ES2732929T3 - Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas - Google Patents
Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2732929T3 ES2732929T3 ES11834541T ES11834541T ES2732929T3 ES 2732929 T3 ES2732929 T3 ES 2732929T3 ES 11834541 T ES11834541 T ES 11834541T ES 11834541 T ES11834541 T ES 11834541T ES 2732929 T3 ES2732929 T3 ES 2732929T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- chain
- acid molecule
- sequence
- sirna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
Abstract
Una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que comprende una primera cadena y una segunda cadena, donde la primera cadena tiene una longitud de 24-31 nt y es complementaria a un ácido nucleico diana y comprende una región monocatenaria de 10-15 nt de longitud; donde la segunda cadena tiene una longitud de 13-16 nt y se une de manera complementaria a la primera cadena, y donde el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena forman un extremo romo.
Description
DESCRIPCIÓN
Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que tiene una nueva estructura y el uso de la misma, y más particularmente a una nueva molécula de ácido nucleico que tiene una estructura que consiste en una primera cadena, que es de 24-121 nucleótidos (nt) de longitud y comprende una región parcial complementaria a un ácido nucleico diana, y una segunda cadena que tiene una longitud de 13-21 nt y tiene una región que se une de manera complementaria a la región parcial complementaria al ácido nucleico diana dentro de la primera cadena, de modo que la molécula de ácido nucleico inhibe la expresión del gen diana con mayor eficiencia, y a un procedimiento para inhibir la expresión de un gen diana utilizando la molécula de ácido nucleico.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo capaz de inhibir la expresión de un gen de una manera altamente específica y eficiente, en la cual la degradación del ARNm de un gen diana se induce mediante la introducción de un a Rn bicatenario, que comprende una cadena con sentido que tiene una secuencia homóloga al ARNm del gen diana y una cadena antisentido que tiene una secuencia complementaria al ARNm del gen diana, en células o similares, inhibiendo así la expresión del gen diana.
En la mayoría de los siRNA que se han utilizado en la técnica, la longitud de la cadena antisentido está limitada a 19-23 nucleótidos (nt). Esto se debe a que la estructura de los siRNA que han sido utilizados por los investigadores imita la estructura de los productos obtenidos al cortar ARNds largos en las células con una dicer (Elbashir y col., Nature 2001, 411:494-498). Además, los primeros estudios de cristalografía de rayos X sugirieron un modelo donde los extremos 5' y 3' de la cadena antisentido de siRNA introducida en Argonauta-2 (Ago2), que es el elemento clave de un complejo RISC, se unen al dominio medio y el bolsillo de unión del dominio PAZ, respectivamente (Song y col. Nat. Struct. Biol. 2003, 10:1026-1032), pero estudios posteriores revelaron que el extremo 3' que sigue al 16.° nucleótido de la cadena antisentido no está unido al dominio PAZ (Wang y col. Nature 2009, 461:754-761). Esto sugiere que puede haber flexibilidad en la secuencia y la longitud del extremo 3' de la cadena antisentido siRNA. Mientras tanto, un estudio adicional sobre siRNA informó sobre un constructo de siRNA-ADN modificado, que comprende una molécula de ADN monocatenaria que puede funcionar como un cebador de la PCR para detectar siRNA en una muestra (documento US 2009/0012022 A1). Sin embargo, el constructo de siRNA-ADN modificado simplemente tiene una herramienta adicional para la cuantificación, pero no tiene una influencia positiva en la eficiencia con la que se inhibe un gen diana.
Por consiguiente, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para conseguir una nueva molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que inhiba un gen diana con mayor eficacia y, como resultado, han diseñado una molécula de ácido nucleico bicatenaria que comprende una primera cadena que tiene una longitud de 24-121 nt y comprende una región complementaria a un ácido nucleico diana, y una segunda cadena que tiene una longitud de 13-21 nt y tiene una región que se une de manera complementaria a la región de la primera cadena, que es complementaria al ácido nucleico diana y los presentes inventores han predicho que un oligonucleótido de ácido nucleico contenido en la región monocatenaria en el extremo 3' de la primera cadena se dirigirá a otros genes diana o guiará esta molécula de ácido nucleico al gen diana. Además, los presentes inventores han construido una estructura de molécula de ácido nucleico, que tiene una región monocatenaria larga en el extremo 3' de la primera cadena, utilizando una estructura de siRNA (publicación de patente coreana en trámite N.° 10-2009-0065880). presentada por los presentes inventores) que muestra efectos distintos a los deseados minimizados y no satura la maquinaria de ARNi, y los presentes inventores han predicho que un oligonucleótido de ácido nucleico, que está contenido en la región monocatenaria en el extremo 3' de la primera cadena, puede mostrar el efecto de dirigirse a otros genes diana o guiar el siRNA en el extremo 5' del gen diana, mientras que los efectos distintos a los deseados se minimizan, cumplimentando así la presente invención.
La información anterior descrita en esta sección de antecedentes pretende solo mejorar la comprensión de los antecedentes de la presente invención y, por lo tanto, puede contener información que no forma la técnica anterior que ya es conocida por un experto en la materia.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Un objeto de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que tiene una nueva estructura y un efecto mejorado sobre la inhibición de la expresión génica.
Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que comprende una primera cadena y una segunda cadena, donde la primera cadena tiene una longitud de 24-31 nt y es complementaria de un ácido nucleico diana y comprende una región monocatenaria de 10-15 nt de longitud, donde la segunda cadena tiene una longitud de 13-16 nt y se une de manera complementaria a la primera cadena, y donde el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena forman un extremo romo.
La presente invención también proporciona un complejo de ácido nucleico que comprende un vehículo de suministro celular unido a la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi.
La presente invención también proporciona un procedimiento in vitro para la administración intracelular de una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi, comprendiendo el procedimiento introducir el complejo de ácido nucleico anterior en una célula.
La presente invención también proporciona una composición para inhibir la expresión génica, que contiene la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior.
La presente invención también proporciona un procedimiento in vitro para inhibir la expresión génica, que comprende una etapa de introducción de la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior en una célula. La presente invención también proporciona un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, comprendiendo el procedimiento una etapa de expresión de la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior en la célula.
La presente invención también proporciona una composición anticancerosa que contiene la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior.
Otras características y realizaciones de la presente invención serán más evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas y las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras que no pertenecen a la invención son solo para fines ilustrativos.
La fig. 1 es una vista esquemática que muestra una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi según la presente descripción.
La fig. 2 muestra un siRNA largo antisentido (lsiRNA) obtenido extendiendo el extremo 3' de la cadena antisentido para proporcionar una secuencia complementaria a un ARNm diana.
La fig. 3 muestra un asiRNA (lasiRNA) largo antisentido obtenido extendiendo el extremo 3' de la cadena antisentido de una estructura de asiRNA para proporcionar una secuencia complementaria a un ARNm diana.
La fig. 4 muestra una estructura obtenida extendiendo una secuencia de ribozima o ADNzima dirigida a ARNm diana en el extremo 3' de una estructura de siRNA.
La fig. 5 muestra estructuras de moléculas de siRNA que inhiben la expresión del gen KRAS que está involucrado en el crecimiento de células cancerosas.
La fig. 6 es un diagrama gráfico que muestra los niveles relativos de ARNm de KRAS causados por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 5.
La fig. 7 es un diagrama gráfico que muestra los resultados de la medición de los niveles de expresión del ARNm de KRAS, causados por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 5, en el día 1, el día 2 y el día 3.
La fig. 8 muestra las estructuras moleculares asiRNA y lasiRNA para KRAS.
La fig. 9 es un diagrama gráfico que muestra los niveles relativos de ARNm de KRAS causados por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 8.
La fig. 10 es un diagrama gráfico que muestra los resultados de la medición de las viabilidades de una línea celular AGS, causadas por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 8, en el día 5.
La fig. 11 muestra lsiRNA (21S 10r) y lasiRNA (16S 10r), que tienen una secuencia extendida complementaria al
ARNm, para KRAS, y estructuras moleculares (21S 10rc y 16S 10rc) que tienen una secuencia extendida no complementaria al ARNm.
La fig. 12 muestra los niveles relativos de ARNm de KRAS causados por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 11.
La fig. 13 muestra las estructuras moleculares de asiRNA y lasiRNA para CTNNB1-2.
La fig. 14 muestra los niveles de expresión de ARNm de KRAS causados por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 13.
La fig. 15 es un diagrama gráfico que muestra los resultados de la medición de las viabilidades de una línea celular Hep3B, causadas por la introducción de las moléculas de ácido nucleico mostradas en la fig. 13, en el día 5.
