power SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)检测PDGFB基因的扩增。GAPDH被扩增作为内部对照。使用以下引物序列：
人GAPDH-正向5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′
人GAPDH-反向5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′
人PDGFB-正向5′-CAA GGG ACC TGC TCA TCA TAT T-3′
人PDGFB-反向5′-TAC CAC AGT CTC CCT CCT ATT T-3′
图13中描绘了mRNA水平结果。靶向PDGFB mRNA的asiRNA序列中的6种(asiRNA(42)、asiRNA(47)、asiRNA(64)、asiRNA(67)、asiRNA(94)、asiRNA(95))显示有效的基因沉默活性(60％～)。
在蛋白质水平的情况下，用RIPA缓冲液(GE)裂解经转染的A549细胞。A549细胞的20μg的总蛋白质提取物被装载到10％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。将膜在室温用5％脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-PDGFB抗体(Abcam)和抗-β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz)的5％脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用1×TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在5％脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体孵育1小时。膜被用1×TBST洗涤10分钟，并且用1×ECL处理1分钟。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对PDGFB和β-肌动蛋白条带成像。
图14中描绘了免疫印迹测定的结果。在A549细胞的asiPDGFB(42、47、66、67、94、95)转染细胞系中，50％或更多的PDGFB蛋白抑制被确认(图14)。
总共靶向PDGFB基因的asiRNA序列中的5种(asiRNA(42)、asiRNA(47)、asiRNA(67)、asiRNA(94)、asiRNA(95))被选择用于后续研究。
实施例13：用于自我递送的asiRNA的化学修饰
将化学修饰应用于实施例3中选择的asiRNA，并且在不存在其他递送运载体的情况下测试经修饰的asiRNA的细胞递送。如下所述，某些修饰改进asiRNA的内吞作用和稳定性。这样的细胞穿透asiRNA(cp-asiRNA)能够在不存在递送运载体的情况下被递送到细胞中。如使用上述方法测定的，图15中提供了细胞PDGFB mRNA的表达，并且图16中提供了PDGFB蛋白水平。
筛选了潜在的cp-asiRNA(表5)，用于在A549细胞中血小板衍生生长因子亚基B(PDGFB)mRNA抑制。将每种潜在的cp-asiRNA在无递送运载体的情况下以1μM和3μM与A549细胞孵育，并且通过qRT-PCR和免疫印迹研究测量PDGFB表达水平。
表5.被测试自我递送和PDGFB抑制的经修饰的asiRNA序列(5’至3’)。m＝2′-O-甲基RNA。*＝硫代磷酸酯键。
Figure BDA0001792390440000361
Figure BDA0001792390440000371
将A549细胞(ATCC)在100mm细胞培养皿中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)中培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素。将表5中列出的潜在的cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。
在cp-asiRNA处理当天，将9×104个细胞接种在6孔板中，并且然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有cp-asiRNA的Opti-MEM培养基。24小时之后，使用qRT-PCR测定A549细胞中的PDGFB mRNA水平。具体地，使用
Figure BDA0001792390440000372
(TaKaRa)提取全部RNA，并且然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)，将500ng的反应混合物用于cDNA合成。稀释合成的cDNA，并且然后使用power SYBR green PCR master Mix(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。
在48小时的cp-asiRNA孵育之后，经由免疫印迹测定PDGFB蛋白表达的水平。简单地说，用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(GE Healthcare)裂解经处理的A549细胞。20μg的总蛋白质提取物被装载到10％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)已经被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。膜在室温用5％脱脂乳(Seoul Milk)封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-PDGFB抗体(Abcam)和抗-γ-微管蛋白抗体(Bethyl)的5％脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在5％脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体(Santa Cruz)孵育1小时。膜被用TBST洗涤10分钟，并且用ECL底物(Thermo Scientific)处理。然后使用Chemidoc仪器(Bio-rad)对蛋白质条带成像。
图15和16中提供了9种潜在的cp-asiRNA中每种的PDGFB抑制的水平。从测试的潜在的cp-asiRNA中，选择cp-asiPDGFB 67(7，4)用于进一步研究。
实施例14：附加的PDGFBcp-asiRNA结构
合成具有不同化学修饰或序列的其他潜在的PDGFB cp-asiRNA结构，并且测试其抑制PDGFB表达的能力(表6)。
表6.附加的cp-asiRNA序列(5’至3’，m＝2′-O-甲基RNA。*＝硫代磷酸酯键)。
Figure BDA0001792390440000381
测试表6中列出的cp-asiRNA抑制A549细胞中PDGFB表达的能力。将A549细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)中培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和100单位/ml青霉素100μg/ml。将表6中列出的cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。在cp-asiRNA处理当天，将2.5×104个细胞接种在24孔板中，然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养24小时，此时，用含有血清的培养基代替含有cp-asiRNA的Opti-MEM培养基。24小时之后，测定A549细胞中的PDGFB表达水平。
