CN105008533A - 嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂 - Google Patents

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Abstract

公开了可用于借助于反义效应改变靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域它们自身的侧翼为第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸，所述第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂还包括退火至反义链的互补链。多核苷酸可用于修饰细胞内的RNA转录水平、miRNA活性或蛋白质水平。

Description

嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂
技术领域
本发明涉及可用于借助于反义效应修饰靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域它们自身的侧翼为第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸，所述第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂包括嵌合单链多核苷酸。双链反义试剂还包括互补链。嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂可用于修饰细胞内的RNA转录水平或蛋白质水平。
背景技术
近年来，寡核苷酸已经成为称为核酸药物的药物产品的持续研发中感兴趣的对象，且具体地，从靶基因的高选择性和低毒性的观点来看，利用反义方法的核酸药物的研发正在积极地进行中。反义方法包括通过向细胞内引入与靶基因的mRNA(有义链)的部分序列互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸(ASO))，选择性地修饰或抑制由靶基因编码的蛋白质的表达的方法。类似地，反义方法还靶向miRNA并起作用以修饰这样的miRNA的活性。
如图1所示(上部)，当将包括RNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，ASO结合到靶基因的转录产物(mRNA)，且形成部分双链。众所周知，这种双链起遮蔽物的作用，以预防被核糖体翻译，并因此抑制由靶基因编码的蛋白质的表达。
另一方面，当将包括DNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，形成部分DNA-RNA异源双链体。因为RNA酶H识别这种结构，且从而分解靶基因的mRNA，抑制由靶基因编码的蛋白质的表达(图1，下部)。在很多情况下，与利用RNA ASO的情况相比，当DNA被用作ASO时(RNA酶H-依赖的途径)时，基因表达抑制效应更高。
当利用寡核苷酸作为核酸药物时，研发出了多种核酸类似物诸如锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)(注册商标)、其他桥接的核酸(BNA)等等，以增强对靶RNA的结合亲和力和体内稳定性。
如图2所示，由于天然核酸(RNA或DNA)的糖部分具有四个碳原子和一个氧原子的五元环，糖部分具有两种构象，N-型和S-型。众所周知，这些构象从一个构象转向另一个构象，并且从而，核酸的螺旋结构也采取不同的形式，A-型和B-型。由于充当前述ASO的靶的mRNA采取A-型的螺旋结构，糖部分主要地为N-型，因此从增加对RNA的亲和力的观点来看，ASO的糖部分采取N-型是非常重要的。在这种理念下研发的产品为修饰的核酸诸如LNA(2’-O,4’-C亚甲基-桥接的核酸(2’,4’-BNA))。例如，在LNA中，由于通过亚甲基基团桥接2’-位置的氧和4’-位置的碳，构象被固定为N-型，且在构象之间不再存在波动。因此，与利用传统的天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过并入若干单元的LNA合成的寡核苷酸具有非常高的对RNA的亲和力和非常高的序列特异性，并且还表现出极好的耐热性和核酸酶耐受性(参见专利文献1)。由于其他人工核酸也具有这样的特性，已经将很多注意力放在了与反义方法的利用等等相关的人工核酸上(参见专利文献1至9)。
尽管如此，即使利用这些高性能修饰的核酸的反义寡核苷酸的设计物，仍然缺少用作治疗剂的合适的效率、效力和/或安全性。
众所周知，ASO的长度显著地影响ASO的性能，但是具有两种形成鲜明对比的结果(非专利文献5-7)。更长的探针长度(例如，16-22个核苷酸)提供了对靶向的RNA序列的更高的结合强度(更高的Tm)和更大的特异性。更大的序列特异性通常导致较少的副作用且很少或没有毒性。然而，更长的探针的效力低。为了补偿这样低的活性，需要大的剂量。
相反，较短的探针长度(例如，12-15个核苷酸)最有效-这个长度范围通常提供了基因表达水平的最高的阻抑或抑制程度。然而，较短的探针具有较低的序列特异性并因此通常引起毒性副作用。
因此，对提供较短的ASO的效率和效力但是同时具有较长的ASO的安全性的多核苷酸存在需求。
此外，当将反义寡核苷酸用作药物时，可以以高特异性和高效率将相关的寡核苷酸递送至靶位点是重要的。用于递送寡核苷酸的方法包括利用脂质诸如胆固醇和维生素E(非-专利文献1和2)、利用受体-特异性的肽诸如RVG-9R(非专利文献3)、或利用靶位点特异性的抗体(非专利文献4)。
引用列表
专利文献
{PTL 1}JP 10-304889 A
{PTL 2}WO 2005/021570
{PTL 3}JP 10-195098 A
{PTL 4}JP 2002-521310 W
{PTL 5}WO 2007/143315
{PTL 6}WO 2008/043753
{PTL 7}WO 2008/029619
{PTL 8}WO 2003/011887
{PTL 9}WO 2007/131238
非专利文献
{NPL 1}Kazutaka Nishina等人,Molecular Therapy,Vol.16,734-740(2008)
{NPL 2}Jurgen Soutscheck等人,Nature,Vol.432,173-178(2004)
{NPL 3}Kazutaka Nishina等人,Molecular Therapy,Vol.16,734-740(2008)
{NPL 4}Dan Peer等人,Science,Vol.319,627-630(2008)
{NPL 5}Ellen Marie Straarup等人,Nucleic Acids Research,Vol.38(20),7100-7111(2010)
{NPL 6}Tsuyoshi Yamamoto等人,J.Nucleic Acids,Article ID 707323,7页(2012)
{NPL 7}Jan Stenvang等人,Silence,Vol.3:1,17页(2012)
发明内容
提供了新的嵌合反义多核苷酸和双链反义试剂，尽管具有增加的长度，但是其保留较短的多核苷酸(～13个碱基)的效率和效力。新的嵌合反义寡核苷酸包括短的缺口体(gapmer)反义寡核苷酸，在缺口体的5’末端、3’末端，或两个末端向该短的缺口体反义寡核苷酸添加另外的核苷酸。另外的核苷酸对蛋白质结合显示低的亲和力。另外，另外的核苷酸比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的DNA酶或RNA酶耐受性，且当递送嵌合反义多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂包括嵌合反义多核苷酸。因此，例如，根据本文的公开内容，可以将13个碱基的缺口体重新设计为20个碱基的缺口体，该缺口体在一个或两个末端添加有侧翼区域，所述侧翼区域包括这样的核苷酸：对蛋白质和蛋白质样(protein-like)细胞组分显示低的结合亲和力、比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的DNA酶/RNA酶耐受性和/或当递送嵌合反义多核苷酸时在细胞内消失。嵌合反义链的缺口体部分，即，中心区域、第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域可以是在标题为“Chimeric Double-Stranded Nucleic Acid”的PCT/JP2012/083180中描述的反义链中的任何一个，其全部内容通过引用并入本文。
本发明的发明人已经确定了，当引入细胞时，新的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂能够改变转录产物的活性或功能。转录产物可以是编码蛋白质的转录产物或非编码蛋白质的产物如miRNA。本申请还构思了用于借助于反义效应更改细胞内的蛋白质的表达水平，以及改变蛋白质结构的方法。
嵌合反义多核苷酸和双链反义试剂还可用于治疗患者，所述患者具有特征在于改变的基因表达水平使得例如蛋白质过表达的状况。通过利用包含嵌合反义多核苷酸或双链反义试剂的药物组合物治疗患者，可以特异性地将基因表达水平阻抑或抑制到蛋白质水平减少，从而改善状况的程度。
在某些实施方式中，提供以下内容。
(1)一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；
其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷酸。
(2)一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；
其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。
(3)根据项目(1或2)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括这样的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，所述中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别。
(4)根据项目(3)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域的核苷酸独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
(5)根据项目(4)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-20个DNA核苷酸。
(6)根据项目(4)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-12个DNA核苷酸。
(7)根据项目(1或2)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立地选自RNA核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸。