La fig. 16 es una fotografía que muestra los resultados del análisis 5'RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la materia al que pertenece esta invención. En general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos experimentales que se describirán más adelante son aquellos bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
La definición de los términos principales utilizados en la descripción detallada de la invención es la siguiente.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ARNi" (interferencia de ARN) se refiere a un mecanismo por el cual un ARN bicatenario (dsRNA) que consiste en una cadena que tiene una secuencia complementaria al ARNm de un gen diana y una cadena que tiene una secuencia complementaria al mismo se introduce en células o similares para inducir la degradación del ARNm del gen diana e inhibir así la expresión del gen diana.
Tal como se usa en el presente documento, el término "siRNA" (ARN de interferencia pequeño) se refiere a un ARN bicatenario (dsRNA) corto que actúa como mediador en el silenciamiento génico eficaz de una manera específica de la secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, el término "cadena antisentido" se refiere a un polinucleótido que es complementario sustancialmente o al 100 % con un ácido nucleico diana de interés. Por ejemplo, una cadena antisentido puede ser complementaria, en su totalidad o en parte, a una molécula de ARNm (ARN mensajero), una secuencia de ARN que no es ARNm (por ejemplo, microARN, piwiARN, ARNt, ARNr y hnARN) o una secuencia de ADN que es codificante o no codificante. Los términos "cadena antisentido" y "cadena guía" se utilizan indistintamente en el presente documento.
El término "cadena con sentido" se refiere a un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos, en su totalidad o en parte, que un ácido nucleico diana, donde el polinucleótido es idéntico, total o parcialmente, a una molécula de ARNm (ARN mensajero), una secuencia de ARN que no es ARNm (por ejemplo, microARN, piwiRNA, ARNt, ARNr y hnRNA) o una secuencia de ADN codificante o no codificante.
Tal como se usa en el presente documento, el término "gen" pretende tener el significado más amplio, y el gen puede codificar una proteína estructural o una proteína reguladora. En el presente documento, la proteína reguladora incluye un factor transcripcional, una proteína de choque térmico o una proteína que está implicada en la replicación, transcripción y / o traducción de ADN/ARN. Además, el gen diana cuya expresión debe inhibirse reside en un genoma vírico que se ha integrado en el gen animal o puede estar presente como un elemento extracromosómico. Por ejemplo, el gen diana puede ser un gen en un genoma de VIH. En este caso, el constructo genético es útil para inactivar la traducción del gen del VIH en una célula de mamífero.
En un aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que comprende una primera cadena, que tiene una longitud de 24-121 nt y comprende una región complementaria a un ácido nucleico diana, y una segunda cadena que es 13-21 nt de longitud y tiene una región que se une de manera complementaria a la región de la primera cadena, que es complementaria al ácido nucleico diana (véase la fig. 1).
Los ejemplos del ácido nucleico diana incluyen, pero no se limitan a, ARNm (ARN mensajero), microARN, piRNA (ARN que interacciona con piwi), una secuencia de ADN codificante y una secuencia de ADN no codificante.
La región complementaria al ácido nucleico diana en la primera cadena tiene preferentemente una longitud de 19-21 nt. Por lo tanto, la primera cadena comprende una región monocatenaria que no se une a la segunda cadena. Preferentemente, la primera cadena puede comprender además, en la región monocatenaria, un oligonucleótido de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN antisentido, ARN antisentido, ribozima y desoxirribozima.
La región monocatenaria de la primera cadena, que no se une de manera complementaria a la segunda cadena, puede unirse directamente o mediante un enlazador a la región que se une de manera complementaria a la segunda cadena. En el presente documento, el enlazador puede ser un enlazador químico. Los ejemplos del enlazador químico incluyen, pero no se limitan a, un resto de ácido nucleico, PNA (un resto de PNA), un resto peptídico, un enlace disulfuro o un resto de polietilenglicol.
La primera cadena puede comprender además, en la región monocatenaria, una secuencia que es complementaria o no complementaria al ácido nucleico diana. Cuando la primera cadena comprende la secuencia complementaria, la secuencia complementaria puede estar situada consecutivamente desde la región de doble cadena de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, es decir, la región de siRNA, que es complementaria del ácido nucleico diana. Alternativamente, la secuencia complementaria también puede estar situada separada de la región bicatenaria. Del mismo modo, la secuencia a la que se dirige el siRNA y la secuencia a la que se dirige la ribozima o la desoxirribozima de la región monocatenaria pueden ubicarse consecutivamente o ubicarse una aparte de la otra. Además, en el caso donde la región monocatenaria de la primera cadena tenga la secuencia complementaria al gen diana al que se dirige el siRNA, cuando la secuencia contenida en la región monocatenaria es un ADN antisentido o un ARN antisentido, la secuencia puede ser al menos aproximadamente 70-80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 80-90 %, e incluso más preferentemente al menos 95-99 % complementaria a la secuencia del gen diana al que se dirige el siRNA, y cuando la región monocatenaria es ribozima o desoxirribozima, la secuencia de la región monocatenaria puede ser al menos aproximadamente 50-60 % complementaria a la secuencia del gen diana al que se dirige el siRNA.
Además, la región monocatenaria puede tener una longitud de 5-100 nt. Si la longitud de la región monocatenaria es inferior a 5 nt, el efecto de aumentar la eficiencia con la que se inhibe la expresión génica será insignificante, y si la longitud es superior a 100 nt, la eficiencia con la que se sintetiza una molécula de ARN será reducida. Preferentemente, la región monocatenaria puede tener una longitud de 9-100 nt o una longitud de 50 nt o menos. Más preferentemente, la región monocatenaria puede tener una longitud de 10-15 nt.
En la presente invención, al menos uno de los nucleótidos de la región monocatenaria en la primera cadena puede comprender un análogo de base en volumen. Cuando una secuencia extendida comprende un análogo de base en volumen tal como un derivado de desoxiadenosina que tiene un grupo fenilo, una cadena de ARNm que se une de manera complementaria a la secuencia extendida se escinde en la ubicación del análogo de base en volumen. Cualquier análogo de base en volumen que induzca esta escisión puede usarse sin limitación en la presente invención.
En la presente invención, se predijo que el extremo 5' de una estructura nucleica obtenida extendiendo la cadena antisentido de siRNA de una manera complementaria a una secuencia de ARNm diana funcionará como el mecanismo de ARNi mientras que el extremo 3' funcionará como un mecanismo antisentido o guía el siRNA del extremo 5' al ARNm diana. Cuando la secuencia del extremo 3' antisentido, que es complementaria al ARNm, es ADN, puede inducir la escisión del ARNm dependiente de la ARNasa Además, se predijo que cuando al menos uno de los nucleótidos de la región monocatenaria del extremo 3' antisentido comprende un análogo de base en volumen o la región monocatenaria se une al ARNm para formar una estructura abultada, puede inducirse la escisión. Además, cuando una molécula de ácido nucleico que comprende la ribozima o desoxirribozima es introducida en la región monocatenaria de la primera cadena puede inducir una escisión sinérgica.
La publicación de patente coreana en trámite N.° 10-2009-0065880 describe una estructura de siRNA que es una molécula de siRNA que consiste en una cadena antisentido de 19-21 nt y una cadena con sentido de 13-16 nt, donde el extremo 5' de la cadena antisentido es un extremo romo. Esta estructura de siRNA inhibe la expresión génica con alta eficiencia sin causar efectos distintos a los deseados por parte de la cadena con sentido de siRNA o inhibiendo otros mecanismos de ARNi. Cuando la estructura de la presente invención se aplica a este siRNA, los efectos distintos a los deseados pueden minimizarse, mientras que puede obtenerse el efecto descrito anteriormente del oligonucleótido de ácidos nucleicos contenido en la región monocatenaria de la primera cadena. Tal como se usa en el presente documento, el término "efectos distintos a los deseados" se refiere a cualquier caso donde la cadena con sentido del siRNA provoca la degradación inesperada de otros ARNm o el silenciamiento de los genes correspondientes, y la cadena antisentido del siRNA se empareja con dianas no deseadas para provocar la
degradación de otros ARNm o el silenciamiento de los genes correspondientes, incluso aunque el siRNA se use originalmente para inducir la degradación del ARNm que tiene una secuencia complementaria a la cadena antisentido para obtener el efecto de inhibir la expresión génica del ARNm.