将cp-asiRNA在Opti-MEM(Gibco)中在95℃孵育2分钟，并且在37℃孵育1小时。通过凝胶电泳确认潜在的cp-asiRNA的适当的链退火。将A549细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)中培养，所述达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco)含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)以及100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。在处理当天，将9×104个A549细胞接种在6孔板中，然后在Opti-MEM中在存在潜在的cp-asiRNA的情况下培养。24小时之后，经由免疫印迹测定A549细胞中的PDGFB蛋白水平。简单地说，用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(GE Healthcare)裂解经处理的A549细胞。20μg的总蛋白质提取物被装载到10％的SDS-PAGE凝胶上并且在120V进行电泳。在电泳之后，将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-rad)，所述PVDF膜(Bio-rad)预先被甲醇(Merck)在300mA活化1小时。膜在室温用5％脱脂乳(Seoul Milk)被封闭1小时，并且然后在4℃在含有抗-PDGFB抗体(Abcam)和抗-γ-微管蛋白抗体(Bethyl)的5％脱脂乳中孵育过夜。然后膜被用TBST洗涤10分钟3次，并且在室温在5％脱脂乳中用HRP缀合的二级抗体(Santa Cruz)孵育1小时。膜被用TBST洗涤10分钟，并且用ECL底物(Thermo Scientific)处理。然后使用Chemidoc仪器(Bio-Rad)对目标蛋白质条带成像。
如图18所示，由21个核苷酸反义链组成的PDGFB表达的潜在的cp-asiPDGFB 67和由19个核苷酸反义链组成的PDGFB表达的潜在的cp-asiRNA展现出相似水平的PDGFB抑制。并且在无递送运载体的情况下，cp-asiPDGFB 94(4，4)、cp-asiPDGFB 95(4，4)、asiPDGFB95(2，4)显示有效的PDGFB抑制。
通过引用并入
本文提到的全部出版物、专利和专利申请以引用方式被整体并入，犹如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表明通过引用被并入。在冲突的情况下，本申请(包含本文中的任何定义)将受约束。
等同物
本领域技术人员将认识到或能够使用仅仅常规实验来确定本文中描述的本发明的具体的实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。

Claims (85)

1.一种RNA复合物，所述RNA复合物包括与PDGFB mRNA序列互补的反义链和由与所述反义链互补的SEQ ID NO:417的序列组成的有义链，其中所述反义链和所述有义链形成复合物，其中所述反义链的5’端和所述有义链的3’端形成平端，并且其中所述反义链由SEQ IDNO:418组成。
2.如权利要求1所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物能够抑制细胞PDGFB表达。
3.如权利要求2所述的RNA复合物，其中所述细胞是SK-N-SH细胞。
4.如权利要求2所述的RNA复合物，其中所述细胞是A549细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链或者所述反义链包括至少一个化学修饰。
6.如权利要求5所述的RNA复合物，其中所述化学修饰为2’-O-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或疏水部分。
7.如权利要求6所述的RNA复合物，其中所述化学修饰为疏水部分。
8.如权利要求7所述的RNA复合物，其中所述疏水部分为胆甾醇部分。
9.如权利要求8所述的RNA复合物，其中所述胆甾醇部分被附连至所述有义链的3’末端。
10.如权利要求8所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物包括2’-O-甲基化核苷。
11.如权利要求10所述的RNA复合物，其中所述2’-O-甲基化核苷被定位于所述有义链的3’末端。
12.如权利要求11所述的RNA复合物，其中所述有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
13.如权利要求10所述的RNA复合物，其中所述2’-O-甲基化核苷被定位于所述反义链的3’末端。
14.如权利要求13所述的RNA复合物，其中所述反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
15.如权利要求10所述的RNA复合物，其中2’-O-甲基化核苷被定位于所述有义链的3’末端和所述反义链的3’末端。
16.如权利要求15所述的RNA复合物，其中所述有义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷，并且所述反义链的3’末端区包括多个2’-O-甲基化核苷。
17.如权利要求5至16中任一项所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物包括硫代磷酸酯键。
18.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25％为硫代磷酸酯键。
19.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少50％为硫代磷酸酯键。
20.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键的至少75％为硫代磷酸酯键。
21.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链中的核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。
22.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少25％为硫代磷酸酯键。
23.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少50％为硫代磷酸酯键。
24.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述反义链中的核糖核苷酸之间的键的至少75％为硫代磷酸酯键。
25.如权利要求17所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述反义链中的核糖核苷酸之间的键全部都为硫代磷酸酯键。
26.如权利要求5所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物的所述有义链和所述反义链选自下表中列出序列：
