KR102259402B1 - 개선된 안정성을 갖는 핵산 분자 및 이의 용도 - Google Patents

개선된 안정성을 갖는 핵산 분자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 간섭을 유도하는 이중가닥 RNA 분자의 구조적 특징에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 개선된 안정성을 갖는 새로운 RNAi 유도 핵산 분자 구조 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자는 표적 유전자에 대한 발현 억제 효율을 유지시키면서 이중가닥 RNA 분자의 체내 안정성을 현저히 증진시킬 수 있는바, 다양한 유전자를 표적하는 확장 가능한 플랫폼으로써 RNA 핵산 분자는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 연구 분야 및 임상에서 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

개선된 안정성을 갖는 핵산 분자 및 이의 용도{Nucleic acid molecule with improved stability and use thereof}
본 발명은 RNA 간섭을 유도하는 이중가닥 RNA 분자의 구조적 특징에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 개선된 안정성을 갖는 새로운 RNAi 유도용 핵산 분자 구조 및 이의 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 표적 유전자와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥 및 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의하여 염기서열에 특이적으로 전사 후 유전자의 발현을 조절하는 내인성 기작이다. 이와 같은 기작은 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 비롯하여 식물, 초파리 및 포유동물에 이르기까지 진핵생물에서 공통적으로 보존되어 왔다. RNA 간섭 현상이 일어나는 과정은 dsRNA가 세포 내로 들어오면 RISC(RNA-induced silencing complex) 복합체와 결합하고 안티센스(가이드) 가닥만이 mRNA와 염기서열 상보적으로 결합하여 RISC 복합체에 존재하는 엔도뉴클라제(endonuclease) 도메인에 의하여 표적 mRNA를 분해하는 것으로 알려져 있다.
작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 약 19-29개 뉴클레오타이드 길이의 이중가닥 RNA로서, RNAi 경로를 통해 표적 유전자의 mRNA를 특이적으로 분해할 수 있다. siRNA는 이러한 높은 특이성 및 다양한 표적 유전자에 대한 용이한 접근성을 가지며, 또한 하나의 siRNA 분자가 대량 1,000개의 mRNA를 분해할 수 있어 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 매우 효과적인 수단으로 여겨져왔다. 이러한 장점들로 인해, siRNA는 다양한 임상 시험을 통해 유전자 치료제로써 그 유효성이 평가되어 왔으며, 2018년 08월에는 Alnylam의 siRNA 치료제(Patisiran)가 유전성 트랜스티레틴 매개성(hATTR) 아밀로이드증 성인 환자의 다발신경병증에 대한 치료제로 미국 FDA 승인을 받아 최초의 RNA 간섭 치료제로 승인되었다. 그러나 siRNA의 높은 치료적 잠재력에도 불구하고, 혈중에서 효소에 의해 쉽게 분해되고 작은 사이즈로 인해 신장에서 빠르게 제거되어 안정성이 낮으며, 효율적으로 표적화된 전달 시스템의 부족 등 여전히 해결해야 할 과제가 남아있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 리포좀, 지질 및 중합체와 같은 다양한 비바이러스성 담체(carrier)가 광범위하게 연구되어왔으며, 특히 양이온성 폴리머는 물에 잘 용해되고 높은 양전하를 가지고 있어 siRNA와 쉽게 결합되며, 혈중에 분포된 다양한 RNase로부터 siRNA의 분해를 감소시켜 이의 전달 효율을 높일 수 있다. 그러나 양이온성 물질은 잠재적 세포독성과 면역반응 유도에 의해 임상 적용에 제한이 따른다. 이에 대한 대안으로, 지질, 펩타이드, 중합체 또는 단백질과 같은 다양한 모이어티를 siRNA에 직접적으로 접합시켜 siRNA를 표적 세포로 전달하는 대안적 전략이 개발되고 있다.
한편, PNA(peptide nucleic acid)는 올리고뉴클레오티드 유사체로, DNA의 데옥시리보스 골격이 슈도 펩타이드 골격(pseudo-peptide backbone)으로 치환되어 있으며(Nieslsen et al., Science, 1991, 254, 1475), PNA에 존재하는 각 서브유닛 또는 단량체는 상기 골격에 부착된 천연 또는 비천연 핵염기(nucleobase)를 가지고 있다. PNA는 이러한 구조적 변화로 인해 상보적 DNA 및 RNA에 대한 높은 친화력, 핵산분해효소(nuclease) 및 단백질분해효소(Protease)에 대한 내성, 생물학적 환경에서의 높은 안정성을 나타내는 장점을 가진다. 또한, PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중가닥체는 융해온도(Tm)로 결정하였을 때, 대응되는 DNA/DNA 또는 RNA/RNA 이중가닥체에 비하여 높은 열역학적 안정성을 나타낸다.