La molécula de siRNA de la presente invención puede ser una molécula sintetizada según un procedimiento general, pero no se limita a la misma. En otras palabras, en la presente invención, la molécula de siRNA puede sintetizarse por medios químicos o enzimáticos. La molécula de siRNA de la presente invención se puede obtener a partir de genes presentes en la naturaleza mediante técnicas recombinantes estándar. En este caso, la molécula de siRNA puede ser sustancialmente complementaria en el nivel de la secuencia de nucleótidos con al menos una parte del ARNm del gen diana, cuya expresión se va a modificar.
Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede comprender una modificación química. La modificación química se puede obtener reemplazando el grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa de al menos un nucleótido, incluido en la molécula de ácido nucleico, por uno cualquiera de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo -O-alquilo, un grupo -O-acilo y un grupo amino, pero no se limita a los mismos. Para aumentar la capacidad de administrar la molécula de ácido nucleico, el grupo hidroxilo puede ser reemplazado por cualquiera de -Br, -Cl, -R, -R'OR, -SH, -SR, -N3 y -CN (R = alquilo, arilo o alquileno). Además, la modificación química se puede obtener reemplazando el esqueleto de fosfato de al menos un nucleótido por cualquiera de una forma de fosforotioato, forma de fosforoditioato, forma de alquilfosfonato, forma de fosforatoamidato y forma de boranofosfato. Además, la modificación química puede obtenerse sustituyendo al menos un nucleótido incluido en la molécula de ácido nucleico por uno cualquiera de LNA (ácido nucleico bloqueado), UNA (ácido nucleico desbloqueado), morfolino y p Na (ácido nucleico peptídico). Además, la modificación química se puede obtener uniendo la molécula de ácido nucleico a una o más seleccionadas del grupo que consiste en lípidos, péptidos que penetran en las células y ligandos de direccionamiento celular.
Además, la molécula de ácido nucleico según la presente invención puede unirse a un vehículo de suministro celular para su introducción en una célula. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se dirige a un complejo de ácido nucleico que comprende un vehículo de suministro celular unido a la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi.
En la presente invención, el vehículo de suministro celular puede seleccionarse del grupo que consiste en polímeros catiónicos, lípidos, péptidos que penetran en las células y ligandos de direccionamiento celular. Los vehículos de suministro de células catiónicas, como los polímeros catiónicos y los lípidos catiónicos, son reactivos cargados positivamente que se utilizan para administrar ácido nucleico (es decir, siRNA) en células in vitro o in vivo. El vehículo de suministro de células catiónicas puede interactuar fuertemente con la molécula de ácido nucleico de la presente invención para formar un complejo de modo que la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi pueda introducirse eficazmente en una célula. El vehículo de suministro celular que se usa en la presente invención puede ser un polímero catiónico tal como polietilenimina (PEI) o un liposoma tal como lipofectamina 2000 (Invitrogen), pero no se limita a los mismos. Será obvio para los expertos en la materia que puede usarse un reactivo cargado positivamente para proporcionar el complejo según la presente invención. Además, un lípido tal como el colesterol puede enlazarse directamente a la molécula de ácido nucleico o enlazarse indirectamente a la molécula de ácido nucleico a través de otro vehículo de suministro celular.
Además, las realizaciones de la presente invención sugieren que la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la presente invención proporciona el efecto de inhibir eficazmente la expresión de un gen diana. Por lo tanto, en otro aspecto más, la presente invención se dirige a una composición para inhibir la expresión génica, que contiene la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior. En el presente documento, la molécula de ácido nucleico puede estar en forma de un complejo de ácido nucleico que comprende un vehículo de suministro celular unido al mismo.
En un ejemplo de la presente invención, se encontró que, cuando la estructura de ácido nucleico de la presente invención se aplicaba a un siRNA que se dirige al KRAs de gen diana o CTNNB1-2, la eficiencia con la que se inhibe la expresión del gen diana podría aumentarse significativamente, y la eficacia del mismo también podría mantenerse durante un largo período de tiempo. Por lo tanto, será evidente para los expertos en la materia que, incluso cuando se proporcionan moléculas de ácido nucleico dirigidas a otros genes diana según la presente invención, se pueden obtener los mismos resultados.
Mientras tanto, la composición para inhibir la expresión génica según la presente invención puede proporcionarse en forma de un kit para inhibir la expresión génica. El kit para inhibir la expresión génica puede adoptar la forma de botellas, recipientes, sobres, envolturas, tubos, ampollas y similares, que pueden formarse en parte o en su totalidad
a partir de plástico, vidrio, papel, papel de aluminio, cera y similares. El contenedor puede estar equipado con una tapa total o parcialmente desmontable que inicialmente puede formar parte del contenedor o fijarse al contenedor por medios mecánicos, adhesivos u otros. El contenedor también puede estar equipado con un tapón, que permite el acceso al contenido con la aguja de una jeringa. El kit puede comprender un envase exterior que puede incluir instrucciones sobre el uso de los componentes.
En otro aspecto más, la presente invención se dirige a un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula utilizando la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior. Es decir, la presente invención está dirigida a un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, que comprende una etapa de introducción de la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior en una célula. En la presente invención, la primera cadena del ácido nucleico inductor de ARNi puede ser complementaria a la secuencia de ARNm de un gen diana.
En la presente invención, el gen diana puede ser un gen endógeno o un transgén.
La molécula de ácido nucleico según la presente invención no está necesariamente limitada a un siRNA sintético y también puede aplicarse ventajosamente al siRNA o shRNA, que se expresa en células utilizando un vector de expresión o similar. En otras palabras, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede expresarse en células para inhibir la expresión del gen diana. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se dirige a un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, comprendiendo el procedimiento una etapa de expresar la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi anterior en la célula.
Mientras tanto, la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la presente invención puede utilizarse para inhibir la expresión de un gen diana tal como un gen que causa o hace crecer el cáncer por sobreexpresión, es decir, un gen relacionado con un tumor. Por lo tanto, la molécula de ácido nucleico inductora de a Rní es útil como composición anticancerosa. En el presente documento, el gen relacionado con el tumor puede ser cualquiera de KRas, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, Mcl-1, IGF1R, Akt1, Grp78, STAT3, STAT5a, p-catenina, WISP1 y c-myc, pero no se limita a los mismos. En un ejemplo de la presente invención, se encontró que el gen KRAS implicado en el crecimiento de células cancerosas se inhibía mediante la introducción de la molécula de siRNA de la presente invención en las células. Además, se demostró que una molécula de siRNA dirigida al gen de la beta-catenina destruía una línea de células cancerosas.
La composición anticancerosa de la presente invención puede proporcionarse como una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi o un complejo que comprende la molécula de ácido nucleico unida a un vehículo de suministro celular solo o en combinación con al menos un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. El complejo puede estar contenido en la composición farmacéutica en una cantidad farmacéuticamente efectiva según una enfermedad y con la gravedad de la misma, la edad, el peso, el estado de salud y el sexo del paciente, la vía de administración y el período de tratamiento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición que es fisiológicamente aceptable y no causa trastornos gástricos, reacciones alérgicas tales como trastornos gastrointestinales o vértigo o reacciones similares, cuando se administra a seres humanos. Los ejemplos de dicho portador, excipiente o diluyente pueden incluir lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, estearato de magnesio y aceites minerales. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente cargas, agentes antiagregantes, lubricantes, agentes humectantes, perfumes, emulsionantes y conservantes. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse usando un procedimiento bien conocido en la técnica, de manera que pueda proporcionar la liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración a mamíferos. La formulación puede estar en forma de soluciones de inyección estériles, etc.
Mientras tanto, la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la presente invención o un complejo que comprende la molécula de ácido nucleico unida a un vehículo de suministro celular puede comprender además un agente quimioterapéutico anticanceroso conocido para proporcionar efectos combinados. Los ejemplos de un agente quimioterapéutico anticanceroso conocido que se puede utilizar en la presente invención incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, valubicina, curcumina, gefitinib, erlotinib, irinotecán, topotecán, vinblastina, vincristina, docetaxel, paclitaxel y similares.
EJEMPLOS
A continuación, la presente invención se describirá más detalladamente con referencia a los ejemplos. Los ejemplos que no pertenecen a la invención son solo para fines ilustrativos.
Ejemplo 1: Construcción de siRNA guiado por antisentido largo: Ejemplo de preparación 1
Se construyó un siRNA de la siguiente manera: la segunda cadena tenía una longitud corta de 21 nt; la región de la primera cadena, que forma una doble cadena con la segunda cadena, tenía 19 nt de longitud; y el extremo 3' de la primera cadena tenía una región monocatenaria de 17 nt complementaria a un ARNm diana. El siRNA construido que tiene la cadena antisentido larga se denominó "siRNA antisentido largo (lsiRNA)". El oligonucleótido de ácido nucleico incluido en la secuencia extendida permite que el siRNA se guíe al ARNm diana o funcione como un mecanismo antisentido típico (véase la fig. 2).