Figure FDA0003514367150000031
所述有义链和所述反义链的组合选自下列：asiPDFGB(95)-S和asiPDFGB(95)-(7,4)AS的组合、asiPDFGB(95)-S和asiPDFGB(95)-(4,4)AS的组合、以及asiPDFGB(95)-S和asiPDFGB(95)-(2,4)AS的组合。
27.如权利要求17至26中任一项所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物能够在不存在递送运载体的情况下穿透细胞的细胞膜。
28.如权利要求1至27中任一项所述的RNA复合物，其中所述RNA复合物不是细胞毒性的。
29.权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物在制造用于抑制细胞PDGFB表达的药物中的应用，所述抑制操作包括使所述细胞与如权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物接触。
30.如权利要求29所述的应用，其中所述细胞是A549细胞。
31.如权利要求29所述的应用，其中所述细胞是SK-N-SH细胞。
32.如权利要求29所述的应用，其中所述细胞是肿瘤细胞。
33.如权利要求32所述的应用，其中所述肿瘤细胞存在于人受试者中的肿瘤中。
34.如权利要求29所述的应用，其中所述细胞存在于人受试者的眼中。
35.权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物在制造用于在受试者中抑制血管生成相关性疾病的药物中的应用，所述抑制操作包括施用如权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物。
36.如权利要求35所述的应用，其中所述血管生成相关性疾病是癌症。
37.如权利要求36所述的应用，其中所述癌症包括实体肿瘤。
38.如权利要求35所述的应用，其中所述血管生成相关性疾病是AMD。
39.如权利要求38所述的应用，其中所述AMD是湿性AMD。
40.如权利要求38所述的应用，其中所述AMD是干性AMD。
41.如权利要求35所述的应用，其中所述血管生成相关性疾病是DME。
42.如权利要求29至41中任一项所述的应用，其中所述RNA复合物在不存在递送运载体的情况下被施用。
43.如权利要求35至37中任一项所述的应用，其中所述RNA复合物被瘤内施用。
44.如权利要求38至41中任一项所述的应用，其中所述RNA复合物被施用至所述受试者的眼。
45.权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物在制造用于在癌症受试者中治疗癌症的药物中的应用，所述治疗操作包括向所述受试者施用如权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物。
46.如权利要求45所述的应用，其中所述RNA复合物在不存在递送运载体的情况下被施用。
47.如权利要求45所述的应用，其中所述RNA复合物被瘤内施用。
48.如权利要求45所述的应用，其中所述RNA复合物被静脉内施用。
49.如权利要求45至48中任一项所述的应用，所述治疗操作还包括施用第二癌症治疗剂。
50.如权利要求49所述的应用，其中所述第二癌症治疗剂是化学治疗剂。
51.如权利要求49所述的应用，其中所述第二癌症治疗剂是免疫检查点抑制剂。
52.权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物在制造用于在受试者中治疗AMD或DME的药物中的应用，所述治疗操作包括向所述受试者施用如权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物。
53.如权利要求52所述的应用，其中所述AMD是湿性AMD。
54.如权利要求52所述的应用，其中所述AMD是干性AMD。
55.如权利要求52所述的应用，所述治疗操作包括向所述受试者的眼施用所述RNA复合物。
56.如权利要求55所述的应用，其中所述RNA复合物被眼内施用。
57.如权利要求56所述的应用，其中所述RNA复合物被玻璃体内施用。
58.如权利要求52所述的应用，其中所述RNA复合物在不存在递送运载体的情况下被施用。
59.如权利要求52所述的应用，其中所述RNA复合物被肠胃外施用。
60.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1至28中任一项所述的RNA复合物和药学上可接受的载体。
61.权利要求60所述的药物组合物在制造用于在受试者中抑制血管生成的药物中的应用，所述抑制操作包括向所述受试者施用如权利要求60所述的药物组合物。
62.权利要求60所述的药物组合物在制造用于在受试者中治疗癌症的药物中的应用，所述治疗操作包括向所述受试者施用如权利要求60所述的药物组合物。
63.如权利要求61所述的应用，所述抑制操作包括向所述受试者中的肿瘤施用所述药物组合物。
64.如权利要求63所述的应用，所述抑制操作包括瘤内、肠胃外或口服施用所述药物组合物。
65.如权利要求62所述的应用，所述治疗操作包括向所述受试者中的肿瘤施用所述药物组合物。
66.如权利要求65所述的应用，所述治疗操作包括瘤内、肠胃外或口服施用所述药物组合物。
67.如权利要求62所述的应用，所述治疗操作还包括施用用于治疗癌症的第二药剂。
68.如权利要求67所述的应用，其中所述第二药剂是化学治疗剂。
69.如权利要求67所述的应用，其中所述第二药剂是免疫检查点抑制剂。
70.如权利要求61或62所述的应用，其中所述受试者自我施用所述药物组合物。
71.权利要求60所述的药物组合物在制造用于在受试者中治疗AMD或DME的药物中的应用，所述治疗操作包括向所述受试者施用如权利要求59所述的药物组合物。
72.如权利要求71所述的应用，其中所述受试者患有AMD。
73.如权利要求72所述的应用，其中所述AMD是湿性AMD。
74.如权利要求72所述的应用，其中所述AMD是干性AMD。
75.如权利要求71所述的应用，其中所述受试者患有DME。
76.如权利要求71至75中任一项所述的应用，所述治疗操作包括向所述受试者的眼施用所述药物组合物。
77.如权利要求76所述的应用，其中所述药物组合物是滴眼剂。
78.如权利要求71至77中任一项所述的应用，所述治疗操作包括眼内施用所述药物组合物。
79.如权利要求78所述的应用，所述治疗操作包括玻璃体内施用所述药物组合物。
80.如权利要求71至75中任一项所述的应用，所述治疗操作包括肠胃外施用所述药物组合物。
81.如权利要求71至75中任一项所述的应用，所述治疗操作包括口服施用所述药物组合物。
82.如权利要求71至81中任一项所述的应用，其中所述受试者自我施用所述药物组合物。
83.如权利要求71至77中任一项所述的应用，所述治疗操作还包括施用用于治疗AMD的第二药剂。
84.如权利要求71至77中任一项所述的应用，所述治疗操作还包括施用用于治疗DME的第二药剂。
85.如权利要求83或84所述的应用，其中所述第二药剂是雷珠单抗、贝伐单抗、哌加他尼或阿柏西普。
CN201780015900.5A 2016-02-02 2017-02-01 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病 Active CN108779464B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662290330P 2016-02-02 2016-02-02