본 발명자들은 표적 유전자 억제 효율에는 크게 영향을 주지 않으면서 체내 안정성을 유의적으로 개선시킬 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, PNA와 상기 핵산 분자를 결합시킨 신규 RNAi 유도 핵산 분자 구조를 개발하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 이중가닥의 RNA 분자; 및 상기 RNA 분자와 결합된 PNA를 포함하는 RNAi 유도용 핵산 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자; 및 세포 내 운반체를 포함하는, RNAi 유도용 복합체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 핵산과 상보적인 영역을 포함하는 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 제1 가닥 및 상기 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 21 내지 62개 뉴클레오티드 길이의 제2 가닥으로 구성된 이중가닥의 RNA 분자; 및 상기 제1 가닥과 결합된 6 내지 13개 뉴클레오티드 길이의 PNA(peptide nucleic acid)를 포함하되,
상기 PNA의 N-말단이 상기 제1 가닥의 3’ 말단과 결합되고,
상기 PNA와 상기 제1 가닥의 결합 영역은 구아닌(Guanine; G) 또는 사이토신(Cytosine; C) 염기로 이루어지는, RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 결합 영역은 제1 가닥의 3’ 말단으로부터 1 내지 2 뉴클레오티드 영역 및 상기 PNA의 N-말단으로부터 1 내지 2 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 제2 가닥은 PNA와의 결합부분을 제외한 나머지 영역에서 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 RNA 분자의 제2 가닥은 1 내지 5 뉴클레오티드로 구성된 3’-오버행(overhang)을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 RNA 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드의 당 구조, 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학적 변형은 리보뉴클레오티드의 2′ 위치의 OH 기가 H, OR, R, 할로젠, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로 치환되고, 상기 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학적 변형은 백본의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 목적 핵산은 mRNA(messenger RNA), microRNA, piRNA(piwi-interacting RNA), ncRNA(non-coding RNA), 코딩 DNA 서열 및 비코딩 DNA 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산 분자는 체내 안정성이 증진된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자; 및 세포 내 운반체를 포함하는, RNAi 유도용 복합체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 세포 내 운반체는 양이온성 폴리머, 지질, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포 투과성 펩타이드의 N-말단은 상기 핵산 분자를 구성하는 PNA의 C-말단과 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 유전자 발현 억제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체의, 유전자 발현 억제용도를 제공한다.
본 발명에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자는 표적 유전자에 대한 억제 효율을 유지시키면서 이중가닥 RNA 분자의 체내 안정성을 현저히 증진시킬 수 있는바, 다양한 유전자를 표적하는 확장 가능한 플랫폼으로써 RNA 핵산 분자는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 연구 분야 및 임상에서 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 합성한 PNA-siRNA 핵산 분자의 구조를 그림으로 도시한 것으로, 도 1a는 PNA의 N-말단이 siRNA의 안티센스 가닥의 3’ 말단과 연결되고 센스 가닥의 5’ 말단 부분과 상보적인 결합을 형성하는 구조이고, 도 1b는 PNA의 C-말단이 siRNA의 안티센스 가닥의 5’ 말단과 연결되고 센스 가닥의 3’ 말단 부분과 상보적인 결합을 형성하는 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 siRNA 이중가닥(duplex)과 PNA를 다양한 몰농도 비율 (1:1 내지 1:5)로 혼합하였을 때 복합체의 형성(complexation) 여부를 검증한 결과로서, 7 mer (도 2a), 10 mer (도 2b) 및 5 mer (도 2c) 길이의 PNA 각각에 대한 결과를 나타낸 것이며, 도 2a에서 7 mer 길이의 PNA는 각각 상기 도 1a (Forward) 및 도 1b (Reverse) 구조의 복합체 형성 여부를 분석하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PNA-siRNA 핵산 분자에 대하여 native PAGE를 통해 혈청 안정성 분석을 실시한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각각 native PAGE 후 밴드의 강도를 정량화한 것으로 PNA-siRNA 복합체 형태(Complex Form) (도 3a) 및 PNA가 분리된 siRNA 이중가닥 형태(Duplex Form) (도 3b)에 대한 결과이며, 도 3c는 native PAGE 후 겔 이미지를 나타낸 결과이다.
도 4는 PNA-siRNA 핵산 분자에서 PNA의 위치 (도 1a 및 도 1b의 구조), 및 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 결합 영역의 염기서열 차이에 따른 혈청 안정성을 분석한 결과로서, 도 4a 및 도 4b는 각각 native PAGE 후 밴드의 강도를 정량화한 것으로 PNA-siRNA 복합체 형태 (도 4a) 및 PNA가 분리된 siRNA 이중가닥 형태(도 4b)에 대한 결과이며, 도 4c는 native PAGE 후 겔 이미지를 나타낸 결과이다.
도 5는 PNA-siRNA 핵산 분자에서 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 결합 영역의 서열은 동일하고 PNA의 위치만 상이한 각각 도 1a의 구조 (#12) 및 도 1b의 구조 (#13)를 갖는 핵산 분자를 이용해 PNA 위치 차이에 따른 혈청 안정성을 분석한 결과로서, 도 5a 및 도 5b는 각각 native PAGE 후 밴드의 강도를 정량화한 것으로 PNA-siRNA 복합체 형태 (도 5a) 및 PNA가 분리된 siRNA 이중가닥 형태 (도 5b)에 대한 결과이며, 도 5c는 native PAGE 후 겔 이미지를 나타낸 결과이다.
도 6은 상기 도 1a에 해당하는 동일한 구조를 갖는 PNA-siRNA 핵산 분자에서 PNA의 길이(5, 7, 10 mer)에 따른 혈청 안정성을 분석한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 각각 native PAGE 후 밴드의 강도를 정량화한 것으로 PNA-siRNA 복합체 형태 (도 6a) 및 PNA가 분리된 siRNA 이중가닥 형태 (도 6b)에 대한 결과이며, 도 6c는 native PAGE 후 겔 이미지를 나타낸 결과이다.
도 7은 PNA-siRNA 핵산 분자가 siRNA의 유전자 발현 억제 효율에 미치는 영향을 분석하기 위해 in vitro 유전자 발현 억제 효율을 분석한 결과이다.