Ejemplo 2: Construcción de siRNA antisentido largo: Ejemplo de preparación 2
Se construyó un siRNA de la siguiente manera: la segunda cadena tenía una longitud corta de 15 nt; la región de la primera cadena que forma una doble cadena con la segunda cadena tenía 19 nt de longitud; el extremo 3' de la primera cadena tenía una secuencia extendida de 17 nt complementaria a un ARNm diana; y el extremo 5' de la primera cadena era un extremo romo. El siRNA construido que tiene la cadena larga antisentido se denominó "siRNA antisentido largo (lasiRNA)". El oligonucleótido de ácido nucleico incluido en la secuencia extendida permite que el siRNA se guíe al ARNm diana o funcione como un mecanismo antisentido típico (véase la fig. 3).
Ejemplo 3: Construcción de siRNA guiado por desoxirribozima (o ribozima) (siRZNA): Ejemplo de preparación 3
Se construyó una estructura que tiene una cadena antisentido larga utilizando CTNNB1-2siRNA y desoxirribozima Dz339 de la siguiente manera: la cadena con sentido tenía una longitud corta de 21 nt; y el extremo 3' de la cadena antisentido de 19 nt tenía desoxirribozima. La estructura construida se denominó "siRNA guiado por desoxirribozima (siRZNA)" (véase la fig. 4).
Ejemplo 4: Construcción de lsiRNA que inhibe la expresión del gen KRAS y el examen de la capacidad para inhibir la expresión del gen KRAS
Se diseñó un siRNA que inhibe la expresión del gen KRAS implicado en el crecimiento de células cancerosas. Además, se construyeron siRNA antisentido largos (lsiRNA) añadiendo cada uno de 5 nt, 10 nt y 15 nt al extremo 3' de la cadena antisentido de una estructura de siRNA convencional (19+2). En el presente documento, se construyeron estructuras (21S+5d, 10d y 15d) que tienen una secuencia de ADN extendida complementaria a un ARNm diana, y estructuras de control (21S+5c, 10c y 15c) que tienen una secuencia de a Dn extendida no complementaria a un ARNm diana, y las eficiencias con las que las estructuras construidas inhiben la expresión del gen diana se compararon entre sí (véase la fig. 5). Además, se construyó una estructura (21 15d-mut) mediante la mutación de la secuencia semilla de lsiRNA, y se analizó si la capacidad del lsiRNA para inhibir la expresión del gen depende de la secuencia semilla, como el siRNA. Cada uno del siRNA y lsiRNA se transfectó en células AGS (ATCC CRL 1739, adenocarcinoma gástrico, humano) a una concentración de 10 nM utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la PCR en tiempo real para la medición de ARNm son los siguientes: KRAS secuencia directa 5-GAGTGCCTTGACGATACAGC-3' (SEQ ID NO:15); y
secuencia inversa 5'-CCCTCATTGCACTGTACTCC-3' (SEQ ID NO:16).
Como resultado, como se puede ver en la fig. 6, el lsiRNA que tiene la región monocatenaria complementaria al ARNm diana mostró una capacidad mejorada para inhibir el gen diana, en comparación con la estructura del siRNA convencional, y esta tendencia fue proporcional a la longitud de la región monocatenaria. Sin embargo, en el caso del lsiRNA de control que tiene la región monocatenaria no complementaria al ARNm diana, no se pudo observar esta capacidad mejorada para inhibir la expresión génica. En el caso de que el lsiRNA que tiene la mutación de secuencia semilla, la capacidad de inhibir el gen diana casi desapareció. Esto sugiere que el lsiRNA inhibe el gen diana por el mecanismo de ARNi dependiente de la secuencia semilla, como el siRNA convencional, y no muestra silenciamiento génico no específico causado por la estructura modificada.
Luego, se examinó si la capacidad de lsiRNA para inhibir el gen diana se mantiene suficientemente después de la introducción intracelular en comparación con la del siRNA. Se demostró que la capacidad de la estructura de siRNA
convencional para inhibir la expresión génica alcanzó un máximo en 1 día después de la introducción intracelular y se redujo a los 2 días y 3 días después de la introducción intracelular (véase la fig. 7). Sin embargo, la capacidad del lsiRNA para inhibir la expresión del gen diana se mantuvo incluso hasta 3 días después de la introducción intracelular. En cambio, en el caso del lsiRNA de control que tiene la región monocatenaria no complementaria al ARNm diana, no se pudo observar esta capacidad mejorada para inhibir la expresión génica. Dichos resultados sugieren que el lsiRNA que tiene la región monocatenaria complementaria al ARNm del gen diana exhibe la alta eficiencia con la que inhibe la expresión génica, en comparación con la estructura del siRNA convencional, y la eficacia del mismo también se mantiene durante un período de tiempo más largo.
Ejemplo 5: Construcción de lasiRNA que inhibe la expresión del gen KRAS y examen de la capacidad para inhibir la expresión del gen KRAS
Además del Ejemplo 4, se realizó un examen para determinar si la estructura de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, cuando se aplica a un siRNA dúplex más corto asimétrico (asiRNA), puede mejorar la capacidad de inhibir la expresión del gen diana.
De una manera similar al Ejemplo 4, las estructuras (16S+5d, 10d y 15d) se construyeron extendiendo el extremo 3' de la cadena antisentido de la estructura de siRNA convencional con un ADN que tiene una secuencia complementaria a un ARNm diana, y se construyeron estructuras de control (16S+5c, 10c y 15c; asiRNA largo antisentido (lasiRNA)) que tienen una secuencia de ADN extendida no complementaria a un ARNm diana (véase la fig. 8). Las estructuras construidas se transfectaron en células AGS y se compararon las capacidades para inhibir el crecimiento de las células cancerosas. Estos ARN se transfectaron en células AGS, y luego se realizó una PCR en tiempo real de la misma manera que se describe en el Ejemplo 4 para verificar las eficiencias con las que las estructuras inhiben la expresión del gen KRAS diana (véase la fig. 9). Cada uno del asiRNA y lasiRNA se transfectó en células AGS (ATCC CRL 1739, adenocarcinoma gástrico, humano) a una concentración de 10 nM utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen).
Como resultado, la capacidad inhibitoria del ARNm diana del lasiRNA que tiene la secuencia monocatenaria extendida complementaria al ARNm diana aumentó proporcionalmente a la longitud de la secuencia extendida, similar al caso del lsiRNA. Sin embargo, este efecto no se observó en el caso donde la secuencia extendida no fuera complementaria al ARNm diana.
Ejemplo 6: lasiRNA que inhibe la expresión del gen KRAS y examen de la capacidad de lasiRNA para inhibir el crecimiento de células cancerosas AGS
Luego, se realizó un examen para determinar si las estructuras de lsiRNA y lasiRNA dirigidas a KRAS que muestran una capacidad mejorada para inhibir el gen diana, en comparación con el siRNA y el asiRNA, también tienen mayor capacidad para inhibir el crecimiento de las células cancerosas AGS. Específicamente, las células AGS sembradas en una placa de 96 pocillos se transfectaron con 10 nM de ARN utilizando lipofectamina 2000, y después de 5 días, se midió la viabilidad de las células contando visualmente el número de células mediante observación microscópica. Como resultado, se demostró que la capacidad para inhibir la expresión del ARNm de KRAS tenía una alta relación con la capacidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas. Específicamente, se demostró que el lsiRNA (21S+15d) que tiene la secuencia extendida de 15 nucleótidos mostró una gran capacidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas, en comparación con el siRNA, y la capacidad del lasiRNA (16S+15d) para inhibir el crecimiento de células cancerosas aumentó en comparación con la de asiRNA (véase la fig. 10). Mientras tanto, el lsiRNA que tiene una mutación introducida en la secuencia semilla (LASmut) no indujo la inhibición del crecimiento de células cancerosas, lo que sugiere que no aparece citotoxicidad no específica por la estructura de la secuencia prolongada. Dichos resultados sugieren que, cuando se introduce una región monocatenaria complementaria a un ARNm diana en el extremo 3' de la cadena antisentido de cada uno de siRNA y asiRNA, se puede aumentar la capacidad de inhibir la expresión génica y la expresión fenotípica en las células.
Ejemplo 7: Examen de las capacidades de lsiRNA y lasiRNA (que tiene ARN como secuencia extendida) para inhibir la expresión del gen KRAS
Luego, se realizó un examen para determinar si las capacidades de lsiRNA y lasiRNA (cada uno con ARN en lugar de ADN como una secuencia extendida) para inhibir la expresión de un gen diana aumentan en comparación con las de siRNA y asRNA, que corresponden al mismo.
Como se muestra en la fig. 11, se construyeron el lsiRNA (21S+10r) y el lasiRNA (16S+10r), cada uno con una
secuencia extendida de 10 nt complementaria al ARNm, y también se construyeron las estructuras de control (21S+10rc y 16S+10rc), cada una con una secuencia extendida no complementaria al ARNm. Las estructuras construidas se transfectaron en células AGS, y luego se examinaron las eficiencias con las que inhibían la expresión del ARNm de KRAS de la misma manera que se describe en el Ejemplo 4.
Como resultado, como se puede ver en la fig. 12, lsiRNA y lasiRNA, que tienen la secuencia de ARN extendida, tenían una alta capacidad para inhibir la expresión del gen diana, en comparación con siRNA y asiRNA, que corresponden a los mismos. Particularmente, lasiRNA que tiene una secuencia de ARN extendida mostró una capacidad inhibitoria aumentada en comparación con lasiRNA que tiene una secuencia de ADN extendida. Esto sugiere que la capacidad para inhibir la expresión del gen diana se puede lograr incluso cuando la secuencia antisentido larga es ARN además de ADN.
Ejemplo 8: Construcción de lasiRNA que inhibe la expresión del gen CTNNB1 y examen de la capacidad para inhibir la expresión del gen CTNNB1
8-1: Medición del nivel de expresión de ARNm de CTNNB1
Luego, para examinar si la estructura de la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede aumentar la actividad de los asiRNA que se dirigen a otros genes, se construyeron estructuras de lasiRNA que corresponden a los asiRNA que se dirigen a la beta-catenina (CTNNB1) (véase la fig. 13). Luego, cada una de las estructuras construidas se transfectó en células Hep3B (ATCC HB 8064) a una concentración de 10 nM utilizando lipofectamina 2000, y luego se examinó la capacidad de inhibir la expresión del gen diana mediante PCR en tiempo real. CTNNB1 secuencia directa 5'-ATGTCCAGCGTTTGGCTGAA-3' (SEQ ID NO:32); y
secuencia inversa 5'-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGTT-3' (SEQ ID NO:33).
Como resultado, como se puede ver en la fig. 14, la capacidad del asiRNA para inhibir la expresión del gen diana disminuyó en comparación con la estructura del siRNA convencional, pero la capacidad inhibidora del gen diana del lasiRNA (16S+15d) que tiene una secuencia de ADN de 15 nt complementaria a la secuencia del ARNm en el extremo 3' de la cadena antisentido aumentó a un nivel similar al del siRNA. Por otro lado, en el caso de la estructura (16S+15c) que tiene una secuencia de ADN extendida no complementaria al gen diana, la disminución en la capacidad para inhibir el gen diana fue insignificante en comparación con la del asiRNA. Por lo tanto, se descubrió que la estructura de lasiRNA tiene una mayor capacidad para inhibir el gen diana, independientemente de la secuencia de asiRNA.
8-2: Medición de la capacidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas Hep3B
La mayor capacidad de la estructura de lasiRNA para inhibir el gen diana se verificó de nuevo midiendo la capacidad de inhibir el crecimiento de las células cancerosas Hep3B. Específicamente, se transfectaron 10 nM de cada uno de siRNA, asiRNA y lasiRNA en células Hep3B, y después de 5 días, se examinó el grado de crecimiento celular contando el número de células. La viabilidad de las células se examinó contando visualmente el número de células mediante observación microscópica. En pocas palabras, las células AGS sembradas en una placa de 96 pocillos se transfectaron con 10 nM de cada uno de siRNA, asiRNA y lasiRNA, y después de 5 días, se contó visualmente el número de células viables.
Como resultado, como se puede ver en la fig. 15, la capacidad del asiRNA para matar células cancerosas disminuyó en comparación con la del siRNA, pero el lasiRNA que tiene una secuencia extendida complementaria al gen diana mostró una capacidad de destrucción celular similar a la del siRNA. Por otro lado, la capacidad de destrucción celular del lasiRNA que tiene una secuencia extendida no complementaria al gen diana no aumentó en comparación con la del asiRNA. Esto sugiere que la molécula de siRNA que contiene una secuencia extendida complementaria al gen diana en el extremo 3' de la cadena antisentido tiene mayor capacidad para inhibir la expresión del gen diana.
Ejemplo 9: Análisis del mecanismo de inhibición de la expresión génica
Con el fin de examinar si la molécula de ácido nucleico de la presente invención inhibe la expresión génica según el mismo mecanismo de ARNi que el siRNA 19+2 o el asiRNA convencional, se realizó la siguiente prueba. Específicamente, para analizar un sitio de escisión para un ARNm diana, se realizó el análisis 5'RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc).
Primero, cada uno de siKRAS, asiKRAS, LaiKRAS y LasiKRAS, construidos en los Ejemplos 4 y 5, se introdujeron
en células HeLa utilizando PEI, y después de 18 horas, se extrajo el ARN total utilizando un kit tri-reactivo (Ambion). El ARN total (3 |jg) se ligó con 0,25 |jg de oligo de ARN de GeneRacer, y el ARN total ligado a oligo de ARN de GeneRacer se transcribió de manera inversa utilizando el kit dT de oligo GeneRacer y RT SuperScript™ III (Invitrogen). El ARNm ligado a oligo de ARN se amplificó utilizando cebadores específicos de gen. El producto de la PCR se clonó en un vector T&A (RBC) y luego se secuenció con un cebador directo M13.
Cebador específico del gen KRAS:5'-CTGCATGCACCAAAAACCCCAAGACA-3' (SEQ ID NO:34);
Cebador específico del gen KRAS anidado:5'-CACAAAGAAAGCCCTCCCCAGTCcTCA -3' (SeQ ID NO:35).
Como resultado, como se puede ver en la fig. 16, los casos de tratamiento con siKRAS, asiKRAS, LsiKRAS y LasiKRAS podrían proporcionar productos RACE que tengan el mismo tamaño. Además, estos productos RACE se clonaron en vectores T (RBC) y se examinó una posición de escisión precisa en la secuencia de nucleótidos mediante secuenciación. Como resultado, se demostró que, en los casos de siKRAS, asiKRAS, LsiKRAS y LasiKRAS, la posición del ARNm correspondiente a la posición entre el 10.° nucleótido y el 11.° nucleótido desde el extremo 5' del antisentido se escindió.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Como se describió anteriormente, la estructura de la molécula de ácido nucleico de la presente invención se dirige a un gen diana complementario a una porción de la primera cadena por el oligonucleótido nucleico incluido en la región monocatenaria en el extremo 3' de la primera cadena para guiar el siRNA hacia el gen diana para aumentar la eficiencia con la que la molécula de ácido nucleico inhibe el gen diana. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede aumentar la capacidad del siRNA para unirse al gen diana o causar escisión sinérgica, mediante la introducción de ADN antisentido, ARN antisentido, ribozima o desoxirribozima, aumentando así la eficiencia con la que la molécula de ácido nucleico inhibe el gen diana. Además, cuando se usa la molécula de ácido nucleico según la presente invención, la eficiencia con la que se inhibe el gen diana se puede mantener durante un período de tiempo prolongado. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la presente invención puede utilizarse eficazmente para el tratamiento del cáncer o infección vírica en lugar de moléculas de siRNA convencionales.
<110> UNIVERSIDAD DE SUNGKYUNKWAN Fundación para la colaboración empresarial
<120> Molécula de ácido nucleico que induce la interferencia del ARN y el uso de la misma
<130> PP-B1010
<150> KR10-2010-0103701
<151> 22-10-2010
<150> KR10-2011-0062504
<151> 27-06-2011
<160> 35
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de siRNA CTNNB1-2
<400> 1
cuaucaagau gaugcagaac u 21
<210>2
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de siRNA CTNNB1-2
<400>2
uucugcauca ucuugauagu u 21
<210>3
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Desoxirribozima Dz339
<400> 3
agcatgaaag gctagctaca acgatgtgta gat 33
<210> 4
<211> 58
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dz339 AS híbrido
<220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(19)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (20)..(58)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 4
uucugcauca ucuugauagt tttttagcat gaaaggctag ctacaacgat gtgtagat 58 <210> 5
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de siRNA de KRAS
<400> 5ggaagcaagu aguaauugau u 21
<210>6
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de siRNA de KRAS (19+2)
<400>6
ucaauuacua cuugcuuccu u 21
<210>7
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de IsiRNA de KRAS (21S+5d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(26)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 7
ucaauuacua cuugcuuccu gtagga 26
<210>8
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lsiRNA de KRAS (21S+5c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(26)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 8
ucaauuacua cuugcuuccu gagcat 26
<210>9
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lsiRNA de KRAS (21S+10d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(31)
<223> desoxirribonucleótidos
<400>9
ucaauuacua cuugcuuccu gtaggaatcc t 31
<210> 10
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lsiRNA de KRAS (21S+10c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(31)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 10
ucaauuacua cuugcuuccu gagcatgacc a 31
<210> 11
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lsiRNA de KRAS (21S+15d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 11
ucaauuacua cuugcuuccu gtaggaatcc tctatt 36
<210> 12
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de IsiRNA de KRAS (21S+15c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 12
ucaauuacua cuugcuuccu gagcatgacc acggtt 36
<210> 13
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de lsiRNA de KRAS (21S+15d-mut) <400> 13
ggaagcaagu aguuuaacau u 21
<210> 14
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lsiRNA de KRAS (21S+15d-mut) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 14
uguuaaacua cuugcuuccu gtaggaatcc tctatt 36 <210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia directa de KRAS
<400> 15
gagtgccttg acgatacagc 20
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia inversa de KRAS
<400> 16
ccctcattgc actgtactcc 20
<210> 17
<211> 16
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de asiRNA de KRAS
<400> 17
agcaaguagu aauuga 16
<210> 18
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de asiRNA de KRAS
<400> 18
ucaauuacua cuugcuuccu u 21
<210> 19
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 5d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(26)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 19
ucaauuacua cuugcuuccu gtagga 26
<210> 20
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 5c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(26)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 20
ucaauuacua cuugcuuccu gagcat 26
<210> 21
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 10d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(31)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 21
ucaauuacua cuugcuuccu gtaggaatcc t 31
<210> 22
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 10c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(31)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 22
ucaauuacua cuugcuuccu gagcatgacc a 31
<210> 23
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 15d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 23
ucaauuacua cuugcuuccu gtaggaatcc tctatt 36 <210> 24
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 15c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 24
ucaauuacua cuugcuuccu gagcatgacc acggtt 36
<210> 25
<211> 31
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA (21S+10r) o lasiRNA (16S 10r) de KRAS <400> 25
ucaauuacua cuugcuuccu guaggaaucc u 31
<210> 26
<211> 31
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA (21S+10rc) o lasiRNA (16S 10rc) de KRAS <400> 26
ucaauuacua cuugcuuccu gagcaugacc a 31
<210> 27
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de siRNA CTNNB1-2 (19+2)
<400> 27
cuaucaagau gaugcagaau u 21
<210> 28
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de siRNA de KRAS (19+2) o asiRNA
<400> 28
uucugcauca ucuugauagu u 21
<210> 29
<211> 16
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena con sentido de siRNA CTNNB1-2
<400> 29
ucaagaugau gcagaa 16
<210> 30
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 15d) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 30
uucugcauca ucuugauagu uaatcaagtt tacaac 36 <210> 31
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cadena antisentido de lasiRNA de KRAS (16S 15c) <220>
<223> Molécula combinada de ARN / ADN
<220>
<221> otras_características
<222> (1)..(21)
<223> ribonucleótidos
<220>
<221> otras_características
<222> (22)..(36)
<223> desoxirribonucleótidos
<400> 31
uucugcauca ucuugauagu uggagcatga ccacgg 36 <210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia directa CTNNB1
<400> 32
atgtccagcg tttggctgaa 20
<210> 33
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia inversa CTNNB1
<400> 33
tggtcctcgt catttagcag tt 22
<210> 34
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador específico del gen KRAS <400> 34
ctgcatgcac caaaaacccc aagaca 26 <210> 35
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador específico del gen KRAS anidado <400> 35
cacaaagaaa gccctcccca gtcctca 27
Claims (9)
1. Una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi que comprende una primera cadena y una segunda cadena, donde la primera cadena tiene una longitud de 24-31 nt y es complementaria a un ácido nucleico diana y comprende una región monocatenaria de 10-15 nt de longitud; donde la segunda cadena tiene una longitud de 13-16 nt y se une de manera complementaria a la primera cadena, y donde el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena forman un extremo romo.
2. La molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico diana es uno cualquiera de ARNm (ARN mensajero), microARN, piRNA (ARN que interacciona con piwi), una secuencia de ADN codificante y una secuencia de ADN no codificante.
3. La molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de la reivindicación 1, donde la molécula de ácido nucleico comprende una o más modificaciones químicas seleccionadas de entre:
i) la modificación química obtenida reemplazando el grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa de al menos un nucleótido incluido en la molécula de ácido nucleico, por uno cualquiera de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo -O-alquilo, un grupo -O-acilo y un grupo amino;
ii) la modificación química obtenida reemplazando el esqueleto de fosfato de al menos un nucleótido incluido en la molécula de ácido nucleico por cualquiera de una forma de fosforotioato, forma de fosforoditioato, forma de alquilfosfonato, forma de fosforoamidato y forma de boranofosfato;
iii) la modificación química obtenida reemplazando al menos un nucleótido incluido en la molécula de ácido nucleico por uno cualquiera de LNA (ácido nucleico bloqueado), UNA (ácido nucleico desbloqueado), morfolino y PNA (ácido nucleico peptídico);
iv) la modificación química obtenida uniendo la molécula de ácido nucleico a uno o más seleccionados del grupo que consiste en lípidos, péptidos que penetran en las células y ligandos de direccionamiento celular; y
v) la modificación química que incluye un análogo de base en volumen entre al menos uno de los nucleótidos de la región monocatenaria en la primera cadena.
4. Un complejo de ácido nucleico que comprende un vehículo de suministro celular unido a la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Un procedimiento in vitro para la administración intracelular de una molécula de ácido nucleico inductora de ARNi, comprendiendo el procedimiento introducir el complejo de ácido nucleico de la reivindicación 4 en una célula.
6. Una composición para inhibir la expresión génica, que contiene la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, que comprende una etapa de introducir la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula.
8. Un procedimiento in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, comprendiendo el procedimiento una etapa de expresar la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la célula.
9. Una composición anticancerosa que contiene la molécula de ácido nucleico inductora de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20100103701 | 2010-10-22 | ||
| KR20110062504 | 2011-06-27 | ||
| PCT/KR2011/006632 WO2012053741A2 (ko) | 2010-10-22 | 2011-09-07 | Rna 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2732929T3 true ES2732929T3 (es) | 2019-11-26 |
Family
ID=45975681
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11834541T Active ES2732929T3 (es) | 2010-10-22 | 2011-09-07 | Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas |
| ES19174058T Active ES2930555T3 (es) | 2010-10-22 | 2011-09-07 | Moléculas de ácido nucleico que inducen la interferencia de ARN y usos de las mismas |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19174058T Active ES2930555T3 (es) | 2010-10-22 | 2011-09-07 | Moléculas de ácido nucleico que inducen la interferencia de ARN y usos de las mismas |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9637742B2 (es) |
| EP (2) | EP3599280B1 (es) |
| JP (1) | JP5795072B2 (es) |
| KR (1) | KR101328568B1 (es) |
| CN (1) | CN103328633B (es) |
| CA (1) | CA2818662C (es) |
| DK (1) | DK2631291T3 (es) |
| ES (2) | ES2732929T3 (es) |
| WO (1) | WO2012053741A2 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2631291T3 (da) | 2010-10-22 | 2019-06-11 | Olix Pharmaceuticals Inc | Nukleinsyremolekyler, der inducerer rna-interferens, og anvendelser deraf |
| US10125362B2 (en) * | 2012-05-22 | 2018-11-13 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | RNA-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor |
| CN103627705B (zh) * | 2013-10-28 | 2016-02-24 | 南京医科大学 | 与膀胱癌相关的piRNA生物标志物及其应用 |
| WO2015140330A1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | Oommen Varghese | Improved small interfering ribonucleic acid molecules |
| CN104531707A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-04-22 | 吉林大学 | 一种抑制survivin基因表达用途的siRNA序列及用途 |
| WO2016204515A1 (ko) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | (주)바이오니아 | STAT3 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 |
| CN108138181B (zh) * | 2015-07-27 | 2022-05-24 | 奥利克斯医药有限公司 | 抑制黑色素生成的rna复合物 |
| KR20180071362A (ko) | 2015-11-16 | 2018-06-27 | 올릭스 주식회사 | MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료 |
| KR20180104692A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-21 | 올릭스 주식회사 | Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 |
| JP6944942B2 (ja) * | 2016-02-02 | 2021-10-06 | オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | ＩＬ４Ｒα、ＴＲＰＡ１、またはＦ２ＲＬ１を標的とするＲＮＡ複合体を用いたアトピー性皮膚炎および喘息の治療 |
| JP2019512014A (ja) * | 2016-02-26 | 2019-05-09 | イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | がん診断法および治療法におけるｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法 |
| KR102339886B1 (ko) | 2016-04-11 | 2021-12-17 | 올릭스 주식회사 | 연결 조직 성장 인자를 표적화하는 rna 복합체를 사용한 특발성 폐 섬유증의 치료 방법 |
| KR101916652B1 (ko) | 2016-06-29 | 2018-11-08 | 올릭스 주식회사 | 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 |
| EP3521430A4 (en) * | 2016-09-29 | 2020-05-20 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | DOUBLE-STRANDED NUCLEIC ACID COMPLEX WITH OVERHEAD |
| KR101913693B1 (ko) * | 2016-12-14 | 2018-10-31 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | SS18-SSX 융합 유전자 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| US11591600B2 (en) | 2017-02-10 | 2023-02-28 | OliX Pharmaceuticals. Inc. | Long double-stranded RNA for RNA interference |
| KR102321426B1 (ko) | 2017-02-21 | 2021-11-05 | 올릭스 주식회사 | 남성형 탈모 표적 유전자의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA |
| WO2020069442A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Tertiary amino lipidated cationic peptides for nucleic acid delivery |
| KR102321425B1 (ko) * | 2019-01-18 | 2021-11-04 | 올릭스 주식회사 | NRL(Neural retina leucine zipper)의 발현을 억제하는 비대칭 siRNA |
| WO2020235936A1 (ko) * | 2019-05-20 | 2020-11-26 | 올릭스 주식회사 | Pd-1의 발현을 억제하는 비대칭 sirna |
| KR102259402B1 (ko) * | 2020-06-04 | 2021-06-01 | 주식회사 아임뉴런바이오사이언스 | 개선된 안정성을 갖는 핵산 분자 및 이의 용도 |
Family Cites Families (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837258A (en) | 1991-08-30 | 1998-11-17 | University Of South Florida | Induction of tissue, bone or cartilage formation using connective tissue growth factor |
| DE10160151A1 (de) | 2001-01-09 | 2003-06-26 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens |
| DK2813582T3 (en) * | 2000-12-01 | 2017-07-31 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V | Small RNA molecules that mediate RNA interference |
| US20050282188A1 (en) | 2001-05-18 | 2005-12-22 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20080188430A1 (en) | 2001-05-18 | 2008-08-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| US20040248835A1 (en) | 2001-10-26 | 2004-12-09 | Anja Krebs | Use of a double-stranded ribonucleic acid for treating an infection with a positivestrand rna-virus |
| US20040138163A1 (en) | 2002-05-29 | 2004-07-15 | Mcswiggen James | RNA interference mediated inhibition of vascular edothelial growth factor and vascular edothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
| BRPI0313202A8 (pt) | 2002-08-05 | 2016-08-16 | Atugen Ag | Formas adicionais para interferir com as moléculas de rna |
| EP2305812A3 (en) | 2002-11-14 | 2012-06-06 | Dharmacon, Inc. | Fuctional and hyperfunctional sirna |
| WO2006006948A2 (en) | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
| EP1605978B1 (en) | 2003-03-07 | 2010-09-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Therapeutic compositions |
| AU2003225410A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-10-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
| US20040198640A1 (en) | 2003-04-02 | 2004-10-07 | Dharmacon, Inc. | Stabilized polynucleotides for use in RNA interference |
| US20050136437A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-06-23 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA |
| WO2005062937A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna |
| US20060134787A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-22 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA |
| US20060069050A1 (en) | 2004-02-17 | 2006-03-30 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for mediating gene silencing |
| ES2423060T3 (es) | 2004-03-12 | 2013-09-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF |
| KR101147147B1 (ko) | 2004-04-01 | 2012-05-25 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드 |
| EP1793835A4 (en) * | 2004-09-10 | 2010-12-01 | Somagenics Inc | SMALL INTERFERING RNA EFFECTIVELY INHIBITING VIRAL GENE EXPRESSION AND METHODS OF USE THEREOF |
| WO2006036916A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Rnai modulation of apob and uses thereof |
| TWI386225B (zh) | 2004-12-23 | 2013-02-21 | Alcon Inc | 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術 |
| US20060142228A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
| KR20070118703A (ko) | 2005-04-08 | 2007-12-17 | 나스텍 파마수티컬 컴퍼니 인코포레이티드 | 호흡기 바이러스 감염을 치료하는 알엔에이 아이 |
| WO2006125977A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | The University Of York | Hybrid interfering rna |
| CA2607668A1 (en) | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Rnai modulation of the rho-a gene and uses thereof |
| WO2007022506A2 (en) | 2005-08-18 | 2007-02-22 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating neurological disease |
| FR2890859B1 (fr) | 2005-09-21 | 2012-12-21 | Oreal | Oligonucleotide d'arn double brin inhibant l'expression de la tyrosinase |
| US8273700B2 (en) | 2005-09-29 | 2012-09-25 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions for treatment of cystic fibrosis |
| US7825099B2 (en) | 2006-01-20 | 2010-11-02 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes |
| WO2007092182A2 (en) * | 2006-01-26 | 2007-08-16 | University Of Massachusetts | Rna interference agents for therapeutic use |
| ES2550099T3 (es) * | 2006-01-27 | 2015-11-04 | Biogen Ma Inc. | Antagonistas del receptor Nogo |
| US20070218495A1 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Dharmacon, Inc. | Methods, libraries and computer program products for gene silencing with reduced off-target effects |
| US7700541B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-04-20 | Nitto Denko Corporation | Biodegradable cationic polymers |
| GB0608838D0 (en) | 2006-05-04 | 2006-06-14 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2008109377A1 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting vegf family gene expression and uses thereof |
| US20100105134A1 (en) | 2007-03-02 | 2010-04-29 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof |
| PT2164967E (pt) | 2007-05-31 | 2015-10-27 | Univ Iowa Res Found | Redução da toxicidade não dirigida do arn de interferência |
| US20090004668A1 (en) * | 2007-06-22 | 2009-01-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Pre-miRNA loop-modulated target regulation |
| WO2009020344A2 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-12 | Postech Acad Ind Found | Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same |
| WO2009029688A2 (en) | 2007-08-27 | 2009-03-05 | Boston Biomedical, Inc. | Compositions of asymmetric interfering rna and uses thereof |
| WO2009039173A2 (en) * | 2007-09-19 | 2009-03-26 | Applied Biosystems Inc. | SiRNA SEQUENCE-INDEPENDENT MODIFICATION FORMATS FOR REDUCING OFF-TARGET PHENOTYPIC EFFECTS IN RNAi, AND STABILIZED FORMS THEREOF |
| WO2009044392A2 (en) | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Novel sirna structures |
| US8614311B2 (en) * | 2007-12-12 | 2013-12-24 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | RTP801L siRNA compounds and methods of use thereof |
| KR100949791B1 (ko) | 2007-12-18 | 2010-03-30 | 이동기 | 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도 |
| WO2009105260A2 (en) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | University Of Kentucky | Ultra-small rnas as toll-like receptor-3 antagonists |
| WO2010011346A1 (en) * | 2008-07-24 | 2010-01-28 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rnai constructs and uses therof |
| JP5294344B2 (ja) * | 2008-09-08 | 2013-09-18 | 学校法人福岡大学 | 白血病治療用医薬組成物 |
| US10138485B2 (en) | 2008-09-22 | 2018-11-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Neutral nanotransporters |
| US20100227920A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-09-09 | The Regents Of The University Of California | Aldehyde dehydrogenase inhibitors as novel depigmenting agents |
| KR101169373B1 (ko) * | 2009-02-04 | 2012-07-30 | 성균관대학교산학협력단 | 세포 내 전달능이 증가된 작은 간섭 ｒｎａ 복합체 |
| US9745574B2 (en) * | 2009-02-04 | 2017-08-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality |
| WO2010094491A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | Silence Therapeutics Ag | Means for inhibiting the expression of ang2 |
| WO2010107952A2 (en) | 2009-03-19 | 2010-09-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| CN103555722B (zh) * | 2009-04-03 | 2016-08-31 | 戴瑟纳制药公司 | 利用不对称双链rna特异性抑制kras的方法和组合物 |
| WO2011019887A2 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Waveguide coupler having continuous three-dimensional tapering |
| KR101207561B1 (ko) | 2009-12-15 | 2012-12-04 | 주식회사 코리아나화장품 | 티로시나제의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물 |
| WO2011084193A1 (en) | 2010-01-07 | 2011-07-14 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs |
| US8859755B2 (en) | 2010-03-05 | 2014-10-14 | Chiralgen, Ltd. | Method for preparing ribonucleoside phosphorothioate |
| US9095504B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-08-04 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in ocular indications |
| US20130115613A1 (en) * | 2010-05-12 | 2013-05-09 | Val-Chum, Limited Partnership | Screening assays based on mag and/or abhd6 for selecting insulin secretion promoting agent |
| CA2812046A1 (en) | 2010-09-15 | 2012-03-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified irna agents |
| WO2012053841A2 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Lg Electronics Inc. | Method and apparatus for transmitting and receiving data in wireless access system supporting machine to machine communication |
| DK2631291T3 (da) | 2010-10-22 | 2019-06-11 | Olix Pharmaceuticals Inc | Nukleinsyremolekyler, der inducerer rna-interferens, og anvendelser deraf |
| SG190412A1 (en) | 2010-12-06 | 2013-06-28 | Quark Pharmaceuticals Inc | Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications |
| EP2681315B1 (en) | 2011-03-03 | 2017-05-03 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway |
| CN102719432B (zh) | 2011-03-29 | 2013-10-23 | 南京大学 | 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用 |
| KR101590586B1 (ko) | 2011-05-30 | 2016-02-01 | 성균관대학교산학협력단 | 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ |
| CN103889461B (zh) | 2011-07-18 | 2016-11-09 | 肯塔基大学研究基金会 | 保护细胞免于alu-rna诱导的变性和用于保护细胞的抑制剂 |
| US9707235B1 (en) | 2012-01-13 | 2017-07-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Protection of cells from degeneration and treatment of geographic atrophy |
| US10125362B2 (en) | 2012-05-22 | 2018-11-13 | Olix Pharmaceuticals, Inc. | RNA-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor |
| WO2014043291A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-20 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double-stranded nucleic acid compounds |
| KR101867414B1 (ko) | 2013-07-05 | 2018-06-14 | (주)바이오니아 | 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| WO2015015498A1 (en) | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Qbi Enterprises Ltd. | Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds |
| US9790506B2 (en) | 2013-10-02 | 2017-10-17 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic and screening methods for atopic dermatitis |
| US8980273B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-03-17 | Kymab Limited | Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA |
| WO2015171641A1 (en) | 2014-05-05 | 2015-11-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Coordinate control of pathogenic signaling by the mir-130/301 family in pulmonary hypertension and fibroproliferative diseases |
| US9139648B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-09-22 | Kymab Limited | Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain |
| WO2016161388A1 (en) | 2015-04-03 | 2016-10-06 | University Of Massachusetts | Fully stabilized asymmetric sirna |
| CN108138181B (zh) | 2015-07-27 | 2022-05-24 | 奥利克斯医药有限公司 | 抑制黑色素生成的rna复合物 |
| KR20180071362A (ko) | 2015-11-16 | 2018-06-27 | 올릭스 주식회사 | MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료 |
| KR20180104692A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-21 | 올릭스 주식회사 | Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 |
| JP6944942B2 (ja) | 2016-02-02 | 2021-10-06 | オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | ＩＬ４Ｒα、ＴＲＰＡ１、またはＦ２ＲＬ１を標的とするＲＮＡ複合体を用いたアトピー性皮膚炎および喘息の治療 |
| KR102339886B1 (ko) | 2016-04-11 | 2021-12-17 | 올릭스 주식회사 | 연결 조직 성장 인자를 표적화하는 rna 복합체를 사용한 특발성 폐 섬유증의 치료 방법 |
| KR101916652B1 (ko) | 2016-06-29 | 2018-11-08 | 올릭스 주식회사 | 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 |
| US11591600B2 (en) | 2017-02-10 | 2023-02-28 | OliX Pharmaceuticals. Inc. | Long double-stranded RNA for RNA interference |
-
2011
- 2011-09-07 DK DK11834541.2T patent/DK2631291T3/da active
- 2011-09-07 WO PCT/KR2011/006632 patent/WO2012053741A2/ko active Application Filing
- 2011-09-07 ES ES11834541T patent/ES2732929T3/es active Active
- 2011-09-07 ES ES19174058T patent/ES2930555T3/es active Active
- 2011-09-07 EP EP19174058.8A patent/EP3599280B1/en active Active
- 2011-09-07 CN CN201180062076.1A patent/CN103328633B/zh active Active
- 2011-09-07 EP EP11834541.2A patent/EP2631291B1/en active Active
- 2011-09-07 US US13/880,670 patent/US9637742B2/en active Active
- 2011-09-07 CA CA2818662A patent/CA2818662C/en active Active
- 2011-09-07 JP JP2013534798A patent/JP5795072B2/ja active Active
- 2011-09-07 KR KR1020110090665A patent/KR101328568B1/ko active IP Right Grant
-
2017
- 2017-03-30 US US15/474,615 patent/US10214744B2/en active Active
-
2018
- 2018-12-14 US US16/220,030 patent/US10829760B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012053741A2 (ko) | 2012-04-26 |
| DK2631291T3 (da) | 2019-06-11 |
| ES2930555T3 (es) | 2022-12-16 |
| US20170335326A1 (en) | 2017-11-23 |
| EP2631291A2 (en) | 2013-08-28 |
| EP2631291A4 (en) | 2015-01-14 |
| JP5795072B2 (ja) | 2015-10-14 |
| US9637742B2 (en) | 2017-05-02 |
| JP2013544505A (ja) | 2013-12-19 |
| US10829760B2 (en) | 2020-11-10 |
| KR101328568B1 (ko) | 2013-11-13 |
| EP2631291B1 (en) | 2019-05-15 |
| KR20120042645A (ko) | 2012-05-03 |
| CN103328633A (zh) | 2013-09-25 |
| CA2818662C (en) | 2021-07-06 |
| US20190177732A1 (en) | 2019-06-13 |
| WO2012053741A9 (ko) | 2012-08-02 |
| US20130273657A1 (en) | 2013-10-17 |
| EP3599280A1 (en) | 2020-01-29 |
| EP3599280B1 (en) | 2022-11-02 |
| US10214744B2 (en) | 2019-02-26 |
| CA2818662A1 (en) | 2012-04-26 |
| WO2012053741A3 (ko) | 2012-06-14 |
| CN103328633B (zh) | 2018-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2732929T3 (es) | Moléculas de ácido nucleico que inducen interferencia de ARN y usos de las mismas | |
| ES2716818T3 (es) | Molécula de ácido nucleico inductora de interferencias de arn capaz de penetrar en las células y uso de la misma | |
| US9297013B2 (en) | pRNA multivalent junction domain for use in stable multivalent RNA nanoparticles | |
| ES2899043T3 (es) | Novedosos conjugados de oligonucleótidos y su uso | |
| KR101752812B1 (ko) | 고효율 나노입자형 이중나선 올리고 rna 구조체 및 그의 제조방법 | |
| ES2865030T3 (es) | Estructuras de ARNip para una alta actividad y una inespecificidad reducida | |
| JP2007504151A (ja) | 核酸および安定二本鎖ｒｎａ導入用ナノ粒子 | |
| US20230183746A1 (en) | Compositions for transfer of cargo to cells | |
| ES2368298B1 (es) | Método para la administración de oligonucleótidos. | |
| JP2023533124A (ja) | 二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含むコロナウイルス感染症－１９（ｃｏｖｉｄ－１９）治療用組成物 | |
| Mokhlis et al. | Nanoparticle delivery of miRNA in cancer | |
| US20230193262A1 (en) | Nucleic acid molecules capable of modulating target gene expression and uses thereof | |
| Kiviniemi | Studies on Intrachain Conjugation, Hybridization and Invasion of Oligonucleotides | |
| Philippou et al. | DEVELOPING APTAMERS FOR THE DELIVERY OF THERAPEUTIC RNA |