(8)根据项目(7)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述核苷酸类似物独立地选自LNA核苷酸、BNA核苷酸、2’-O-Me RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸。
(9)根据项目(8)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立地选自2’-O-Me RNA核苷酸和2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸的核苷酸。
(10)根据项目(1-9)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的核苷酸的至少一个被硫代磷酸酯化。
(11)根据项目(10)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的所有核苷酸都被硫代磷酸酯化。
(12)根据项目(1-11)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第一侧翼区域中的核苷酸是桥接的核苷酸。
(13)根据项目(1-12)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述桥接的核苷酸独立地选自LNA、cEt BNA、酰胺BNA(amideBNA)和cMOE BNA。
(14)根据项目(1-13)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域和所述第一侧翼区域中的核苷酸类似物中的至少一个被硫代磷酸酯化。
(15)根据项目(1-14)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述低蛋白质-亲和力核苷酸独立地选自2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸(boranophosphate nucleotides)、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、UNA和5-丙炔基尿嘧啶。
(16)根据项目(1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域。
(17)根据项目(1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二3’-侧翼区域。
(18)根据项目(1-15)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域和第二3’-侧翼区域。
(19)根据项目(1-18)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸还包括连接到所述嵌合反义多核苷酸的3’-末端和/或5’-末端的功能部分。
(20)根据项目(19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分具有选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能的功能。
(21)根据项目(19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分经由可切割的接头部分连接到所述嵌合反义多核苷酸。
(22)根据项目(19)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分是选自脂质、肽和蛋白质的分子。
(23)根据项目(22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。
(24)根据项目(22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚。
(25)根据项目(22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述肽选自受体配体片段和抗体片段。
(26)根据项目(22)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述蛋白质选自受体配体和抗体。
(27)根据项目(1或2)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸能够在25摄氏度下在pH7.2，100mM氯化钠，10mM磷酸钠的缓冲液中与细胞转录产物杂交。
(28)根据项目(27)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心区域与所述嵌合反义多核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物完全地互补。
(29)根据项目(27)所述的嵌合反义多核苷酸，其中当所述嵌合反义多核苷酸与所述嵌合反义多核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物杂交时，所述第二5’-侧翼区域和/或所述第二3’-侧翼区域包括至少一个错配的碱基。
(30)根据项目(29)所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第二5’-侧翼区域和/或所述第二3’-侧翼区域的所有碱基都是错配的。
(31)一种双链反义试剂，所述双链反义试剂包括根据项目(1-18)和(27-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸和退火至所述嵌合反义多核苷酸的互补链。
(32)根据项目(31)所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述互补链还包括连接到3’-末端和/或5’-末端的功能部分。
(33)根据项目(32)所述的双链反义试剂，其中所述功能部分具有独立地选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能的功能。
(34)根据项目(32)所述的双链反义试剂，其中所述功能部分经由可切割的接头部分被独立地连接到所述嵌合反义多核苷酸和/或所述互补链。
(35)根据项目(32)所述的双链反义试剂，其中所述功能部分是独立地选自脂质、肽和蛋白质的分子。
(36)根据项目(35)所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。
(37)根据项目(35)所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚。
(38)根据项目(35)所述的双链反义试剂，其中所述肽独立地选自受体配体片段和抗体片段。
(39)根据项目(35)所述的双链反义试剂，其中所述蛋白质独立地选自受体配体和抗体。
(40)根据项目(31)所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述嵌合反义多核苷酸能够在25摄氏度下在pH7.2，100mM氯化钠，10mM磷酸钠的缓冲液中与细胞转录产物杂交。
(41)一种药物组合物，所述药物组合物包含根据项目(1-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据项目(31-40)的任一项所述的双链反义试剂，和药物学上可接受的载体。
(42)一种修饰细胞内转录产物的功能的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据项目(1-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据项目(31-40)的任一项所述的双链反义试剂。
(43)一种改变细胞内蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据项目(1-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据项目(31-40)的任一项所述的双链反义试剂。
(44)一种改变细胞内蛋白质结构的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据项目(1-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据项目(31-40)的任一项所述的双链反义试剂。
(45)一种用于治疗患者的方法，所述患者具有特征在于改变靶基因的表达水平、功能或编辑的状况，所述方法包括：施用治疗上有效量的药物组合物至所述患者，所述药物组合物包含：
(a)至少一种根据项目(1-30)的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据项目(31-40)的任一项所述的双链反义试剂；和
(b)药物学上可接受的载体。
根据某些实施方式，通过将递送部分与复合体缔合，可以以高特异性和高效率将嵌合反义多核苷酸递送到靶位点。根据某些实施方式，通过将诸如递送部分的功能部分与双链复合体缔合，可以以高特异性和高效率将双链反义试剂递送到靶位点。
附图简述
[图1]图1是示出了某些反义方法的一般机制的图。如图中示出的，当将与靶基因的mRNA的部分序列互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸(ASO))(图中的“DNA”)引入到细胞内时，由靶基因编码的蛋白质的表达被选择性地抑制。在虚线框中，显示了降解机制，其中RNA酶H在mRNA与ASO杂交的位置处切割mRNA。由于RNA酶H切割的结果，mRNA通常将不会被翻译以产生功能基因表达产物。
[图2]图2是示出了RNA、DNA和LNA核苷酸的结构的示意图。
[图3]图3A-C是示出了嵌合多核苷酸的适合的实施方式的实例的示意图。核心5’-(第一5'侧翼)(中心区域)(第一3'侧翼)-3’可与(第二5’侧翼)和(第二3’侧翼)(图3A)、仅与(第二5’侧翼)(图3B)、或仅与(第二3’侧翼)(图3C)连接。
[图4]图4A-D是示出了嵌合多核苷酸的适合的实施方式的实例的示意图。嵌合多核苷酸5’-(第二5’侧翼)(第一5’侧翼)(中心区域)(第一3’侧翼)(第二3’侧翼)-3’链是能够与靶向的RNA链诸如转录产物杂交的反义核酸。在图示中，“X”代表功能部分，且可以独立地代表脂质(例如，胆固醇或生育酚)、糖或诸如此类，或蛋白质、肽(例如，抗体)或诸如此类。
[图5]图5显示了多种天然的和非天然的核酸部分的结构式。
[图6]图6A-6D是示出了关于嵌合有侧翼的反义寡核苷酸的设计的示意图，该嵌合有侧翼的反义寡核苷酸在5’和3’第二侧翼区域内并入了序列错配作为用于调节反义效应的效力的方式。
[图7]图7显示了示出施用全部都具有与ApoB1基因的碱基序列互补的序列的“20mer19PS”、“20mer12PS”和“13mer12PS”至Hep 1-6细胞，并通过定量PCR分析细胞内ApoB1基因的表达的量后获得的结果的图；每一种反义多核苷酸的序列；和比较每一种多核苷酸的设计的图。