본 발명은 연구 분야, 다양한 질병의 진단 또는 치료 분야 등에서 유용하게 활용될 수 있는 RNA 핵산 분자에 관한 것으로서, 한정되지 않은 수의 디자인으로 확장 가능한 기본 플랫폼 RNA 핵산 분자 구조에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 목적 핵산과 상보적인 영역을 포함하는 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 제1 가닥 및 상기 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 21 내지 62개 뉴클레오티드 길이의 제2 가닥으로 구성된 이중가닥의 RNA 분자; 및 상기 제1 가닥과 결합된 6 내지 13개 뉴클레오티드 길이의 PNA(peptide nucleic acid)를 포함하되,
상기 PNA의 N-말단이 상기 제1 가닥의 3’ 말단과 결합되고,
상기 PNA와 상기 제1 가닥의 결합 영역은 구아닌(Guanine; G) 또는 사이토신(Cytosine; C) 염기로 이루어지는, RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “RNAi(RNA interference)”란 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의하여 염기서열에 특이적으로 표적 유전자의 mRNA 분해를 유도함으로써 표적 유전자의 발현을 조절하는 기작을 의미한다.
본 발명에서, 상기 이중가닥 RNA는 목적 핵산을 표적하여 이의 발현을 억제하는 기능을 갖는 것으로, 바람직하게는 siRNA일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “siRNA(small interfering RNA)”란 서열 특이적으로 표적 유전자의 mRNA를 절단(cleavage)함으로써 RNAi 현상을 유도하여 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중가닥 RNA(dsRNA)를 의미한다. 상기 이중가닥은 센스 RNA 가닥 및 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제하므로 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로써 또는 유전자치료(gene therapy)의 수단으로 이용될 수 있다.
상기 제1 가닥은 안티센스 가닥(antisense strand)을 의미하는 것으로, 관심 있는 표적 핵산(target nucleic acid)에 적어도 50%, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%이고, 가장 바람직하게는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로써 상보적일 수 있다.
본 발명에 있어서, 제1 가닥은 목적 핵산과 상보적인 영역을 포함하는 15 내지 49개 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 15 내지 39개 뉴클레도티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 30개 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 목적 핵산에 따라 이에 특이적인 RNA 분자의 제1 가닥의 길이는 상기 범위 내에서 제한 없이 조절될 수 있다.
상기 제2 가닥은 센스 가닥(sense strand)을 의미하는 것으로, 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본 발명에 있어서, 제2 가닥은 상기 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 21 내지 62개 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 21 내지 52개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 21 내지 43개 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 목적 핵산에 따라 이에 특이적인 RNA 분자의 제2 가닥의 길이는 상기 범위 내에서 제한 없이 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 영역은 제1 가닥의 3’ 말단으로부터 1 내지 2 뉴클레오티드 영역 및 상기 PNA의 N-말단으로부터 1 내지 2 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 뉴클레오티드 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 가닥은 PNA와 상보적인 결합을 형성하는 부분을 제외한 나머지 영역에서 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 RNAi 유도용 핵산 분자를 구성하는 모든 뉴클레오티드가 상보적인 결합 쌍을 이룸으로써 핵산 분자의 양 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 분자의 제2 가닥은 1 내지 5 뉴클레오티드로 구성된 3’-오버행(overhang)을 가질 수 있고, 바람직하게 3’-히드록시기를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 분자의 두 가닥 중 하나 이상의 RNA 가닥의 5’ 말단은 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 또는 히드록시기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 RNA 분자는 자연에 존재하는(변형되지 않은) 리보뉴클레오티드 단위구조를 가질 수 있으며, 하나 이상의 화학적 변형(modification)을 가지도록 합성되는 등의 화학적으로 변형된 것일 수도 있다.　상기 화학적 변형을 통해 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화(타겟 특이성) 향상, 안정성 증가, 또는 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 타겟 이외 효과(off-target effect) 감소, RISC 로딩(loading) 증가(RNAi 활성 증가) 등의 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서, RNA 분자의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 하나 이상의 리보뉴클레오티드의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것일 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 RNA 분자를 합성하고 변형시킬 수 있다. 또한 상기 변형은 조합된 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학적 변형은, 핵염기-변형된 리보뉴클레오티드, 즉, 5번-위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들면, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8번 위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들면, 8-브로모 구아노신; 데아자(deaza) 뉴클레오티드, 예를 들면, 7-데아자-아데노신; 0- 및 N-알킬화된 뉴클레오티드, 예를 들면, N6-메틸 아데노신과 같은, 천연 핵염기(nucleobase) 대신 비천연 핵염기를 포함하는, 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 당-변형된 리보뉴클레오티드에 있어서, 2′OH 기는 H, OR, R, 할로젠(F, Cl, Br 또는 I), SH, SR, NH2, NHR, NR2 및 CN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기(R은 C1-C6 알킬, 알케닐, 또는 알키닐)에 의하여 치환될 수 있다.
