JP6300212B2 - 二重鎖核酸結合剤、当該結合剤−二重鎖核酸複合体、当該複合体を含有する医薬品組成物、及び、当該複合体の製造方法 - Google Patents

二重鎖核酸結合剤、当該結合剤−二重鎖核酸複合体、当該複合体を含有する医薬品組成物、及び、当該複合体の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、様々な医学的・生物学的分野において応用可能な、二重鎖核酸結合剤、特に二重鎖ＲＮＡ等のＡ型二重鎖核酸を安定化させることの可能な二重鎖核酸結合剤と、当該結合剤の応用に関する発明である。
近年、核酸医薬、特にＲＮＡ干渉医薬（ＲＮＡｉ医薬）は、新たな治療医薬として焦点が当てられている（非特許文献１〜３）。しかしながら現在の代表的なＲＮＡｉ医薬であるsiＲＮＡは、細胞膜透過性の低さと細胞内における不安定性により十分に効果的ではない。そこで、新たなＲＮＡｉ医薬のデリバリーシステム（ＤＤＳ）の構築に当たって実用的な適用手段が求められており、siＲＮＡの安定性を高めるために多くの化学的な修飾が提案されている（非特許文献４〜７）。siＲＮＡの安定化のためのもう一つの戦略は、ＲＮＡ分子に非共有結合できる分子の使用である。ＲＮＡｉ医薬は、Ａ型二重鎖として存在する二重鎖ＲＮＡにて構成される。従前の研究においてＤＤＳの発展に寄与するために、本発明者らはＡ型二重鎖核酸の主溝中のリン酸基をターゲットとする「α−（１→４）−linked−２，６−ジアミノ−２，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコピラノース」を設計した（非特許文献８）。当該オリゴジアミノサッカライドはＡ型ＲＮＡ二重鎖を安定させることが可能であり、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖への結合選択性を示した。しかしながら、様々なオリゴジアミノサッカライドの合成は多くの段階が要求され、一般的に困難である。
なお本発明に関連して、アミノ基の結合した８アミノ酸基で構成される陽イオン性オリゴペプチドが、１２量体モデルの二重鎖ＲＮＡに結合して当該ＲＮＡの熱安定性を向上させることは、本出願時において公知となっている（２０１１年３月日本化学会第９１春季年会要旨集、同年９月アンチセンス・遺伝子・デリバリーシンポジウム２０１１要旨集、第４８回ペプチド討論会要旨集、２０１２年３月日本化学会第９２春季年会要旨集）。しかしながら、グアニジノ基の結合した陽イオン性オリゴペプチドにおける同知見は新規性喪失の例外規定の適用内であり、アミノ基とグアニジノ基の双方のタイプにおいて、陽イオン性オリゴペプチドにおけるsiＲＮＡを用いたヌクレアーゼ耐性に関する知見や、キメラ型二重鎖におけるＲＮaseＨ活性の促進作用は、非公知である。またここに記載された事項は全て、米国におけるいわゆるグレースピリオドの適用期間内の発表である。
特開２００８−１２５３７４号公報 国際公開第２０１３／０８９２８３号公報
Davidson, B. L.; McCray, P. B. Nat. Rev. Genetics 2011, 12, 329-40. Pecot, C. V.; Calin, G. a; Coleman, R. L.; Lopez-Berestein, G.; Sood, A. K. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 59-67. Kim, S.-S.; Garg, H.; Joshi, A.; Manjunath, N. Trends Mol. Med. 2009, 15, 491-500. a) Czauderna, F. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 2705-2716. b) Robbins, M.; Judge, A.; Maclachlan, I. Oligonucleotides2009, 19, 57-67. Jackson, A. L.; Burchard, J.; Leake, D.; Reynolds, A.; Schelter, J.; Guo, J. I. E.; Johnson, J. M.; Lim, L. E. E.; Karpilow, J. O. N.; Nichols, K. I. M.; Marshall, W.; Khvorova, A.; Linsley, P. S. RNA2006, 1197-1205. Foerster, C.; Zydek, M.; Rothkegel, M.; Wu, Z.; Gallin, C.; Gessner, R.; Lisdat, F.; Fuerste, J.P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012, 419,60-5. a) Eckstein, F. Biochimie 2002, 84, 841-848. b) Amarzguioui,M. Nucleic Acids Res.2003, 31, 589-595. Iwata, R.; Sudo, M.; Nagafuji, K.; Wada, T. J. Org. Chem.2011, 76, 5895-5906. ２０１１年３月日本化学会第９１春季年会要旨集 ２０１１年９月アンチセンス・遺伝子・デリバリーシンポジウム２０１１要旨集 ２０１１年９月第４８回ペプチド討論会要旨集 ２０１２年３月日本化学会第９２春季年会要旨集
上記の状況下で本発明者らは、ＲＮＡ結合性分子として陽イオン性オリゴペプチドを用いることに想到した。ペプチドの合成はオリゴサッカライドよりも容易であり、例えばシグナルペプチド等のデリバリー分子に代表される他の分子との連結も比較的容易である。その一環として、側鎖端にアミノ基（ＮＨ３＋）を伴うアミノ酸残基を連続して配列した陽イオン性オリゴペプチドを作出したところ、当該陽イオン性オリゴペプチドが二重鎖ＲＮＡの主溝のリン酸基と結合し、当該二重鎖ＲＮＡ−オリゴペプチド複合体の熱安定性が向上することが確認された。
しかしながら上記のアミノ基を伴う陽イオン性オリゴペプチドの二重鎖ＲＮＡに対する結合強度は比較的緩徐であり、ドラッグデリバリーシステムとしての実用化に際しては、例えば結合力や結合態様において、さらに多様な陽イオン性オリゴペプチドの提供が望まれる。本発明の課題は第一に、上記のアミノ基を伴う陽イオン性オリゴペプチドを用いるドラッグデリバリーシステムの実用化に向けての、新たな手段を提供することである。そして第二に、同じくドラッグデリバリーシステムの実用化や研究手段の多様化に向けて、さらに強い二重鎖核酸に対する結合力を有する陽イオン性オリゴペプチドを提供することにある。
上記の第一の課題に関し、側鎖にアミノ基を伴う陽イオン性オリゴペプチドを結合させた「二重鎖ＲＮＡ−当該陽イオン性オリゴペプチドの複合体」における、ヌクレアーゼ（ＲＮase）に対する抵抗性を検証したところ、優れたヌクレアーゼ抵抗性が現れることと同時に、結合対象の二重鎖ＲＮＡとして用いたsiＲＮＡは、当該陽イオン性オリゴペプチドの当量を増加させても依然として高活性を維持することが明らかになった。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして応用可能なキメラ型二重鎖においては、上記陽イオン性オリゴペプチドと複合体が形成されることにより、上記のヌクレアーゼ抵抗性と共に、少なくともＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖のＲＮＡ鎖を分解する活性を有するＲＮaseＨの作用を増強することが明らかになった。ＲＮＡｉ医薬をはじめとする核酸医薬の課題の一つは、核酸医薬の生体内での安定性である。核酸医薬は生体内のヌクレアーゼにより容易に分解されるため、現状においては医薬単体で有効な活性を示すことは困難である。特にＲＮＡｉ医薬の本体であるＲＮＡは血清内のヌクレアーゼにより極短時間に分解されるため、血清中で容易に分解される。そのため、生体内での安定化が必要とされている。それと同時に生体内での作用が可能な限り妨げられないことが要求される。さらにアミノ基を側鎖とする陽イオン性オリゴペプチドにおいて、より優れた特徴があることも確認された。
また第二の課題に関し、従来の陽イオン性オリゴペプチドの側鎖のアミノ基に代えて、グアニジノ基とすることにより、さらに二重鎖核酸との結合性と熱安定性が向上し、二重鎖ＤＮＡの主要な態様であるＢ型二重鎖核酸と結合させることさえも可能であること、さらには複合体においてヌクレアーゼに対する抵抗性が認められることが明らかになった。
このような新たな重要な知見を基に、本発明者は下記の発明を提供するに至った。
本発明は第一に、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含む２〜４０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド領域であって、かつ、当該下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続部分以外は、連続しない１個のアミノ酸残基であるオリゴペプチド領域（以下、特定オリゴペプチド領域ともいう）、を含むオリゴペプチド又は当該オリゴペプチド誘導体（以下、本発明のオリゴペプチド等ともいう）からなること、を特徴とする二重鎖核酸結合剤（以下、本発明の核酸結合剤ともいう）を提供する。
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−、又は、式（II）で示される基である。Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１〜３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１〜４のアルキレン基である。一つのオリゴペプチド領域においてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
Ｒ１が「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」である態様は、式（Ｉ）のアミノ酸残基が「アミノ基を伴うアミノ酸残基」であることを意味する。すなわち「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」のメチレン基を除いた部分がアミノ基であり、この基が特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基の側鎖の先端部を構成する。Ｒ１をアミノ基（Ｈ３Ｎ＋−）とせずに基「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」と定義した理由は、全く形式的なものである。
この「アミノ基を伴うアミノ酸残基」を構成として含む特定オリゴペプチド領域を有する本発明のオリゴペプチド等が結合する二重鎖核酸は、Ａ型二重鎖核酸である。
これに対してＲ１が「式（II）の基」である態様は、式（Ｉ）のアミノ酸残基が「グアニジノ基を伴うアミノ酸残基」であることを基本とするものである。すなわち「式（II）の基」の、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が全て水素原子である当該基がグアニジノ基である。
この「グアニジノ基等を伴うアミノ酸残基」を構成として含む特定オリゴペプチド領域を有する本発明のオリゴペプチド等が結合する二重鎖核酸は、Ａ型二重鎖核酸と共に、Ｂ型二重鎖核酸も対象となり得る。ただし、当該二重鎖核酸がＡ型である場合とＢ型である場合とは、好適なアルキレン基Ｒ２の炭素原子数がそれぞれ異なっている。
Ａ型二重鎖構造とＢ型二重鎖構造は、糖の立体配座（パッカリング）によって異なる核酸のらせん構造の区別であり、Ａ型二重鎖は「糖のＮ型コンフォメーション」に、Ｂ型二重鎖は「糖のＳ型コンフォメーション」に、それぞれ基づいている。それぞれ、塩基対間の距離、回転角、塩基対の傾き、一回転当たりの残基数、主溝（メジャーグルーブ）と副溝（マイナーグルーブ）の広さと深さ、リン酸基間の距離、において違いがあり、例えば、主溝の深さはＡ型が１３．５Å・Ｂ型が８．５Åであり、同広さはＡ型が２．７Å・Ｂ型が１１．７Åである。リン酸基間の距離はＡ型が５．９Å・Ｂ型が７．０Åである。
「二重鎖ＲＮＡ」と「ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖（以下、「ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖」とも記載する）は、少なくとも生理的環境下ではＡ型二重鎖構造をとることが知られている。また、これらに準じる核酸誘導体を含む二重鎖も同様」に生理的環境下においてＡ型二重鎖構造として存在することが知られている。これに対して「二重鎖ＤＮＡ」と、これに準じる核酸誘導体を含む二重鎖は、少なくとも生理的環境下ではＢ型二重鎖構造をとることが知られている。後述するように本発明におけるＤＮＡ又はＲＮＡは、天然型のみならず、人為的な修飾が施された人工のＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。
上記の通り、二価基Ｒ２は、上記のＲ１が「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」の場合、すなわち式（Ｉ）のアミノ酸残基が「アミノ基を伴うアミノ酸残基」の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１〜３のアルキレン基である。ここに記した「存在しない」とは、「二価基Ｒ２が存在しない」こと、すなわち式（Ｉ）のアミノ酸残基の２位の炭素原子に「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」が直接結合していることを意味する。
これに対して上記のＲ１がグアニジノ基に基づく「式（II）の基」の場合は、炭素原子数１〜４のアルキレン基である。
いずれの場合にも本発明のオリゴペプチド等が結合する二重鎖核酸が「Ａ型二重鎖」の場合には、好適なＲ２は炭素原子数が１のメチレン基（−ＣＨ２−）である。これに対して、上記のＲ１がグアニジノ基に基づく「式（II）の基」の場合に、本発明のオリゴペプチド等が結合する二重鎖核酸が「Ｂ型二重鎖」である場合の好適なＲ２は、炭素原子数が３のトリメチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）である。
一般的に結合の対象となる二重鎖核酸の鎖が長く塩基数が多いほど、それに伴うリン酸基の数も多くなり、これらに結合することが可能な特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基数は大小についての多様性を伴う。すなわち二重鎖核酸の鎖が長くリン酸基の数が増加すれば、これに結合する特定オリゴペプチド領域として、「短いものが多数個の場合」、「長いものが少数個の場合」、さらにこれらの組み合わせが考えられることになり、理論上そのバリエーションは、二重鎖核酸の長さが増すに従い相乗的に増加することになる。
本発明のオリゴペプチド等において、特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなることは本発明のオリゴペプチド等の好適な態様の一つである。ここで本発明のオリゴペプチド等における「特定オリゴペプチド領域」とそれ以外の部分は、上記した「特定オリゴペプチド領域」の定義により導かれる。すなわち、「式（Ｉ）以外のアミノ酸残基」が２つ以上連続する箇所は、「特定オリゴペプチド領域」からは外れることになる。この場合、２つ以上連続する式（Ｉ）のアミノ酸残基のうち、「式（Ｉ）以外のアミノ酸残基」が２つ以上連続する箇所に最も近い式（Ｉ）のアミノ酸残基、が、Ｃ末端側もＮ末端側も同様に「特定オリゴペプチド領域の末端」となる。
この「特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなる場合」で、かつ、二重鎖核酸がＡ型二重鎖の場合において、当該Ａ型二重鎖の長さと、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数と相関するＲＮＡ二重鎖の主溝の向かい合うリン酸の数については以下の様に計算がなされる。
◇１２量体の場合：リン酸基の数＝１１個、主溝に無いリン酸の数＝７個（オリゴマーの長さによらず一定）、主溝で向かい合うリン酸基の数＝１１−７＝４対、結合に必要なオリゴペプチドの正電荷の数＝４×２＝８；
◇２５量体の場合：リン酸基の数＝２４個、主溝に無いリン酸基の数＝７個（オリゴマーの長さによらず一定）、主溝で向かい合うリン酸基の数＝２４−７＝１７対、結合に必要なオリゴペプチドの正電荷の数＝１７×２＝３４；
この計算によれば、Ａ型二重鎖２１量体には３分子、２５量体には４分子のＤａｂ８が結合し得ることになる。短い特定オリゴペプチド領域が数分子結合する場合と、長い特定オリゴペプチド領域が１分子結合する場合を想定すれば、１０〜２５量体のＡ型二重鎖に対応するペプチド残基数は８〜３４となる。
これらのことを二重鎖核酸の塩基数１０〜２５量体の範囲で類型化すると、
（１）二重鎖核酸が１０〜２５量体であり、かつ、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜１０である場合：アミノ酸残基数が８〜１０という小分子の特定オリゴペプチド領域のみが、二重鎖核酸の塩基数（リン酸基数）に応じた結合をする態様である。
（２）二重鎖核酸が１８〜２５量体であり、かつ、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜３４である場合：アミノ酸残基数が８〜３４という小分子と大分子のオリゴペプチド領域が多様な組み合わせで、二重鎖核酸の塩基数（リン酸基数）に応じた結合をする態様である。
ここで主なＡ型二重鎖核酸について簡単に開示する。これらのＡ型二重鎖核酸の製造方法は既に公知である（例えば特許文献１、２）。
（ａ）二重鎖ＲＮＡ
主に１８〜２５量体の二重鎖ＲＮＡとしてsiＲＮＡが挙げられる。microＲＮＡ（miＲＮＡ）もこの範疇に入ることが知られている（ただし、オリジナルのmiＲＮＡは一重鎖であり、本発明において用い得る態様はこれを二重鎖として改変されたものである）。
（ｂ）キメラ型二重鎖
これについては、例えば、特許文献１と特許文献２、特に特許文献２において具体的かつ詳細に開示されている。
後述するようにこのキメラ型態様のＡ型二重鎖核酸は、標的遺伝子のｍＲＮＡの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（略称ＡＳＯ））として、核酸医薬としての応用が期待されている。
具体的には、「相補鎖のうち『一方』が４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域を含む核酸であり、『他方』が当該一方の核酸と相補的な塩基配列を有するＲＮＡとＰＮＡの双方又はいずれかである二重鎖核酸」である。ＡＳＯとして用いられる場合、全体の鎖長として、上記の４塩基（４量体）を最低長として、通常１０〜３５量体の範囲で設計される。好適な塩基長の目安として、通常は１２〜２５量体であり、さらに好適な目安として１３〜２０量体が挙げられる。
最も基本的なキメラ型二重鎖として、「ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖」が挙げられる。
さらに前記相補鎖の「一方の核酸」における、「４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域」の５’末端側と３’末端側の双方又はいずれかにおいて、連続又は不連続に修飾核酸を含む領域（単量体を含む）が設けられている複合ＤＮＡ鎖が挙げられ、当該修飾核酸として、特にＬＮＡが好適例として挙げられる。ここで「連続」とは、核酸の領域同士が、ホスホジエステル結合等により分子的に連続であることを意味する。これに対して「不連続」とはこの様な分子的な連続性を伴わずに、例えば核酸の領域同士が「隣り合って存在している」等を意味する。
前記相補鎖の「他方の核酸」がＲＮＡであって、上記「一方の核酸」の修飾領域を含む領域に対して相補的な領域が修飾されており、当該修飾がＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する効果を有するものである態様が挙げられる。この「ＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する効果を有することを特徴とする修飾」として、特に、２’−Ｏ−メチル化とホスホロチオエート化の双方又はいずれかが好適例として挙げられる。