[图8A]图8A显示了两个缺口体反义多核苷酸和三个嵌合有侧翼的反义多核苷酸的序列，以及比较每一种多核苷酸的设计的示意图。
[图8B]图8B显示了示出施用全部具有与ApoB1基因的碱基序列互补的序列的“20mer缺口体”、“20mer嵌合体5'/3'侧翼”、“20mer嵌合体3'侧翼”、“20mer嵌合体5'侧翼”和“13mer缺口体”至Hep 1-6细胞，并通过定量PCR分析细胞内ApoB1基因的表达的量后获得的结果的图。
[图9]图9是示出了通过将嵌合多核苷酸和对照多核苷酸(图的上部所示)施用至小鼠，并分析小鼠内ApoB1基因的表达的量获得的结果的图，ApoB1基因的转录产物被反义链靶向。
[图10]图10显示了RNA印迹分析的结果。检测到肝内缺失的T17和T20(-)与13mer的长度的杂交的信号(右下图)。在上图中显示了小鼠U6(内部对照)。
[图11]图11示出了多种嵌合单链多核苷酸的相对反义效应。
[图12]图12指示了与对照13mer相比，通过Gapdh mRNA表达水平标准化的ApoB mRNA表达水平。
[图13]图13显示了13mer和Toc-20mer-8U PS(-)单链多核苷酸的反义效应的比较或时间进程。
[图14]图14指示了多种嵌合单链多核苷酸对脂质水平(LDL-胆固醇、总胆固醇和甘油三酯)的影响。
[图15]图15呈现了嵌合反义寡核苷酸的实施方式和适合的互补链的示例实施方式的示意图。
[图16A]图16A显示了靶向ApoB1的缺口体反义多核苷酸和嵌合反义多核苷酸、以及用于与反义多核苷酸形成双链反义试剂的互补核苷酸的序列。
[图16B]图16B是示出了通过将图16A中所示的双链复合体施用至小鼠，并分析小鼠中ApoB1基因的表达的量获得的结果的图，ApoB1基因的转录产物被反义链靶向。
实施方式描述
包括下列结构的嵌合单链多核苷酸借助于反义效应在修饰或阻抑靶基因的表达或更通常地转录产物的水平中有活性：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸类似物；
连接到中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
第二5’-侧翼区域连接到第一5’-侧翼区域的5’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；且
第二3’-侧翼区域连接到第一3’-侧翼区域的3’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；
其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷酸。
另外，包括下列结构的嵌合单链多核苷酸借助于反义效应在修饰或阻抑靶基因的表达或更通常地转录产物的水平中有活性：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少一个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
第二5’-侧翼区域连接到第一5’-侧翼区域的5’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合反义多核苷酸时，在细胞内消失；且
第二3’-侧翼区域连接到第一3’-侧翼区域的3’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；
其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。
某些实施方式包括纯化的或分离的双链反义试剂，所述纯化的或分离的双链反义试剂包括上述的嵌合单链反义多核苷酸。
在一些实施方式中，反义链的中心核苷酸区域包括当反义链与转录产物杂交时被RNA酶H识别的至少4个连续的核苷酸，或在一些实施方式中，反义链的中心核苷酸区域包括当反义链与转录产物杂交时被RNA酶H识别的至少5个连续的核苷酸。
互补链包括核苷酸和任选地核苷酸类似物，和任选地低蛋白质-亲和力核苷酸，并且互补链能够退火至反义链。
在一些实施方式中，互补链包括：
(i)RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物，和任选地低蛋白质-亲和力核苷酸，和任选地DNA核苷酸；或
(ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物和/或低蛋白质-亲和力核苷酸；或
(iii)PNA核苷酸。
“反义效应”意指阻抑靶基因的表达或靶向的转录产物的水平，其由于靶向的转录产物(RNA有义链)与例如DNA链或更通常地经设计引起反义效应、与转录产物的部分序列互补的链等等的杂交而发生。在某些情况下，可以通过杂交产物遮蔽转录产物引起翻译或剪接功能修饰作用诸如外显子跳跃的抑制(参见在图1中的虚线包围的区域之外的上部中的描述)，和/或由于杂交部分的识别，可以发生转录产物的分解(参见在图1中的虚线包围的区域内的描述)。
其表达被反义效应阻抑的“靶基因”或“靶向的转录产物”没有具体限制，并且它们的实例包括其表达在多种疾病中增加的基因。同样，“靶基因的转录产物”是从编码靶基因的基因组DNA转录的mRNA，并且还包括没有经受碱基修饰的mRNA、还没有被剪接的mRNA前体等等。更通常地，“转录产物”可以是由DNA-依赖的RNA聚合酶合成的任何RNA。
如本文使用的，术语“核酸”可以指单体核苷酸或核苷，或可以意指由众多单体组成的寡核苷酸。术语“多核苷酸”和“核酸链”也在本文中用于指寡核苷酸。可以通过化学合成方法整个或部分地制备核酸链，所述化学合成方法包括利用自动的合成仪或通过酶促过程，包括但不限于聚合酶、连接酶、或限制反应。
本文使用的术语“嵌合多核苷酸”意指包括至少一个天然核苷酸(例如，DNA或RNA核苷酸)和至少一个非天然的核苷酸(例如，LNA、2’-O-甲基RNA)的多核苷酸，或完全地包括非天然的核苷酸的多核苷酸，并因此是非天然存在的多核苷酸。根据某些实施方式的嵌合多核苷酸是与转录产物诸如靶基因的转录产物互补的反义寡核苷酸。
术语“嵌合反义多核苷酸”或“嵌合ASO”意指包括与靶向的转录产物互补的序列的嵌合多核苷酸。
术语“双链反义试剂(double-stranded antisense agent)”意指可以引起反义效应的双链多核苷酸复合体。双链反义试剂可以包括两条或更多条多核苷酸链。在一些实施方式中，链被退火。在一些实施方式中，试剂包括两条链，反义链和互补链，这两条链能够退火以形成双链复合体。反义链是嵌合多核苷酸(详情如下)。互补链在一些实施方式中是嵌合多核苷酸，且在其他实施方式中由天然的核苷酸组成，且在其他实施方式中包括肽核酸单元。
如本文使用的术语“互补的”意指其中可以经由氢键键合形成所谓的Watson-Crick碱基对(天然类型的碱基对)或非Watson-Crick碱基对(Hoogsteen碱基对等等)的关系。靶向的转录产物(例如，靶基因的转录产物)的碱基序列，和嵌合反义多核苷酸的碱基序列不必完全地互补，且如果碱基序列具有至少70％或更高，优选地80％或更高，且更优选地90％或更高(例如，95％、96％、97％、98％、或99％或更高)的互补性，是可以接受的。可以通过利用BLAST程序等等确定序列的互补性。当序列是互补的时，第一链能够“退火”或“杂交”至第二链。考虑链之间的互补性的程度，本领域的普通技术人员可以容易地确定两条链可以退火的条件(温度、盐浓度，等等)。同样，基于例如，靶基因的碱基序列的信息，本领域的普通技术人员可以容易地设计与靶向的转录产物互补的反义核酸。
嵌合反义多核苷酸的链长度没有具体限制，但是链长度通常是至少8个碱基、至少10个碱基、至少12个碱基、或至少13个碱基。链长度可以多达20个碱基、25个碱基或35个碱基。链长度甚至可以长达大约100个碱基。长度的范围可以是10至35个碱基、12至25个碱基、或13至20个碱基。在某些情况下，除了其他因素诸如成本、合成产率等等之外，长度的选择通常取决于反义效应的强度与核酸链对靶的特异性的平衡。
在一些实施方式中，嵌合ASO的长度的选择和它与靶链之间的互补性的程度也取决于其被RNA酶H切割之后，嵌合ASO和靶链之间的结合亲和力。ASO的效力取决于切割之前ASO与靶的结合亲和力以及切割的材料从ASO分离使得它自由地结合到另一个靶链的解离率。
嵌合反义多核苷酸包括“中心区域”、“第一5’-侧翼区域”和“第一3’-侧翼区域”。嵌合多核苷酸还包括“第二5’-侧翼区域”或“第二3’-侧翼区域”，或两者。下面进一步解释这些区域。具体的核苷酸到一个这样的区域或另一个区域的分配不是专有的。可以存在几种方式以将给定的多核苷酸的核苷酸分配到不同的区域。这些区域名称是为了方便，尽管很显然，通过制备其中核苷酸提供这样的区域的序列，多核苷酸将获得本文描述的功能性能。
“中心区域”包括天然的和非天然的核苷酸二者。选择用于中心区域的核苷酸的类型在很大程度上决定可能的反义作用机制的类型。例如，在中心区域中包括DNA和/或DNA-样核苷酸可以导致可被RNA酶H识别的DNA/RNA异源双链体结构的形成。因此，在这种情况下，RNA酶H-依赖的作用机制是可能的。另一方面，如果从中心区域排除DNA和/或DNA-样核苷酸，那么预期会发生RNA酶H-非依赖的作用机制。当然，即使形成DNA/RNA异源双链体结构，仍然可能发生RNA酶H-非依赖的机制。
在一些实施方式中，中心区域包括至少5个核苷酸，所述至少5个核苷酸“当与RNA多核苷酸杂交时，中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别”。
当与RNA杂交时“被RNA酶H识别”的“至少5个核苷酸”通常是包括5至20个连续的碱基的区域、包括5至16个连续的碱基的区域、包括5至12个连续的碱基的区域、或包括5至8个连续的碱基的区域。此外，可用于这个区域的核苷酸是当与RNA核苷酸杂交时，被RNA酶H识别的那些，如天然的DNA，其中RNA酶H切割RNA链。适合的核苷酸诸如修饰的DNA核苷酸和其他碱基在本领域是已知的。已知含有2’-羟基基团的核苷酸，如RNA核苷酸是不合适的。当期望RNA酶H-依赖的效应时，本领域的技术人员可以容易地确定用于在“至少5个核苷酸”的这个区域中使用的核苷酸的适宜性。在一个实施方式中，中心核苷酸区域的核苷酸独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
在一些实施方式中，中心区域可以包括少至4个这样的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别。
在其他实施方式中，中心区域不包括DNA。也就是说，在某些实施方式中，反义核酸具有RNA酶H-非依赖的效应，或可替换地，非RNA酶H-依赖的反义效应。“非RNA酶H-依赖的反义效应”意指当使靶基因的转录产物(RNA有义链)和与转录产物的部分序列互补的核酸链杂交时，由于翻译或剪接功能修饰作用诸如外显子跳跃的抑制而发生的阻抑靶基因的表达的活性(参见在图1中的虚线包围的区域之外的上部的描述)。