또한, 리보뉴클레오티드에 있어서, 백본의 포스포디에스테르 결합은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “목적 핵산”은 본 발명의 핵산 분자에서 siRNA의 안티센스 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 핵산으로, 바람직하게는 siRNA를 통해 발현을 억제하고자 하는 표적 핵산을 의미하며, 더욱 바람직하게는 mRNA(messenger RNA), microRNA, piRNA(piwi-interacting RNA), ncRNA(non-coding RNA), 코딩 DNA 서열 및 비코딩 DNA 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 핵산 분자는 일반적으로 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 핵산 분자는 화학적 또는 효소학적으로 합성된 것일 수 있다. 본 발명의 이중가닥 RNA 분자는 표준 재조합 기법에 의해 자연 발생적 유전자로부터 유도할 수 있으나, 이 경우 발현을 변화시킬 목적 유전자의 mRNA의 적어도 일부분과 뉴클레오티드 서열 수준에서 실질적으로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자의 체내 안정성 증진 효과를 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에 따른 구조의 RNA 핵산 분자 및 이의 안정성 효과 비교를 위한 대조군 RNA 핵산 분자를 설계 및 합성하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기에서 설계한 RNA 핵산 분자를 구성하는 7 mer 및 10 mer의 PNA와 이중가닥의 RNA가 복합체를 잘 형성하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자의 안정성 증진 효과를 확인하였으며, 대조군 RNA 핵산 분자와의 안정성을 비교함으로써 본 발명에 따른 핵산 분자의 구조가 안정성을 증진시킬 수 있는 특이적인 구조임을 확인하였다. 또한, PNA의 길이가 7 mer 및 10 mer인 경우에만 안정성 증진 효과를 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 구조를 갖는 핵산 분자의 유전자 발현 억제 효율을 분석한 결과, 뉴클레오티드가 추가된 구조적 변형에도 유전자의 발현 억제 효율은 변화하지 않은 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
상기와 같은 실시예 결과들은, 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자는 본래의 유전자 발현 억제 효율은 유지되면서 체내 안정성을 현저히 증진시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산 분자; 및 세포 내 운반체를 포함하는, RNAi 유도용 복합체를 제공한다.
상기 세포 내 운반체는 양이온성 폴리머, 지질, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 양이온성 폴리머, 양이온성 지질과 같은 양이온성 세포 전달체는 in vitro 및 in vivo의 어느 상태에서도 본 발명의 핵산 분자를 세포 내로 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 양이온성 세포전달체는 본 발명의 핵산 분자와 강하게 상호작용을 하여 복합체를 형성함으로써 RNAi를 유도하는 핵산 분자가 효과적으로 세포 내 도입될 수 있도록 한다. 바람직하게는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 폴리머 또는 리포좀을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 콜레스테롤과 같은 지질은 핵산 분자에 직접적으로 연결되거나, 다른 세포전달체에 결합된 다음 핵산 분자와 결합함으로써 간접적으로 연결될 수도 있다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 세포(막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 갖는 펩타이드를 의미한다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 세포 투과능을 가지는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 원하는 목적을 달성하기 위하여 적절하게 선택할 수 있다. 이의 비제한적인 예시로는, dNP2(KIKKVKKKGRKKIKKVKKKGRK, 서열번호 27), Tat(RKKRRQRRR, 서열번호 28), Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV, 서열번호 29), MPG(GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV, 서열번호 30), Penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열번호 31), KALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA, 서열번호 32) 또는 CADY(GLWRALWRLLRSLWRLLWRA, 서열번호 33) 아미노산 서열을 포함하거나 표시되는 것일 수 있다. 이때, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 27 내지 33으로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
상기 세포 투과성 펩타이드가 상기 PNA-siRNA 핵산 분자와 함께 RNAi 유도용 복합체를 형성할 경우, 상기 펩타이드의 N-말단은 상기 핵산 분자를 구성하는 PNA의 C-말단과 연결될 수 있다.
상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form 이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 RNAi 유도용 복합체를 포함하는, 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본원발명에서, “유전자”란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화하는 것일 수 있고, 병리학적 조건과 연관된 것일 수 있다. 상기 유전자는 내인성(endogeneous) 유전자 및 삽입유전자(transgene) 모두를 포함한다. 유전자의 종류는 구체적인 것으로 제한되지 않고 당업자가 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 유전자 발현 억제용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 추가적으로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능한 담체”란 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 생물체를 자극하지 않고 투여 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 예컨대, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용 가능하며, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내(intravenous), 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 피내(intradermal), 척수강 내(intrathecal), 뇌실질내(intracerebroventricular), 점막 내(mucosal), 흡입(inhalation) 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 유전자 발현 억제용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNAi 유도용 복합체를 처리하는 단계를 포함하는, 유전자의 발현 억제방법을 제공한다. 상기 복합체를 처리하는 단계는 바람직하게 상기 복합체를 세포 내로 도입시키는 과정을 모두 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험방법