US62/290,330 2016-02-02
PCT/IB2017/000167 WO2017134526A1 (en) 2016-02-02 2017-02-01 Treatment of angiogenesis-associated diseases using rna complexes that target angpt2 and pdgfb

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108779464A CN108779464A (zh) 2018-11-09
CN108779464B true CN108779464B (zh) 2022-05-17

Family

ID=59386437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780015900.5A Active CN108779464B (zh) 2016-02-02 2017-02-01 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10519449B2 (zh)
EP (1) EP3411481A4 (zh)
JP (1) JP7003044B2 (zh)
KR (1) KR20180104692A (zh)
CN (1) CN108779464B (zh)
CA (1) CA3022877A1 (zh)
WO (1) WO2017134526A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2732929T3 (es) 2010-10-22 2019-11-26 Olix Pharmaceuticals Inc Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas
EP2853597B1 (en) 2012-05-22 2018-12-26 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rna-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
KR20180104692A (ko) 2016-02-02 2018-09-21 올릭스 주식회사 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
EP3411480A4 (en) 2016-02-02 2020-01-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGETE IL4R, TRPA1, OR F2RL1
WO2017178883A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
JP7424728B2 (ja) 2017-02-10 2024-01-30 オリック パルマセゥティカルズ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉のための長鎖の二本鎖ｒｎａ

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837258A (en) 1991-08-30 1998-11-17 University Of South Florida Induction of tissue, bone or cartilage formation using connective tissue growth factor
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
ES2215494T5 (es) 2000-12-01 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Moléculas de RNA pequeñas que median la interferencia de RNA
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20080188430A1 (en) 2001-05-18 2008-08-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050119202A1 (en) 2001-10-26 2005-06-02 Roland Kreutzer Medicament to treat a fibrotic disease
US20040138163A1 (en) 2002-05-29 2004-07-15 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
PT1527176E (pt) 2002-08-05 2007-04-30 Atugen Ag Novas formas de muléculas de arn de interferência
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP1605978B1 (en) 2003-03-07 2010-09-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions
US20040198640A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Dharmacon, Inc. Stabilized polynucleotides for use in RNA interference
US20050136437A1 (en) * 2003-08-25 2005-06-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
US20060134787A1 (en) 2004-12-22 2006-06-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA
US20060069050A1 (en) 2004-02-17 2006-03-30 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
ES2423060T3 (es) 2004-03-12 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
WO2006031901A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Somagenics, Inc. SMALL INTERFERING RNAs THAT EFFICIENTLY INHIBIT VIRAL GENE EXPRESSION AND METHODS OF USE THEREOF
EP2377873B1 (en) 2004-09-24 2014-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of ApoB and uses thereof
US20060142228A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