“不包括DNA的核酸”意指不包括天然的DNA和修饰的DNA的反义核酸，且它的实例可以是RNA、修饰的RNA、核苷酸类似物、PNA、或包括吗啉代核酸的核酸。此外，关于“不包括DNA的核酸”，从对核酸酶的耐受性是高的观点来看，核酸的部分或全部可以包括修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物。这样的修饰的实例包括下面描述的那些，且相同的核苷酸可以经受多种修饰的组合。此外，如下面描述的，与修饰的核酸的数目和修饰的位置相关的优选的实施方式可以通过在修饰之后测量由嵌合多核苷酸具有的反义效应来表征。
中心区域中的核苷酸的碱基序列和靶基因的转录产物的碱基序列彼此不必完全地互补，且碱基序列可以具有至少70％或更高、优选地80％或更高、且更优选地90％或更高(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的互补性。
对“不包括DNA的核酸”的长度没有具体的限制，但是长度如以上描述的，且通常是5至35个碱基、5至25个碱基、12至25个碱基、或13至20个碱基。
对“不包括DNA的核酸”的长度没有具体的限制，但是长度如以上描述的，且通常是5至35个碱基、5至25个碱基、12至25个碱基、或13至20个碱基。
如本文使用的，“DNA核苷酸”意指天然的DNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键(phosphate linkage)亚单元的DNA核苷酸。类似地，“RNA核苷酸”意指天然的RNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元是这样的亚单元：其中在亚单元中添加或取代了单个取代基，且该亚单元作为整体没有被不同的化学基团取代。从包括核苷酸的区域的部分或整体具有高的对脱氧核糖核酸酶等等的耐受性的观点来看，DNA可以是修饰的核苷酸。这样的修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化(phosphorothioation)、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化(phosphorodithioation)、磷酰胺化(phosphoroamidation)、2’-O-甲基化、2’-甲氧乙基(MOE)化、2’-氨丙基(AP)化和2’-氟化。然而，从具有极好的药代动力学观点来看，优选硫代磷酸酯化。可以实行这样的修饰，使得相同的DNA可以经受多种修饰的组合。并且，如下面讨论的，RNA核苷酸可以被修饰以取得相似的效果。
在某些情况下，修饰的DNA的数目和修饰的位置可影响由本文公开的嵌合反义多核苷酸提供的反义效应等等。由于这些实施方式可随着靶基因的序列等等而变化，它可以取决于多种情况，但是本领域的普通技术人员可以通过参考与反义方法相关的文献的描述确定适合的实施方式。此外，当测量在修饰之后嵌合反义多核苷酸具有的反义效应时，如果因此获得的测量的值没有显著地低于修饰之前嵌合反义多核苷酸的测量的值(例如，如果在修饰之后获得的测量的值低于修饰之前嵌合反义多核苷酸的测量的值的30％或比修饰之前嵌合反义多核苷酸的测量的值更多)，可以评价相关的修饰。如下面的实施例所示，可以通过下列步骤实行反义效应的测量：将处于测试中的核酸化合物引入细胞等等，且通过适当利用已知的技术诸如Northern印迹、定量PCR和蛋白质印迹，测量细胞内的靶基因的表达的量(mRNA的量、cDNA的量、蛋白质的量，等等)，其中所述表达被处于测试中的核酸化合物提供的反义效应阻抑。候选试剂可以是嵌合反义多核苷酸自身，或作为双链反义试剂的部分的嵌合反义多核苷酸。
如本文使用的，“RNA核苷酸”意指天然存在的RNA核苷酸，或具有修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元的RNA核苷酸。修饰的碱基、糖或磷酸酯键亚单元是这样的亚单元：其中在亚单元中添加或取代了单个取代基，且该亚单元作为整体没有被不同的化学基团取代。
从具有高的对核酸酶诸如核糖核酸酶(RNA酶)的耐受性的观点来看，核酸的部分或全部可以是修饰的核苷酸。这样的修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、磷酰胺化、2’-O-甲基化、2’-甲氧乙基(MOE)化、2’-氨丙基(AP)化、脱氧核糖(导致‘UNA’)的2’-碳和3’-碳之间的断裂和2’-氟化。同样地，还构思了具有胸腺嘧啶碱基取代了尿嘧啶碱基的RNA核苷酸。然而，从具有极好的药代动力学观点来看，使用硫代磷酸酯化。此外，可以实行这样的修饰，使得相同的核酸可以经受多种修饰的组合。例如，如下面描述的实施例中使用的，相同的RNA可以经受硫代磷酸酯化和2’-O-甲基化，以便提供对酶促切割的耐受性。如本文使用的，“核苷酸类似物”意指非-天然地存在的核苷酸，其中碱基、糖或磷酸酯键亚单元在亚单元中具有多于一个添加的或取代的取代基，或亚单元作为整体被不同的化学基团取代。具有多于一个取代的类似物的实例是桥接的核酸，其中桥接的单元凭借糖环上的两个取代被添加，所述桥接的单元通常连接到2’和4’碳原子。关于根据某些实施方式的第一侧翼，从增加对靶基因的转录产物的部分序列的亲和力和/或靶基因对核酸酶的耐受性的观点来看，第一侧翼还包括核苷酸类似物。“核苷酸类似物”可以是其中由于修饰(桥接的基团、取代基，等等)，增强了对靶基因的转录产物的部分序列的亲和力和/或核酸对核酸酶的耐受性的任何核酸，且它的实例包括JP 10-304889 A、WO 2005/021570、JP 10-195098 A、JP 2002-521310 W、WO 2007/143315、WO 2008/043753、WO 2008/029619和WO 2008/049085中公开的适用于反义方法的核酸(在下文中，这些文献将被称为“与反义方法相关的文献”)。也就是说，它的实例包括以上描述的文献中公开的核酸:己糖醇核酸(HNA)、环己烷核酸(CeNA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、吗啉代核酸、三环-DNA(tcDNA)、2’-O-甲基化的核酸、2’-MOE(2’-O-甲氧乙基)化的核酸、2’-AP(2’-O-氨丙基)化的核酸、2’-氟化的核酸、2’-F-阿拉伯糖核酸(2’-F-ANA)和BNA(桥接的核酸)。
根据某些实施方式，BNA可以是其中通过两个或更多个原子桥接2’碳原子和4’碳原子的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。本领域的技术人员已知桥接的核酸的实例。这样的BNA的一个亚组可以描述为具有通过4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'桥接的在2’-位置的碳原子和4’-位置的碳原子(这里，p、m和n分别地代表从1至4的整数、从0至2的整数和从1至3的整数；且R3代表氢原子、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团和单元取代基(荧光或化学发光标记的分子、具有核酸切割活性的官能团、细胞内或细胞核内定位信号肽等等))。此外，关于根据某些实施方式的BNA，在3’-位置的碳原子处的OR2取代基和5’-位置的碳原子处的OR1取代基中，R1和R2通常是氢原子，但是彼此可以是相同的或不同的，且也可以是用于核酸合成的羟基基团的保护基团、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团、甲硅烷基基团、磷酸基团、由用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团、或-P(R4)R5(这里，R4和R5，彼此可以是相同的或不同的，各自代表羟基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的羟基基团、巯基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1至5个碳原子的烷氧基基团、具有1至5个碳原子的烷硫基基团、具有1至6个碳原子的氰基烷氧基基团、被具有1至5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团)。这样的BNA的非限制性实例包括α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA或β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA，其又名为LNA(锁核酸(注册商标)，2’,4’-BNA)、乙烯基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA，其又名为ENA、β-D-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA、氨基氧基(4’-CH2-O-N(R3)-2’)BNA、氧氨基(4’-CH2-N(R3)-O-2’)BNA，其又名为2’,4’-BNANC、2',4'-BNACOC、3’-氨基-2’,4’-BNA、5’-甲基BNA、(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA，其又名为cEt BNA、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA，其又名为cMOE BNA、酰胺BNA(4’-C(O)-N(R)-2’)BNA(R＝H、Me)，其又名为AmNA、以及本领域的技术人员已知的其他BNA。
根据某些实施方式，解锁核酸(UNA)可以是其中2’碳原子和3’碳原子之间的共价键断裂以引起增加柔性的任何核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。本领域的技术人员已知解锁核酸的实例。
此外，在核苷酸类似物中，根据某些实施方式，可以修饰碱基部分。碱基部分的修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；和鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化。此外，在根据某些实施方式的修饰的核酸中，磷酸二酯结合位点可以被修饰。磷酸二酯结合位点的修饰的实例包括硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、和磷酰胺化。然而，从具有极好的药代动力学的观点来看，硫代磷酸酯化可被用于例如中心区域和第一侧翼区域。同样，可以实行这样的碱基部分的修饰或磷酸二酯结合位点的修饰，使得相同的核酸可以经受多种修饰的组合。
通常，修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物不限于本文例示的那些。本领域已知许多修饰的核苷酸和修饰的核苷酸类似物，诸如例如Tachas等人的美国专利号8,299,039特别是第17-22栏中公开的那些，并且可被用于本申请的实施方式。在图5中显示了天然的核苷酸、修饰的核苷酸、和核苷酸类似物的实例。