1-1. PNA 합성
본 실시예에서는 레진의 N-말단에 N-말단이 Fmoc으로 보호되어 있는 아미노산의 C-말단을 하나씩 결합하는 유기합성법인 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis; SPPS) 방법을 이용해 PNA를 합성하였다. 이때, 4종류의 PNA 모노머(monomer) 즉, Fmoc-A(Bhoc)-aeg-OH, Fmoc-G(Bhoc)-aeg-OH, Fmoc-C(Bhoc)-aeg-OH 및 Fmoc-T-aeg-OH를 사용하였다. 본 실시예에 따른 PNA 후보군들은 모두 상기와 동일한 방법으로 합성하였으며, 모든 반응은 가열교반기(hot plate stirrer)에서 진행하였다. 모든 반응에서 N,N-다이메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide; DMF)를 용매로 사용하였고, PNA 커플링은 PNA : 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 유로늄(Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium; HBTU) : N,N-다이이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine; DIEA)을 1 : 1 : 2의 몰비로 혼합한 다음 1시간 동안 반응시킴으로써 진행하였다. 다음 PNA를 합성하기 위해서는 이전 PNA의 Fmoc을 제거하여야 하며, 이를 위해 80% DMF와 20% 피페리딘(Piperidine) 용액을 사용하여 상온에서 30분 동안 디프로텍팅 과정을 실시하였다. 모든 커플링 및 디프로텍팅 과정 사이에는 DMF와 염화메틸렌(dichloromethane; DCM)을 이용해 교대로 3회씩 세척하는 과정을 실시하였다. 이후, 고체상 레진으로부터 합성된 PNA를 분리하기 위해 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA) : 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane; TIS) : 증류수 (95 : 2.5 : 2.5)로 구성된 클리비지 용액에서 합성이 완료된 레진을 2시간 동안 교반하면서 반응을 진행한 다음, 석면필터로 레진을 걸러내었다. 이어서 걸러진 용액 안의 용액을 질소 기체 하에서 증발시키고 침전물이 생기면 차갑게 보관한 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 침전시켰으며, 침전된 PNA는 건조시킨 후 증류수에 녹여 동결건조 하였다. 이후 동결건조가 완료된 PNA는 증류수나 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN) 등으로 녹여 역상 고성능 액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography; HPLC)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 이때, 이동상 용매로는 Solvent A(증류수 99.9% 및 TFA 0.1%)와 Solvent B(증류수 9.9%, 아세토니트릴 90% 및 TFA 0.1%)를 사용하였다. HPLC 이동상은 Solvent A 90%와 Solvent B 10%로 시작하여 Solvent B가 1%/min 구배로 증가하면서 분리가 진행되도록 하였다. 분리된 펩타이드 용액은 액체 질소에서 급속 냉각시킨 후, 동결건조하여 용매를 제거하고 이후 DEPC(Diethyl Pyrocarbonate water)에 녹여 실험에 사용하였다.
1-2. PNA-siRNA 핵산 분자 제조
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 합성된 PNA와 siRNA가 복합체를 형성한 핵산 분자를 제조하기 위하여, 융해 온도(melting temperature; Tm)보다 높은 온도로 가열한 후, 천천히 식혀 어닐링(annealing)하는 방식을 사용하였다. 보다 상세하게, siRNA와 PNA를 siRNA의 센스 가닥(sense strand) : siRNA의 안티센스 가닥(antisense strand siRNA) : PNA를 1 : 1 : 2의 몰비로 혼합하고, 어닐링 버퍼와 DEPC 수를 첨가한 후 100℃로 가열된 히팅 블록(heating block)에서 2분 동안 끓여주었다. 이후 히팅 블록의 온도를 상온으로 설정하여, 샘플을 천천히 식혔다. 상기 어닐링 버퍼는 1 M Tris (pH 8.0) 완충액, 5 M NaCl 및 DEPC 수를 5 : 2 : 93의 부피 비로 혼합하여 5X로 만들어 사용하였다.
PNA와 siRNA의 복합체 형성 여부는 18% native PAGE 겔에서 native 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Polyacylamide gel electrophoresis; PAGE)을 실시하여 확인하였다. 이후 GelRed®를 이용해 겔을 40분 동안 염색한 후 결과를 확인하였다.
1-3. 안정성 분석
상기 실시예 1-2의 방법으로 제조한 PNA-siRNA 핵산 분자에 대하여, 혈청 안정성을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 100% 마우스 혈청을 이용하였으며, 상기 PNA-siRNA 핵산 분자를 혈청과 1 : 4의 비율로 혼합한 후 37℃에서 배양하였다. 배양 후 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간마다 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)(pH 8.0)을 처리하여 반응을 중지시키고 15% native gel에서 native PAGE를 이용하여 확인하였다. 겔은 GelRed®를 사용하여 40분 동안 염색한 후 결과를 확인하였으며, 대조군으로는 마우스 혈청에 노출시키지 않은 동일한 몰수의 핵산 분자를 사용하였다. 이후 겔 이미지 상에 나타난 밴드의 강도(intensity)를 정량하고 대조군 밴드의 강도와 비교하여 비율로 나타내었다.
1-4. In vitro 유전자 발현 억제 효율 분석
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 제조한 PNA-siRNA 핵산 분자의 표적 유전자인 GFP에 대한 발현 억제 효율을 조사하기 위해, 하기 방법에 따라 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, 인간 293A 세포를 384웰 플레이트에 분주하고 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지를 이용해 37℃, CO2 조건으로 밤새 배양하였다. 다음으로, PNA-siRNA 핵산 분자 각각을 TOM(transfection optimized medium, TR004-01) 40 μL를 기준으로 기준 1 nM, 10 nM 또는 50 nM이 되도록 RNAiMax(Thermo fisher scientific)를 이용하여 형질감염(transfection)하였다.
또한, 형질감염을 진행하고 48시간 후 Hoechst 33342를 DMEM에 1:5000으로 희석한 후 각 웰에 5 μL씩 추가로 넣은 후 30분 동안 배양하였다. 다음으로, Cytation 5(BioTek) 장비로 DAPI 및 GFP 파장을 각 웰 별로 4군데씩 이미징한 후 DAPI mask를 기준으로 각각의 세포를 개별화하였다. 이후 핵 주변 20 μm의 GFP value를 세포마다 구하고 이를 토대로 각 웰에 따른 mean-GFP value를 얻었다. 얻어진 mean-GFP value를 excel로 export하여 GraphPad Prism 8 프로그램을 이용하여 발현 억제 효율을 비교하기 위한 그래프로 나타내었다.
실시예 2. RNA 핵산 분자의 설계 및 합성
2-1. 본 발명의 RNA 핵산 분자 설계 및 합성
본 발명자들은 본 발명에 따른 RNA 분자 구조를 만족하는 다양한 핵산 분자를 디자인하였고, 이때 각각의 RNA 분자는 융해 온도(Tm)가 유사하도록 서열을 디자인하였다. 상기 각 RNA 분자들에 대한 구체적인 정보는 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
샘플
(#) 		PNA (C - N)
(Tm, ℃) 		명칭 및 서열
1 - (+GC)siGFP
SS : 5'-CGCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3' (서열번호 1)
AS : 3'-GCGGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5' (서열번호 2)
2 ATTGC CG (45.2) PNA-(+ GC )siGFP
SS : 5'-UAACGGCCGCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3' (서열번호 3)
AS : 3'- ATTGC CG GC GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5' (서열번호 4)
3 ATTGC CG (45.2) PNA-(+ UA )siGFP
SS : 5'-UAACGGCAUCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3' (서열번호 5)
AS : 3'- ATTGC CG UA GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5' (서열번호 6)
4 GCCGT TA (43.7) PNA-(+ GC )siGFP
SS : 5'-CGGCAAUCGCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3' (서열번호 7)
AS : 3'- GCCGT TA GC GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5' (서열번호 8)
상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA 분자를 합성하기 위하여, GFP 특이적 siRNA의 이중가닥을 일 예로 하여 다양한 핵산 분자를 합성하였다.
즉, 각 RNA 분자에서 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 부분의 4개 뉴클레오티드 즉, 연결 부위의 PNA 말단으로부터 2개 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥 말단으로부터 2개 뉴클레오티드는 모두 G 및 C로 구성되거나(#2), 어느 한쪽 말단에만 G 및 C가 위치하도록 디자인하였다(#3 및 #4).
또한, 상기 표 1의 RNA 분자 구조를 보다 다양화하기 위해, 하기 표 2와 같이 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 부분의 4개 뉴클레오티드가 모두 G 및 C로 이루어지면서 PNA의 길이만 5 mer(#9) 및 10 mer(#10)인 경우의 RNA 분자를 추가로 디자인하였다.
샘플
(#) 		PNA (C - N)
(Tm, ℃) 		명칭 및 서열
9 ATG GC
(20.2) 		PNA-(+ GC )siGFP
SS : 5’-UAGGCCGCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3’ (서열번호 17)
AS : 3’- ATG GC GC GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5’ (서열번호 18)
10 ATTATTGC CG
(53.5) 		PNA-(+ GC )siGFP
SS : 5’-UAAUAACGGCCGCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3’ (서열번호 19)
AS : 3’- ATTATTGC CG GC GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5’ (서열번호 20)
상기 표 1 및 2에 개시된 RNA 분자들은 도 1a에 그림으로 도시된 바와 같이 PNA의 N-말단이 siRNA의 안티센스 가닥의 3’ 말단과 연결되고, 상기 PNA 서열은 siRNA의 센스 가닥의 5’ 말단 영역에 상보적으로 결합되어 있는 구조이다.
상기 핵산 분자 서열에서, 안티센스 가닥과 연결된 PNA 서열은 기울임체로 표시하였으며, PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 부위의 4개 뉴클레오티드는 밑줄로 표시하였다.
2-2. 대조군 RNA 핵산 분자 설계 및 합성
본 발명자들은 상기 실시예 2-1에서 합성한 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자와의 효과를 비교하기 위한 대조군으로 핵산 분자들을 디자인하였고, 구체적인 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
샘플
(#) 		PNA (C - N)
(Tm, ℃) 		명칭 및 서열
5 GCCGT TA (43.7) PNA-(+ UA )siGFP
SS : 5’-CGGCAAUAUCCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3’ (서열번호 9)
AS : 3’- GCCGT TA UA GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5’ (서열번호 10)
6 - siGFP(+CG)
SS : 5’-CCCCGACCACAUGAAGCAGCAGC-3’ (서열번호 11)
AS : 3’-GGGGCUGGUGUACUUCGUCGUCG-5’ (서열번호 12)
7 GC CGTTA (43.7) siGFP(+ CG )-PNA
SS : 5’-CCCCGACCACAUGAAGCAGCAGCCGGCAAU-3’ (서열번호 13)
AS : 3’-GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU CG GC CGTTA -5’ (서열번호 14)
8 AT CGTTA (33.1) siGFP(+ AU )-PNA
SS : 5’-CCCCGACCACAUGAAGCAGCAUAUAGCAAU-3’ (서열번호 15)
AS : 3’-GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU AU AT CGTTA -5’ (서열번호 16)
상기 대조군 RNA 분자에서, #5은 도 1a의 구조를 가지는 것이나 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 부위의 4개 뉴클레오티드가 T(U) 및 A로만 구성된 것으로 디자인하였다.
또한, 도 1b에 그림으로 도시된 바와 같이 도 1a의 구조와 상반되게 PNA의 C-말단이 siRNA의 안티센스 가닥의 5’ 말단에 연결되며 상기 PNA 서열이 siRNA의 센스 가닥의 3’ 말단에 상보적으로 결합되어 있는 구조의 RNA 분자를 디자인하였다(#7 및 #8). 보다 구체적으로, 상기 RNA 분자에서 PNA와 안티센스 가닥이 연결되는 부분의 4개 뉴클레오티드 즉, 연결 부위의 PNA 말단으로부터 2개 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥 말단으로부터 2개 뉴클레오티드는 모두 G 및 C로 구성되거나(#7), 모두 T(U) 및 A가 위치하도록 디자인하였다(#8).
실시예 3. PNA와 이중가닥 RNA의 복합체 형성 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 각각 디자인한 PNA와 이중가닥 RNA가 결합하여 복합체를 형성하는지를 확인하고자 하였다.
이를 위해, 길이가 5, 7 및 10 mer인 PNA 각각에 대하여 이중가닥 RNA에 대한 PNA의 몰농도비(Molar ratio)를 1:1 내지 1:5로 달리한 조건에서 복합체 형성 여부를 관찰하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자인 #2(7 mer), #9(5 mer), #10(10 mer) 및 대조군 RNA 핵산 분자인 #7에 해당하는 PNA 및 siRNA 이중가닥을 이용하였다. 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 실험을 진행하고 18% native 겔을 이용해 native PAGE를 실시하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같이 PNA가 7 mer 및 10 mer인 경우 1 : 1 내지 1 : 5 몰비에서 모두 PNA-siRNA 핵산 분자가 형성된 것으로 나타났다. 이에 반해 5 mer PNA의 경우에는 siRNA 이중가닥의 밴드와 밴드의 위치 차이가 거의 없는 것으로 보아 핵산 분자가 형성되지 않은 것을 확인하였으며, 이는 5 mer PNA의 Tm이 20.2℃이므로 상온에서 분리(dissociation)되기 때문인 것으로 판단되었다.
실시예 4. PNA 위치 및 PNA-AS 결합 영역의 염기서열에 따른 안정성 비교
본 발명자들은 먼저 상기 실시예 2-1에서 디자인 및 합성한 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자들의 혈청 안정성을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 표 1의 핵산 분자 #2, #3 및 #4를 이용하여 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 혈청 안정성을 분석하고 이의 결과를 정량화하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자인 #2, #3, 및 #4 모두 혈청 안정성이 현저히 증가한 것으로 나타났으며, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 핵산 분자에서 PNA가 분리된 이중가닥 RNA 형태의 안정성도 높게 유지되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 도 3c에 나타낸 바와 같이 겔 이미지 상에 나타난 밴드의 강도를 통해서도 확인할 수 있다.
상기 결과에 근거하여, 본 발명자들은 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자의 안정성 증진 효과가 구조에 특이적인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-2에서 합성한 표 3의 대조군 RNA 핵산 분자와의 안정성을 비교하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 도 1b의 PNA가 RNA의 안티센스 가닥의 5’ 말단에 결합한 구조를 갖는 핵산 분자(#7, #8)와 비교하여 본 발명에 따른 도 1a의 구조를 갖는 핵산 분자(#2, #3, #4)의 안정성이 현저히 높게 나타났으며, PNA가 결합된 복합체 형태뿐만 아니라 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 PNA가 분리된 이중가닥 RNA의 안정성 또한 유사한 경향을 나타내었다. 이러한 결과는, 도 4c의 겔 이미지상의 밴드 강도를 통해서도 확인할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 도 1a의 구조를 갖는 RNA 핵산 분자에서, RNA의 안티센스 가닥과 결합하는 PNA 말단의 2개 뉴클레오티드, 및 PNA와 결합하는 안티센스 가닥 말단의 2개 뉴클레오티드의 염기서열이 안정성에 중요한 영향을 미치는지 확인하기 위해 상기 4개 뉴클레오티드가 모두 T(U)와 A로만 구성된 대조군 핵산 분자(#5)와의 안정성을 비교하였다.
그 결과, 도 4a 내지 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 핵산 분자(#2, #3, #4)들과는 달리, 상기 4개 뉴클레오티드가 모두 T(U)와 A로만 구성된 핵산 분자(#5)의 경우에는 안정성이 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 PNA가 결합된 복합체 형태뿐만 아니라 PNA가 분리된 이중가닥 RNA에서도 유사하게 나타났다.
단, 본 발명자들은 도 4a의 PNA가 결합된 복합체 형태의 결과에서, PNA-안티센스 가닥이 결합되는 부위의 염기서열에 관계 없이 도 1a의 구조를 갖는 핵산 분자(#2, #3, #4, #5)가 도 1b 구조의 핵산 분자(#7, #8)에 비해 안정성이 높은 것을 확인하였다. 그러나, 이중가닥 RNA에 대한 도 4b에서는 PNA-안티센스 가닥이 결합되는 부위가 T(U) 및 A로 구성된 핵산 분자의 경우 도 1a 구조의 핵산 분자(#5)가 도 1b의 구조를 갖는 핵산 분자(#8)보다 안정성이 다소 낮게 나타난 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 PNA 위치에 따른 안정성을 보다 정확히 비교하기 위해 하기 표 4에 나타낸 RNA 핵산 분자를 추가로 합성하였다.
샘플
(#) 		PNA (C - N)
(Tm, ℃) 		명칭 및 서열
11 - (+ U) siGFP
SS : 5’-ACCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3’ (서열번호 21)
AS : 3’-UGGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5’ (서열번호 22)
12 ATTGC CG (45.2) PNA-(+ U )siGFP
SS : 5’-UAACGGCACCCCGACCACAUGAAGCAGCA-3’ (서열번호 23)
AS : 3’- ATTGC CG U GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU-5’ (서열번호 24)
13 GC CGTTA (43.7) (+ U )siGFP-PNA
SS : 5’-CCCCGACCACAUGAAGCAGCAACGGCAAU-3’ (서열번호 25)
AS : 3’-GGGGCUGGUGUACUUCGUCGU U GC CGTTA -5’ (서열번호 26)
구체적으로, PNA-안티센스 가닥 결합부위의 염기서열 및 PNA 서열 등 다른 조건들은 모두 동일하고 PNA의 위치만이 상이한 #12 및 #13 핵산 분자를 이용하여 PNA 위치에 따른 안정성을 보다 정확히 비교분석하였다. 그 결과, 도 5a 내지 도 5c에 나타낸 바와 같이 본원발명에 따른 도 1a의 구조를 갖는 RNA 핵산 분자(#12)의 안정성이 현저히 높게 나타났으며, PNA가 분리된 이중가닥 RNA 형태에서도 유사한 결과를 확인하였다.
상기 결과들을 통해, 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자의 PNA의 결합 위치 및 PNA-안티센스 가닥의 결합 영역이 안정성 증진에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. PNA 길이에 따른 안정성 비교
다음으로, RNA 핵산 분자에서 PNA의 길이가 핵산 분자의 안정성에 영향을 미치는지 분석하고, 가장 효과적으로 안정성을 증진시킬 수 있는 PNA의 길이를 결정하기 위해, 상기 표 1 및 2의 핵산 분자 #9(PNA 5 mer), #2(7 mer) 및 #10(10mer)을 이용하여 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 혈청 안정성을 분석하고 이의 결과를 정량화하여 그래프로 나타내었다.
실험 결과, 도 6a 내지 도 6c에 나타낸 바와 같이 PNA의 길이가 5 mer인 경우에는 siRNA 이중가닥과 결합된 RNA 분자가 형성되지 않은 반면, 7 mer 및 10 mer인 경우에는 안정성이 유사하게 나타났으며 7 mer인 경우가 다소 높게 나타났다. 또한, PNA가 분리된 RNA 이중가닥 형태에서도 7 mer 및 10 mer의 경우 안정성이 모두 유사한 정도로 7 mer에서 다소 높은 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, PNA의 길이가 7 mer인 경우 구조체의 안정성이 가장 높은 수준으로 증진되는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 목적 유전자의 발현 억제 효율 확인
본 발명자들은 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자의 구조를 만족하기 위해 naive siRNA에 뉴클레오티드를 추가한 것이 본래의 유전자 발현 억제 효율에 영향을 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해, PNA가 결합되지 않은 형태의 GFP siRNA 이중가닥(#1)을 대조군으로 하여, 본 발명의 RNA 핵산 분자(#2, #3 및 #4)의 유전자 발현 억제 효율을 실시예 1-4의 방법에 따라 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, RNA 핵산 분자의 경우 대조군과 비교해 변경된 구조를 가짐에도 불구하고 siRNA의 유전자 발현 억제 효율이 유지되는 것을 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 RNA 핵산 분자는 이중가닥 RNA의 유전자 발현 억제 효율은 유지시키면서 체내 안정성은 현저히 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (13)

  1. 목적 핵산과 상보적인 영역을 포함하는 15 내지 49개 뉴클레오티드 길이의 제1 가닥 및 상기 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 21 내지 62개 뉴클레오티드 길이의 제2 가닥으로 구성된 이중가닥의 RNA 분자; 및
    상기 제1 가닥과 결합된 6 내지 13개 뉴클레오티드 길이의 PNA(peptide nucleic acid)를 포함하되,
    상기 PNA의 N-말단이 상기 제1 가닥의 3’ 말단과 결합되고,
    상기 PNA와 상기 제1 가닥의 결합 영역은 구아닌(Guanine; G) 또는 사이토신(Cytosine; C) 염기로 이루어지는, RNAi 유도용 핵산 분자로서,
    상기 결합 영역은 제1 가닥의 3’ 말단으로부터 2개의 뉴클레오티드 영역 및 상기 PNA의 N-말단으로부터 2개의 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2 가닥은 PNA와의 결합부분을 제외한 나머지 영역에서 제1 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 분자의 제2 가닥은 1 내지 5 뉴클레오티드로 구성된 3’-오버행(overhang)을 갖는 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드의 당 구조, 염기 구조, 또는 상기 리보뉴클레오티드 간의 결합 부위가 화학적으로 변형(modification)된 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 리보뉴클레오티드의 2′ 위치의 OH 기가 H, OR, R, 할로젠, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로 치환되고, 상기 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 백본의 포스포디에스테르 결합을 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하는 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 목적 핵산은 mRNA(messenger RNA), microRNA, piRNA(piwi-interacting RNA), ncRNA(non-coding RNA), 코딩 DNA 서열 및 비코딩 DNA 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 체내 안정성이 증진된 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 핵산 분자.
  10. 제1항의 핵산 분자; 및
    세포 내 운반체를 포함하는, RNAi 유도용 복합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포 내 운반체는 양이온성 폴리머, 지질, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포 투과성 펩타이드의 N-말단은 상기 핵산 분자를 구성하는 PNA의 C-말단과 연결된 것을 특징으로 하는, RNAi 유도용 복합체.
  13. 제10항의 복합체를 포함하는, 유전자 발현 억제용 조성물.
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