TWI386225B (zh) 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
CA2603842A1 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Rnai therapeutic for respiratory virus infection
ATE546526T1 (de) 2005-05-25 2012-03-15 Univ York Hybrid-interferenz-rna
NZ564375A (en) 2005-06-24 2010-02-26 Intervet Int Bv Inactivated chimeric flavivirus vaccines and related methods of use
FR2890859B1 (fr) 2005-09-21 2012-12-21 Oreal Oligonucleotide d'arn double brin inhibant l'expression de la tyrosinase
US7825099B2 (en) 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
JP2009524430A (ja) 2006-01-26 2009-07-02 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 治療的使用のためのｒｎａ干渉剤
CA2913655A1 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Biogen Ma Inc. Nogo receptor antagonists
US20070218495A1 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Dharmacon, Inc. Methods, libraries and computer program products for gene silencing with reduced off-target effects
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
US20100105134A1 (en) * 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2008109372A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgf gene expression and uses thereof
CA2679867A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf family gene expression and uses thereof
DK2164967T3 (en) 2007-05-31 2015-10-19 Univ Iowa Res Found Reduction of off-target rna interferenstoksicitet
US20090004668A1 (en) 2007-06-22 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pre-miRNA loop-modulated target regulation
CA2692632A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 Intradigm Corporation Methods and compositions for treatment of cancer and other angiogenesis-related diseases
WO2009020344A2 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Postech Acad Ind Found Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same
CN101842381A (zh) 2007-08-27 2010-09-22 波士顿生物医药公司 作为微小rna模拟物或抑制剂的不对称rna双链体的组合物
CN101849008A (zh) 2007-09-19 2010-09-29 应用生物系统有限公司 用于减少RNAi中的脱靶表型效应的siRNA的不依赖于序列的修饰形式和其稳定形式
CA2701845A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirna structures
US8614311B2 (en) 2007-12-12 2013-12-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. RTP801L siRNA compounds and methods of use thereof
KR100949791B1 (ko) 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
WO2009105260A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 University Of Kentucky Ultra-small rnas as toll-like receptor-3 antagonists
CA2731779A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
WO2010026660A1 (ja) 2008-09-08 2010-03-11 学校法人福岡大学 Ｚｆａｔ遺伝子発現抑制ｒｎａ
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
US20100227920A1 (en) 2008-09-29 2010-09-09 The Regents Of The University Of California Aldehyde dehydrogenase inhibitors as novel depigmenting agents
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US8829179B2 (en) * 2009-02-18 2014-09-09 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of ANG2
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
ES2921573T3 (es) 2009-04-03 2022-08-29 Dicerna Pharmaceuticals Inc Métodos y composiciones para la inhibición específica de KRAS por RNA bicatenario asimétrico
WO2011019887A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Waveguide coupler having continuous three-dimensional tapering