本领域的普通技术人员可以在这样的修饰的核酸之中适当选择和使用核苷酸类似物同时考虑反义效应、对靶基因的转录产物的部分序列的亲和力、对核酸酶的耐受性，等等。然而，在一些实施方式中，核苷酸类似物是由下式(1)表示的LNA：
[化学式l]
在式(1)中，“碱基”代表可以被取代的芳香族杂环基团或芳香族烃环基团，例如，天然的核苷的碱基部分(嘌呤碱基或嘧啶碱基)、或非天然的(修饰的)核苷的碱基部分，同时碱基部分的修饰的实例包括以上描述的那些；且
R1和R2，彼此可以是相同的或不同的，各自代表氢原子、用于核酸合成的羟基基团的保护基团、烷基基团、烯基基团、环烷基基团、芳基基团、芳烷基基团、酰基基团、磺酰基基团、甲硅烷基基团、磷酸基团、由用于核酸合成的保护基团保护的磷酸基团、或-P(R4)R5(这里，R4和R5，彼此可以是相同的或不同的，各自代表羟基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的羟基基团、巯基基团、由用于核酸合成的保护基团保护的巯基基团、氨基基团、具有1至5个碳原子的烷氧基基团、具有1至5个碳原子的烷硫基基团、具有1至6个碳原子的氰基烷氧基基团、或具有1至5个碳原子的烷基基团取代的氨基基团。
将由上述化学式显示的化合物表示为核苷，但是“LNA”且更通常地，根据某些实施方式的BNA包括其中磷酸衍生的基团结合到相关的核苷(核苷酸)的核苷酸形式。换句话说，BNA诸如LNA被归为构成双链核酸复合体的核酸链中的核苷酸。
此外，在一些实施方式中，核苷酸类似物是由下列式(2)和(3)表示的解锁核酸(UNA)：
[化学式2]
[化学式3]
解锁核酸(UNA)寡核苷酸是柔性的RNA模拟物，其能够使它们调节它们对其他核苷酸的亲和力和特异性。解锁核酸UNA是非环式-RNA类似物，且又名为2’,3’-开环-RNA，其中C2’-C3’键断裂。键断裂使得它们有柔性并引起它们调节多种核酸的热力学稳定性。
根据某些实施方式，“第一5’-侧翼区域”和“第一3’-侧翼区域”分别位于5’侧面和3’侧面，且连续地连接到中心区域的每一末端的末端核苷酸。
紧邻中心区域的5’-侧面布置的包括核苷酸类似物的区域(在下文中，也称为“第一5’侧翼区域”)和紧邻中心区域的3’侧面布置的包括核苷酸类似物的区域(在下文中，也称为“第一3’侧翼区域”)各自可以独立地包括在与反义方法相关的文献中讨论的核苷酸类似物中的至少一种，且除了这样的核苷酸类似物之外，还可以包括天然的核酸(DNA或RNA)。此外，第一5’侧翼区域和第一3’侧翼区域的链长度通常独立地是1至10个碱基、1至7个碱基、或2至5个碱基。
此外，存在第一5’侧翼区域和第一3’侧翼区域中核苷酸类似物和天然的核苷酸的种类的数目和位置的适合的实施方式，因为在某些实施方式中，那些核酸的数目和位置可能影响由双链核酸复合体提供的反义效应等等。由于这些适合的实施方式可以随着序列等等而变化，它可以取决于多种情况，但是本领域的普通技术人员可以通过参考与反义方法相关的文献的描述确定适合的实施方式。此外，当以与在包括“至少5个核苷酸”的区域的情况中相同的方式测量修饰之后由单独的反义链或双链反义试剂具有的反义效应时，如果因此获得的测量的值没有显著地低于修饰之前的链或试剂的测量的值，那么相关的修饰可以被评价为优选的实施方式。
如以上所指出的，嵌合反义多核苷酸包括至少一个“第二侧翼”区域。一些实施方式可以仅包括在多核苷酸的5’末端或3’末端的一个第二侧翼区域，或嵌合反义多核苷酸可以包括第二5’侧翼区域和第二3’-侧翼区域二者。在图3A-3C中示出了这些结构设计。
如果存在，“第二5’-侧翼区域”和“第二3’-侧翼区域”包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸。
“低蛋白质-亲和力核苷酸”是这样的核苷酸：(i)比天然的DNA或RNA核苷酸具有更强的对DNA酶或RNA酶的耐受性且(ii)对蛋白质或蛋白质样细胞组分具有低的结合亲和力。具体地，核苷酸比硫代磷酸酯化的核苷酸具有更低的对蛋白质的结合亲和力。因此，低蛋白质-亲和力核苷酸是以上描述的修饰的核苷酸或核苷酸类似物，但是核苷酸没有被硫代磷酸酯化。
低蛋白质-亲和力核苷酸的实例包括2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、解锁核酸(UNA)和5-丙炔基尿嘧啶。
本文公开的第二侧翼延长了目标嵌合多核苷酸的长度，超过通常所期望的ASO长度。然而，此处和在下面的实例中描述的，通过在第二侧翼区域中包括低蛋白质-亲和力核苷酸，减少或甚至消除通常在较长长度的ASO中观察到的性能降低。换句话说，可以利用本文描述的嵌合反义多核苷酸获得的基因表达抑制的程度接近于不具有第二侧翼区域因此长度必然更短的传统的缺口体ASO的性能。并且，可以利用本文描述的双链反义试剂获得的基因表达抑制的程度接近、等于、并且在一些实施方式中超过不具有第二侧翼区域因此长度必然更短的传统的单链缺口体ASO的性能。
每一个第二侧翼区域的长度是独立的。除了对嵌合反义多核苷酸的整个长度不超过100个核苷酸的整体限制之外，对每一个第二侧翼的长度没有具体的限制。
可以期望调整第二侧翼区域中碱基的结合亲和力。在一个极端，第二侧翼区域中的核苷酸可以被选择为与转录产物中的靶向的序列完全地互补。或者，第二侧翼区域序列可以与相应的靶完全地错配。并且，还构思了第二侧翼区域中匹配和错配的碱基对的任何组合。在图6A-6D中示意性地示出了这些选择。本领域知晓结合亲和力是反义抑制的性能中重要的考虑因素。如非专利文献6中讨论的，存在ASO和靶之间的结合亲和力的最佳范围用于获得ASO的最大效力。因此，可以根据本文公开的实施方式，最佳化第二5’-侧翼区域和第二3’侧翼区域内并入的匹配和错配的碱基的长度、碱基含量和模式，以供使用。
根据一些实施方式的互补链是与以上描述的嵌合反义多核苷酸互补的多核苷酸。互补链的碱基序列和嵌合反义链的碱基序列彼此不必完全地互补，并且碱基序列可以具有至少70％或更高、优选地80％或更高、且更优选地90％或更高(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更高)的互补性。
互补链是包括选自RNA、DNA、PNA(肽核酸)和BNA(例如，LNA)的核酸中的至少一种的多核苷酸。更具体地，互补链包括(i)RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物、和任选地低蛋白质-亲和力核苷酸、和任选地DNA核苷酸；或(ii)DNA核苷酸和/或核苷酸类似物和/或低蛋白质亲和力核苷酸；或(iii)PNA核苷酸。
术语“RNA核苷酸和任选地核苷酸类似物、和任选地低蛋白质-亲和力核苷酸、和任选地DNA核苷酸”意指，互补链包括RNA核苷酸、且任选地还可以在链中包括核苷酸类似物、且任选地还可以在链中包括低蛋白质-亲和力核苷酸、且任选地还可以在链中包括DNA核苷酸。术语“DNA核苷酸和/或核苷酸类似物和/或低蛋白质-亲和力核苷酸”意指，第二链可以包括DNA核苷酸或核苷酸类似物、或低蛋白质-亲和力核苷酸，或可以包括DNA核苷酸、核苷酸类似物、或低蛋白质-亲和力核苷酸的一些组合。术语“PNA核苷酸”意指，第二链可以基本上包括PNA核苷酸，尽管可以包括其他核苷酸。
当某些实施方式的双链反义试剂被细胞内的RNA酶H识别且互补的核酸链因此分解，释放嵌合反义链时，第二核酸链通常包括RNA核苷酸。在一些实施方式中，从功能分子诸如肽可以容易地结合到双链复合体的观点来看，第二核酸链包括PNA。
互补链的长度没有具体限制。互补链可以比嵌合反义多核苷酸短、与它一样大小、或比它长。在一些实施方式中，使用能够退火至两种或更多种嵌合反义多核苷酸的互补链。两种或更多种嵌合反义链可以靶向相同的序列或不同的序列。
在一些实施方式中，双链反义试剂包括多于两个多核苷酸。例如，两条反义链可以与一条互补链形成双链复合体。在PCT/JP2012/083180中公开了多个多组分双链复合体，且那些也可以应用于本申请中公开的双链反义试剂。
在一些实施方式中，互补的多核苷酸与天然的核苷酸相比，全部或部分地包括对核酸酶诸如核糖核酸酶(RNA酶)有耐受性的修饰的核苷酸或核苷酸类似物。这样的修饰的实例包括胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、和N4-甲基化；胸腺嘧啶的5-脱甲基化、5-氟化、5-溴化、和5-碘化；腺嘌呤的N6-甲基化和8-溴化；和鸟嘌呤的N2-甲基化和8-溴化；硫代磷酸酯化、甲基磷酸化、甲硫基磷酸化、手性甲基磷酸化、二硫代磷酸酯化、磷酰胺化、2’-O-甲基化、2’-甲氧乙基(MOE)化、2’-氨丙基(AP)化和2’-氟化。同样地，还构思了具有胸腺嘧啶碱基取代了尿嘧啶碱基的RNA核苷酸。互补链中也可并入低蛋白质-亲和力核苷酸。然而，在一些实施方式中，使用硫代磷酸酯化。此外，可以实行这样的修饰，使得相同的核酸可以经受多种修饰的组合。例如，如下面描述的实例中使用的，相同的RNA可以经受硫代磷酸酯化和2’-O-甲基化，以便提供对酶促切割的耐受性。然而，在预期或期望RNA核苷酸被RNA酶H切割的情况下，那么通常仅应用硫代磷酸酯化或2’-O-甲基化。
存在互补链内核苷酸类似物的数目和修饰的位置的适合的实施方式，因为在某些实施方式中，修饰的数目和位置可影响由双链反义试剂提供的反义效应等等。由于这些适合的实施方式可随着所要修饰的核酸的类型、序列等等而变化，它可以取决于多种情况，但是类型、序列等等可以以与以上描述相同的方式，通过测量修饰之后的双链反义试剂所具有的反义效应来表征。
在一些实施方式中，从当通过核糖核酸酶诸如RNA酶A的分解被抑制，直到互补链被递送至特定细胞的细胞核内时，互补链在特定细胞中可以容易地表现出由RNA酶H分解的反义效应的观点来看，互补链通常包括RNA，且可并入增加核酸酶稳定性和/或Tm的核苷酸。例如，在与嵌合反义链的侧翼区域之一(也就是，第一或第二5’侧翼区域和/或第一或第二3’侧翼区域)互补的互补链的区域中，人们任选地可以并入一个或更多个修饰的核酸、一个或更多个核苷酸类似物、和/或一个或更多个低蛋白质-亲和力核苷酸，这有助于阻抑酶诸如核糖核酸酶分解复合体。
根据某些实施方式，修饰是RNA的2’-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化。此外，在一些实施方式中，可以修饰与反义链的侧翼区域之一互补的互补链的整个区域，或可以修饰与反义链的侧翼区域互补的区域的部分。另外，修饰的区域可以比包括第一核酸链的修饰的核酸的区域长、或可以比其短，只要修饰的区域包括那个部分。在图15中显示了关于反义链的结构的互补链的结构的一些实施方式的实例。首先，上部结构是双侧翼反义多核苷酸(DW-ASO)。下面是互补链的四个实例。例如，在期望双链试剂易受RNA酶H切割的情况下，那么优选地，与中心区域互补的互补链的部分包括RNA。(RNA(o)＝具有二磷酸酯键的RNA)。与DW-ASO的多个侧翼区域互补的互补链的部分也可包括修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物。例如，在互补链中也可包括双侧翼结构(cRNA(DW))。或者，在每一个末端与第一和第二侧翼区域互补的互补链的部分可以包括修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，尽管不一定包括低蛋白质-亲和力核苷酸(cRNA(G)或cLNA(G)；G指的是“缺口体”结构)。或者，互补链可以包括肽核酸。图6显示了结构的简易图，且多个互补的区域不一定被登记上。本领域的技术人员可以容易地明白，结构可以被修饰而不会偏离双链反义试剂的期望的功能性，包括组成的多核苷酸的功能性。最后，图15中所示的互补链包括5’末端的官能团“X”。这样的基团任选地被包括且描述如下。
在双链反义试剂中，组成的多核苷酸的一个或更多个还可包括功能部分。
在一些实施方式中，与反义多核苷酸互补的链可以包括结合到多核苷酸的功能部分。返回参考图15，功能部分“X”被示出为连接到互补链的多个实例的5’末端。下面进一步描述的功能部分可以可选地连接在3’末端，或在多核苷酸内部的位置处。在其他实施方式中，互补链包括多于一个功能部分，所述多于一个功能部分可以连接在多个位置处，和/或作为基团连接到多核苷酸的一个位置处。
在一些实施方式中，嵌合反义多核苷酸可以包括键合到多核苷酸的功能部分。例如，如图4B、4C和4D所示，可以将功能部分连接到嵌合反义多核苷酸的5’末端核苷酸、或3’-末端核苷酸、或5’和3’末端核苷酸二者。当然，功能部分也可以连接到内部位置处，且如上所描述的，可以连接多于一个部分。
在某些实施方式的嵌合反义多核苷酸中，功能部分可以与多核苷酸键合。多核苷酸(例如，反义多核苷酸或互补多核苷酸)和功能部分之间的键合可以是直接的键合，或可以是通过另外的物质介导的间接键合。然而，在某些实施方式中，优选的是功能部分经由共价键、离子键、氢键等等与多核苷酸诸如第二侧翼直接键合，且从可以获得更稳定的结合的观点来看，更优选共价键。功能部分也可以经由可裂解的连接基团与多核苷酸键合。例如，可以经由二硫键连接功能部分。
对根据某些实施方式的“功能部分”的结构没有具体的限制，只要它赋予嵌合多核苷酸期望的功能即可。期望的功能包括标记功能、纯化功能和递送功能。提供标记功能的部分的实例包括诸如荧光蛋白、萤光素酶等等的化合物。提供纯化功能的部分的实例包括诸如生物素、亲和素、His标签肽、GST标签肽、FLAG标签肽等等的化合物。
此外，从以高特异性和高效率将嵌合多核苷酸递送到靶位点，并从而通过相关核酸非常有效地阻抑靶基因的表达的观点来看，优选的是将具有将某些实施方式的嵌合反义多核苷酸递送至体内的“靶位点”的活性的分子作为功能部分，与嵌合反义多核苷酸和/或组成双链反义试剂的另一多核苷酸结合。在一些实施方式中，优选的是功能部分连接到互补链，即，与反义多核苷酸互补并退火至反义多核苷酸的多核苷酸。
从能够以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌合多核苷酸递送至肝脏等等的观点来看，具有“靶向递送功能”的部分可以是例如，脂质。这样的脂质的实例包括：脂质诸如胆固醇和脂肪酸(例如，维生素E(生育酚、生育三烯酚)、维生素A和维生素D)；脂溶性维生素诸如维生素K(例如，酰基肉碱)；中间代谢物诸如酰基辅酶A；糖脂、甘油酯和其衍生物。然而，在这些之中，从具有更高的安全性的观点来看，在某些实施方式中，使用胆固醇和维生素E(生育酚、生育三烯酚)。此外，从能够以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌合反义多核苷酸递送至脑的观点来看，根据某些实施方式的“功能部分”的实例包括糖(例如，葡萄糖和蔗糖)。同样地，从能够通过结合到多种器官的细胞表面上存在的多种蛋白质，以高特异性和高效率将某些实施方式的嵌合反义多核苷酸递送至多种器官的观点来看，根据某些实施方式的“功能部分”的实例包括肽或蛋白质诸如受体配体和抗体和/或其片段。
关于某些实施方式的嵌合反义多核苷酸，如图4B、4C和4D所示，可以将功能部分连接到5’末端核苷酸、或3’-末端核苷酸、或5’末端核苷酸和3’末端核苷酸二者。用于将标签偶联到核酸链的技术随标签部分的性质和核酸中的附接点而变化，并且本领域熟知这些技术。尽管没有示出，功能部分可以连接到多核苷酸的内部位点而不连接到多核苷酸的链末端位点。再次，本领域熟知这样的技术。
因此，已经描述了一些实施方式的嵌合多核苷酸的一些适合的示例性实施方式，但是嵌合多核苷酸不旨在限于以上描述的示例性实施方式。此外，本领域的普通技术人员可以通过适当地选择已知的方法产生根据多个实施方式的嵌合多核苷酸。例如，可以通过下列步骤产生根据一些实施方式的核酸：根据靶向的转录产物的碱基序列(或，在一些情况下，靶向的基因的碱基序列)的信息，设计核酸的各自的碱基序列；通过利用商业上可得的自动核酸合成仪(Applied Biosystems,Inc.的产品；Beckman Coulter,Inc的产品；等等)合成核酸；以及随后通过利用反相柱等等纯化所得寡核苷酸。将以这种方式产生的核酸混入适合的缓冲溶液并在大约90摄氏度至98摄氏度下变性几分钟(例如，5分钟)，随后使核酸在大约30摄氏度至70摄氏度退火大约1至8小时，并因此可以产生一些实施方式的双链核酸复合体。此外，可以通过在寡核苷酸合成期间或之后，将功能部分连接到寡核苷酸链产生具有功能部分的多核苷酸。本领域熟知用于将功能部分连接到核酸的许多方法。
因此，已经描述了嵌合单链反义多核苷酸、互补多核苷酸的适合的示例性实施方式。在下面的实施例中还公开了另外的实施方式。然而，如发明人构思的嵌合多核苷酸和双链反义试剂不限于以上描述的、或下面的实施例中描述的示例性实施方式。
还构思了用于借助于反义效应改变靶基因的表达或靶向的转录产物的水平的组合物。
如下面描述的实施例中将公开的，可以以高特异性和高效率将一些实施方式的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂递送至靶位点，并且可以有效地阻抑靶基因的表达或转录产物的水平。因此，一些实施方式提供了一种组合物，所述组合物含有一些实施方式的嵌合反义多核苷酸或双链反义试剂作为活性成分并预期借助于反义效应修饰或阻抑，例如，靶基因的表达。具体地，甚至当以低浓度施用时，一些实施方式的嵌合反义多核苷酸或双链反义试剂也可以产生高效力，且嵌合设计也显示出减少的毒性。此外，通过引导反义多核苷酸或双链反义试剂至特定的器官，可以减少不利的副作用。因此，一些实施方式也可以提供一种药物组合物，所述药物组合物旨在治疗和预防与例如增加的靶基因的表达相关的疾病，诸如代谢性疾病、肿瘤和传染病。
可以通过已知的制药方法配制含有一些实施方式的嵌合反义多核苷酸或双链反义试剂的组合物。例如，组合物可以以下列形式肠内地(经口地等等)使用：胶囊、片剂、丸剂(pill)、液体、粉剂、颗粒剂、细颗粒剂、薄膜包衣剂、弹丸剂(pellet)、锭剂、舌下剂、胶溶剂、含服制剂、糊剂、糖浆剂、混悬剂、酏剂、乳剂、涂层剂、软膏剂、硬膏剂、泥罨剂、经皮制剂、洗剂、吸入剂、气雾剂、注射剂和栓剂；或非肠内地使用。
关于这些制剂的配制，可以适合地包括药理学上可接受的载体或可接受作为食品和饮料的载体，具体地无菌水、生理盐水、植物油、溶剂、碱、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、pH调节剂、稳定剂、调味剂、芳香剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、稀释剂、等渗剂(isotonizing agents)、舒缓剂(soothing agents)、延展剂、崩解剂、缓冲剂、涂层剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、矫味剂、分解辅助剂、和其他添加剂。
在配制之际，如在非专利文献1中公开的，可促使脂质作为功能部分结合至其的一些实施方式的嵌合反义多核苷酸或双链反义试剂与脂蛋白诸如乳糜微粒或乳糜微粒残余物形成复合体。此外，从增加肠内施用的效率的观点来看，除了脂蛋白之外，也可以使用具有结肠粘膜上皮渗透增强作用的物质(例如，中链脂肪酸、长链不饱和脂肪酸、或其衍生物(盐、酯形式或醚形式))和表面活性剂(非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂)的复合物(混合的胶束和乳液)。
对一些实施方式的组合物的施用的优选的形式没有具体的限制，且其实例包括肠内(经口等等)或非肠内施用，更具体地，静脉施用、动脉施用、腹膜内施用、皮下施用、皮内施用、气管施用、直肠施用、和肌内施用、和通过输液施用。
一些实施方式的组合物可用于作为受试者的动物，包括人类。然而，对除人类之外动物没有具体的限制，且多种家畜、家禽、宠物、实验动物等等可以是一些实施方式的受试者。
当施用或摄取一些实施方式的组合物时，可以根据受试者的年龄、体重、症状和健康状况，组合物的类型(药物产物、食品和饮料等等)等等适当地选择施用的量或摄取的量。然而，根据某些实施方式的组合物的摄取的有效量是0.001mg/kg/天至50mg/kg/天嵌合多核苷酸。
如下面的实施例中将公开的，可以高特异性和高效率将一些实施方式的嵌合多核苷酸或双链反义试剂递送至靶位点，并且可以非常有效地改变或阻抑靶基因的表达或转录产物的水平。因此，一些实施方式可以提供将一些实施方式的嵌合多核苷酸或双链反义试剂施用至受试者，并借助于反义效应阻抑靶基因的表达或转录产物水平的方法。此外，也可以提供通过施用一些实施方式的组合物至受试者来治疗或预防与例如增加的靶基因的表达相关的多种疾病的方法。
实施例
在下文中，将通过实施例更具体地描述一些实施方式，但是实施方式不旨在限于下面的实施例。
实施例1
进行了比较根据本发明的一个实施方式的嵌合多核苷酸与两种传统的缺口体反义寡核苷酸的抑制效力的实验。在图7中显示多核苷酸结构和实验的结果。对照缺口体的长度是13个碱基(ApoB1 ASO 13mer；SEQ IDNO:6)和20个碱基(ApoB1 ASO 20mer-4；SEQ ID NO:2)。13mer对照具有8个硫代磷酸酯化的DNA核苷酸的中心区域，2个LNA碱基的第一5’-侧翼区域和3个LNA碱基的第一3’-侧翼区域，但是在任何一侧都不具有第二侧翼。20mer对照具有与13mer相同的结构，并且在5’末端增加4个硫代磷酸酯化的2’-O-Me RNA碱基以及在3’末端增加3个硫代磷酸酯化的2’-O-Me RNA碱基。根据本公开内容，这些碱基不是低蛋白质-亲和力核苷酸(因为它们被硫代磷酸酯化)并因此它们不会组成第二5’-侧翼区域或3’-侧翼区域。它们实际上被归类为第一侧翼区域的部分(并因此，20mer对照是具有6个碱基的5’-侧翼区域和6个碱基的3’-侧翼区域的缺口体)。
嵌合多核苷酸(ApoB1 ASO 20mer-5；SEQ ID NO:7)含有8个碱基中心区域、2个LNA碱基的第一5’-侧翼区域和3个LNA碱基的第一3’-侧翼区域，并且增加4个2’-O-Me RNA碱基的第二5’-侧翼区域和3个2’-O-Me RNA碱基的第二3’-侧翼区域。2’-O-Me RNA碱基是低蛋白质亲和力核苷酸并因此组成第二侧翼区域。
根据下列程序，利用Hep 1-6肝细胞体内测试三种ASO。
根据与试剂一起提供的使用说明，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Inc.制造)转染了各ASO。在转染的时候，培养基中的每一种ASO的浓度是2nM、10nM和20nM。此外，还制备了没有ASO添加到细胞的对照。随后，在转染之后24小时，通过利用Isogen收集细胞，并根据制造商的使用说明收集mRNA并确定mRNA的量。
根据制造商的方案，通过利用Superscript III从特定量的mRNA合成cDNA。随后，将获得的cDNA用作模板，并通过利用TaqMan系统实行定量RT-PCR。用于定量RT-PCR的引物是基于多种基因数目，由LifeTechnologies Cop.设计和生产的那些。关于温度和时间的PCR条件如下：将95摄氏度15秒，60摄氏度30秒，和72摄氏度1秒指定为一个循环，并实行它的40个循环。基于如此获得的定量RT-PCR的结果，分别地计算rApoB的表达的量/rGAPDH(内部标准基因)的表达的量，并通过t-检验比较和评价对照组的计算结果和核酸-施用组的计算结果。在图7中呈现了如此获得的结果。
如图7中的结果所示，所有三种ASO都显示了反义效应，具有在更高的ASO浓度下获得更大的抑制。然而，比较20mer嵌合多核苷酸和20mer对照的抑制效力，嵌合多核苷酸提供了更大的抑制程度。尽管13mer对照的效力仍然较大，但是与传统20mer对照ASO相比，第二侧翼的存在提供了改进的性能，且与13mer对照相比，预期具有减少的毒性。结果显示，包括第二侧翼区域提供了改进的反义性能。
实施例2
进行了比较本发明的实施方式的具有第二5’-侧翼区域、第二3’-侧翼区域或两个侧翼区域的嵌合多核苷酸的抑制效力的实验。在图8A中显示多核苷酸结构和实验的结果。将两个传统的缺口体对照与3个不同的嵌合多核苷酸的抑制效力比较。
根据实施例1中描述的程序，利用Hep 1-6肝细胞体内测试ASO，且在图8B中显示了结果。以20nM的浓度转染ASO。
如由图8B中的结果所示，相对于阴性对照(没有ASO)，所有五种ASO都显示了反义效应。然而，比较20mer嵌合多核苷酸与20mer对照的抑制效力，在所有三种情况下，嵌合多核苷酸提供了更大的抑制程度。显著地，具有第二5’-侧翼的嵌合多核苷酸显示在统计学上与利用13mer对照获得的抑制相同的效力。因此，第二侧翼的存在，利用20mer ASO产生了与利用13mer缺口体获得的抑制相同的性能。而且，与13mer对照相比，预期20mer嵌合多核苷酸具有减少的毒性。
实施例3
接下来，在小鼠中体内测试了嵌合多核苷酸。在图9中显示了ASO探针和对照的序列和设计。通过尾静脉，以每一种3.0mg/kg的量将ASO静脉注射至小鼠。小鼠是4周龄的雌性ICR小鼠，具有20至25g的体重。以n＝3实行利用小鼠的全部实验。同样，作为阴性对照组，还制备了向其仅注射PBS，而不是单链ASO或双链核酸复合体的小鼠。在注射之后七十二小时，利用PBS灌注小鼠，且然后将小鼠解剖，以提取肝脏。随后，通过与实施例1中描述的方法相同的方法实行mRNA的提取、cDNA的合成、和定量RT-PCR，计算mApoB的表达的量/mGAPHD(内部标准基因)的表达的量，且在施用PBS(仅PBS)的组和施用核酸的组之间进行比较。在图9中呈现了如此获得的结果。
如图9中示出的，两种ASO显示了反义效应(13mer对照和20mer-5嵌合多核苷酸)，但是两种20mer对照(20mer-1和20mer-4)没有显示反义效应。尽管13mer对照的效力仍然大于嵌合多核苷酸，但是与传统20mer对照ASO相比，第二侧翼的存在提供了改进的性能，并且与13mer对照相比，预期具有减少的毒性。结果显示，包括第二侧翼区域提供了改进的体内反义性能。
实施例4
Toc(生育酚)-HDO的设计和合成。设计一系列不同长度(13-至23-mer)的DNA-LNA缺口体或嵌合体，以靶向小鼠ApoB mRNA(NM-009693)，并由Gene Design(日本，大阪)和Hokkaido System Science(日本，札幌)合成。
靶向ApoB mRNA的嵌合体的序列如下：
1)ApoB1 13mer，
5′-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：1)；
2)ApoB1 Toc13met PS(-)，
5′-Toc_G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：1)；
3)ApoB1 Toc17merPS(-)，
5′-Toc-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：2)；
4)ApoB1 Toc20merPS(-)，
5′-Toc-A(X)-A(X)-G(X)-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：3)；
5)ApoB1 Toc20merPS(+)
5′-Toc^A(X)^A(X)^G(X)^U(X)^C(X)^C(X)^A(X)^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：4)；以及
6)ApoB1 TocPEG13mer
5′-Toc^间隔序列18^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3′(SEQ ID NO：1)；
其中小写字母代表DNA，括号内标记的大写字母L代表LNA(大写C表示LNA甲基胞嘧啶)，括号内标记的大写字母X代表UNA或2’-O-甲基糖修饰，V形图记代表硫代磷酸酯键。
小鼠研究
在具有自由进取食物和水的无-病原体动物设施中，以12-h光/黑暗周期饲养4-5周龄的野生型Crlj:CD1(ICR)小鼠(日本，东京，Oriental Yeast)。根据体重，通过尾静脉注射将ASO缺口体或嵌合体施用至小鼠。在PBS中配制所有的寡核苷酸，PBS也被用作对照。通过0.75-6mg/kg的单次注射将寡核苷酸施用至野生型小鼠。关于后期分析，首先利用腹膜内施用的60mg/kg戊巴比妥使小鼠深度麻醉，且然后在证实缺少瞬目反射之后，通过利用PBS的经心脏灌注将其处死。所有的动物实验根据东京医科牙科大学(Tokyo Medical and Dental University)的动物实验的伦理和安全指导方针进行(#0140144A)。
实时定量聚合酶链式反应测定。通过利用Isogen(日本，东京，NipponGene)从小鼠肝脏提取总RNA。为了检测mRNA，利用Superscript III和随机六聚体(CA，卡尔斯巴德，Life Technologies)逆转录DNA酶-处理的RNA(2微克)。为了检测RNA，通过利用Light Cycler 480实时PCR仪器(德国，曼海姆，Roche Diagnostics)进行实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析。用于小鼠ApoB、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh；NM_008084)基因的引物和探针由Applied Biosystems设计。在图10中呈现了如此获得的结果。
RNA印迹分析。通过利用Isogen II(Nippon Gene)从小鼠肝脏提取总RNA。通过在18％聚丙烯酰胺-尿素凝胶中的电泳分离总的RNA(45微克)并转移至Hybond-N+膜(NJ，皮斯卡塔韦，Amersham Bio-sciences)。利用与cRNA序列对应的探针，或利用小鼠U6微RNA序列(内部对照)杂交印迹，该探针和小鼠U6微RNA序列通过利用第二代DIG寡核苷酸3'-末端标记试剂盒(Roche Diagnostics)，标记有地高辛-ddUTP。用于检测缺口体或嵌合体的DNA探针的序列是5'-TGAATACCAATGCTG-3'。通过Gene Images CDP-star检测试剂盒(Amersham Biosciences)使信号可视化。在图10中呈现了如此获得的结果。
如图11和图12中示出的，三种ASO(13mer对照、Toc-17-mer-8U PS-嵌合多核苷酸和Toc-20-mer-8U PS-嵌合多核苷酸)显示反义效应。另一方面，两种20mer对照(20mer-9和20-mer-8U PS+)没有显示反义效应。Toc-20-mer-8U PS-的效力仍然比其他两种嵌合多核苷酸(13mer对照和Toc-20-mer-8U PS-嵌合多核苷酸)的效力大。此外，Toc-20-mer-8U PS-的功效延长直至注射之后14天(图13)。此外，Toc-20-mer-8U PS-的效力是剂量依赖的方式(图14)。
这些结果表明，与具有PS的传统20mer对照ASO相比，不具有PS的第二侧翼的存在提供了改进的性能，且与对照相比，预期上述20-mer-8UPS-ASO具有减少的毒性。
“高-核酸外切酶耐受性的核苷酸”是(i)比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，(ii)比天然的DNA或RNA核苷酸具有更高的对核酸外切酶的耐受性且(iii)比天然的DNA或RNA核苷酸具有相对相同的或更低的对核酸内切酶的耐受性的核苷酸。
高-核酸外切酶耐受性的核苷酸的实例包括2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、磷酸酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、和解锁核酸(UNA)。
实施例5
接下来，在小鼠中体内测试了双链反义试剂。在图16A中显示多种反义探针和互补链的序列和设计。在互补链中，将生育酚(Toc)结合到5’末端。因此，能够引导双链试剂和可能地嵌合反义多核苷酸递送至肝脏的功能部分被并入互补链中。
根据已知的技术通过以下步骤实施生育酚部分与cRNA的结合：制备生育酚酰胺，其中将生育酚的色烷环的6位置的羟基基团连接到亚磷酰胺；以及然后通过标准的偶联方法，将生育酚酰胺偶联到RNA的5’-末端。
反义多核苷酸和互补链(cRNA)的序列、组成和链长度如下：
反义链
1.20mer-1 ApoB1 ASO：
5′-TsCsCsAsGsCsaststsgsgstsastsTsCsAsGsTsG-3(SEQ ID NO：5)′
2.20mer-4 ApoB1 ASO：
5′-u s c s c s a sGsCsaststsgsgstsastsTsCsAs g s u sg-3(SEQ ID NO：6)′
3.20mer-5 ApoB1 ASO：
5′-uccaGsCsaststsgsgstsastsTsCsAgug-3(SEQ ID NO：7)′
4.13mer ApoB1 ASO：
5′-GsCsaststsgsgstsastsTsCsA-3′(SEQ ID NO：8)
(大写字母：LNA；小写字母：DNA；加下划线的：2’-O-Me RNA；s：碱基之间的硫代磷酸酯)
互补链
1.20-mer Toc-ApoB1 cRNA：
5′-Toc-c s a s c s u s g sAAUACCAAUGs c s u s g s g s a-3′(SEQ ID NO：9)
2.13-mer Toc-ApoB1 cRNA：5′-Toc-u s g s a sAUACCAAUs g s c-3′(SEQ ID NO：10)
(大写字母：RNA；加下划线的：2’-OMe-RNA：s：碱基之间的硫代磷酸酯)
以等摩尔的量混合具有相同长度的反义多核苷酸和各cRNA，且在95摄氏度下将混合物加热5分钟，且然后在37摄氏度保温一小时，从而使这些核酸链退火并形成双链核酸复合体。将退火的核酸存储在4摄氏度或冰上。
通过尾静脉，以每一种0.75mg/kg的量将双链复合体静脉注射至小鼠。小鼠是4周龄的雌性ICR小鼠，具有20至25g的体重。以n＝3实行利用小鼠的全部实验。同样，作为阴性对照组，还制备了向其仅注射PBS，而不是双链复合体的小鼠。在注射之后七十二小时，利用PBS灌注小鼠，且然后将小鼠解剖，以提取肝脏。随后，通过与实施例1中描述的方法相同的方法实行mRNA的提取、cDNA的合成、和定量RT-PCR，计算mApoB的表达的量/mGAPHD(内部标准基因)的表达的量，并在施用PBS(仅PBS)的组和施用核酸的组之间进行比较。在图16B中呈现了如此获得的结果。
如在图16B中示出的，与PBS对照相比，三种双链复合体(含有20mer-4、20mer-5和13mer ASO的那些)显示统计学上显著的阻抑水平。此外，包括20mer-5 ASO的双链试剂显示了类似于双链13mer缺口体对照的反义效应的反义效应。因此，与传统的20mer对照ASO相比，20mer-5ASO中的双侧翼结构提供了改进的性能，且与13mer对照相比，预期具有减少的毒性。结果证明，包括嵌合反义多核苷酸(即，具有双侧翼结构的反义多核苷酸，在这种情况下，且第二侧翼在多核苷酸的3’和5’末端)的双链反义试剂提供了改进的体内反义性能。

Claims (45)

1.一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端且包括至少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；
其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷酸。
2.一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端，比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；
其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括这样的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，所述中心核苷酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别。
4.根据权利要求3所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域的核苷酸独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
5.根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-20个DNA核苷酸。
6.根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括5-12个DNA核苷酸。
7.根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立地选自RNA核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述核苷酸类似物独立地选自LNA核苷酸、BNA核苷酸、2’-O-Me RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸。
9.根据权利要求8所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域包括独立地选自2’-O-Me RNA核苷酸和2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸的核苷酸。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的核苷酸中的至少一个被硫代磷酸酯化。
11.根据权利要求10所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域中的所有核苷酸都被硫代磷酸酯化。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第一侧翼区域中的核苷酸是桥接的核苷酸。
13.根据权利要求1-12的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述桥接的核苷酸独立地选自LNA、cEt BNA、酰胺BNA和cMOE BNA。
14.根据权利要求1-13的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸区域和所述第一侧翼区域中的核苷酸类似物中的至少一个被硫代磷酸酯化。
15.根据权利要求1-14的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述低蛋白质-亲和力核苷酸独立地选自2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、UNA和5-丙炔基尿嘧啶。
16.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域。
17.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二3’-侧翼区域。
18.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域和第二3’-侧翼区域。
19.根据权利要求1-18的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸还包括连接到所述嵌合反义多核苷酸的3’-末端和/或5’-末端的功能部分。
20.根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分具有选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能的功能。
21.根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分经由可切割的接头部分连接到所述嵌合反义多核苷酸。
22.根据权利要求19所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述功能部分是选自脂质、肽和蛋白质的分子。
23.根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。
24.根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述脂质选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚。
25.根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述肽选自受体配体片段和抗体片段。
26.根据权利要求22所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述蛋白质选自受体配体和抗体。
27.根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述嵌合反义多核苷酸能够在25摄氏度下在pH7.2，100mM氯化钠、10mM磷酸钠的缓冲液中与细胞转录产物杂交。
28.根据权利要求27所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心区域与所述嵌合反义多核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物完全地互补。
29.根据权利要求27所述的嵌合反义多核苷酸，其中当所述嵌合反义多核苷酸与所述嵌合反义多核苷酸能够与其杂交的细胞转录产物杂交时，所述第二5’-侧翼区域和/或所述第二3’-侧翼区域包括至少一个错配的碱基。
30.根据权利要求29所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述第二5’-侧翼区域和/或所述第二3’-侧翼区域的所有碱基都是错配的。
31.一种双链反义试剂，所述双链反义试剂包括根据权利要求1至18和27至30中的任一项所述的嵌合反义多核苷酸和退火至所述嵌合反义多核苷酸的互补链。
32.根据权利要求31所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述互补链还包括连接到3’-末端和/或5’-末端的功能部分。
33.根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分具有独立地选自标记功能、纯化功能和靶向递送功能的功能。
34.根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分经由可切割的接头部分被独立地连接到所述嵌合反义多核苷酸和/或所述互补链。
35.根据权利要求32所述的双链反义试剂，其中所述功能部分是独立地选自脂质、肽和蛋白质的分子。
36.根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、脂肪酸、脂溶性维生素、糖脂和甘油酯。
37.根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述脂质独立地选自胆固醇、生育酚和生育三烯酚。
38.根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述肽独立地选自受体配体片段和抗体片段。
39.根据权利要求35所述的双链反义试剂，其中所述蛋白质独立地选自受体配体和抗体。
40.根据权利要求31所述的包括所述嵌合反义多核苷酸的双链反义试剂，其中所述嵌合反义多核苷酸能够在25摄氏度下在pH7.2，100mM氯化钠、10mM磷酸钠的缓冲液中与细胞转录产物杂交。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂，和药物学上可接受的载体。
42.一种修饰细胞内转录产物的功能的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂。
43.一种改变细胞内的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂。
44.一种改变细胞内的蛋白质结构的方法，所述方法包括施用组合物至所述细胞的步骤，所述组合物包含根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂。
45.一种用于治疗患者的方法，所述患者具有特征在于改变靶基因的表达水平、功能或编辑的状况，所述方法包括：施用治疗上有效量的药物组合物至所述患者，所述药物组合物包含：
(a)至少一种根据权利要求1-30的任一项所述的嵌合反义多核苷酸或至少一种根据权利要求31至40的任一项所述的双链反义试剂；和
(b)药物学上可接受的载体。
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