また、前記相補鎖の「他方の核酸」（ＲＮＡとＰＮＡの双方又はいずれか）に機能性分子が結合している態様も挙げられる。当該機能性分子として、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子である。この機能性分子は、キメラ型二重鎖のみならず、上述した二重鎖ＲＮＡにおいて結合させることもできる。
また、特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基のうち、光学活性を伴うアミノ酸残基は、全てＬ型、あるいは、全てＤ型の同一の光学活性を有するアミノ酸残基であることが好適である。
さらに本発明のオリゴペプチド等における、概ね陽イオン性の細胞膜の効率的な通過や、特定の標的（臓器等）への選択性を付与するため等の目的のために、いわゆるデリバリー分子を本発明のオリゴペプチド等に結合させることが可能である。
本発明の核酸結合剤は、その使用による「二重鎖核酸に対するヌクレアーゼによる分解抑制効果」に基づいた「ヌクレアーゼ分解抑制剤」（以下、本発明の分解抑制剤ともいう）としての態様をとることが可能である（ただし、この二重鎖核酸に対するヌクレアーゼからＲＮaseＨは除外する）。このヌクレアーゼの分解対象である二重鎖核酸には、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ二重鎖、及び、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖が含まれる。また、ここに例示されるヌクレアーゼにおける二重鎖核酸に対する分解作用以外の作用、典型的にはＲＮＡやＤＮＡの一重鎖に対する分解作用を保有することを除外するものではない。
「二重鎖核酸に対するヌクレアーゼ」として、例えば、ＲＮaseＡ、オリゴヌクレオチダーゼ(oligonucleotidase)、ＲＮaseII、ＲＮaseIII、Spleen exonuclease、ＤＮaseＩ、ＤＮaseII、エクソデオキシリボヌクレアーゼ(Exodeoxyribonuclease)VII等が挙げられる。ここではヒトにおいて存在するヌクレアーゼを一部例示列挙したが、それ以外も「二重鎖核酸に対するヌクレアーゼ」に含まれる。
このヌクレアーゼによる分解抑制効果は、本出願時点における報告はなされておらず、かつ、上述した様に本発明の核酸結合剤を医薬用途、すなわちドラッグデリバリーシステムとしての実用化に向けて用いる場合の本質的な効果である。このヌクレアーゼ分解抑制効果が伴わなければ、他の効果、例えば熱安定性効果が認められても、医薬用途の実現することは困難である。ただし、他の用途、例えば、研究支援用途等においては、このヌクレアーゼ分解抑制効果は必須とはいえない。この点において、「核酸結合剤」と「ヌクレアーゼ分解抑制剤」を区別して規定する意義が存在する。なお、ヌクレアーゼには、ペプチド鎖内部から分解するエンドヌクレアーゼと、末端から分解するエキソヌクレアーゼの２種類があり、ＲＮaseの場合は、栄養素等の吸収を司る腸管部にエンドヌクレアーゼがより多く存在する。そのため択一的視点からすると、エンドヌクレアーゼに対する分解抑制効果を有することが、エキソヌクレアーゼに対する分解抑制効果のみを有するよりも好適であるといえる。本発明において、特にその分解活性を抑制するべきエンドヌクレアーゼとしては、例えば、上記のＲＮaseＡ、ＲＮaseIII等が挙げられる。ＲＮaseＡは、別名をＲＮase、ＲＮaseＩ、Pancreatic ＲＮase、Pancreatic Ribonuclease、又は、RibonucleaseＩともいい、２段階反応によりＲＮＡをエンド的に切断し、ピリミジンの３’−側を好み、３’−ホスホモノ又はオリゴヌクレオチドを生成することが知られている。ＲＮaseIIIは、別名をRibonucleaseIII、ＲＮaseＯ、又は、ＲＮaseＤともいい、二重鎖ＲＮＡを認識して、エンド的若しくはエキソ的に分解することが知られている。
さらに本発明の核酸結合剤は、その使用による「ＲＮaseＨの分解促進効果」に基づいた「ヌクレアーゼ分解促進剤」（以下、本発明の分解促進剤ともいう）としての態様をとることが可能である。ＲＮaseＨは、別名をCalf thymus ribonucleaseＨ、エキソリボヌクレアーゼ(Exoribonuclease)Ｈ、又は、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ハイブリッドリボヌクレオチドハイドロラーゼ(hybrid ribonucleotidohydrolase)ともいい、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖のＲＮＡをエンド的に分解し、５’−ホスホモノ又はオリゴヌクレオチドを生成し、細菌から哺乳類まで広く認められ、１つの細胞に２〜３種類のＲＮaseＨが存在することが知られている。
本発明の分解促進剤の効果は、特にキメラ型二重鎖のＤＮＡ鎖やＬＮＡ鎖（以下、ＤＮＡ鎖等、又は、ＤＮＡ等ともいう）を、標的ｍＲＮＡのアンチセンス核酸として用いる場合に、標的細胞内において速やかに当該キメラ型二重鎖のＲＮＡ鎖を分解して、アンチセンス核酸としてのＤＮＡ鎖等の働きを促進する上で非常に有利な作用である。当該ＤＮＡ鎖等は標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、当該ｍＲＮＡ／ＤＮＡ等の二重鎖のｍＲＮＡはさらに、ＲＮaseＨより分解されて、当該アンチセンスＤＮＡ等が遊離する。このようなプロセスを繰り返すことにより、標的ｍＲＮＡに基づくタンパク合成を効果的に阻害することが可能である。
上述した通りに本発明の核酸結合剤は、ＲＮaseＡ等のヌクレアーゼによる分解抑制剤としても、ＲＮaseＨに対する分解促進剤としても働く。この一見相反する働きは、本発明の核酸結合剤が影響を与えるヌクレアーゼの二重鎖核酸の結合部位の違いに基づくものである。すなわち、ＲＮaseＡは二重鎖核酸のメジャーグルーブ側の本発明の核酸結合剤が結合する部位に結合すると考えられるために、本発明の核酸結合剤の存在により働きが阻害されるが、対してＲＮaseＨは、これとは異なるマイナーグルーブ側に結合するため、むしろ、本発明の核酸結合剤がＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖を熱力学的に安定化することによって、ＲＮＡ鎖の分解が促進されるものと考えられる。
本発明は第二に、本発明の核酸結合剤が二重鎖核酸に結合して安定化された、二重鎖核酸−ペプチド複合体（本発明の核酸−ペプチド複合体ともいう）を提供する発明でもある。
本発明の核酸−ペプチド複合体の要件の説明は、実質的に本発明の核酸結合剤の説明において言及した内容に従う。例えば上記のこの本発明の核酸−ペプチド複合体において、結合の対象となる二重鎖核酸はＢ型二重鎖核酸よりもＡ型二重鎖核酸が好適であり、さらに好適にはsiＲＮＡ等の二重鎖ＲＮＡや、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖が挙げられる。また、結合の対象となる二重鎖核酸が１０〜２５量体であり、かつ、オリゴペプチド領域の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなる場合には、オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜３４であることが好適である。すなわち、（１）二重鎖核酸が１０〜２５量体であり、かつ、オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜１０である場合と、（２）二重鎖核酸が１８〜２５量体であり、かつ、オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜３４である場合が例示されること等、については上記の本発明の核酸結合剤の説明において言及した通りである。これらに加えて、二重鎖核酸が１８〜２５量体程度のＡ型二重鎖、例えば二重鎖ＲＮＡであるsiＲＮＡの場合には、当該二重鎖核酸に対して２〜３当量の本発明の核酸結合剤が結合していることが、優れたＲＮase抵抗性が付与され得るという点において好適である。特に、この様に複数当量本発明の核酸結合剤を結合させても、本来のsiＲＮＡの活性に悪影響を全く与えないという優れた特徴が、「アミノ基を伴うアミノ酸残基（Ｉ）」を構成として含む特定オリゴペプチド領域を有する本発明のオリゴペプチド等からなる核酸結合剤においても認められる。よって１８〜２５量体程度のＡ型二重鎖核酸を結合対象とする場合に、この「アミノ基を伴うアミノ酸残基（Ｉ）」の特定オリゴペプチド領域を用いる態様では、２当量以上の本発明の核酸結合剤の結合がより好適であるといえる。４〜１７量体程度のＡ型二重鎖核酸を結合対象とする場合には、１当量以上の本発明の核酸結合剤の結合も好適な範囲である。
これに対して、ＲＮaseＨによる分解促進剤として本発明の核酸結合剤をＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖に対して用いる場合には、４量体以上のキメラ型二重鎖に対して１当量以上の本発明の核酸結合剤の結合が好適である。
ＲＮaseＡ等のヌクレアーゼに対する分解抑制とＲＮaseＨの分解促進の両方の作用を１８〜３５量体のＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖に対して効果的に発揮させる場合には、キメラ型二重鎖に対して２当量以上の本発明の核酸結合剤を結合させることが好適である。４〜１７量体程度のキメラ型二重鎖を結合対象とする場合には、１当量以上の本発明の核酸結合剤の結合であっても好適である。
本発明の核酸−ペプチド複合体は、本発明の核酸結合剤、及び、二重鎖核酸を、緩衝液中において共存させて、二重鎖核酸−ペプチド複合体を形成させることにより製造することができる（以下、本発明の製造方法ともいう）。
本発明の核酸結合剤と共に緩衝液中に共存させる「二重鎖核酸」は、「アニーリング後の二重鎖核酸」である。核酸を改めて二重鎖とするためのアニーリング前の核酸と、本発明の核酸結合剤を共存させることは、核酸分子の凝集を招く可能性があるため好適とはいえない。また、用いる緩衝液は、リン酸緩衝液を用いることも可能であるが、二重鎖核酸のリン酸基との相互作用を考慮して、二価の陰イオン、特にリン酸イオンを含有しない緩衝液を用いることが、かかる凝集現象を回避するために好適である。例えば、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、カコジル酸緩衝液等が例示できる。
また、siＲＮＡやキメラ型二重鎖等の二重鎖核酸が１８〜２５量体の場合は、上記の様に当該二重鎖核酸に対して２〜３当量の本発明の核酸結合剤が当該二重鎖核酸に結合していることが、優れたＲＮase抵抗性が付与され得るという点において好適である。この状態を実現するために、当該二重鎖核酸に対して２〜５当量の本発明の核酸結合剤、及び、siＲＮＡやキメラ型二重鎖等の二重鎖核酸を、上述した緩衝液中において共存させることが好適である。本発明の核酸結合剤が２当量未満であると、形成される本発明の核酸ペプチド複合体における、本発明の核酸結合剤の当量数も２当量未満となってしまう。また、同５当量を超えても、本発明の核酸結合剤の増量に見合った所望のsiＲＮＡ−ペプチド複合体製造に対する効果は認められなくなり、かえってsiＲＮＡの活性に悪影響を及ぼす可能性がある。これに対して二重鎖核酸が４〜１７量体の場合には、上記の本発明の核酸結合剤の共存量の好適な下限は当該二重鎖核酸に対して１当量である。４〜１７量体二重鎖核酸における好適範囲の上限は当該二重鎖核酸に対して５当量である。
本発明は第三に、本発明の核酸−ペプチド複合体を含有することを特徴とする、医薬品組成物（以下、本発明の医薬品組成物ともいう）を提供する発明である。生体環境における安定性に優れ、かつ、siＲＮＡ等の機能性ＲＮＡの活性の維持がなされている本発明の核酸−ペプチド複合体や、標的ｍＲＮＡの働きを抑制するためのアンチセンスＤＮＡ等を複合化した、前記のキメラ型二重鎖を有効成分として含有する医薬品組成物を提供することにより、実質的な効果に優れる核酸医薬を提供することができる。
本発明は第四に、本発明の核酸結合剤及び二重鎖核酸を緩衝液中にて接触させ、当該剤を当該二重鎖核酸に結合させることによる二重鎖核酸−ペプチド複合体の形成により、当該二重鎖核酸を安定化させることを特徴とする、核酸の安定化方法（以下、本発明の核酸安定化方法ともいう）、並びに、同二重鎖核酸分解の抑制方法（以下、本発明の分解抑制方法ともいう）を提供する発明であり、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖におけるＲＮaseＨの働きを促進する二重鎖核酸分解の促進方法（以下、本発明の分解促進方法ともいう）を提供する発明でもある。これらの本発明の方法における諸要件については、本発明の核酸結合剤の説明、及び、本発明の核酸−ペプチド複合体とその製造方法の説明等、において言及した通りである。
本発明により、二重鎖核酸、特に二重鎖ＲＮＡ等のＡ型二重鎖核酸に結合して、その安定性を向上させることが可能な核酸結合剤が提供され、さらに当該核酸結合剤が結合してなる二重鎖核酸の安定化がなされた核酸−ペプチド複合体、当該複合体を含有する医薬品組成物、及び、当該安定化二重鎖核酸を形成させることによる核酸の安定化方法が提供される。また本発明により、二重鎖ＲＮＡ等の二重鎖核酸に結合して、そのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を付与することが可能な二重鎖核酸のヌクレアーゼ分解抑制剤、並びに、当該分解抑制剤と二重鎖核酸の複合体を形成させることによる、当該二重鎖核酸のヌクレアーゼ分解の抑制方法が提供される。さらに本発明により、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖に結合して、ＲＮaseＨの働きを促進する核酸分解促進剤、並びに、当該分解促進剤とキメラ型二重鎖に結合して複合体を形成させることによる、当該キメラ型二重鎖のヌクレアーゼ分解の促進方法が提供される。
１２量体のＲＮＡ二重鎖の構造、及び、当該ＲＮＡ二重鎖とアミノ基を有するペプチド（Ｄａｂ８）の複合体のモデルである。 実施例において設計したアミノ基を有する陽イオン性オリゴペプチド配列と構造並びにアミノ基間距離を示した図面である。 実施例において設計したグアニジノ基を有する陽イオン性オリゴペプチド配列と構造並びにグアニジノ基間距離を示した図面である。 交互配列を有するグアニジノ基を伴う陽イオン性オリゴペプチドの一つの（Ａｇｐ４）配列と構造を、グアニジノ基間距離と、その基構造と共に示した図面である。 等量の陽イオン性オリゴペプチド（各々のペプチドと二重鎖は、20℃、pH7.0、4μＭ）の存在下と非存在下における、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＣＤスペクトルである。 等量の陽イオン性オリゴペプチド（各々のペプチドと二重鎖は、20℃、pH7.0、4μＭ）の存在下と非存在下における、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＣＤスペクトルである。 ＲＮＡ二重鎖とＲＮＡ−ペプチド複合体のＣＤスペクトルにおける差スペクトルを示した図面である。 「二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−アミノ基を有するペプチド複合体」の融解温度の変化について検討した結果を示す図面である。 「二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−グアニジノ基を有するペプチド複合体」の融解温度の変化について検討した結果を示す図面である。 「二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−グアニジノ基を有するペプチド複合体」の陽イオン性オリゴペプチドの添加量を変化させた場合の融解温度の変化について検討した結果を示す図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、緩衝液の種類が核酸二重鎖と陽イオン性ペプチドの相互作用に及ぼす影響に関して検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、光学活性（Ｌ体とＤ体の差違）が核酸二重鎖と陽イオン性ペプチドの相互作用に及ぼす影響に関して検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、光学活性（Ｌ体とＤ，Ｌ体の差違）が核酸二重鎖と陽イオン性ペプチドの相互作用に及ぼす影響に関して検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、特定オリゴペプチド領域におけるアミノ酸残基数が核酸二重鎖と陽イオン性ペプチドの相互作用に及ぼす影響に関して検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、ＲＮＡ−交互配列ペプチド複合体の融解温度の変化を検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、主鎖に自由度の異なるアミノ酸を導入した場合の融解温度の変化を検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、主鎖に自由度を低くするプロリン骨格のアミノ酸を導入した場合の融解温度の変化を検討した図面である。 グアニジノ基を伴うオリゴペプチドにおいて、オリゴペプチドの蛍光基修飾が核酸二重鎖の融解温度に及ぼす影響に関して検討した結果を示す図面である。 ＩＴＣによるＲＮＡ（左）、ＤＮＡ（右）に対するＤａｂ８の滴定結果を示す図面である。 ＩＴＣによるＲＮＡ（左）、ＤＮＡ（右）に対するＡｇｐ８の滴定結果を示す図面である。 ＩＴＣによるＲＮＡ（左）、ＤＮＡ（右）に対するＡｇｂ８の滴定結果を示す図面である。 ネオマイシン存在下でのＩＴＣによるＲＮＡに対するＤａｂ８（左）、Ａｇｐ８（右）、Ａｇｂ８（左下）の滴定結果を示す図面である。 ＲＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチド（左：Ｄａｐ８、右：Ｄａｂ８）を添加したことによる蛍光異方性変化およびフィッティング曲線である。 ＲＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチド（左：Ｏｒｎ８、右：Ｌｙｓ８）を添加したことによる蛍光異方性変化およびフィッティング曲線である。 ＲＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチド（左：Ａｇｐ８、右：Ａｇｂ８）を添加したことによる蛍光異方性変化およびフィッティング曲線である。 ＲＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチド（左：Ａｒｇ８、右：Ａｇｂ８Ｇ３）を添加したことによる蛍光異方性変化およびフィッティング曲線である。 ＲＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチド（左：ＡｇｐＶ、右：ネオマイシン）を添加したことによる蛍光異方性変化およびフィッティング曲線である。 ＲＮＡ二重鎖に対する陽イオン性ペプチドの解離定数及び融解温度変化の関係を一覧した図面である。 実施例２−４で用いた陽イオン性ペプチドの一覧である。 ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の融解温度を、当該鎖の濃度を変えて検討した結果を示す図面であり、右図は左図の拡大図である。 ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖についてのＣＤスペクトルの測定結果を、アミノ基を伴う陽イオン性ペプチド（左）と、グアニジノ基を伴う陽イオン性ペプチドにおいて検討した結果を示す図面である。 アミノ基を伴うオリゴペプチド（１）、及び、グアニジノ基を伴うオリゴペプチド（２）、においてペプチド−ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における融解温度の変化を検討した図面である。 陽イオン性ペプチドと３種の核酸二重鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ）の蛍光異方性測定による結合定数を比較した結果を示す図面である。 陽イオン性ペプチドのペプチド長を変化させ、ペプチド−ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍ測定を行った結果を示す図面である。 siＲＮＡの二重鎖と１分子のＡｇｐ８の複合体（左）と同３分子の複合体（右）のモデルである。 ｓｉＲＮＡ−Ｄａｂ８複合体の融解温度の変化を示したグラフである。 ｓｉＲＮＡ−Ａｇｐ８複合体の融解温度の変化を示したグラフである。 ＲＮaseＡで処理したＲＮＡ及びＲＮＡ−ペプチド複合体を電気泳動により展開した結果を示す図面である。 siＲＮＡに対して、陽イオン性オリゴペプチド１当量での複合体のＲＮＡｉ活性を検討した図面である。 ｈＡｐｏＢに働くsiＲＮＡに対して、陽イオン性オリゴペプチド１当量、３当量、及び、５当量での複合体のＲＮＡｉ活性を検討した結果を表す図面である。 １μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対するＤａｂ８の結合の有無によるＲＮaseＡ耐性に与える影響を考察した結果を示す図面であり、左がＲＮaseＡを０．５μｇ／ｍｌ共存させた場合の結果を、右が０．１μｇ／ｍｌ共存させた場合の結果を示している。 ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対する陽イオン性ペプチドの結合の有無によるＲＮaseＨ活性に与える影響を考察した結果を示す図面である。
１．本発明の核酸結合剤
上述の様に本発明の核酸結合剤の本質的成分は、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含む２〜４０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド領域（特定オリゴペプチド領域）であって、かつ、当該下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続部分以外は、連続しない１個のアミノ酸残基であるオリゴペプチド領域、を含むオリゴペプチド又は当該オリゴペプチド誘導体（本発明のオリゴペプチド等）である。
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−、又は、式（II）で示される基である。Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１〜３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１〜４のアルキレン基である。一つのオリゴペプチド領域においてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
以下、式（Ｉ）のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドをＡｎ（ｎはアミノ酸残基Ａの結合数を示す正の整数である）と略記しつつ、特定オリゴペプチド領域の具体的な態様を例示列挙する。
（１）Ａｎ（ｎは２〜４０）
すなわち特定オリゴペプチド領域全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基である態様である。
（２）［Ａｍ−Ｘ］ｐ（ｍは２又は３以上の数であり、ｐは［Ａｍ−Ｘ］単位の繰り返し数を表し、当該繰り返し単位の中でＸは同一でも異なってもよい式（Ｉ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である）
すなわち式（Ｉ）のアミノ酸残基が２個、又は２個を超える数連なる単位の間に、他のアミノ酸残基を挟む態様である。この他のアミノ酸残基は特定オリゴペプチド領域の自由度（フレキシビリティー）を増す、場合によっては減ずる等の目的で挿入することができる。この態様（２）の具体例として例えば、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（２）−１：Ａ２−Ｘ−Ａ２−Ｘ−Ａ２−・・・（Ｘは同一でも異なってもよい式（Ｉ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である）、
（２）−２：Ａ３−Ｘ−Ａ２−Ｘ−Ａ３・・・（Ｘは同一でも異なってもよい式（Ｉ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である）
上記の「他のアミノ酸残基」は特に限定されず、オリゴペプチドに与えることを企図する自由度に応じて適宜選択することができる。自由度の大きなアミノ酸残基としてグリシンが挙げられるが、それ以外にオリゴペプチドの自由度に影響を与えるアミノ酸残基としては、例えばＬ−アラニン、Ｌ−プロリンの他、プロリン骨格を有するアミノ酸として、Ｌ−アミノプロリン、Ｌ−グアニジノプロリン等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
上述した様に、結合の対象となる二重鎖核酸はＢ型二重鎖核酸よりもＡ型二重鎖核酸が好適である。生理的条件下でＢ型二重鎖核酸であるものとして二重鎖ＤＮＡが挙げられる。同じく、生理的条件下でＡ型二重鎖核酸であるものとして二重鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等キメラ型二重鎖が挙げられる。また、これらのいわば天然型の核酸以外に、ヌクレアーゼ耐性の向上等を目的として化学修飾を加えたＤＮＡやＲＮＡを用いたＡ型二重鎖核酸を用いることもできる。このような化学修飾を伴う核酸を、本発明に係わるキメラ型二重鎖を構成する核酸として適宜用いることができる。
これらの核酸の化学修飾の態様としては、塩基部位の修飾態様として、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’−Ｏ−メチル化、２’−ＭＯＥ化、２’−ＡＰ化、２’−フルオロ化が挙げられる。例えば体内動態を重視すれば、２’−Ｏ−メチル化、又は、ホスホロチオエート化が好ましい。例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡは標的遺伝子のサイレンシング能を維持しつつ、オフターゲット効果を抑制することが知られている。さらに、これらの化学修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施すことも可能である。
また、連続４塩基以上のＤＮＡ領域を含む「一方の核酸」を構成し得る核酸として、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化核酸、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）化核酸、２’−ＡＰ（２’−Ｏ−アミノプロピル）化核酸、２’−フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が挙げられる。特にこれらの中でＢＮＡとしては、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’−ＢＮＡ）とも称される、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）又はβ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ３）−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡが挙げられ、これらの中でも特にＬＮＡが好適である。
リン酸部修飾による生体内での安定性の向上や、疎水性の増加による細胞膜透過性の向上が知られているが、代表的なリン酸部修飾ＲＮＡは、ホスホロチオエートＲＮＡ（ＰＳ−ＲＮＡ）や、ボラノホスフェートＲＮＡ（ＰＢ−ＲＮＡ）が挙げられる。
また、上記の「一方の核酸」に対して相補的な「他方の核酸」には機能性分子が結合していてもよい。この結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、共有結合、イオン結合、水素結合等で直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。当該「機能性分子」としては特に制限はなく、標識化合物（蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等）、精製用化合物（ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等）が挙げられる。
上記の「一方の核酸」を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制し得る点から、上記機能性分子は、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。
「二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子」として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的に本発明の二重鎖核酸を送達できるという点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができる。例えば、安全性を重視すれば、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）が好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の二重鎖核酸を送達できるという点からは、糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的に本発明の二重鎖核酸を送達できるという点から、受容体のリガンドや抗体等のペプチドやタンパク質も「機能性分子」として挙げられる。
後述する実施例では「二重鎖のＲＮＡ」と「ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖」が用いられている。
本発明の結合剤の結合安定化対象としての「二重鎖のＲＮＡ」は、「元来二重鎖ＲＮＡであるもの」、「元来は一重鎖ＲＮＡであるものを二重鎖に改変したＲＮＡ」双方を挙げることができる。また、部分的に二重鎖になっている構造、例えば、ヘアピン型構造、ステムαループ構造、ダンベル型構造を有するＲＮＡも、本発明の結合剤の結合安定化対象となり得る。本発明を適用可能な比較的低分子のＲＮＡを列挙すれば、siＲＮＡ、miＲＮＡ、piＲＮＡ、rasiＲＮＡ、smＲＮＡ、tncＲＮＡ、tncＲＮＡ、テロメラーゼＲＮＡ、スプライセオソームsnＲＮＡ、U7snＲＮＡ、C/DＲＮＡ、7SKＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの中で現実的な医薬用途（ＲＮＡｉ医薬）に用い得るものとしてsiＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ：small interfering RNA）が挙げられる。siＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、まず、外来二重鎖ＲＮＡ (dsＲＮＡ) がＤｉｃｅｒにより切断され、２１〜２３塩基対のsiＲＮＡが形成される。このsiＲＮＡがＡＴＰを消費してＡｇｏ２、Ｄｉｃｅ、ＴＲＢＰなどの蛋白質と結合し、ＲＬＣ(RISC loading complex) と呼ばれる複合体を形成する。その後、パッセンジャー鎖 (又はセンス鎖) がエンドヌクレアーゼにより分解、解離し、標的のｍＲＮＡに相補的なガイド鎖 (又はアンチセンス鎖) のみが残るＲＩＳＣと呼ばれる複合体が形成される。ＲＩＳＣはガイド鎖と相補的なｍＲＮＡに結合と分解を繰り返すことで、標的遺伝子の発現を抑制する。
ＲＮＡｉ医薬では、このＤｉｃｅｒにより切断されたsiＲＮＡまたは切断される前駆体を細胞内に導入することで、標的ｍＲＮＡのガイド鎖を保有するＲＩＳＣを形成し、ｍＲＮＡを分解することを主要な目的とする。このようなＲＮＡｉ医薬は、標的に結合するだけでなく、生体内の機構により標的分子を分解するため、特に有効な核酸医薬として期待されている。本発明は、このＲＮＡｉ医薬の主役と位置付けられるsiＲＮＡの生体内での安定性を増加させることにより、この核酸医薬の実用化への途を開くものである。
本発明の結合剤の結合安定化対象としての「ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖」は、核酸医薬として用いることができるものである。これは例えば、ＲＮＡと複合化されたＤＮＡが特定のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸として働くことを目的とするものである。すなわち、ＤＮＡと複合化させるＲＮＡの塩基配列を、その働きを抑制する標的ｍＲＮＡの配列の全部又は一部としたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖、を核酸医薬として用いることができる。この核酸医薬としてのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖は、細胞内においてＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖を二重鎖として認識して、そのＲＮＡ鎖を選択的に分解するＲＮaseＨの働きにより、標的ｍＲＮＡに対して相補的な配列を有する一重鎖ＤＮＡ等となり、当該一重鎖ＤＮＡ等が細胞内の標的ｍＲＮＡと結合してこれに基づくタンパク合成を抑制し、かつ、上記ＲＮaseＨの働きによって標的ｍＲＮＡは分解される。このプロセスが細胞内で繰り返し行われることにより、標的ｍＲＮＡの働きを極めて効果的に抑制することが可能となる。
キメラ型二重鎖のうち、最も基本的なＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は総合的にヌクレアーゼに対して優れた耐性を伴うことが知られている（例えば、特許文献１）が、その反面で、後述する実施例で示す通りに熱変性温度が二重鎖ＲＮＡと比べても低くなっており、例えば人体に投与されて低濃度になった場合に、その体温によりＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が一部変性し一重鎖ＲＮＡが露出して、当該一重鎖ＲＮＡやＤＮＡが、細胞内に到達する前に生体内のＲＮaseＡやＤＮase等により分解されてしまい、所望の働きをすることが阻害されてしまうことが想定される。
これも実施例に示す様に、陽イオン性ペプチドを結合させたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖では熱安定性を向上させることが可能であり、その結果、人体におけるヌクアーゼ安定性もまた向上させることが可能である。その反面、少なくとも細胞内におけるＲＮaseＨ、の働きを決定的に阻害しないことが必要であり、好ましくは当該ＲＮaseＨの働きを少なくとも阻害せず、更に好ましくは当該ＲＮaseＨの働きの促進が認められることである。
驚くべきことに、本発明の結合剤においては上述したＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖の安定化作用と共に、ＲＮaseＨの働きを促進する作用が認められ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖の核酸医薬としての実用化の途を開くものである。
本発明のオリゴペプチド等における、特定オリゴペプチド誘導体以外の部分は必要に応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されない。例えば、必要に応じて保護基やフルオレセイン等の蛍光基等のシグナル源が結合されているアミノ酸誘導体残基を用いることも可能である。いわゆるデリバリー分子を本発明のオリゴペプチド等に結合させることが可能である。デリバリー分子としては、本発明のオリゴペプチド等を細胞内に導入し得るシグナルペプチド等の分子、標的選択性を有する分子等を挙げることができる。
例えば、脂質をデリバリー分子として用いることで、肝臓等に対して選択的に本発明のオリゴペプチド等を体内導入することができる。当該脂質としては、例えばコレステロール；ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類等）、ビタミンＡ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン；アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物；糖脂質；グリセリド等の脂質、並びに、これらの脂質の誘導体が挙げられる。これらの中でコレステロール又はビタミンＥ類は、安全性等の観点から一般的な好適例として挙げられる。さらに、グルコースやスクロース等の糖をデリバリー分子として用いることで、脳に対して選択的に本発明のオリゴペプチドを導入することが可能となる。また、各臓器の細胞表面にある各種の蛋白質や受容体に本発明のオリゴペプチドを結合させることも選択的な導入手段として認められるため、これらの細胞表面蛋白等に特異的な抗体やリガンドをデリバリー分子として用いることも可能である。
後述する実施例では、本発明のオリゴペプチド等は、Ｎ末端やＣ末端に上記のデリバリー分子を結合させることが想定されるため、Ｎ末端をアセチル基、Ｃ末端をアミド基で保護したものを用いている。また、濃度測定のためＵＶ吸収をもつＬ−チロシンを、グリシンを２残基介して導入している。
本発明のオリゴペプチド等は、公知のペプチドの化学合成法に従い製造することが可能である。すなわち、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法も、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能であり、必要に応じてライゲーション法を用いることも可能である。後述する実施例では、現時点で最も一般的に行われているＦｍｏｃ固相法を用いて必要なオリゴペプチド等の合成を行った。また、オリゴペプチド等を構成する個々のアミノ酸は、公知の方法により製造可能であり、市販品を用いることも可能である。
合成したオリゴペプチド等は常法に従い、脱保護等の工程後に、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）等の常法により精製することが可能である。そして、質量分析法（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight:ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、又は、liquid chromatography-electro spray ionization：ＬＣ−ＥＳＩ）により目的のオリゴペプチドの同定を行うことが可能である。最終的にはオリゴペプチドを加水分解して、アミノ酸組成と含有量の確認を行うことができる。また、本発明に重要な意義を有する特定オリゴペプチド領域において隣り合うアミノ基やグアニジノ基間の距離は、分子力学・分子動力学計算による分子モデリング等によって確認することが可能である。なお当該アミノ基間やグアニジノ基間の距離のうちアミノ基間の距離とは、例えば図２のアミノ基を伴う各特定オリゴペプチド領域を構成する２単位の式（Ｉ）のアミノ酸残基の組における２つのプラスチャージを伴う窒素原子間の距離を意味する。また、グアニジノ基間の距離とは、例えば図３のグアニジノ基を伴う各特定オリゴペプチド領域を構成する２単位の式（Ｉ）のアミノ酸残基の組における２つのグアニジノ基の窒素原子間の平均距離のことを意味する。図２及び図３では、特定オリゴペプチド領域を構成する最小単位の２アミノ酸残基がペプチド結合を介して連なっている状態を基にして、本発明の核酸結合剤の本質成分の化学式の例示を行っている。
以上の本発明のオリゴペプチド等を本質成分し、かつ、二重鎖核酸への結合を用途とする剤が、本発明の核酸結合剤である。
本発明の核酸結合剤は、「二重鎖核酸のヌクレアーゼ分解抑制剤」、又は、ＲＮaseＨによる「ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖の分解促進剤」としての態様をとり得ることは上述した通りである。
２．本発明の核酸−ペプチド複合体等
本発明の核酸−ペプチド複合体は、前述の本発明の核酸結合剤が二重鎖核酸に結合して安定化された、二重鎖核酸−ペプチド複合体である。
前述の様に本発明の核酸結合剤と結合させる二重鎖核酸は、（１）式（Ｉ）のアミノ酸残基のＲ１が「基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−」である場合（アミノ基を伴うアミノ酸残基である場合）は、Ａ型二重鎖核酸である。
（２）式（Ｉ）のアミノ酸残基のＲ１が「式（II）の基」である場合（式（Ｉ）のアミノ酸残基が「グアニジノ基を伴うアミノ酸残基」であることを基本とするものである場合）は、Ａ型二重鎖核酸と共に、Ｂ型二重鎖核酸も対象となり得る。ただし、当該二重鎖核酸がＡ型である場合とＢ型である場合とは、好適なアルキレン基Ｒ２の炭素原子数がそれぞれ異なっており、通常はＡ型二重鎖核酸が対象となる。
本発明の核酸結合剤と結合させる二重鎖核酸の好適な具体例については、上の「本発明の結合剤」の欄において既に記載した通りである。なお、二重鎖核酸の主溝とは、二重鎖核酸の二重らせん構造のらせん内部において形成される幅広い方の溝構造であり、幅狭い方の溝構造を意味する副溝に対する用語である。主溝と副溝には、二重らせんを構成するヌクレオチドのリン酸基が規則正しく並んでいる。この主溝の負電荷を伴うリン酸基と、正電荷を伴うオリゴペプチド領域のアミノ基やグアニジノ基が非共有結合をなすことにより、本発明の核酸−ペプチド複合体が形成される。この二重らせんの溝構造は、Ａ型二重らせんとＢ型二重らせんにおいて異なっていることは前述した通りである。本発明の核酸−ペプチド複合体は、ペプチドが融合していない二重鎖核酸と比較して熱変性しにくく、二重鎖核酸に対する一般的なヌクレアーゼに対する抵抗性も認められ、実質的に本来の二重鎖核酸の働きは損なわれない。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖に本発明の結合剤を結合させた場合に、ＲＮaseＨの働きを実質的に阻害せずに、むしろ促進する性質も認められることは上述した通りである。
上述した様に本発明の核酸−ペプチド複合体は、本発明の核酸結合剤、及び、二重鎖核酸を、緩衝液中において共存させて、二重鎖核酸−ペプチド複合体を形成させることにより製造することができる（本発明の製造方法）。さらに本発明の核酸結合剤と共に緩衝液中に共存させる「二重鎖核酸」は、「アニーリング後の二重鎖核酸」である。核酸を改めて二重鎖とするためのアニーリング前の核酸と、本発明の核酸結合剤を共存させることは、ＲＮＡ分子の凝集を招く可能性があるため好適とはいえない。また、用いる緩衝液はリン酸緩衝液を用いることも可能であるが、二重鎖核酸のリン酸基との相互作用を考慮して、二価の陰イオン、特にリン酸イオンを含有しない緩衝液を用いることが、かかる凝集現象を回避するために好適である。例えば、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、カコジル酸緩衝液等が例示できる。反応温度は０〜５０℃、好適には１０〜４０℃であり、溶媒のｐＨは５〜９、好適には６〜８である。また、当該溶媒系における二重鎖核酸と本発明の核酸結合剤の当量比や核酸結合剤の本質成分であるオリゴヌクレオチド等、特に特定オリゴヌクレオチド領域の大きさは、どのような結合状態の本発明の核酸−ペプチド複合体を調製するかによっても異なる。一般的に結合の対象となる二重鎖核酸の鎖が長く塩基数が多いほど、それに伴うリン酸基の数も多くなり、これらに結合することが可能な特定オリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基数は大小の多様性を伴う。すなわち二重鎖核酸の鎖が長くリン酸基の数が増加すれば、これに結合する特定オリゴペプチド領域として、「短いものが多数個の場合」、「長いものが少数個の場合」、さらにこれらの組み合わせが考えられることになり、理論上そのバリエーションは、二重鎖核酸の長さが増すに従い相乗的に増加することになる。すなわち、二重鎖核酸の長さが比較的短い場合（本実施例の前半で用いたモデル二重鎖ＲＮＡの様に１２mer近傍のもの）は、二重鎖１分子に対して本発明の結合剤（陽イオン性オリゴペプチド）は１当量であり、せいぜい１〜２当量程度の本発明の結合剤を共存させることで、所望の核酸−ペプチド複合体を調製することができる。しかしながら二重鎖核酸のサイズが大きくなれば、当該二重鎖核酸における結合サイト（リン酸基）の数も多くなり、二重鎖核酸一分子が要求し得る「同一のアミノ酸基数の特定オリゴペプチド領域（典型的には８〜１２mer程度）を有する」本発明のオリゴペプチド等が本質成分である本発明の結合剤、の当量は増加する。また、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数の多様性も相乗的に生じてくる。
前述した様に二重鎖核酸の塩基数１０〜２５量体の範囲で類型化すると、（１）二重鎖核酸が１０〜２５量体であり、かつ、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜１０である場合と、（２）二重鎖核酸が１８〜２５量体であり、かつ、特定オリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜３４である場合、に大別される。
そして１８〜２５量体となり得る二重鎖核酸を例示すれば、Ａ型二重鎖の代表的態様としてsiＲＮＡ、二重鎖形態として改変されたmicroＲＮＡ（miＲＮＡ）、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖等のキメラ型二重鎖等が挙げられる。
これらの２種類の態様のうち（１）の、アミノ酸残基数が８〜１０という小分子のオリゴペプチド領域のみが二重鎖核酸の塩基数（リン酸基数）に応じた結合をする態様において述べれば、例えば、ＲＮＡｉ医薬において有望な小分子ＲＮＡの一つであるsiＲＮＡやキメラ型二重鎖核酸では、本発明の結合剤は１当量から３当量の割合で結合させることができる。ただし、特に二重鎖核酸の塩基数が１８〜２５量体以上の場合（上記態様（２））においては、本発明の結合剤の１当量の結合は、出来上がった核酸−ペプチド複合体が二重鎖核酸に対する一般的なヌクレアーゼ（ＲＮaseＨを除く）への十分な抵抗性を伴わない傾向が認められるので、２〜３当量の結合であることが好適である。特に、この様に複数当量本発明の核酸結合剤を結合させても、本来のsiＲＮＡやＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖の活性に実質的な悪影響を与えないという優れた特徴が認められる。これは、「アミノ基を伴うアミノ酸残基（Ｉ）」を構成として含む特定オリゴペプチド領域を含むオリゴペプチド等を本質成分とする核酸結合剤において特に優れている。よって１８〜２５量体程度のＡ型二重鎖核酸を結合対象とする場合に、２当量以上、特に好適には３当量以上の本発明の核酸結合剤の結合が好適であり、特に、この「アミノ基を伴うアミノ酸残基（Ｉ）」の特定オリゴペプチド領域を用いる態様が好適である。
この状態を実現するために、１８〜２５量体の二重鎖核酸に対して２〜５当量、好適には３〜４当量の本発明の核酸結合剤、特に好ましくはアミノ基タイプの核酸結合剤、及び、当該二重鎖核酸を、上述した緩衝液中において共存させることが好ましい。本発明の核酸結合剤が２当量未満であると、形成される本発明の核酸ペプチド複合体における、本発明の核酸結合剤の当量数も２当量未満となってしまう。また、同５当量を超えても、本発明の核酸結合剤の増量に見合った所望の−ペプチド複合体製造に対する効果は認められなくなり、かえって本来の核酸の活性に悪影響を及ぼす可能性がある。
この様にして本発明の核酸−ペプチド複合体が製造（生産）され、当該複合体は例えばＲＮＡｉ医薬、遺伝子機能解析等を行うための研究試薬、アンチセンス医薬、二重鎖ＲＮＡからなる核酸アジュバント等として用いることができる。
この本発明の核酸−ペプチド複合体に関連して、本発明の核酸結合剤及び二重鎖核酸を接触させ、当該剤を当該二重鎖核酸に結合させることによる本発明の核酸−ペプチド複合体の形成により、二重鎖核酸を安定化させることを特徴とする、核酸の安定化方法の提供がなされる。また、本発明の核酸結合剤の別態様である、本発明の分解抑制剤及び二重鎖核酸を接触させ、当該剤を当該二重鎖核酸に結合させることによる本発明の核酸−ペプチド融合体の形成により、二重鎖核酸に対する一般的なヌクレアーゼ（ＲＮaseＨを除く）による分解が抑制される、本発明の分解抑制方法が提供される。また、本発明の分解促進剤及びＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖を接触させ、当該剤を当該キメラ型二重鎖に結合させることによる核酸−ペプチド融合体の形成により、ＲＮaseＨの働きを促進する、二重鎖分解の促進方法が提供される。
３．本発明の医薬組成物
上述の様に本発明の医薬組成物は、「本発明の核酸−ペプチド複合体を含有することを特徴とする、医薬品組成物」である。
上述した様に本発明の核酸−ペプチド複合体は、「医薬組成物」の有効成分として人体に投与される。当該核酸−ペプチド複合体の直接投与の場合も、注射剤等を用時混合することになるので、これも医薬組成物に含められる。
本発明の医薬組成物は、有効成分である本発明の核酸−ペプチド複合体と共に適切な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。当該製剤担体としては、使用形態に応じた担体を選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤ないし希釈剤を使用することができる。組成物の形態は、本発明の核酸−ペプチド複合体を効果的に含有可能な形態であれば特に限定されるものではなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤や軟膏剤であってもよいが、通常は、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適である。また、本発明の核酸−ペプチド複合体を適切な担体の添加によって使用時に液状となし得る乾燥品とすることも可能である。さらに本発明の医薬品組成物において、シクロデキストリン含有ポリマーで構成されたナノ粒子、高分子ミセル、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、多機能エンベローブ型ナノ構造体（ＭＥＮＤ）等のドラッグデリバリーシステム活用して、本発明の核酸−ペプチド複合体の有効成分としての効果をより向上させることが可能である。
得られた医薬品組成物は、その形態に応じた適切な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬品組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬品組成物は、経口ないし経腸にて投与される。医薬品組成物中の本発明の核酸−ペプチド複合体の量は、当該組成物の投与方法、投与形態、使用目的、患者の症状等に応じて適宜選択され一定ではないが、通常、本発明の核酸−ペプチド複合体を、０．１〜９５質量％程度含有する組成物形態に調製して、上述した投与量（1日成人1人当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度であり、一日１回ないし２〜５回、さらに数日おきに行うことも可能である）、にて投与を行うことが好ましい。
この様に生体環境における安定性に優れ、かつ、siＲＮＡ等の機能性ＲＮＡの活性の維持がなされている本発明の核酸−ペプチド複合体や、複合化されたＤＮＡが、標的ｍＲＮＡのアンチセンス核酸の機能に着目して用いられるＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等のキメラ型二重鎖−ペプチド複合体を有効成分として含有する医薬品組成物を提供することにより、siＲＮＡや当該キメラ型二重鎖等が司る実質的な効果に優れる核酸医薬を提供することができる。siＲＮＡやＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖等キメラ型二重鎖の核酸医薬としての用途は、がんや各種疾患の治療薬や、ＨＩＶやＨＣＶの抗ウイルス薬として用いることが可能である。例を挙げれば、ＦＡＫ遺伝子を標的遺伝子とした腎細胞がん治療薬、ＶＥＧＦ遺伝子をターゲット遺伝子とした加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）と糖尿病による黄斑浮腫の治療薬、ＶＥＧＦＲ１遺伝子やＲＴＰ８０１遺伝子をターゲット遺伝子とした加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）治療薬、プロテインキナーゼＮβをターゲットとした膵臓がん治療薬、ＶＥＧＦ遺伝子とキネシン紡錘体蛋白質をターゲットとした肝がん治療薬、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２サブユニットをターゲットとした肝がん治療薬、ＨＢＶゲノムをターゲットとしたＢ型肝炎治療薬、ＨＣＶゲノムをターゲットとしたＣ型肝炎治療薬、ＲＳＶゲノムをターゲットとしたＲＳＶ治療薬、インフルエンザウイルスゲノムをターゲットとしたインフルエンザ治療薬、Ｔｈ２サイトカインをターゲットとした喘息治療薬、ＰＣＳＫ９遺伝子をターゲットとした高コレステロール血症治療薬、ＨＩＶ−１ゲノムをターゲットにしたＡＩＤＳ治療薬、heir growth geneをターゲットとした脱毛治療薬、Huntingtin又はα-synucleinをターゲットとしたパーキンソン病治療薬、スーパーオキシドムスターゼをターゲットとした筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）治療薬、ＴＮＦ−αをターゲットとする炎症性疾患治療薬、等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の人体へ上述した態様の投与を行うことにより、有効成分としての本発明の核酸−ペプチド複合体の働きにより、上記例示の疾患の治療を行うことが可能となる。特に本発明の医薬組成物においては、本発明の核酸−ペプチド複合体におけるＲＮaseＡやＲＮaseIII等のヌクレアーゼに対する優れた安定性に伴い、経口投与が可能となる。
以下、本発明の実施例を開示する。
◇ 実施例において用いた試薬、機械、装置
実施例の開示に先立ち、ここで用いた試薬、機械、装置について述べる。
Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体、Ｂｏｃアミノ酸誘導体は渡辺化学工業株式会社より購入し、そのまま用いた。Ｆｍｏｃ−Ａｍｐ−ＯＨは既存の手法に従ってＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）から合成し、ＮＭＲにて確認したものを用いた。ペプチド固相合成担体としての樹脂は、Nova biochem社又は渡辺化学工業株式会社より購入したものを用いた。他の試薬は、アミノ酸を含め、市販のものを精製せずに用いた。
各ペプチド鎖の手動合成にはポリプロピレン製エンプティーカラム(Pharmacia Biothech)を用いた。手動合成で攪拌、反応温度調節には、Ｐｅｔｉ−ｓｙｚｅｒ(ハイペップ研究所)を用いた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）には、ポンプ：ＰＵ・２０８０ｉ ｐｌｕｓ(日本分光)、検出器：ＵＶ・２０７５ｉ ｐｌｕｓ(日本分光)、低圧グラジェントユニット：ＬＧ−２０８０−０２(日本分光)、デガッサ：ＤＧ・２０８０・５３(日本分光)、逆相カラム：μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ，Ｃ１８，５μｍ，１００Ａ（ｗａｔｅｒｓ）を用いた。溶出溶媒としては、Ａ液：０．０５％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ液：０．０５％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮの混合溶媒を用い、３０分間でＡ液とＢ液の直線勾配により溶出した。検出波長は２８０ｎｍとした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ４３２７(Applied Biosystem)を用いて行い、ジヒドロキシベンゾイックアシッド(DHB)をマトリックスとして用いた。
ＣＤスペクトルは、分光偏光計：Ｊ−７２５(日本分光)、光源：ＰＳ−４５０Ｊ(日本分光)、温度制御装置：ＰＴＣ−３４８ＷＩ(日本分光) を用いて測定した。また、Ｔｍ測定はＵＶ−１６５０ＰＣ(SIMADZU) を用いて測定した。蛍光異方性は、蛍光光度計：ＦＰ６５００(日本分光)、温度制御装置：ＥＴＣ−２７３Ｔ(日本分光)、偏光板：ＦＤＰ−２４３(日本分光) を用いて測定した。
［実施例１］ ペプチド合成
１−１ アミノ基を有するペプチドの設計
まず初めに、陽イオン性官能基としてアミノ基を選択した。アミノ基は生理条件下でプロトン化され、陽イオン性となり、ＲＮＡ結合蛋白質やＲＮＡ結合性のアミノグリコシドなどの様に、ＲＮＡ結合分子中によくみられる官能基である。先行研究で、ＩｗａｔａらはＲＮＡ二重鎖に選択的に結合するオリゴジアミノグルコースの獲得にも成功しており、アミノ基はＲＮＡ二重鎖との結合に有効な官能基と考えられる。
ここでは図１に示す様に核酸二重鎖の主溝に位置する向かい合ったリン酸基に効率的に相互作用可能な、種々のアミノ基を有するペプチドを設計し、核酸二重鎖との相互作用を比較検討した。ここで、Ｂ型二重らせん構造をとるＤＮＡとＡ型二重らせん構造をとるＲＮＡにおいて、高次構造の違いから、主溝上のリン酸基間の距離が大きく異なるため、リン酸基間距離の差を認識することで、ＲＮＡ二重鎖選択的に結合する分子の獲得が期待される。そこで、陽イオン性オリゴヌクレオチドにおけるアミノ基間距離を制御することで、ＲＮＡ二重鎖に効率的に結合するペプチドの獲得を目指した。ペプチド上のアミノ基間距離を制御するため、側鎖長の異なるアミノ酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｌ−２，４−ジアミノブチル酸（Ｄａｂ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）を用いて設計した。
ここではまず二重鎖ＲＮＡ１２量体を用いて陽イオン性オリゴペプチドとの相互作用を解析することとした。今回用いる二重鎖ＲＮＡ１２量体「ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２」（配列番号１）、二重鎖ＤＮＡ１２量体「ｄ（ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）２」（配列番号２）は自己相補的配列で調製が簡便であり、また、融解温度も高く室温近傍で十分に二重鎖を形成する配列であるため、モデルとして選択した。Ａ型二重らせん構造を有するＲＮＡ１２量体には４組、８個の向かい合うリン酸が存在する（図１）。この規則的に配列した４組の向かい合ったリン酸を標的とするため、ペプチドは＋８の電荷をもつ様にＤａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８の８量体及び、濃度測定のためＵＶ吸収をもつチロシン（Ｔｙｒ）を、グリシン（Ｇｌｙ）を二残基介して導入した１１量体のペプチドを設計した（下記）。また、Ｄａｂ８のアミノ酸のキラリティの影響を検討するためＤ体のアミノ酸ｄａｂを用いたｄａｂ８を合わせて設計した（下記）。図２には、βシート構造におけるペプチド（１）〜（４）のＮ−Ｎ間距離を、配列と構造と共に示している。
（１）Ｄａｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｐ８−ＮＨ２
（２）Ｄａｂ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ８−ＮＨ２
（３）Ｏｒｎ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｏｒｎ８−ＮＨ２
（４）Ｌｙｓ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｌｙｓ８−ＮＨ２
（２’）ｄａｂ８：Ａｃ−ＹＧＧ−ｄａｂ８−ＮＨ２
１−２ グアニジノ基を有するペプチドの設計
次に、陽イオン性官能基としてグアニジノ基を選択した。グアニジノ基はアミノ基同様、生理条件下で陽イオン性を示し、ＲＮＡ結合蛋白質によくみられる官能基である。グアニジノ基を有するペプチドの合成は、アミノ基を有するペプチドを固相合成した後に、Ｓｃｈｅｍｅ １の方法に従い、グアニジノ基に変換することで行った。
アミノ基を有するペプチドの場合と同様に、グアニジノ基を有するペプチドでも、側鎖長の異なるアミノ酸、Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ）、Ｌ−２−アミノ−４−グアニジノブチル酸（Ａｇｂ）、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）のオリゴマーを設計した（下記）。ペプチドは＋８の電荷をもつ様にＡｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８の８量体及び、濃度測定のためＵＶ吸収をもつＴｙｒをＧｌｙ二残基介して導入した１１量体のペプチドを設計した。また、Ｄａｂ８と同様に、Ａｇｐ８のアミノ酸のキラリティの影響を検討するためＤ体のアミノ酸ａｇｐを用いたａｇｐ８を合わせて設計した。図３には、βシート構造におけるペプチド（５）〜（７）のＮ−Ｎ間距離を、配列と構造と共に示している。
（５）Ａｇｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ８−ＮＨ２
（６）Ａｇｂ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｂ８−ＮＨ２
（７）Ａｒｇ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｒｇ８−ＮＨ２
（８）ａｇｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−ａｇｐ８−ＮＨ２
１−３ 交互配列を有するペプチドの設計
次に、官能基の配置や種類の影響を検討するため、二種類のアミノ酸が交互に配列したペプチドを設計した（下記及び図４）。まず、キラリティの影響を検討するため、Ｄ体とＬ体のアミノ酸を交互に配列したＤ，Ｌ−Ａｇｐ８を設計した。さらに、他の官能基の効果を検討するため、グアニジノ基を有するアミノ酸と他のアミノ酸の交互配列を設計した。グアニジノ基を有するアミノ酸としては、グアニジノ基の間隔が広くなりすぎることを懸念し、最も側鎖長の短いＡｇｐを用いた。このＡｇｐと自由度の高いＧｌｙ、疎水性の異なるＬ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）、ＲＮＡ結合蛋白質中でリン酸と水素結合を形成することが知られているＬ−セリン（Ｓｅｒ），Ｌ−アスパラギン（Ａｓｐ）の交互配列を設計した。主溝の４組のリン酸基との相互作用を想定しているため、ペプチド側も（Ａｇｐ−ａａ）の４回繰り返し配列を設計した。それぞれ、ＡｇｐＧ、ＡｇｐＡ、ＡｇｐＶ、ＡｇｐＳ、ＡｇｐＮと略記する。
（９）Ｄ，Ｌ−Ａｇｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−（ａｇｐ−Ａｇｐ）４−ＮＨ２
（10）ＡｇｐＧ：Ａｃ−ＹＧＧ−（ＡｇｐＧ）４−ＮＨ２
（11）ＡｇｐＡ：Ａｃ−ＹＧＧ−（ＡｇｐＡ）４−ＮＨ２
（12）ＡｇｐＶ：Ａｃ−ＹＧＧ−（ＡｇｐＶ）４−ＮＨ２
（13）ＡｇｐＳ：Ａｃ−ＹＧＧ−（ＡｇｐＳ）４−ＮＨ２
（14）ＡｇｐＮ：Ａｃ−ＹＧＧ−（ＡｇｐＮ）４−ＮＨ２
１−４ 主鎖の自由度を変化させたペプチドの設計
ペプチド鎖の自由度を変化させるため、Ｄａｂ８、Ａｇｐ８中に自由度の高いＧｌｙを１〜３ヶ所導入したペプチド、Ａｇｐ８中に自由度の異なるＬ−Ａｌａ及びＬ−プロリン（Ｐｒｏ）を導入したペプチドを設計した（下記（15）〜(32)）。それぞれ、Ａｇｐ８Ｇ１、Ａｇｐ８Ｇ２、Ａｇｐ８Ｇ３、Ａｇｐ８Ａ１、Ａｇｐ８Ａ２、Ａｇｐ８Ｐ１、Ａｇｐ８Ｐ２と略称した。また、Ｄａｂ８、Ａｇｐ８に対してそれぞれプロリン骨格をもつＬ−アミノプロリン（Ａｍｐ）、Ｌ−グアニジノプロリン（Ｇｕｐ）に１，２，４，８ヶ所置換したＤａｂ７Ａｍｐ１、Ｄａｂ６Ａｍｐ２、Ｄａｂ４Ａｍｐ４、Ａｍｐ８、Ａｇｐ７Ｇｕｐ１、Ａｇｐ６Ｇｕｐ２、Ａｇｐ４Ｇｕｐ４を設計した。
（15）Ｄａｂ８Ｇ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ４−Ｇｌｙ−Ｄａｂ４−ＮＨ２
（16）Ｄａｂ８Ｇ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ３−Ｇｌｙ−Ｄａｂ２−Ｇｌｙ−Ｄａｂ３−ＮＨ２
（17）Ｄａｂ８Ｇ３：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ２−Ｇｌｙ−Ｄａｂ２−Ｇｌｙ−Ｄａｂ２−Ｇｌｙ−Ｄａｂ２−ＮＨ２
（18）Ａｇｐ８Ｇ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ４−Ｇｌｙ−Ａｇｐ４−ＮＨ２
（19）Ａｇｐ８Ｇ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ３−Ｇｌｙ−Ａｇｐ２−Ｇｌｙ−Ａｇｐ３−ＮＨ２
（20）Ａｇｐ８Ｇ３：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ２−Ｇｌｙ−Ａｇｐ２−Ｇｌｙ−Ａｇｐ２−Ｇｌｙ−Ａｇｐ２−ＮＨ２
（21）Ａｇｐ８Ａ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ４−Ａｌａ−Ａｇｐ４−ＮＨ２
（22）Ａｇｐ８Ａ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ３−Ａｌａ−Ａｇｐ２−Ａｌａ−Ａｇｐ３−ＮＨ２
（23）Ａｇｐ８Ｐ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ４−Ｐｒｏ−Ａｇｐ４−ＮＨ２
（24）Ａｇｐ８Ｐ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ３−Ｐｒｏ−Ａｇｐ２−Ｐｒｏ−Ａｇｐ３−ＮＨ２
（25）Ｄａｂ７Ａｍｐ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ４−Ａｍｐ−Ｄａｂ３−ＮＨ２
（26）Ｄａｂ６Ａｍｐ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ２−Ａｍｐ−Ｄａｂ２−Ａｍｐ−Ｄａｂ２−ＮＨ２
（27）Ｄａｂ４Ａｍｐ４：Ａｃ−ＹＧＧ−（Ｄａｂ−Ａｍｐ）４−ＮＨ２
（28）Ａｍｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｍｐ８−ＮＨ２
（29）Ａｇｐ７Ｇｕｐ１：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ４−Ｇｕｐ−Ａｇｐ３−ＮＨ２
（30）Ａｇｐ６Ｇｕｐ２：Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｐ２−Ｇｕｐ−Ａｇｐ２−Ａｍｐ−Ａｇｐ２−ＮＨ２
（31）Ａｇｐ４Ｇｕｐ４：Ａｃ−ＹＧＧ−（Ａｇｐ−Ｇｕｐ）４−ＮＨ２
（32）Ｇｕｐ８：Ａｃ−ＹＧＧ−Ｇｕｐ８−ＮＨ２
１−５ 蛍光基修飾ペプチドの合成
ペプチドの生体内での動態を追跡する目的で、蛍光官能基としてフルオレセインを導入したペプチドを設計した。ここで、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）を用いてＮ末端に導入することを試みたが、α−アミノ酸ではエドマン分解によりＮ末端のアミノ酸ごと蛍光基が脱離してしまい、１残基短いペプチドが得られた。そのため、Ｓｃｈｅｍｅ ２の通りに、ペプチドのＮ末端に、β−Ａｌａを介してＦＩＴＣを導入したペプチドを設計した。このペプチドの合成はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認した。
１−６ ペプチド合成
ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略を用いることによって、従来の固相法を介して合成した。ペプチド鎖は、カップリングのためにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＦｍｏｃアミノ酸誘導体（５当量）、N,N-ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ、１０当量）、及び２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール-1-イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、５当量）、並びにＦｍｏｃ基の除去のために２５％ピペリジン／ＤＭＦを用いて、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＰＥＧ樹脂上で組み立てた。最後のアミノ酸のカップリングの後、無水酢酸（１０当量）を用いて、Ｎ−末端のアミノ基をアセチル（Ａｃ）基で保護した。当該樹脂から当該ペプチドを切り離し、側鎖保護基を除去するために、当該ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−トリイソプロピルシラン−水（９５：２．５：２．５，ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。飽和ＮａＨＣＯ３ａｑ（２００μｌ）中のペプチドの一部を、１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−（トリフルオロメチルスルホニル）グアニジン（１アミノ基につき１０当量）の、ジオキサン（２００μｌ）溶液に加え、室温で一晩撹拌し、次いで真空内で濃縮した。
前述の通りにグアニジノ基を有するペプチドの合成は、アミノ基を有するペプチドを固相合成した後に、前述のＳｃｈｅｍｅ １の方法に従い、グアニジノ基に変換することで行った。まず樹脂をＤＭＦ，ＣＨＣｌ３でそれぞれ５回洗浄し、デシケーター中で減圧乾燥した。得られた樹脂を室温でＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／triisopropyl silane ［９５／２．５／２．５，ｖ／ｖ／ｖ］中で１時間撹拌し、脱保護・脱樹脂を行った。樹脂を濾去し、氷冷Ｅｔ２Ｏによりを加えてペプチドを沈殿させた。遠心分離機 (３０００ｒｐｍ、１５分) にかけてデカンテーションした後、Ｅｔ２Ｏをアルゴン気流下気化させた。沈殿を減圧乾燥し、粗精製のアミノ基を有するペプチドを得た。次に粗ペプチドをジオキサン/ Ｈ２Ｏ(1:1, v/v) を１０ｍＭになる様に加え、２．５equivのグアニジル化剤と２０％ほどｓａｔＮａＨＣＯ３ａｑを加えて６時間撹拌した。その後溶液を留去し、ＴＦＡにて１時間処理することでグアニジノ基を有するペプチドを得た。グアニジノ基から保護基を除去するために、当該ペプチドを、TFA−トリイソプロピルシラン−水（９５：２．５：２．５， ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。全てのペプチドを逆相ＨＰＬＣ（水−アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ）で精製した。
各オリゴペプチドは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化重量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により、成功裏に同定された。表１は、陽イオン性オリゴペプチドの分子量を示す。
１−７ ＣＤスペクトルによる測定
溶液中のペプチドとＲＮＡ−ペプチド複合体の構造は、円二色性分散計(CD spectroscopy：Jasco J-720WI spectropolarimeter)を用いて解析された。すなわち全てのＣＤスペクトルを２０℃で記録し、機器の設定は、解像度が０．１ｎｍ、感度が１０mdeg、応答が４秒、速度が１０ｎｍ／分、累積を６とした。
スペクトルはペプチドのアミド結合に基づくモル残基楕円率［θ］／degcm2dmol-1 で表し、［θ］は以下の式から算出した。なお、モル残基濃度にはアミド結合数（ペプチド濃度×残基数）を用いた。
［θ］＝θｏｂｓ（Ｍ／ＬＣ）
［θｏｂｓ：実測の楕円角（ｍｄｅｇ）、Ｍ：モル残基分子量、Ｌ：光路長（ｍｍ）、Ｃ：モル残基濃度（ｍｇ／ｍｌ）］
分子機構の計算に基づいて、ペプチド、特にＤａｐ８とＡｇｐ８中の、アミノ基とグアニジノ基は、主鎖中のアミノ基を伴う分子間の水素結合を形成することが可能である。しかしながら二重鎖核酸の非存在下では、全てのペプチドのスペクトルはランダムコイルの存在を示した。ゆえにペプチドの二次構造の影響は、これらのケースでは無視することができるものであった。ＲＮＡ−ペプチド複合体の構造もまた解析された。当該ペプチドは、側鎖長及び陽イオン性官能基の性質に依存して様々なＴｍ値を示したために、静電的な相互作用と水素結合だけではなく、構造的な要素も存在していたと解釈される。しかしながらＲＮＡとＤＮＡの二重鎖の両者とも、いくつかの陽イオン性オリゴペプチドの添加においては、核酸における構造的な感知可能な変化は何も認められなかった（図５−１、図５−２）。図５−１及び図５−２は「白黒表示」ゆえ、各オリゴペプチド同士がいずれの曲線を指すのかが明らかではないが、全ての例がほぼ同じ曲線を描き判別をすることが難しいことがわかる。これらの図は、必要があればカラーの図面を別途提出することが可能である。ペプチドの存在下又は非存在下でＲＮＡとＤＮＡ二重鎖のＣＤスペクトルは、それぞれ典型的なＡ型とＢ型のらせんであった。二重鎖ＲＮＡに対して１当量の各ペプチドを添加したことで、２６５ｎｍ及び２１０ｎｍ付近のピークの変化がみられ、特に２１０ｎｍ付近のピークの変化が大きく変化している。ペプチド添加前後のスペクトルの差をとると、図６（左がアミノ基タイプ、右がグアニジノ基タイプ）のようなシグナルが得られた。このスペクトルがペプチドに由来するシグナルだと仮定した場合、β−シート構造に特徴的な形状をしている。そのため、ペプチドは核酸と結合することでβ−シート様の構造が誘起されていることが推測される。
［実施例２］ 陽イオン性オリゴペプチドとモデル核酸二重鎖(12量体)の相互作用
ＲＮＡ結合分子がＲＮＡ二重鎖の熱安定性を向上させれば、生体内でも二重鎖の安定化が期待される点から、二重鎖の安定化能はＲＮＡ結合分子の最も重要な性質であると言える。そこで、ＲＮＡ二重鎖に対してペプチドを添加したことによる融解温度変化を検討した。また、一般的にＲＮＡ二重鎖に対して強く結合する分子ほど、その融解温度を上昇させる傾向がみられているため、ペプチド‐核酸間の相互作用を融解温度の変化の度合いから評価した。ＲＮＡ二重鎖に対して高い熱安定性を示すペプチドに対しては、等温滴定カロリメトリーや蛍光異方性測定により、直接相互作用を測定し、相互作用様式に関して検討を試みた。
（実施例２−１） 融解温度（Ｔｍ）解析
（２−１（１）） アミノ基を有する陽イオン性オリゴペプチドと核酸二重鎖との融解温度測定
本例では、アニーリングさせたＲＮＡ二重鎖に対してペプチドを添加して複合体を形成させ、その融解温度（Ｔｍ値）を測定した。本来であれば、ＲＮＡ二重鎖とペプチドを共存させてアニーリングすることで最安定構造に収束することが望ましいが、ＲＮＡとペプチドの混合溶液をアニーリングしたところ、ＲＮＡ二重鎖の安定化は観測されなかった。これは、アミノ基を有するペプチドがリン酸緩衝液中で昇温することにより凝集するためと考えられる。実際に、各ペプチド溶液のＵＶ吸収スペクトル、ＣＤスペクトル及びＨＰＬＣ追跡にて、チロシン由来のシグナルの消失が観測されることから、陽イオン性ペプチドの分解ではなく凝集により、ペプチド濃度が減少したことが示唆された。そのため、以降の測定はすべてアニーリングした核酸二重鎖に対してペプチドを添加して核酸−ペプチド複合体を調製した。
Ｔｍ値の測定は次の要領で行った。すなわち、１ｍＭ核酸二重鎖水溶液８μｌに対し、２０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ）１００μｌ、及び、滅菌水を９２μｌ加え、９５℃で１０分保った後−１℃／分で１０℃まで徐冷した。これに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解した０．１ｍＭオリゴペプチド溶液を８μｌ加えることで２０８μｌの水溶液（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）とした。これを用いてＴｍを測定した。
測定条件は以下のとおりである。
吸収波長：２６０ｎｍ
温度変化：１０℃→９５℃
昇温速度：０．２℃／分
ＲＮＡ二重鎖に対して各ペプチドを添加したところ、側鎖長に応じて異なるＴｍ値を示した。側鎖長が最も短いＤａｐ８を添加したことによる熱安定性の上昇は見られなかったが、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８を比較したところ、側鎖長が短いペプチドほど高い熱安定性を示す傾向が見られた（図７、表２）。特にＤａｂ８では最も高い熱安定性を示した。一方、ＤＮＡ二重鎖に対してペプチドを添加したところ、いずれのペプチドでも有効な熱安定性の向上は見られなかった。これはＤａｂ８のアミノ基間距離がＲＮＡ二重鎖のリン酸基間距離によく適合したためと考えられる。ＤＮＡではリン酸基の間隔がＲＮＡ二重鎖よりも二倍以上広いため、いずれのペプチドも有効な相互作用を形成できなかったと考えられる。
前述した様に、ＲＮＡ二重鎖の熱安定性には陽イオン性ペプチドの官能基の距離が大きく影響することが示唆されたが、他の構造的特徴についても検討することにした。ＲＮＡ二重鎖は右巻きのらせん構造であり、ペプチドを構成するアミノ酸もＬ体のキラリティをもつ分子である。この分子のキラリティが相互作用に及ぼす影響を検討するため、Ｌ体、Ｄ体のみからなるＤａｂ８、ｄａｂ８をＲＮＡ二重鎖に添加して熱安定性を比較したところ、両ペプチド共にほぼ同程度のＴｍ値を示した。このことから、ペプチドのキラリティはＲＮＡへの結合に影響を与えないことが示唆された。これは、側鎖にある程度の自由度があるため、主鎖のキラリティが結合様式に影響を及ぼさないのではないかと考えられる。
次に、測定時の緩衝液の影響に関して検討した。陽イオン性オリゴペプチドを生体内で用いることを想定して、生理的条件での挙動を調べる必要があるため、主として測定はリン酸緩衝液中で行った。しかし、ペプチドの陽イオン性官能基がＲＮＡのリン酸基と相互作用するため、緩衝液中に多量にリン酸が存在する条件は、結合に少なからず影響を及ぼすことが懸念された。そこで、緩衝能が温度の影響を比較的受けにくいＨＥＰＥＳバッファーを用いて、融解温度を測定した（表３）。ＨＥＰＥＳ緩衝液中で複合体を形成させた場合、各ペプチドにて２℃程度のＲＮＡ二重鎖の熱安定性の向上が観測された。これは、リン酸が２価の陰イオンであるのに対して、ＨＥＰＥＳが１価の陰イオンであることから、陽イオン性官能基との静電相互作用に与える影響が異なると考えられる。特に異なる挙動として、ＨＥＰＥＳバッファー中では高温でのペプチドの凝集が観測されず、ＲＮＡとペプチドの混合液をアニーリングした場合と、アニーリングしたＲＮＡにペプチドを加えた場合で同程度の熱安定性を示した。この挙動の差は、リン酸緩衝液中では多価ペプチド同士を２価のリン酸が架橋するため凝集するのが、ＨＥＰＥＳバッファーでは１価であるため架橋されず、凝集しないのではないかと考えられる。なお、後述するＩＴＣでの複雑な挙動は、これら緩衝液の成分なども関与しているためと考えられる。以上のことから、相互作用ＲＮＡ−ペプチド間の相互作用の性質を正確にみるためには、リン酸緩衝液のみでなく、カコジル酸緩衝液などを用いる条件が有効であることが示唆された。
（２−１（２）） グアニジノ基を有するペプチドと核酸二重鎖との融解温度測定
次に「グアニジノ基を有する各ペプチドと核酸二重鎖複合体」の融解温度を測定した。アミノ基を有するペプチドの場合と異なり、グアニジノ基を有するペプチドはリン酸緩衝液中で核酸とともにアニーリングしても凝集は確認されなかったが、同条件で熱安定化能を比較するため、アミノ基を有するペプチドと同様の手法で測定を行った。
グアニジノ基を有するペプチドをＲＮＡ二重鎖に対して添加したところ、アミノ基を有するペプチドの場合と同様に、ＲＮＡ二重鎖は側鎖長に応じて異なる熱安定性を示した（図８、表４）。側鎖長が短いペプチドほど高い熱安定性を示す傾向が見られ、特に側鎖長が最も短いＡｇｐ８の場合に最も高いＴｍ値を示した。一方、ＤＮＡでは逆の傾向が見られ、Ａｇｐ＜Ａｇｂ＜Ａｒｇと、側鎖長が長いほど高いＴｍ値を示す傾向が見られた。これはＡｇｐ８の官能基間距離が、ＲＮＡ二重鎖のリン酸基間距離とよく適合したため、高いＴｍ値を示したのではないかと考えられる。この様に、ＲＮＡに対しては、側鎖長と官能基間距離が適合することで陽イオン性ペプチドの親和力が向上したことが示唆された。一方、ＤＮＡに対しては、側鎖長が長くなるにつれ、官能基間距離がＤＮＡ二重鎖の主溝のリン酸間距離に適合するため、熱安定性も向上させたと考えられる。なお、ＤＮＡに対しては明らかにリン酸基の間隔が陽イオン性ペプチドの官能基間距離よりも長いため、ＲＮＡほど有効に相互作用できないため、ΔＴｍがＲＮＡと比較して小さいと推測される。ＲＮＡに対して加えるＡｇｐ８の当量を増加させると、低温領域で吸光度の増加が観測されたことから、過剰量のＡｇｐ８存在下ではＲＮＡ分子間相互作用が生じて凝集体が形成されると考えられる（図９）。
次に緩衝液の種類が核酸二重鎖と陽イオン性ペプチドの相互作用に及ぼす影響に関して検討した。グアニジノ基を有するペプチドでも、リン酸緩衝液をＨＥＰＥＳバッファーに変更したことによるＴｍの向上が見られた（図１０、表５）。しかし、アミノ基ほどＴｍ値は大きく変化しなかった。ＲＮＡ二重鎖の熱安定性の上昇は、緩衝剤の電荷が２価から１価へ変化したことにより、静電相互作用に及ぼす影響が変化したことによると考えられる。グアニジノ基とアミノ基のＲＮＡ二重鎖の熱安定性に及ぼす影響の差異は、緩衝液中のリン酸と陽イオン性ペプチドの官能基との結合様式が関与しているのではないかと考えられる。前述のとおり、アミノ基を有するペプチドはリン酸緩衝液中でアニーリングすることで凝集することが確認されているが、グアニジノ基を有するペプチドでは凝集がほぼ見られない。この様に、リン酸緩衝液中のリン酸とアミノ基を有するペプチドは複雑な相互作用様式をとることが予想される。おそらく、この様にアミノ基を有するペプチドは緩衝液中のリン酸と強く結合をし、解離しにくいため、ＲＮＡとの結合を阻害するのではないかと考えられる。
また、アミノ酸キラリティの影響を検討するため、Ａｇｐ８とａｇｐ８を比較したところ、ＲＮＡ二重鎖は両ペプチド共にほぼ同程度の熱安定性を示した。このことから、グアニジノ基を有するペプチドを構成するアミノ酸のキラリティは、ＲＮＡへの結合に大きな影響を及ぼさないことが示唆された（図１１）。これは、アミノ基を有するペプチドの場合と同様に、側鎖にある程度の自由度があるため、主鎖のキラリティがＲＮＡに対する結合に大きな影響を及ぼさないのではないかと考えられる。一方、Ｌ体とＤ体を交互に配列した（Ａｇｐ−ａｇｐ）４では優位な熱安定性の減少が見られた。これは、α−アミノ酸骨格をもつＰＮＡでも見られる現象であり、主鎖がホモキラルである構造がヘテロキラルな構造と比較して核酸との結合に適していることが示唆される（図１２、表６）
Ａｇｐオリゴマーでの残基数と結合の相関を確認するため、Ａｇｐ４、Ａｇｐ６、Ａｇｐ８、Ａｇｐ１０についてＲＮＡ二重鎖に対する結合を確認したところ、ペプチド鎖が長いほどＲＮＡ二重鎖と強く結合することがわかった（図１３、表７）。そのため、分子中の各グアニジノ基はそれぞれＲＮＡのリン酸と有効に相互作用していることが考えられる。特にＡｇｐ１０でも強い結合を形成したことは、余ったグアニジノ基が主溝の８個のリン酸以外とも結合していることが示唆された。
（２−１（３）） 交互配列を有するペプチドと核酸二重鎖との融解温度測定
ＲＮＡ二重鎖に対して、Ａｇｐと他の官能基をもつアミノ酸の種々の交互配列を有するペプチド、及び同じ電荷を有するＡｇｐ４を添加し、Ｔｍ値の比較を行った（図１４、表８）。前項までのペプチドと比較して、交互配列を有するペプチドは電荷が半分になったため、ＲＮＡ二重鎖に対して２当量のペプチドを添加した。この場合、相互作用点が半減したため、ＲＮＡ二重鎖に対して２当量加えてもなおＡｇｐ８と比較して低い値ではあるが、Ａｇｐ４で有意なＴｍ値の上昇が見られた。一方、他のいずれの交互配列を有するペプチドでも熱安定性の有意な向上が見られなかった。図１４において、ＡｇｐＶ、ＡｇｐＳ及びＡｇｐＮは曲線の目視での区別は困難である。ＡｇｐＧでは微小な安定化が観測されたが、他のペプチドでは、ほぼ熱安定化は確認されなかった。これは、他の交互配列ペプチドがβ−炭素により回転の自由度が大きく制限されることから、グアニジノ基の方向が制御されているために、ＲＮＡの向かい合ったリン酸と有効に相互作用できなかったと考えられる。それに対して、ＡｇｐＧではグリシンのメチレン鎖に自由度がある事で主溝のリン酸を架橋する形で結合できるため、若干の熱安定化が見られたのではないかと考えられる。しかし、ＲＮＡの熱安定性を向上させるためには、Ａｇｐの連続した配列が極めて有効であることが明らかとなった。連続したＡｇｐを有するペプチドでは、側鎖間の電荷の反発から、側鎖が主査に対して逆方向に伸びやすく、向かい合ったリン酸との相互作用に有利な構造をとるのではないかと考えられる。陽イオン性ペプチドがＲＮＡに結合する際、ペプチドは交互に側鎖が伸びるβ−構造を誘起されている可能性があり、この結果とよく合致している。
（２−１（４）） 自由度を変化させたペプチドと核酸二重鎖との融解温度測定
上記の検討の結果、側鎖長の違いやペプチドの配列が複合体の熱安定性に大きな影響を及ぼすことが示された。この熱安定性の差は、官能基間の強く相互作用するエンタルピー的な要因だけでなく、ペプチドの自由度によるエントロピー的な要因も考えられる。そこで、エントロピー的な要因を検討するため、主鎖に自由度の異なるアミノ酸を導入して主鎖の自由度を変化させたペプチドを設計し、ＲＮＡ二重鎖の熱安定性に及ぼす影響を検討した。
まず、ペプチドの自由度を上げるため、Ｄａｂ８、Ａｇｐ８に等間隔に１〜３個のＧｌｙを導入したところ、ペプチドに応じて異なる傾向が見られた（図１５、表９）。Ｄａｂ８ではＧｌｙの導入、自由度の増加に依存して熱安定性の低下が見られたが、それに対しＡｇｐ８では自由度の影響が見られなかった。さらに、Ａｇｐ８ではＡｌａ、Ｐｒｏを導入しても熱安定性への影響が見られなかった。
同様に自由度を下げるため、プロリン骨格をもつＡｍｐ、Ｇｕｐを導入して熱安定性への影響を検討した。グリシンを導入した場合と同様に、Ｄａｂ８はＡｍｐによる熱安定性の低下が見られたが、Ａｇｐ８はＧｕｐによる熱安定性の変化は見られなかった（図１６、表１０）。特にＤａｂをＡｍｐに置換したことにより、傾斜の減少が観測された。これはペプチドにプロリン骨格を導入したことで構造が変化し、主溝に適合しない構造に変化したためと推測される。これらのことから、アミノ基はリン酸との相互作用がエンタルピー的にそれほど強くないため、エントロピー的に不利な影響を顕著に受けるが、グアニジノ基はリン酸とエンタルピー的に極めて有利に相互作用するため、エントロピー的な影響が小さかったことが示唆される。なお、Ａｌａ、Ｐｒｏを導入することでグアニジノ基の位置が大きく変化し、グアニジノ基と相互作用するリン酸基は変化すると予想されるが、Ａｇｐ８と同程度の熱安定性を示した。このことから、グアニジノ基は隣接した他のリン酸などと結合しても、有効な熱安定性を獲得し得るほど強く相互作用することが考えられる。つまり、Ａｇｐ１０の熱安定性が高かった様に、すべての分子内の陽イオン性官能基が主溝内にない場合でも、一部のグアニジノ基が主溝のリン酸と相互作用していれば、それを足場に他の部位のリン酸とも共同的に有効な相互作用ができることが示唆された。
（２−１（５）） 蛍光基修飾したペプチドと核酸二重鎖との融解温度測定
蛍光基は一般的に広い共鳴構造をとるため、かさ高い官能基である。実施例ではモデルとしてフルオレセインを導入したペプチドを合成したが、蛍光基が陽イオン性ペプチドの近傍にある事で相互作用に影響を及ぼすことが懸念された。そのため、ＦＩＴＣ修飾した陽イオン性ペプチドとＲＮＡ二重鎖複合体の融解温度測定により相互作用の評価を試みた。
他のペプチドと同様にアニーリングしたＲＮＡ二重鎖に対して１当量の蛍光基修飾したペプチドを添加して融解温度を測定したところ、蛍光基のない陽イオン性ペプチドと同様の挙動を示した（図１７、表１１）。特にＡｃ−ＹＧＧ−Ｄａｂ８とＦＩＴＣ−Ｄａｂ８はほぼ同じ融解温度を示したことから、蛍光基を導入した場合でもＲＮＡ二重鎖に対する相互作用は影響を受けないことが明らかとなった。これは、ペプチドへの蛍光基の導入を、β−Ａｌａを介してＦＩＴＣを反応させたて行ったため、陽イオン性残基とフルオレセインが十分に離れており、かつ自由度も高いため立体障害の影響を受けなかったと考えられる。
（実施例２−２） 等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）による計測
前述の様に、種々の陽イオン性ペプチドを用いてＲＮＡ二重鎖に効率的に結合するために重要な因子を明らかにした。しかし、より効率的な分子設計を行うためには、ＲＮＡ二重鎖に対するペプチドの結合様式を定量的に理解する必要がある。そこで、相互作用の詳細な解析を行うため、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）による測定を試みた。
すなわち、陽イオン性ペプチド及び核酸二重鎖を、ｐＨ７．０の、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した。当該ペプチド溶液（１５０μＭ）を核酸二重鎖溶液（１０μＭ）に２５℃で滴下した。ペプチド溶液の滴下は、最初の０．５μｌ、続いて２４回の１．５μｌ（添加は、１２０秒間隔で３秒間にわたって行われる）、として行った。前述した様に二重鎖核酸は、自己相補的ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖「ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ：配列番号１）２」、及び、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖「ｄ（ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ：配列番号２）２」を用いた。
ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ二重鎖に対してＤａｂ８、Ａｇｐ８、Ａｇｂ８をそれぞれ滴定したところ、静電相互作用による発熱を伴う相互作用だけではなく、脱水和、溶媒中のリン酸との脱リン酸和による吸熱を伴う相互作用も確認された（図１８：Ｄａｂ８、図１９：Ａｇｐ８、図２０：Ａｇｂ８）。
ＲＮＡ二重鎖に対してＤａｂ８を滴定した場合では脱水和に起因すると思われる急激な吸熱が観測されたのち、ＲＮＡ−ペプチド間相互作用による発熱が観測された。一方、ＤＮＡに対してペプチドを滴定した場合では相互作用による熱量変化が観測されなかった。次に、ＲＮＡに対してＡｇｐ８を滴定した場合では、はじめほとんど発熱が見られなかったが、次第に発熱量が増加し、その後発熱量の減少が観測された。これはＤａｂ８の場合と同様に吸熱を伴う相互作用と発熱を伴う相互作用が共存していると考えられる。グアニジノ基がアミノ基よりもリン酸と強く相互作用するため、Ａｇｐ８はＤａｂ８よりも発熱量が一見大きく、吸熱が見られなかったと考えられる。また、一方、ＤＮＡに対してＡｇｐ８を滴定した場合でも有意な相互作用は観測されなかった。それらに対し、Ａｇｂ８をＲＮＡ，ＤＮＡに対して添加した場合、双方ともに相互作用による熱量変化がみられた（図２０）。ＲＮＡに対してＡｇｂ８を滴定した場合、Ａｇｐ８と同様に吸熱は測定されず、当初小さい発熱が測定されたのちに次第に発熱が大きくなり、その後、発熱量の減少が観測された。これは、グアニジノ基がリン酸と強く相互作用するため発熱が優先的に測定されたと考えられる。各滴定における発熱量はＡｇｐ８と比較して大きかった。これはＡｇｂ８の方がＡｇｐ８より側鎖が長く、自由度が大きいため、グアニジノ基がよりリン酸と相互作用しやすい位置に配置できるためエンタルピー的により有利になったためと考えられる。一方、ＤＮＡに対しては吸熱が測定されたのち、次第に発熱が大きくなり、その後発熱の減少が観測された。Ａｇｂ８はグアニジノ基の自由度が大きく、選択性が減少したためにＤＮＡに対しても結合したと考えられ、Ｔｍの挙動とも一致する。ＲＮＡの場合とは異なり、初期に吸熱が測定されたのは、Ａｇｂ８のグアニジノ基とＤＮＡのリン酸との相互作用が、ＲＮＡのリン酸との相互作用と比較して弱いためと考えられる。
前述した様に、核酸二重鎖−ペプチド間の相互作用様式は複雑であり、熱力学的パラメータの算出はできなかった。しかし、Ｄａｂ８、Ａｇｐ８はＲＮＡ二重鎖選択的に結合することが確認された。つまり、単純なリン酸の配列ではなく、ＲＮＡ二重鎖特有の高次構造を認識していることが示唆された。一方、Ａｇｂ８では側鎖が長いため、グアニジノ基の自由度が高く、特定の構造に対する選択性が減少し、ＲＮＡ、ＤＮＡともに相互作用し得る結果が得られた。
Ｄａｂ８、Ａｇｐ８はＲＮＡ二重鎖の高次構造を認識することが示唆された。そこで、ペプチドが認識する特定の構造に関与するリン酸基を特定する、つまり結合部位を確認するために、結合阻害実験を試みた。本設計では主溝の向かい合ったリン酸基が、官能基の空間的配置から陽イオン性官能基と最も結合する可能性が高い。そこで、ＲＮＡの主溝に結合することが知られているネオマイシンを阻害剤として用いた。
過剰量のネオマイシン存在下で各ペプチドを添加したところ、顕著な相互作用の阻害が確認された（図２１）。Ｄａｂ８では吸熱を伴う相互作用が確認されたのに対して、Ａｇｐ８ではほとんど相互作用が確認できなかった。Ｄａｂ８では発熱を伴う相互作用のみが阻害されたのに対して、Ａｇｐ８では吸熱を伴う相互作用も阻害された。これは、Ａｇｐ８のグアニジノ基が水溶液中のリン酸とも強く相互作用するため、阻害のされ方に差が生じたのではないかと考えられる。また、Ａｇｂ８では吸熱を伴う相互作用が確認された。これはグアニジノ基の自由度が高いため、非特異的な相互作用のみが測定された結果ではないかと考えられる。以上のことから、Ｄａｂ８、Ａｇｐ８は主溝またはその近傍のリン酸基が関与して結合していることが示唆された。
（実施例２−３） 蛍光異方性(Fluorescence anisotropy)測定
ＲＮＡ二重鎖と各ペプチドの相互作用が複雑であるため、等温滴定カロリメトリーでは結合定数を算出することができなかった。そこで、蛍光異方性測定によりＲＮＡ二重鎖と各ペプチドとの見かけの解離定数を算出し、結合力を定量的に比較することを試みた。
蛍光異方性測定とは、分子の結合状態や運動状態に応じて発する蛍光の角度が異なることを利用して、相互作用を測定する手法である。直線偏光した励起光で励起された分子は、吸収した偏光と蛍光を発する。しかし、励起状態でいる間に、自由運動により分子が回転することで、偏光励起光とは異なる偏光の蛍光が認められる。つまり、直線偏光した励起光で励起し、蛍光の偏光状態（偏光解消）を測定することで分子の回転度を測定可能である。これを利用して、結合前後の見かけの分子量変化から相互作用の測定が可能である。具体的には、励起光・蛍光それぞれ鉛直・水平方向の変更を測定し、下式から蛍光異方性度を算出した。
Ｒ ＝ ＩＶＶ−ＧＩＶＨ ／ ＩＶＶ＋２ＧＩＶＨ
（Ｇ ＝ ＩＨＶ ／ ＩＨＨ）
［式中、Ｒは蛍光異方性であり、ＩＶＶ、ＩＶＨ、ＩＨＶ、ＩＨＨは、鉛直、水平方向の励起光での鉛直、水平方向の蛍光強度である。Ｖは鉛直、Ｈは水平を示し、例えばＩＶＶは鉛直の励起光・鉛直の蛍光強度の組を表している。］
蛍光異方性測定は分子量が小さいほど自由回転が大きく、偏光が測定しにくい。そのため、分子量が小さく自由度の高いペプチド（ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−Ｄａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８）ではなく、分子量が大きく、構造が固いＲＮＡ二重鎖に蛍光基を導入して蛍光異方性測定を行った。さらに本例では水溶液の粘性を上げることが知られるＴｗｅeｎ２０を添加して測定を行った。ＲＮＡの５’側をフルオレセインで修飾したＲＮＡ（Fluorescein−ｒＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ：配列番号１）２に各陽イオン性ペプチドを添加した際の蛍光異方性を測定した。測定した蛍光異方性Ｒを添加したペプチド濃度に対してプロットした(白黒表示が著しく困難なため図示せず。必要に応じてカラー図面を提出する用意有り。)。このプロットを下式：
でフィッティングすることで、見かけの解離定数を算出した（図２２−１〜５、表１２）。Ａｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｇｐ８Ｇ３では、低濃度（＜０．０５μＭ）における傾きが多少異なり、ＩＴＣでも観測された様に複数の結合様式の存在が示唆された。
まず、異方性度変化の比較を行うと、ネオマイシン（ＭＷ ６１４）では０．００８、アミノ基を有するペプチドＤａｐ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８（ＭＷ １０００〜１４００）では０．０１６程度であり、分子量との相関がみられた。一方、Ｄａｂ８（ＭＷ １１３７）では０．０２５、グアニジノ基を有するペプチドＡｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８（ＭＷ １３００〜１６００）では０．０５と、異方性度の大きな変化がみられた。同程度の分子量による異方性度の違いは、相互作用によるＲＮＡの見かけの分子量が増加した以外の影響が示唆される。要因としては末端に導入した蛍光基の自由度が、ＲＮＡ二重鎖にペプチドが結合したことで変化するため、結合様式の違いから蛍光異方性度の変化に差が生じたことが考えられる。
次に算出された解離定数を比較すると、Ｔｍの変化と解離定数の間に相関がみられた（図２３）。なお、ネオマイシンのＲＮＡに対する解離定数の測定値は１．０×１０−７であり、文献値の１．８×１０−７とも十分近い値を示した。ＲＮＡ二重鎖の熱安定性を最も向上させたＡｇｐ８とＡｇｐ８Ｇ３は最も強い結合力を示した。解離定数が２倍程度のＤａｂ８、Ｏｒｎ８、Ａｇｂ８の場合でも同程度の熱安定化と結合力が観測された。これに対して解離定数が３〜５倍のＤａｐ８、Ｌｙｓ８、Ａｒｇ８では多少挙動に差が生じた。蛍光異方性測定からＤａｐ８ではある程度ＲＮＡに結合しているのに対して、Ｔｍ測定ではＲＮＡ二重鎖の安定化はみられなかった。Ｄａｐ８のアミノ基がＲＮＡ二重鎖のリン酸を十分に架橋するのではなく、非特異的にリン酸と相互作用するため、ＲＮＡ二重鎖の熱安定化が得られなかったのではないかと考えられる。側鎖が長く自由度の高いＬｙｓ８とＡｒｇ８でも結合様式の違いから熱安定化の度合いが異なるのではないかと考えられる。交互配列を有するＡｇｐＶでは電荷が＋４、と他のペプチドの半分であるため、有効な相互作用が測定できなかった。
以上より、ＲＮＡ二重鎖に対して選択性をもつペプチドは、強固に結合するほど高い熱安定性を示すことが示された。これは、主溝の向かい合ったリン酸をより強く架橋するほど、二重鎖の状態が安定化されるためと考えられる。また、ネオマイシンのＲＮＡに対する結合力と比較して、陽イオン性ペプチドはＲＮＡ二重鎖の熱安定性を大きく向上させた。このことから、ペプチドの構造がＲＮＡ二重鎖の向かい合ったリン酸を効率的に架橋するなど、ＲＮＡ二重鎖安定化に適した構造をしていることが考えられる。今回設計した陽イオン性ペプチドはＲＮＡ二重鎖に対して０．２〜０．０５μＭ程度の解離定数をもち、Tat proteinとTAR RNAやRev proteinとＲＲＥ ＲＮＡ、ＴＡＲ ＲＮＡの示す解離定数０．０７−０．００５μＭと比較すると、ＲＮＡ結合蛋白質と同程度か若干弱い結合力をもつことが明らかとなった。
（実施例２−４） ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖を含めた検討
この実施例ではＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖を含めて、陽イオン性ペプチドの側鎖長と主鎖長が熱安定性にどのような影響を及ぼすかを検討するため、前述の陽イオン性ペプチドに加えて、さらにいくつかを前述した手法に準じて製造した。なお、本実施例で用いた陽イオン性ペプチドの一覧を図２４において示した。
（２−４（１）） ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖の融解温度（Ｔｍ）測定
ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の各測定条件での核酸の状態を確認するため、核酸の濃度を１μＭ、４μＭにおける融解温度（Ｔｍ）を、リン酸緩衝液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中において測定した。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の配列は、「ｒＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧ／ｄＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴ」（配列番号３（ＲＮＡ鎖）、配列番号４（ＤＮＡ鎖））である。また、対照として用いたＲＮＡ二重鎖の配列は配列番号１に示したものである。系の温度は０．５℃／分の割合で上昇させた。Ｔｍ測定も、「実施例２−１」の冒頭に示した方法に準じて行った。
その結果を示す図２５のグラフの横軸は温度であり、縦軸は２６０ｎｍにおける相対的吸光度である。右のグラフは、酵素処理を行う３７℃近傍における、左のグラフの拡大図である。この結果より、酵素処理を行う３７℃ではＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の状態が異なることが明らかになった。すなわち、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は４μＭでは二重鎖を形成しているが、１μＭでは一部の二重鎖が解離している状態であることが確認された。
（２−４（２）） ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖のＣＤスペクトル測定
ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対して陽イオン性ペプチドが結合した際の構造変化をＣＤスペクトルにて確認した。陽イオン性ペプチドは、前述したＤａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８、Ａｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８の他に、「Ａｇｈ８」（Ａｃ−ＹＧＧ−Ａｇｈ８−ＮＨ２）を合成して用いた。ＣＤスペクトル測定は、実施例１の「１−７ ＣＤスペクトルによる測定」の冒頭の内容に従って行い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０℃）中で５ｍＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対して１当量の各陽イオン性ペプチドを加え、結合前後のＣＤスペクトルをそれぞれ測定して比較した。その結果を図２６において示す。図２６の左側のグラフはアミノ基を伴う陽イオン性ペプチドを用いたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖についてのＣＤスペクトルの測定結果であり、右側のグラフはグアニジノ基を伴う陽イオン性ペプチドを用いたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖についてのＣＤスペクトルの測定結果である。
その結果、アミノ基を伴う陽イオン性ペプチドにおいては、スペクトルにそれほど大きな変化は認められなかった。Ｌｙｓ８のみシグナルが多少大きくなったが、スペクトルの形状に目立った際は認められなかった。一方、グアニジノ基を伴う陽イオン性ペプチドにおいては、２６０ｎｍのピークが大きくなるのに対し、２１０ｎｍのピークが小さくなっており、陽イオン性ペプチドが結合したことによる何らかの構造変化が起こっていることが示された。
（２−４（３）） 側鎖長の異なる陽イオン性ペプチドと核酸二重鎖の相互作用の検討
この検討のために、前述したＤａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８、Ａｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８、及び、Ａｇｈ８を用いた。この実施例では、カチオン性ペプチドが、Ａ型二重鎖核酸であるＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の安定化に及ぼす影響を確認するため、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍ測定を行った。複合体の調製は前述した「実施例２−１」の冒頭に示した方法に準じて、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液中で、４μＭのペプチドと４μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を接触させて行った。
そのＴｍ測定の結果を図２７に示す。図２７（１）はアミノ基を有するペプチド（Ｄａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８）についての結果を示しており、図２７（２）はグアニジノ基を有するペプチド（Ａｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８、Ａｇｈ８）についての結果を示している。表１３は、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液中でのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍを示している。
図２７と表１３において、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においてもＲＮＡ／ＲＮＡの場合と同様に、Ｄａｂ８とＡｇｐ８において最も高い熱安定性を示した。しかし、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における安定化の度合いは、ＲＮＡ／ＲＮＡの場合と比較して３〜４℃ほど小さい傾向が認められた。
次に、カチオン性ペプチドと核酸二重鎖の解離定数（Ｋｄ）を前出（実施例２−３）の蛍光異方性測定に基づき算出した（表１４）。
その結果、陽イオン性ペプチドは各核酸二重鎖に対して、１０−７〜１０−８Ｍの、核酸結合タンパク質と同等の結合力で結合することが示された。核酸二重鎖間で比較すると、ＲＮＡ／ＤＮＡ ＞ ＲＮＡ／ＲＮＡ ＞ ＤＮＡ／ＤＮＡの順で結合力が強い傾向が見られ、ペプチド間で比較すると、側鎖長が短くなるほどＡ型核酸二重鎖に対する選択性が向上することが明らかとなった（図２８）。また、同一の核酸二重鎖においてＫｄとＴｍ間で相関がみられたことから、同一の核酸二重鎖間では、結合力が強いほど高い熱安定性を示す傾向が確認された。
（２−４（４）） 主鎖長の異なるカチオン性ペプチドと核酸二重鎖の相互作用の検討
前記の実施例では、陽イオン性分子は主溝の向かい合った８個のリン酸をターゲットとして８個のアミノ基を有する様に設計した。しかし、アミノ基をさらに増やすことにより、向かい合ったリン酸以外の部位とも相互作用を形成することを確認するため、ペプチド長を変化させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＴｍ測定を行った。結果を図２９と表１５に示す。
その結果、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖ではＤａｂ８より長い領域においても、鎖長に応じた熱安定性の向上が認められた。特に、最も長いＤａｂ１２においては＋１９℃と極めて高い熱安定性を示した。このことから、主溝の向かい合ったリン酸に限らず、両末端側の官能基とも効率的に相互作用することが示された。
［実施例３］ 陽イオン性オリゴペプチドとsｉＲＮＡの相互作用
前述のとおり、各ペプチドはモデル二重鎖ＲＮＡ（１２量体）の熱安定性を向上させることが確認された。次にsｉＲＮＡ（２１量体）に対してペプチドを添加した際の物性を評価した。
（実施例３−１） 熱安定性への影響
sｉＲＮＡ（２１量体）は、モデル二重鎖ＲＮＡ（１２量体）より２倍程度の鎖長をもつため、核酸の総電荷だけでなく、主溝に存在するリン酸基対の数も増えている。そのため、sｉＲＮＡには複数のペプチドが結合可能だと予想され（図３０）、ペプチドの当量が二重鎖の熱安定性に大きな影響を及ぼすが予想された。そこで、まずアポリポ蛋白質として知られるＡｐｏＢ１を標的とするsｉＲＮＡ（ＳＳ：５’−ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡｄＴｄＴ−３’（配列番号５）、ＡＳ：５’−ＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣｄＴｄＴ−３’（配列番号６））に対してＤａｂ８とＡｇｐ８を加えた複合体の熱安定性を調べた。二重鎖ＲＮＡ１２量体では結合部位となるリン酸が８個、総電荷が＋２２であるが、sｉＲＮＡ ２１量体（ｄｓＲＮＡ １９ｍｅｒ＋ ２ｍｅｒ overhang）では結合部位のリン酸が２２個、総電荷が＋４０である。そのため、図３０右に示す様に最大３分子のペプチドが主溝に結合可能である。そこで１２量体二重鎖ＲＮＡでは陽イオン性ペプチドを１当量のみ加えたが、sｉＲＮＡ２１量体では１当量の他、結合部位となるリン酸に合わせた３当量、総電荷を合わせた５当量を用いて複合体を形成させた。sｉＲＮＡとペプチド複合体の調製は二重鎖ＲＮＡ（１２量体）と同様に、アニーリングしたsｉＲＮＡにＤａｂ８又はＡｇｐ８を加えて調製した。
Ｄａｂ８を１当量用いた場合、主溝が十分にカバーできていないためか、温度に伴い吸光度のなだらかな上昇が認められた（図３１）。一方、３及び５当量のＤａｂ８を用いた場合、融解温度付近での吸光度の比較的急な上昇が認められた（図３１）。また、３及び５当量を用いた場合の融解温度の差はほぼ認められなかった（図３１）。これは、Ｄａｂ８を３当量用いることで、ペプチドが主溝に存在するリン酸すべてに、ほぼ完全に結合しているため、それ以上のペプチドの添加による熱安定性の向上が見られなかったのではないかと考えられる。ここで、モデルＲＮＡ１２量体とsｉＲＮＡ２１量体のΔＴｍを比較
すると、１当量の時には安定化の効果が比較的小さいが、sｉＲＮＡに３当量のＤａｂ８を加えた場合に、ＲＮＡ１２量体に１当量のＤａｂ８を加えた場合と同程度のΔＴｍを示した（表１７）。この結果より、ＲＮＡの長さによらず、主溝に対して十分な当量のＤａｂ８を添加した場合、Ｄａｂ８はＲＮＡ二重鎖の熱安定性に同程度の影響を及ぼすことが示唆された。
次にsｉＲＮＡにＡｇｐ８を１当量用いて複合体を形成した場合、Ｄａｂ８と比較して吸光度の急な上昇が認められた（図３２）。これはＡｇｐ８がＤａｂ８と比較してより強く結合するため、１当量でも吸光度の上昇が急に起こったのではないかと考えられる。一方、３及び５当量のＡｇｐ８を用いた場合、低温領域に吸光度の減少が観測された。これは、ＲＮＡと強く結合するＡｇｐ８が、ＲＮＡ二重鎖に結合しきれずに溶液中に多数存在することで、分子間で相互作用しやすくなり、凝集体が形成したため吸光度の減少が観測されたと考えられる。この様な挙動の差から、Ａｇｐ８はＤａｂ８と異なり、sｉＲＮＡに１当量加えた場合でもＲＮＡ１２量体とほぼ同程度のΔＴｍを示したと考えられる（表１６）。
（実施例３−２） ＲＮａｓｅ耐性への影響
前述した様にＤａｂ８とＡｇｐ８は、モデルＲＮＡ二重鎖（１２量体）と同様に、sｉＲＮＡ（２１量体）の熱安定性を向上させることが明らかとなった。そこで次に、sｉＲＮＡに対してＤａｂ８及びＡｇｐ８を加えて複合体を形成させ、ヌクレアーゼに対する安定性に及ぼす影響を調べた。ＲＮＡｉ医薬のＤＤＳには陽イオン性ペプチドのＲＮＡ二重鎖への結合や熱安定性の向上に加え、生体内での安定性の向上のためのヌクレアーゼ耐性が極めて重要である。
（１）sｉＲＮＡに対する検討
終濃度が１０μＭ sｉＲＮＡ（ＡｐｏＢ１を標的とする）を、０、１０、３０、５０μＭ ペプチド（０、１、３、５当量）に調製したsｉＲＮＡ−ペプチド（Ｄａｂ８又はＡｇｐ８）混合水溶液を、１wellあたりのsｉＲＮＡが１００pmolとなる様に、表１８の比率で混合して複合体を調製した。その後３７℃で２５分間インキュベートして、sｉＲＮＡを、二重鎖ＲＡＮを切断するエンドヌクレアーゼであるＲＮaseＡで分解した。６×ＬＢを加えて、全量を１５％ アクリルアミドゲルにアプライし、１００Ｖで６０分間泳動させた。泳動が完了した後、エチジウムブロミドにてＲＮＡを染色して、二重鎖ＲＮＡの存在量を評価した。図３３の各レーンに流したサンプルを表１７に示す。
レーン３、５のsｉＲＮＡ単体がＲＮaseＡにより完全に分解されるのに対して、ＲＮＡ−ペプチド複合体ではＲＮＡが分解されずに存在していることが観測された。特に、Ｄａｂ８を１当量用いたレーン６では低分子領域に、部分的に分解されたと思われるバンドが認められるのに対して、３当量のレーン７及び５当量のレーン８では分解の抑制が認められた。また、３、５当量のペプチドを加えた場合、sｉＲＮＡよりも高分子領域にバンドが観測された。これはsｉＲＮＡにペプチドが結合したことによる分子量の増加に加え、陽イオン性ペプチドがsｉＲＮＡに結合したことで複合体の総電荷が打ち消され、泳動しにくくなったものと考えられる。
一方、Ａｇｐ８を１、３、５当量用いたレーン９、１０、１１においてもＤａｂ８と同様の傾向が観測されたが、全体としてバンドが薄かった。低分子領域にバンドが認められないにもかかわらず、バンドが薄いことから、sｉＲＮＡ量の減少よりもsｉＲＮＡの染色がペプチドに阻害された可能性が考えられる。また、Ａｇｐ８の方がＤａｂ８よりもsｉＲＮＡ複合体が凝集しやすいことなどの影響も考えられるが、凝集が起こらない１当量のＡｇｐ８でもＲＮＡを示すバンドが薄いことから、Ｄａｂ８とＡｇｐ８のsｉＲＮＡに対する結合様式の差などに基づいて、ＲＮＡ二重鎖のエチジウムブロミドの染色の差が影響していると考えられる。そのため、sｉＲＮＡを蛍光標識するなど、ペプチドの影響を受けないと思われる検出法により、改めて確認する必要がある。
この様にＡｇｐ８は検出法について検討が必要であるが、これらの結果より、主溝全体を覆うのに十分な３当量以上のペプチドを用いることで、Ｄａｂ８とsｉＲＮＡの複合体が十分なヌクレアーゼ耐性を獲得することが明らかとなった。Ｄａｂ８とＡｇｐ８は、ＲＮＡ結合蛋白質と同等の強い結合力でsｉＲＮＡに結合しているため、ＲＮaseＡによる分解を十分に阻害できたと考えられる。
（２）モデルＲＮＡ二重鎖（１２量体）を用いたペプチド複合体の酵素耐性の定量的検討
ｄｓＲＮＡ−ペプチド複合体の酵素耐性を定量的に評価するため、ＨＰＬＣによる解析を行った。まずｄｓＲＮＡ（ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２）をアニーリング後、各陽イオン性ペプチドを１当量加えて複合体を形成し、１０μＭ ｄｓＲＮＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ溶液を調製した。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で終濃度１μＭ ｄｓＲＮＡ、１０μｇ／ｍｌ ＲＮaseＡになる様に調製し３７℃で１時間処理した。その後ＲＮaseＡ阻害剤を加えて反応を停止後すぐにＨＰＬＣにて解析した。内部標準として加えたベンズアミドに対する残存ｄｓＲＮＡの面積比より酵素耐性を評価した。
結果を表１８に示す。
陽イオン性ペプチドの中で、Ｄａｐ８、Ａｒｇ８、及び、Ａｇｈ８は殆ど酵素耐性を示さなかったのに対し、アミノ基を伴うＤａｂ８とＯｒｎ８は７割程度、グアニジノ基をもつＡｇｐ８は５割程度のｄｓＲＮＡの残存が確認され、高い酵素耐性を示した。
（実施例３−３） ＲＮＡｉ活性への影響
ＲＮＡ結合分子によるＲＮＡｉ医薬のＤＤＳで考慮すべきこととして、ＲＮＡｉ活性に及ぼす影響がある。ＲＮＡｉ医薬の輸送や安定化を考えたとき、より強く結合する分子が求められる。しかしその一方で、強く結合する分子はＲＮＡｉ活性を阻害する可能性がある。そこで、sｉＲＮＡ−ペプチド複合体がＲＮＡｉ活性をどの程度保持しているか確認した。
本例ではＡｐｏＢ１を標的としたsｉＲＮＡ及びトランスサイレチン（ｈＴＴＲ）を標的としたsｉＲＮＡ（ＳＳ：５’−ＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡＧＵＡＵＵＣＣＡＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）、ＡＳ：５’−ＡＵＧＧＡＡＵＡＣＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣｄＴｄＴ−３’（配列番号８）をモデルsｉＲＮＡとして用いて、陽イオン性オリゴペプチドがＲＮＡｉ活性に与える影響を評価した。終濃度が１０μＭのsｉＲＮＡ、０、１０、３０、５０μＭ peptideに調製したsｉＲＮＡ−ペプチド混合水溶液（０．６μＬ）、Lipofectamine2000（１μＬ）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（１００μＬ）をEppendorf Tube内で混合した。転倒混和後常温にて２０分放置してから、２４well-plateのwellに全量加えた。一方、１０ｃｍ ｄｉｓｈ１枚に１００％confluentな状態のラット肝癌由来細胞（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）を、トリプシンを用いて回収した後、Serum Free Mediumを５０％confluent状態となる様に加えた。この懸濁溶液を０．５ｍＬずつ各wellに加えて、３７℃で培養した。６時間後上清を捨て、通常の培養液であるＤＭＥＭ溶液（１０％ＦＢＳ ＋ １％ penicillin/streptomycin）を０．５ｍＬずつ加えた。２４時間後、上清を捨てて細胞からＩｓｏｇｅｎを用いてＲＮＡを抽出し、４００ｎｇのＲＮＡからSuper Script IIIとRandom Hexamersを用いてｃＤＮＡを合成した。さらにこれを１０分の１に希釈した後、quantitative TaqMan system using the Light Cycler 480 Real-Time PCR InstrumentとｒＡｐｏＢとｒＧＡＰＤＨのプライマー及びプローブを用いてｑＰＣＲを行い、ｒＡｐｏＢとｒＧＡＰＤＨの発現量を定量した。
sｉＲＮＡとペプチド複合体の調製は、融解温度測定やヌクレアーゼ耐性試験と同様に、アニーリングしたsｉＲＮＡに１当量のＤａｂ８又はＡｇｐ８を加えて調製した。結果を図３４に示す。図３４の縦軸は、相対的ＲＮＡ活性を示す。ここに示す通りに、両オリゴペプチドにおいてこれらを加えていない系と同程度のＲＮＡｉ活性が認められた。このことから１当量のＤａｂ８とＡｇｐ８は、ＲＮＡｉ活性に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
しかし、sｉＲＮＡに対して１当量のＤａｂ８とＡｇｐ８を加えた場合、主溝の一部にしかオリゴペプチドが結合していないために、sｉＲＮＡの活性が保持されていたことが考えられる。また、１当量のＤａｂ８とＡｇｐ８の添加では十分な酵素耐性を示さないことは実施例３−２にて示した通りである。そこで、sｉＲＮＡに対して加えるペプチドの当量を増やし、主溝に対して十分あるいは過剰量のペプチドが存在した状態でsｉＲＮＡ−ペプチド複合体を調製し、ＲＮＡｉ活性に対する影響を検討した。ｈＡｐｏＢに働くsｉＲＮＡに対して１当量、３当量、及び、５当量のＤａｂ８とＡｇｐ８を添加して複合体を調製し、１当量の時と同様にＲＮＡｉ活性を確認した（図３５；図３５の縦軸は、相対的ＲＮＡ活性を示す）。その結果、ｈＡｐｏＢに働くsｉＲＮＡに対してＤａｂ８を加えた系及び１当量のＡｇｐ８を加えた系ではＲＮＡｉ活性が保持されることが明らかとなった。一方、３当量及び５当量のＡｇｐ８を加えた系では、ペプチドの添加量依存的に若干ではあるが、ＲＮＡｉ活性の低下が観測された。融解温度測定時に観測された様に、５当量のＡｇｐ８をsiＲＮＡに加えた場合には、ＲＮＡ二重鎖の凝集による活性の低下が考えられる。しかし、それほど吸光度の減少が見られなかった３当量のＡｇｐ８を用いた系でも、ＲＮＡｉ活性の減少が認められたことから、Ａｇｐ８はsiＲＮＡと強く結合し、細胞質中でも解離しづらいためにＲＮＡｉ活性を阻害したとも考えられる。阻害の機構は、ＲＩＳＣ形成時のＡｇｏ蛋白質のsiＲＮＡに対する結合阻害や、ＲＩＳＣ形成時のsｉＲＮＡ二重鎖の解離を阻害することが考えられる。siＲＮＡに対してＡｇｐ８を１〜５当量用いた複合体はほぼ同じ熱安定性を示したにもかかわらず、Ａｇｐ８を１当量用いただけで十分なsｉＲＮＡ活性を示したことから、sｉＲＮＡ二重鎖の解離を阻害した影響とは考えがたい。そのため、過剰量のＡｇｐ８はsｉＲＮＡのＲＩＳＣ形成過程を阻害したと考えられる。一方Ｄａｂ８はＡｇｐ８と比較して結合力が弱いため、いずれかのプロセスでsｉＲＮＡから解離し、ＲＩＳＣ形成を阻害しなかったためＲＮＡｉ活性が保持されたと考えられる。この結果より、酵素耐性の獲得には不十分量である１当量のペプチドではＤａｂ８、Ａｇｐ８ともにＲＮＡｉ活性を阻害しないが、主溝をすべて覆うのに十分な３当量以上では、Ｄａｂ８を用いた系では活性を保持したのに対して、Ａｇｐ８を用いた系ではＲＮＡｉ活性が若干ではあるが阻害された。このことから、Ａｇｐ８はＲＮＡ二重鎖に対する結合力は強いが、sｉＲＮＡに対して過剰量用いる場合にはその具体的な用量に留意する必要があると考えられる。一方、Ｄａｂ８は過剰量用いることで十分なヌクレアーゼ耐性を獲得し、かつ、ＲＮＡｉ活性を阻害せずにsｉＲＮＡに結合するため、ＲＮＡｉ医薬のＤＤＳの有用な分子として期待される。
［実施例４］ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖のＲＮａｓｅに対する挙動の検討
前述した様にＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖が核酸医薬として用いられる場合、ＲＮＡと複合化されたＤＮＡが特定のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸として働くことを目的とする場合が考えられ、元々ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は総合的にヌクレアーゼに対して優れた耐性を伴うことが知られている（例えば、特許文献１）。その反面で、実施例２−４（１）にて示した通りに熱変性温度が低くなっているが、実施例２−４（３）にて示した様に、陽イオン性ペプチドを結合させたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖では熱安定性を向上させることが可能であり、その結果、人体におけるヌクアーゼ安定性もまた向上させることができる。
しかしながら既に述べた様に、少なくとも細胞内におけるＲＮaseＨの働きを決定的に阻害しないことが必要であり、ここではＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮaseＡに対する挙動と共に、さらにＲＮaseＨに対する作用を検討した。
(実施例４−１） ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖のＲＮaseＡに対する耐性の検討
（ａ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮaseＡに対する耐性を定量的に評価するため、ＨＰＬＣによる解析を行った。実施例２−４において用いたのと同じＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をアニーリングした後、各陽イオン性ペプチド［アミノ基を伴うペプチド（Ｄａｐ８、Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８）、及び、グアニジノ基を伴うペプチド（Ａｇｐ８、Ａｇｂ８、Ａｒｇ８、Ａｇｈ８）］を加えて複合体を形成し、終濃度４μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対して、それぞれ１０、２、１、０．５、０．１μｇ／ｍｌのＲＮaseＡとなる様に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）でサンプルを調製した。各サンプルは３７℃下で３０分処理した後に、ＲＮaseＡ阻害剤を加えて反応を停止し、ＨＰＬＣにて分解速度を解析した。
その結果、４μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は１μｇ／ｍｌ以上のＲＮaseＡに対しては耐性を示さず、全長(full length)のＲＮＡ鎖はほぼ分解されていた。これに対しいずれの陽イオン性ペプチドを加えた場合でも決定的なＲＮaseＡ耐性の向上は認められなかったが、分解の促進は認められなかった。分解プロファイルは陽イオン性ペプチドごとに異なり、特にＤａｂ８とＡｇｐ８では比較的長鎖と思われるＲＮＡが観測された。この結果はペプチドが核酸二重鎖の結合した一部分のみＲＮaseＡ耐性が向上したのではないかと推測される。
（ｂ）次に人体内の核酸医薬の投与環境を想定して、比較的低濃度である１μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の陽イオン性ペプチド結合の効果を検討した。
上記(ａ)と同様にして、１μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対するＤａｂ８の結合の有無によるＲＮaseＡ耐性に与える影響を考察した。ＲＮaseＡの共存量は比較的低比率に設定し、０．１、０．５μｇ／ｍｌの２種類の共存群を設けた。結果を図３６に示す。図３６の左がaseＡを０．５μｇ／ｍｌ共存させた場合の結果であり、右が同じく０．１μｇ／ｍｌ共存させた場合の結果である。各々のＲＮaseＡの濃度条件において有意に全長(full length)のＲＮＡ鎖の残存率を向上させた。これはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の解離した部位からＲＮaseＡにより分解されるため、熱安定性の向上によりＲＮaseＡ耐性が向上したと考えてられる。
以上示した結果からＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においては、ＲＮaseＡに対する耐性は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に比べて低下せずに、条件によっては向上させることが明らかになった。これは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を核酸医薬として用いる場合の人体における標的部位に達するまでの安定性を示している。
（実施例４−２）ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖のＲＮaseＨに対する促進性の検討
終濃度１μＭ又は４μＭ ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖となるように１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）でサンプルを調製した。各サンプルは２０ｕ（ユニット）ＲＮaseＨを加えて３０℃で３０分処理した後に、ＲＮaseＨ阻害剤を加えて反応を停止し、ＨＰＬＣにて分解速度を解析した。その結果を図３７に示す。図３７は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対する陽イオン性ペプチドの結合の有無によるＲＮaseＨ活性に与える影響を考察した結果を示す図面であり、図中の点線より左が１μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における結果を示しており、点線より右が４μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における結果を示している。
前述した様にＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の熱安定性については比較的低い温度で二重鎖の解離変性が認められ、３０℃付近から二重鎖の安定性が低くなるためか、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮaseＨによる分解は比較的遅かった。これに対しアミノ基を伴う陽イオン性ペプチド（Ｄａｂ８、Ｏｒｎ８、Ｌｙｓ８）を結合させると、１μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の場合には、ＲＮaseＨによる一重鎖ＲＮＡ部分の分解の促進が認められた。グアニジノ基を伴う陽イオン性ペプチドを結合させた場合には、Ａｒｇ８とＡｇｈ８において優れたＲＮaseＨの分解活性の促進効果が認められた。すなわちこれらの５種類の陽イオン性ペプチドを結合させたＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮaseＨのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖におけるＲＮＡ一重鎖の分解活性を向上させ、これらのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖を標的核酸に対するアンチセンス核酸とする核酸医薬として非常に有望であることが明らかになった。ただし、顕著なＲＮaseＨの促進効果を示さないＤａｐ８、Ａｇｐ８、Ａｇｂ８においてもＲＮaseＨの作用はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖と同程度には認められており、これらの陽イオン性ペプチドの使用により認められる温度安定性を勘案すれば、これらの陽イオン性ペプチドもまた同様のＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖を標的核酸に対するアンチセンス核酸とする核酸医薬として有望であることが認められる。特にＡｇｐ８とＡｇｂ８における結果は、そのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に結合することによる二重鎖の構造変化により、ＲＮaseＨによるＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の認識の阻害が関係しているものと考えられる。
さらに二重鎖の融解温度を上昇させるため、４μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（Ｄａｂ８）に対してＲＮaseＨ処理を行うと、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のみでも効率的に分解されており、熱安定性の向上がＲＮaseＨの活性を増大させることが示唆された。これは二重鎖の熱安定性が向上してＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の構造が安定になることで、ＲＮaseＨにより認識されやすくなったためであると考えられる。これは上記の１μＭのＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における結果を裏付けるものであるともいえる。

Claims (24)

  1. 下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含む２〜４０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド領域であって、かつ、当該下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続部分以外は、連続しない１個のアミノ酸残基であるオリゴペプチド領域、を含むオリゴペプチド又は当該オリゴペプチド誘導体からなる二重鎖核酸結合剤が、相補鎖のうち一方が４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域を含む核酸であり、他方が当該一方の核酸と相補的な塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＰＮＡのキメラ型二重鎖と結合してなることを特徴とする、二重鎖核酸−ペプチド複合体。
    ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−、又は、式（ＩＩ）で示される基である。Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１〜３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（ＩＩ）で示される基の場合は炭素原子数１〜４のアルキレン基である。一つのオリゴペプチド領域においてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    ［式（ＩＩ）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
  2. キメラ型二重鎖はＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖であることを特徴とする、請求項１に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  3. 前記相補鎖の一方の核酸は、４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域の５’末端側及び／又は３’末端側において、連続又は不連続に修飾核酸を含む領域が設けられている複合ＤＮＡ鎖であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  4. 前記相補鎖の一方の核酸における前記修飾核酸はＢＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  5. ＢＮＡは、ＬＮＡ、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ３）−２’）ＢＮＡ、オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡからなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項４に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  6. 前記相補鎖の他方の核酸がＲＮＡであって、一方の核酸の修飾領域を含む領域に対して相補的な領域が修飾されており、当該修飾がＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する効果を有するものであることを特徴とする、請求項３〜５のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  7. 前記修飾が、２’−Ｏ−メチル化及び／又はホスホロチオエート化であることを特徴とする、請求項６に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  8. 前記相補鎖の他方の核酸に機能性分子が結合していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  9. 機能性分子は、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子である、請求項８に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  10. キメラ型二重鎖核酸は１８〜２５量体であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  11. Ｒ１は式（ＩＩ）の基であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  12. 式（ＩＩ）の基のＲ３、Ｒ４及びＲ５は全て水素原子である、請求項１１に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  13. Ｒ１は基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  14. 二重鎖核酸結合剤のオリゴペプチド領域の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  15. 二重鎖核酸結合剤のオリゴペプチド領域を構成するアミノ酸残基のうち光学活性を伴うアミノ酸残基は、全てＬ型、あるいは、全てＤ型の光学活性を有するアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  16. 二重鎖核酸結合剤は、デリバリー分子が結合しているオリゴペプチド又は当該オリゴペプチド誘導体であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  17. 式（Ｉ）のＲ２はメチレン基であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  18. 二重鎖核酸が１０〜２５量体であり、かつ、二重鎖核酸結合剤のオリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜１０であり、当該アミノ酸残基の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなることを特徴とする、請求項１〜１７に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  19. 二重鎖核酸が１８〜２５量体であり、かつ、二重鎖核酸結合剤のオリゴペプチド領域のアミノ酸残基数は８〜３４であり、当該アミノ酸残基の全てが式（Ｉ）のアミノ酸残基からなることを特徴とする、請求項１〜１７に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  20. 前記キメラ型二重鎖に対して、１〜３当量の二重鎖核酸結合剤が当該キメラ型二重鎖に結合していることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体。
  21. 請求項１〜２０のいずれかに記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体を含有することを特徴とする、医薬品組成物。
  22. 請求項２に記載の二重鎖核酸−ペプチド複合体を含有することを特徴とする、医薬品組成物。
  23. 下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含む２〜４０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド領域であって、かつ、当該下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続部分以外は、連続しない１個のアミノ酸残基であるオリゴペプチド領域、を含むオリゴペプチド又は当該オリゴペプチド誘導体からなる二重鎖核酸結合剤、並びに、４〜２５量体の相補鎖のうち一方が４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域を含む核酸であり、他方が当該一方の核酸と相補的な塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＰＮＡのキメラ型二重鎖、を緩衝液中にて接触させ、当該剤を当該複合二重鎖に結合させることによる複合体の形成により、当該複合二重鎖におけるＲＮａｓｅＨによる分解を促進することを特徴とする、二重鎖核酸分解の促進方法。
    ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−、又は、式（ＩＩ）で示される基である。Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋−ＣＨ２−の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１〜３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（ＩＩ）で示される基の場合は炭素原子数１〜４のアルキレン基である。一つのオリゴペプチド領域においてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    ［式（ＩＩ）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
  24. 前記キメラ型二重鎖は、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合二重鎖であることを特徴とする、請求項２３に記載の二重鎖核酸分解の促進方法。
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