KR101207561B1 (ko) 2009-12-15 2012-12-04 주식회사 코리아나화장품 티로시나제의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
EP2550001B1 (en) 2010-03-24 2019-05-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
EP2569445B1 (en) 2010-05-12 2017-01-04 Val-Chum, Limited Partnership Screening assays based on abhd6 for selecting insulin secretion promoting agents
WO2012037254A1 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
US9238812B2 (en) * 2010-09-30 2016-01-19 Lsip, Llc Agent for suppressing expression of dominant mutant gene
ES2732929T3 (es) 2010-10-22 2019-11-26 Olix Pharmaceuticals Inc Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas
CN103298939A (zh) 2010-12-06 2013-09-11 夸克医药公司 包含位置修饰的双链寡核苷酸化合物
CN102719432B (zh) 2011-03-29 2013-10-23 南京大学 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用
KR101590586B1 (ko) 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
EP2853597B1 (en) 2012-05-22 2018-12-26 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rna-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
JP2016525346A (ja) 2013-07-05 2016-08-25 バイオニア コーポレーションＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれを含む呼吸器疾患予防または治療用組成物
US20160208247A1 (en) 2013-07-31 2016-07-21 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
US9790506B2 (en) 2013-10-02 2017-10-17 The Regents Of The University Of California Diagnostic and screening methods for atopic dermatitis
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US20170226507A1 (en) 2014-05-05 2017-08-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Coordinate control of pathogenic signaling by the mir-130/301 family in pulmonary hypertension and fibroproliferative diseases
US9139648B1 (en) * 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
WO2016161388A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
CN108138181B (zh) 2015-07-27 2022-05-24 奥利克斯医药有限公司 抑制黑色素生成的rna复合物
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
EP3411480A4 (en) 2016-02-02 2020-01-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGETE IL4R, TRPA1, OR F2RL1
KR20180104692A (ko) 2016-02-02 2018-09-21 올릭스 주식회사 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
WO2017178883A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
JP7424728B2 (ja) 2017-02-10 2024-01-30 オリック パルマセゥティカルズ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉のための長鎖の二本鎖ｒｎａ

Also Published As

Publication number Publication date
CN108779464A (zh) 2018-11-09
JP2019506862A (ja) 2019-03-14
US10519449B2 (en) 2019-12-31
WO2017134526A1 (en) 2017-08-10
EP3411481A4 (en) 2020-02-26
KR20180104692A (ko) 2018-09-21
US20200123548A1 (en) 2020-04-23
CA3022877A1 (en) 2017-08-10
EP3411481A1 (en) 2018-12-12
JP7003044B2 (ja) 2022-01-20
US20170218374A1 (en) 2017-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108779464B (zh) 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病
US10829761B2 (en) Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
CN108699556B (zh) 使用靶向myd88或tlr3的rna复合物治疗老年性黄斑变性
US10947541B2 (en) Treatment of atopic dermatitis and asthma using RNA complexes that target IL4Rα, TRPA1, or F2RL1
KR102575703B1 (ko) Wfdc2의 발현을 조절하는 안티센스 화합물
KR20230042646A (ko) Wfdc2의 발현을 조절하는 안티센스 화합물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant