JP3781879B2 - 新規ヌクレオチド類縁体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なヌクレオチド類縁体に関し、更に詳細にはアンチセンス分子に適したヌクレオチド類縁体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９７８年アンチセンス分子がインフルエンザウィルスの感染を阻害したとの報告が初めてなされた。以後、ガン遺伝子発現やＡＩＤＳ感染を阻害したとの報告もなされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドが望ましくない遺伝子の発現を特異的に制御することから、医薬品として近年、最も期待されている分野のうちの一つである。
【０００３】
アンチセンス法とは、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質という、いわゆるセントラルドグマの一連の流れをアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて制御しようという概念に基づいている。
【０００４】
しかしながら、天然型オリゴヌクレオチドをアンチセンス分子としてこの方法に適用した場合、生体内の酵素により加水分解を受けたり、細胞膜透過性が高くないなどの問題が生じた。そしてこれらを解消するために核酸誘導体が数多く合成され、研究が重ねられてきた。例えば、リン原子上の酸素原子をイオウ原子に置換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチルホスホネート、また最近になっては、リン原子も炭素原子で置換したものやリボースを非環式骨格にした分子も合成されている（F. Eckstein et al., Biochem., 18, 592(1979), P.S.Miller et al., Nucleic Acids Res., 11, 5189 (1983), P.Herdewijn et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1567 (1993), P.E. Nielsen et al., Science, 254, 1497 (1991))。
【０００５】
しかし、いずれの場合も、生体内での安定性またはオリゴヌクレオチドの合成の容易さ等の点で満足のいく誘導体が得られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
生体内で細胞膜透過性が高く、酵素の加水分解を受けにくく、しかも合成が容易であるアンチセンス分子用のヌクレオチド類縁体が提供されることが望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者等は、アンチセンス法において有用であろう、核酸の糖部分を修飾した核酸誘導体を設計し、それを合成してその有用性を確認した。以下に本発明を説明する。
【０００８】
本発明のヌクレオチド類縁体は下記の一般式：
【化３】
［式中、Ｂは同一または異なってもよく、ピリミジンもしくはプリン核酸塩基またはそれらの誘導体である］で表されるヌクレオチド類縁体であるモノマー単位を１または２以上含有するオリゴまたはポリヌクレオチド類縁体である。
【０００９】
このモノマー単位は一般式：
【化４】
［式中、Ｂはピリミジンもしくはプリン核酸塩基又はそれらの誘導体であり、Ｙ１及びＹ２は同一もしくは異なり、水素または水酸基の保護基である。保護基としては公知のどのような基も使用できるが、好ましくはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アシル基、アラルキル基又はシリル基である］で表されるヌクレオシド類縁体もしくはそれらのアミダイト誘導体である。
【００１０】
アルキル基とは炭素数１ー２０の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を示し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等があげられる。
【００１１】
アルケニル基とは、炭素数２−２０の直鎖または分枝鎖状のアルケニル基を示し、例えば、ビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ゲラニル基、ファルネシル基等があげられる。
【００１２】
アルキニル基とは、炭素数２−２０の直鎖または分枝鎖状のアルキニル基を示し、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。
【００１３】
シクロアルキル基とは、炭素数３−８のシクロアルキル基を示し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等があげられる。シクロアルキル基の環上の１つ以上の任意のメチレンが酸素原子や硫黄原子あるいはアルキル基で置換された窒素原子に置換された複素環基も含まれ、例えばテトラヒドロピラニル基などがあげられる。
【００１４】
アリール基とは、芳香族炭化水素基から水素原子１個を除いた１価の置換基を意味し、例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等である。また、アリール基の環上の炭素原子はハロゲン原子、低級アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基等の１種以上の基によって置換されていてもよい。置換基としてはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基等があげられる。
【００１５】
アシル基としては、アセチル基、ホルミル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基等があげられる。シリル基の例としては、トリアルキルシリル基があげられるが、好ましくは、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等があげられ、更に好ましくはトリメチルシリル基である。
【００１６】
アラルキル基とは、芳香族炭化水素で置換されたアルキル基を意味し、好ましくはベンジル基、トリチル基である。各々の芳香環は置換されていてもよい。更に好ましいアラルキル基としては、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基である。
【００１７】
本発明における、ピリミジン又はプリン核酸塩基とは、チミン、ウラシル、シトシン、アデニン、グアニン及びそれらの誘導体である。
【００１８】
本発明のヌクレオチド類縁体は次のように合成できる。説明を簡明にするため、まず、上記の式中Ｂがウラシルである化合物を例にとって説明する。
【００１９】
（１）モノマーユニットの合成
【化５】
文献既知の化合物である２',３'−Ｏ−シクロヘキシリデンーウリジン（１）をｐ−トルエンスルホニルクロリドと反応させて、化合物２を得る。次いで、この化合物をＴＦＡ−Ｈ2Ｏ中で撹拌することにより、４'−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジンである化合物３を得る。
【００２０】
化合物３に４,４'−ジメトキシトリチルクロリドを反応させて、５’位の水酸基を保護した化合物４を得る。さらに、ＮａＨＭＤＳと反応させることにより、５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ,４'−メタノウリジン、化合物５を得る。
【００２１】
（２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成
化合物５に２−シアノエチルーＮ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを作用させ、アミダイト体（化合物６）を得、ＤＮＡシンセサイザーを用いて種々のアンチセンスオリゴマー類縁体を合成する。次いで、得られるアンチセンスオリゴマー類縁体を逆相カラムを用いて精製し、精製物の純度を逆相ＨＬＰＣで分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の生成を確認できる。
【００２２】
化合物５のモノマーユニットは、オリゴヌクレオチド類縁体の中に１つ以上存在させることができる。また、オリゴヌクレオチド類縁体中の２カ所以上の位置に、１又は２以上の天然ヌクレオチドを介して隔離された状態で存在させても良い。本発明によれば、本発明のヌクレオチド類縁体を必要な位置に必要な数（長さ）で導入したアンチセンス分子を合成することができる。ヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオシド単位が２〜５０、好ましくは１０〜３０個である。
【００２３】
このようなアンチセンス分子は、エキソヌクレアーゼに対してばかりでなく、エンドヌクレアーゼに対しても分解されにくく、生体への投与後、長く生体内に存在することができる。そして、例えば、センス鎖ＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タンパク質）の形成（翻訳）を阻害したり、二重鎖ＤＮＡとの間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウィルスの増殖を阻害すると考えられる。
【００２４】
これらのことから、本発明のヌクレオチド類縁体を用いたアンチセンス分子は、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤をはじめとした遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品としての有用性が期待されている。
【００２５】
本発明のヌクレオチド類縁体を用いたアンチセンス分子は、例えば緩衝剤および／または安定剤等の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることができる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担体を配合して軟膏、クリーム、液剤、または膏薬等に調剤できる。
【００２６】
【実施例】
本発明のヌクレオチド類縁体の合成を実施例及び製造例により、さらに詳しく説明する。
【００２７】
実施例１：モノマーユニットの合成
（１）２',３'−Ｏ−シクロヘキシリデンー４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物２）の合成
窒素気流下、文献（G.H.Jones et al, J.Org.Chem., 44, 1309(1979)）既知の化合物１（９５６ｍｇ、２．７０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１３．５ｍｌ）溶液に室温でｐ-トルエンスルホニルクロライド（７７１ｍｇ，４.０５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で５時間撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、ベンゼンで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、ベンゼンで３回共沸し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１５：１）により精製後、ベンゼン／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物２）（８０８ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，５９％）を得た。
【００２８】
mp104-106℃（benzene/hexane).
IR(KBr):νmax3326,2929,2850,1628,1577,1544,1437,1311,1244cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ1.45-1.67(10H,m,cyclohexyl-),2.45(3H,s,φ-CH 3),3.71(2H,ABq,J=11.5Hz,C5'-H2),4.20(2H,ABq,J=10.5Hz,C4'-CH 2OTs),4.92(1H,d,J2'3'=6.4Hz,C3'-H),5.05,5.06(1H,dd,J1'2'=3.7Hz,J2'3'=6.4Hz,C2'-H),5.60(1H,d,J4'5'=7.3Hz,C4-H),5.75(1H,d,J1'2'=3.7Hz,C1'-H),7.48(2H,d,J=8.2Hz,φ),7.77(1H,d,J4'5'=7.8Hz,C5-H),7.81(2H,d,J=8.2Hz,φ),10.10(1H,s,NH).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.5,24.1,24.5,25.5,34.8,36.9,63.5,69.7,82.5,84.7,87.8,92.9,102.9,115.4,128.8,130.8,133.9,142.7,145.9,151.3,163.5.
Mass(EI):m/z 481(M+-H2O).
Anal Calcd for C23H28N2O9S・1/3 H2O:C,53.69;H,5.61;N,5.44;S,6.22.Found:C,53.99;H,5.48;N,5.42;S,6.10.
【００２９】
（２）４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物３）の合成
上記の化合物２（１０７ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をＴＦＡ−Ｈ2Ｏ（９８：２，１ｍｌ）中室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧留去し、エタノールを加えて３回共沸した。得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製し、白色粉末（化合物３）（８５．０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，９４％）を得た。
【００３０】
mp119-120℃.
IR(KBr):νmax3227,3060,2932,2837,1709,1508,1464,1252,978,835,763,556cm-1.1H-NMR(acetone-d6):δ 2.31(3H,s,φ-CH 3),2.84(3H,s,OH),3.71(2H,s,C5'-H2),4.13,4.20(2H,ABq,J=10.9Hz,C4'-CH 2OTs),4.28,4.31(1H,dd,J1'2'=8.6Hz,J2'3'=5.6Hz,C2'-H),4.36(1H,d,J2'3'=5.6Hz,C3'-H),5.54(1H,d,J4'5'=7.9Hz,C4-H),5.75(1H,d,J1'2'=6.6Hz,C1'-H),7.32(2H,d,J=7.9Hz),7.67(2H,d,J=8.2Hz),7.70(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C5-H),10.14(1H,s,NH).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.5,63.7,70.8,72.7,74.6,86.8,88.8,103.1,128.8,130.7,133.9,141.7,145.8,151.8,163.9.
Mass(EI):m/z 256(M+-OTs).
【００３１】
（３） ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物４）の合成
上記化合物３（１．１３ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）に無水ピリジンを加えて３回共沸した後、無水ピリジン（１４．５ｍｌ）溶液とし、窒素気流下、室温で４，４−ジメトキシトリチルクロライド（１．０７ｇ，３.１７ｍｍｏｌ）を加え室温で１６時間撹拌した。
【００３２】
反応溶液に飽和重曹水を加えた後、ＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、ベンゼンで２回共沸した後、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精製後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物４）（８６８ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ，４１％）を得た。
【００３３】
mp104-105℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax3396,2937,2737,2675,2493,1691,1474,1397,1173,1035cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ2.41(3H,s,φ-CH 3),3.22,3.33(2H,ABq,J=9.9Hz,C5'-H2),3.79(6H,s,p-OCH 3-φ),4.29(1H,dd,J1'2'=6.3Hz,J2'3'=5.6Hz,C2'-H),4.34,4.41(2H,ABq,J=11.2Hz,C4'-CH 3OTs),4.40(1H,d,J2'3'=5.6Hz,C3'-H),5.35(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C4-H),5.82(1H,d,J1'2'=6.3Hz,C1'-H),6.89(4H,d,J=8.9Hz,p-CH3O-φ),7.26-7.41(7H,m),7.43(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C5-H),7.70(2H,d,J=8.3Hz).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.6,55.5,64.6,70.7,72.7,74.3,85.8,87.8,88.9,102.8,114.0,127.7,128.7,128.8,130.7,130.9,131.0,133.9,141.1,145.5,151.4,159.7,163.3.
Anal Calcd for C38H38N2O11S・1/3 H2O:C,61.95;H,5.29;N,3.80;S,4.34.Found:C,62.37;H,5.26;N,3.60;S,4.15.
【００３４】
（４）５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ，４'−メタノウリジン（化合物５）の合成
窒素気流下、化合物４（７３５ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１１．１ｍｌ）中に室温でＮａＨＭＤＳ（８．９６ｍｍｏｌ）の無水ベンゼン溶液（４ｍｌ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応溶液に飽和重曹水を加え、ＣＨ2Ｃｌ2にて３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。
【００３５】
溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精製後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物５）（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，５２％）を得た。
【００３６】
mp120-121℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax3395,3222,3062,2930,1693,1508,1461,1385,1298,1252,1177,1034cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ2.92(1H,br s,OH),3.47,3.51(2H,ABq,J=10.3Hz,C5'-H2),3.85(6H,s,p-OCH 3-φ),4.36(1H,dd,J1'2'=4.3Hz,J2'3'=4.3Hz,C2'-H),4.52,4.83(2H,ABq,J=7.7Hz,C4'-CH 2O-),5.11(1H,d,J2'3'=4.3Hz,C3'-H),5.57(1H,d,J4'5'=7.7Hz,C4-H),6.51(1H,d,J1'2'=7.7Hz,C1'-H),6.96(4H,d,J=8.6Hz,p-CH3O-φ),7.39-7.41(7H,m,φ),7.52(2H,d,J=5.1Hz,φ),7.71(1H,d,J4'5'=8.6Hz,C5-H).
13C-NMR(acetone-d6):δ55.4,64.1,75.5,79.0,85.5,86.2,87.1,88.8,103.3,113.7,113.9,127.6,128.4,128.6,128.8,129.9,130.9,131.1,136.3,136.4,141.2,145.7,151.6,159.6,163.4.
Mass(EI):m/z 558(M+),303(DmTr+),256(M+-DmTr),227(M+-DmTrOCH2).
【００３７】
（５）２’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５'−Ｏ−(４，４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ，４'−メタノウリジン（化合物６）の合成
化合物５（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（３９．９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ3ＣＮで３回共沸した後、無水ＣＨ3ＣＮ−無水ＴＨＦ（５：１、１０ｍｌ）溶媒とし、窒素気流下、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１８ｍｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。
【００３８】
溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（無水ＡｃＯＥｔ：Ｅｔ3Ｎ＝１００：４）により精製後、無水ジエチルエーテル／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物６）（３４０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００３９】
mp94-96℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax2966,2252,2049,1697,1607,1509,1460,1298,1253,1038.
31P-NMR(acetone-d6):δ150.8,151.2.
【００４０】
実施例２：オリゴヌクレオチド類縁体の合成
【化６】
（１）５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’（ＸＴ５）の合成
３’−水酸基が支持体に結合した５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（０．２μｍｏｌ）のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）をトリクロロ酢酸によって脱保護し、その５’−水酸基に５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジン２−シアノエチルホスホアミダイト誘導体をテトラゾールにより縮合し、未反応の５’−水酸基を無水酢酸と４−ジメチルアミノピリジン、２，４，６−コリジンでアセチル化した後、ヨウ素と２，４，６−コリジン、水によりリンを酸化した。
【００４１】
同様に脱保護、縮合、アセチル化、酸化を繰り返した。（４員環アミダイト誘導体も他のアミダイト誘導体と同様に用いることができた。）最後の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン２−シアノエチルホスホアミダイト誘導体を縮合し、酸化して得られた１２−ｍｅｒのオリゴマー（ここまでの工程はPharmacia社製ＤＮＡ合成装置Gene Assembler Plusにより行なった。）を濃アンモニア水１ｍｌによって支持体から切り出すとともに、リンからシアノエチル基をはずし、さらにアデニン、グアニン、シトシンの保護基をはずした。
【００４２】
得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドは、逆相カラム（Millipore,Oligo-PakTMSP)上でトリフルオロ酢酸５ｍｌによりＤＭＴｒ基をはずし、引き続き精製を行ない、目的の５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’（ＸＴ５）（０．０２ｍｍｏｌ，１０％）を得た。得られたオリゴヌクレオチド類縁体の純度は逆相ＨＰＬＣにより確認した。
【００４３】
（２）５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２ＸＴ３）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２ＸＴ３）（０．０４ｍｍｏｌ，２０％）を得た。
【００４４】
（３）５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ３ＸＴ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ３ＸＴ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４５】
（４）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’（Ｔ５Ｘ）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’（Ｔ５Ｘ）（０．０２ｍｍｏｌ，１０％）を得た。
【００４６】
（５）５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｘ２Ｔ４）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｘ２Ｔ４）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４７】
（６）５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４８】
（７）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’（Ｔ４Ｘ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’（Ｔ４Ｘ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４９】
（８）５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’（Ｘ６）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’（Ｘ６）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００５０】
実験例１：融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例２で合成した種々のアンチセンス分子であるオリゴマー鎖（アンチセンス鎖）とセンス鎖とをアニーリング処理したもののＴｍを測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
【００５１】
終濃度をそれぞれ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、センス鎖４μＭとしたサンプル溶液（５００μＬ）を沸騰水中に浴し、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Shimadzu,ＵＶ−２１００ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間５℃に保った後、測定を開始した。温度は９０℃まで毎分０．２℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお温度上昇により濃度が変化するのを防ぐため、セルは蓋付きのものを用い、サンプル溶液表面に鉱油を１滴添加し測定を行った。
【００５２】
測定に用いたアンチセンス鎖及びセル鎖の配列を次に示す。
【００５３】
なお、本明細書では便宜上天然ヌクレオシドをＴ，Ｃ，Ａ，Ｇのように大文字で表記し、本発明における類縁体をそれぞれｔ，ｃ，ａ，ｇのように小文字で表記する。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実験例２：酵素耐性の測定
天然型及び非天然型の下記のオリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチドを３’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を調べた。
【００５６】
１５分間３７℃に保ったオリゴヌクレオチドのバッファー溶液（１０μＭ，４００μｌ）に、蛇毒ホスホジエステラーゼのバッファー溶液（０．００３Ｕ／ｍｌ，４００μｌ）を混合した。オリゴマーの分解による紫外部吸収（２６０ｎｍ）の増加をＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−２１００ＰＣを用い、３７℃で経時的に測定した。用いたバッファーの組成はＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．６）０．１Ｍ，ＮａＣｌ ０．１Ｍ，ＭｇＣｌ2 １４ｍＭであり、測定前に十分に脱気した。
【００５７】
測定に用いたオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
天然鎖 ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
Ｘ２ ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’
【００５８】
半減期（ｔ1/2）の測定
測定開始時（ｔ＝０）及び紫外部吸収（２６０ｎｍ）の増加が認められなくなった時点での紫外部吸収値の平均値を示す時間を半減期（ｔ1/2）とした。結果は次の通りである。
オリゴヌクレオチド ｔ 1/2 （秒）
天然鎖 ３５０
Ｘ２ １３９０
【００５９】
また、紫外部吸収の経時変化を示すチャートを図１（天然鎖）及び図２（Ｘ２）に示した。天然鎖は酵素反応開始後、約３０分で紫外部吸収値が一定となり、Ｘ２では約９０分で一定となった。
【００６０】
【配列表】
出願人の氏名：今西武
発明の名称：新規ヌクレオチド類縁体
整理番号：
出願番号：
出願日：平成９年１１月１７日
優先権番号：特願平８−３０６５８５号
優先日：平成８年１１月１８日
配列の数：１０
【００６１】
配列番号：１
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６２】
配列番号：２
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６３】
配列番号：３
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’
【００６４】
配列番号：４
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’
【００６５】
配列番号：５
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６６】
配列番号：６
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’
【００６７】
配列番号：７
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’
【００６８】
配列番号：８
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’
【００６９】
配列番号：９
配列の長さ：１３
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
【００７０】
配列番号：１０
配列の長さ：１３
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’
【図面の簡単な説明】
【図１】 天然型のオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎｍ）の経時変化を示すチャートである。
【図２】 本発明のオリゴヌクレオチド（Ｘ２）をエキソヌクレアーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎｍ）の経時的変化を示すチャートである。
【産業上の利用分野】
本発明は新規なヌクレオチド類縁体に関し、更に詳細にはアンチセンス分子に適したヌクレオチド類縁体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９７８年アンチセンス分子がインフルエンザウィルスの感染を阻害したとの報告が初めてなされた。以後、ガン遺伝子発現やＡＩＤＳ感染を阻害したとの報告もなされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドが望ましくない遺伝子の発現を特異的に制御することから、医薬品として近年、最も期待されている分野のうちの一つである。
【０００３】
アンチセンス法とは、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質という、いわゆるセントラルドグマの一連の流れをアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて制御しようという概念に基づいている。
【０００４】
しかしながら、天然型オリゴヌクレオチドをアンチセンス分子としてこの方法に適用した場合、生体内の酵素により加水分解を受けたり、細胞膜透過性が高くないなどの問題が生じた。そしてこれらを解消するために核酸誘導体が数多く合成され、研究が重ねられてきた。例えば、リン原子上の酸素原子をイオウ原子に置換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチルホスホネート、また最近になっては、リン原子も炭素原子で置換したものやリボースを非環式骨格にした分子も合成されている（F. Eckstein et al., Biochem., 18, 592(1979), P.S.Miller et al., Nucleic Acids Res., 11, 5189 (1983), P.Herdewijn et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1567 (1993), P.E. Nielsen et al., Science, 254, 1497 (1991))。
【０００５】
しかし、いずれの場合も、生体内での安定性またはオリゴヌクレオチドの合成の容易さ等の点で満足のいく誘導体が得られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
生体内で細胞膜透過性が高く、酵素の加水分解を受けにくく、しかも合成が容易であるアンチセンス分子用のヌクレオチド類縁体が提供されることが望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者等は、アンチセンス法において有用であろう、核酸の糖部分を修飾した核酸誘導体を設計し、それを合成してその有用性を確認した。以下に本発明を説明する。
【０００８】
本発明のヌクレオチド類縁体は下記の一般式：
【化３】
【０００９】
このモノマー単位は一般式：
【化４】
【００１０】
アルキル基とは炭素数１ー２０の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を示し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等があげられる。
【００１１】
アルケニル基とは、炭素数２−２０の直鎖または分枝鎖状のアルケニル基を示し、例えば、ビニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ゲラニル基、ファルネシル基等があげられる。
【００１２】
アルキニル基とは、炭素数２−２０の直鎖または分枝鎖状のアルキニル基を示し、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。
【００１３】
シクロアルキル基とは、炭素数３−８のシクロアルキル基を示し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等があげられる。シクロアルキル基の環上の１つ以上の任意のメチレンが酸素原子や硫黄原子あるいはアルキル基で置換された窒素原子に置換された複素環基も含まれ、例えばテトラヒドロピラニル基などがあげられる。
【００１４】
アリール基とは、芳香族炭化水素基から水素原子１個を除いた１価の置換基を意味し、例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基等である。また、アリール基の環上の炭素原子はハロゲン原子、低級アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基等の１種以上の基によって置換されていてもよい。置換基としてはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基等があげられる。
【００１５】
アシル基としては、アセチル基、ホルミル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基等があげられる。シリル基の例としては、トリアルキルシリル基があげられるが、好ましくは、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等があげられ、更に好ましくはトリメチルシリル基である。
【００１６】
アラルキル基とは、芳香族炭化水素で置換されたアルキル基を意味し、好ましくはベンジル基、トリチル基である。各々の芳香環は置換されていてもよい。更に好ましいアラルキル基としては、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基である。
【００１７】
本発明における、ピリミジン又はプリン核酸塩基とは、チミン、ウラシル、シトシン、アデニン、グアニン及びそれらの誘導体である。
【００１８】
本発明のヌクレオチド類縁体は次のように合成できる。説明を簡明にするため、まず、上記の式中Ｂがウラシルである化合物を例にとって説明する。
【００１９】
（１）モノマーユニットの合成
【化５】
【００２０】
化合物３に４,４'−ジメトキシトリチルクロリドを反応させて、５’位の水酸基を保護した化合物４を得る。さらに、ＮａＨＭＤＳと反応させることにより、５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ,４'−メタノウリジン、化合物５を得る。
【００２１】
（２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成
化合物５に２−シアノエチルーＮ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを作用させ、アミダイト体（化合物６）を得、ＤＮＡシンセサイザーを用いて種々のアンチセンスオリゴマー類縁体を合成する。次いで、得られるアンチセンスオリゴマー類縁体を逆相カラムを用いて精製し、精製物の純度を逆相ＨＬＰＣで分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の生成を確認できる。
【００２２】
化合物５のモノマーユニットは、オリゴヌクレオチド類縁体の中に１つ以上存在させることができる。また、オリゴヌクレオチド類縁体中の２カ所以上の位置に、１又は２以上の天然ヌクレオチドを介して隔離された状態で存在させても良い。本発明によれば、本発明のヌクレオチド類縁体を必要な位置に必要な数（長さ）で導入したアンチセンス分子を合成することができる。ヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオシド単位が２〜５０、好ましくは１０〜３０個である。
【００２３】
このようなアンチセンス分子は、エキソヌクレアーゼに対してばかりでなく、エンドヌクレアーゼに対しても分解されにくく、生体への投与後、長く生体内に存在することができる。そして、例えば、センス鎖ＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タンパク質）の形成（翻訳）を阻害したり、二重鎖ＤＮＡとの間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウィルスの増殖を阻害すると考えられる。
【００２４】
これらのことから、本発明のヌクレオチド類縁体を用いたアンチセンス分子は、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤をはじめとした遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品としての有用性が期待されている。
【００２５】
本発明のヌクレオチド類縁体を用いたアンチセンス分子は、例えば緩衝剤および／または安定剤等の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることができる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担体を配合して軟膏、クリーム、液剤、または膏薬等に調剤できる。
【００２６】
【実施例】
本発明のヌクレオチド類縁体の合成を実施例及び製造例により、さらに詳しく説明する。
【００２７】
実施例１：モノマーユニットの合成
（１）２',３'−Ｏ−シクロヘキシリデンー４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物２）の合成
窒素気流下、文献（G.H.Jones et al, J.Org.Chem., 44, 1309(1979)）既知の化合物１（９５６ｍｇ、２．７０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１３．５ｍｌ）溶液に室温でｐ-トルエンスルホニルクロライド（７７１ｍｇ，４.０５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で５時間撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、ベンゼンで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、ベンゼンで３回共沸し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１５：１）により精製後、ベンゼン／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物２）（８０８ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，５９％）を得た。
【００２８】
mp104-106℃（benzene/hexane).
IR(KBr):νmax3326,2929,2850,1628,1577,1544,1437,1311,1244cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ1.45-1.67(10H,m,cyclohexyl-),2.45(3H,s,φ-CH 3),3.71(2H,ABq,J=11.5Hz,C5'-H2),4.20(2H,ABq,J=10.5Hz,C4'-CH 2OTs),4.92(1H,d,J2'3'=6.4Hz,C3'-H),5.05,5.06(1H,dd,J1'2'=3.7Hz,J2'3'=6.4Hz,C2'-H),5.60(1H,d,J4'5'=7.3Hz,C4-H),5.75(1H,d,J1'2'=3.7Hz,C1'-H),7.48(2H,d,J=8.2Hz,φ),7.77(1H,d,J4'5'=7.8Hz,C5-H),7.81(2H,d,J=8.2Hz,φ),10.10(1H,s,NH).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.5,24.1,24.5,25.5,34.8,36.9,63.5,69.7,82.5,84.7,87.8,92.9,102.9,115.4,128.8,130.8,133.9,142.7,145.9,151.3,163.5.
Mass(EI):m/z 481(M+-H2O).
Anal Calcd for C23H28N2O9S・1/3 H2O:C,53.69;H,5.61;N,5.44;S,6.22.Found:C,53.99;H,5.48;N,5.42;S,6.10.
【００２９】
（２）４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物３）の合成
上記の化合物２（１０７ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をＴＦＡ−Ｈ2Ｏ（９８：２，１ｍｌ）中室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧留去し、エタノールを加えて３回共沸した。得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製し、白色粉末（化合物３）（８５．０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，９４％）を得た。
【００３０】
mp119-120℃.
IR(KBr):νmax3227,3060,2932,2837,1709,1508,1464,1252,978,835,763,556cm-1.1H-NMR(acetone-d6):δ 2.31(3H,s,φ-CH 3),2.84(3H,s,OH),3.71(2H,s,C5'-H2),4.13,4.20(2H,ABq,J=10.9Hz,C4'-CH 2OTs),4.28,4.31(1H,dd,J1'2'=8.6Hz,J2'3'=5.6Hz,C2'-H),4.36(1H,d,J2'3'=5.6Hz,C3'-H),5.54(1H,d,J4'5'=7.9Hz,C4-H),5.75(1H,d,J1'2'=6.6Hz,C1'-H),7.32(2H,d,J=7.9Hz),7.67(2H,d,J=8.2Hz),7.70(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C5-H),10.14(1H,s,NH).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.5,63.7,70.8,72.7,74.6,86.8,88.8,103.1,128.8,130.7,133.9,141.7,145.8,151.8,163.9.
Mass(EI):m/z 256(M+-OTs).
【００３１】
（３） ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物４）の合成
上記化合物３（１．１３ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）に無水ピリジンを加えて３回共沸した後、無水ピリジン（１４．５ｍｌ）溶液とし、窒素気流下、室温で４，４−ジメトキシトリチルクロライド（１．０７ｇ，３.１７ｍｍｏｌ）を加え室温で１６時間撹拌した。
【００３２】
反応溶液に飽和重曹水を加えた後、ＣＨ2Ｃｌ2で３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、ベンゼンで２回共沸した後、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精製後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物４）（８６８ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ，４１％）を得た。
【００３３】
mp104-105℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax3396,2937,2737,2675,2493,1691,1474,1397,1173,1035cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ2.41(3H,s,φ-CH 3),3.22,3.33(2H,ABq,J=9.9Hz,C5'-H2),3.79(6H,s,p-OCH 3-φ),4.29(1H,dd,J1'2'=6.3Hz,J2'3'=5.6Hz,C2'-H),4.34,4.41(2H,ABq,J=11.2Hz,C4'-CH 3OTs),4.40(1H,d,J2'3'=5.6Hz,C3'-H),5.35(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C4-H),5.82(1H,d,J1'2'=6.3Hz,C1'-H),6.89(4H,d,J=8.9Hz,p-CH3O-φ),7.26-7.41(7H,m),7.43(1H,d,J4'5'=8.3Hz,C5-H),7.70(2H,d,J=8.3Hz).
13C-NMR(acetone-d6):δ21.6,55.5,64.6,70.7,72.7,74.3,85.8,87.8,88.9,102.8,114.0,127.7,128.7,128.8,130.7,130.9,131.0,133.9,141.1,145.5,151.4,159.7,163.3.
Anal Calcd for C38H38N2O11S・1/3 H2O:C,61.95;H,5.29;N,3.80;S,4.34.Found:C,62.37;H,5.26;N,3.60;S,4.15.
【００３４】
（４）５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ，４'−メタノウリジン（化合物５）の合成
窒素気流下、化合物４（７３５ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１１．１ｍｌ）中に室温でＮａＨＭＤＳ（８．９６ｍｍｏｌ）の無水ベンゼン溶液（４ｍｌ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応溶液に飽和重曹水を加え、ＣＨ2Ｃｌ2にて３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄した後、無水ＭｇＳＯ4にて乾燥した。
【００３５】
溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：Ｅｔ3Ｎ：ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精製後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物５）（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，５２％）を得た。
【００３６】
mp120-121℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax3395,3222,3062,2930,1693,1508,1461,1385,1298,1252,1177,1034cm-1.
1H-NMR(acetone-d6):δ2.92(1H,br s,OH),3.47,3.51(2H,ABq,J=10.3Hz,C5'-H2),3.85(6H,s,p-OCH 3-φ),4.36(1H,dd,J1'2'=4.3Hz,J2'3'=4.3Hz,C2'-H),4.52,4.83(2H,ABq,J=7.7Hz,C4'-CH 2O-),5.11(1H,d,J2'3'=4.3Hz,C3'-H),5.57(1H,d,J4'5'=7.7Hz,C4-H),6.51(1H,d,J1'2'=7.7Hz,C1'-H),6.96(4H,d,J=8.6Hz,p-CH3O-φ),7.39-7.41(7H,m,φ),7.52(2H,d,J=5.1Hz,φ),7.71(1H,d,J4'5'=8.6Hz,C5-H).
13C-NMR(acetone-d6):δ55.4,64.1,75.5,79.0,85.5,86.2,87.1,88.8,103.3,113.7,113.9,127.6,128.4,128.6,128.8,129.9,130.9,131.1,136.3,136.4,141.2,145.7,151.6,159.6,163.4.
Mass(EI):m/z 558(M+),303(DmTr+),256(M+-DmTr),227(M+-DmTrOCH2).
【００３７】
（５）２’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５'−Ｏ−(４，４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ，４'−メタノウリジン（化合物６）の合成
化合物５（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（３９．９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ3ＣＮで３回共沸した後、無水ＣＨ3ＣＮ−無水ＴＨＦ（５：１、１０ｍｌ）溶媒とし、窒素気流下、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１８ｍｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分撹拌した。
【００３８】
溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（無水ＡｃＯＥｔ：Ｅｔ3Ｎ＝１００：４）により精製後、無水ジエチルエーテル／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物６）（３４０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００３９】
mp94-96℃（Et2O/hexane).
IR(KBr):νmax2966,2252,2049,1697,1607,1509,1460,1298,1253,1038.
31P-NMR(acetone-d6):δ150.8,151.2.
【００４０】
実施例２：オリゴヌクレオチド類縁体の合成
【化６】
３’−水酸基が支持体に結合した５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（０．２μｍｏｌ）のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）をトリクロロ酢酸によって脱保護し、その５’−水酸基に５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジン２−シアノエチルホスホアミダイト誘導体をテトラゾールにより縮合し、未反応の５’−水酸基を無水酢酸と４−ジメチルアミノピリジン、２，４，６−コリジンでアセチル化した後、ヨウ素と２，４，６−コリジン、水によりリンを酸化した。
【００４１】
同様に脱保護、縮合、アセチル化、酸化を繰り返した。（４員環アミダイト誘導体も他のアミダイト誘導体と同様に用いることができた。）最後の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン２−シアノエチルホスホアミダイト誘導体を縮合し、酸化して得られた１２−ｍｅｒのオリゴマー（ここまでの工程はPharmacia社製ＤＮＡ合成装置Gene Assembler Plusにより行なった。）を濃アンモニア水１ｍｌによって支持体から切り出すとともに、リンからシアノエチル基をはずし、さらにアデニン、グアニン、シトシンの保護基をはずした。
【００４２】
得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドは、逆相カラム（Millipore,Oligo-PakTMSP)上でトリフルオロ酢酸５ｍｌによりＤＭＴｒ基をはずし、引き続き精製を行ない、目的の５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’（ＸＴ５）（０．０２ｍｍｏｌ，１０％）を得た。得られたオリゴヌクレオチド類縁体の純度は逆相ＨＰＬＣにより確認した。
【００４３】
（２）５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２ＸＴ３）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２ＸＴ３）（０．０４ｍｍｏｌ，２０％）を得た。
【００４４】
（３）５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ３ＸＴ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ３ＸＴ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４５】
（４）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’（Ｔ５Ｘ）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’（Ｔ５Ｘ）（０．０２ｍｍｏｌ，１０％）を得た。
【００４６】
（５）５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｘ２Ｔ４）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’（Ｘ２Ｔ４）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４７】
（６）５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４８】
（７）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’（Ｔ４Ｘ２）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’（Ｔ４Ｘ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００４９】
（８）５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’（Ｘ６）の合成
（１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’（Ｘ６）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を得た。
【００５０】
実験例１：融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例２で合成した種々のアンチセンス分子であるオリゴマー鎖（アンチセンス鎖）とセンス鎖とをアニーリング処理したもののＴｍを測定することにより、アンチセンスのハイブリッド形成能を調べた。
【００５１】
終濃度をそれぞれ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、センス鎖４μＭとしたサンプル溶液（５００μＬ）を沸騰水中に浴し、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Shimadzu,ＵＶ−２１００ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間５℃に保った後、測定を開始した。温度は９０℃まで毎分０．２℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお温度上昇により濃度が変化するのを防ぐため、セルは蓋付きのものを用い、サンプル溶液表面に鉱油を１滴添加し測定を行った。
【００５２】
測定に用いたアンチセンス鎖及びセル鎖の配列を次に示す。
【００５３】
なお、本明細書では便宜上天然ヌクレオシドをＴ，Ｃ，Ａ，Ｇのように大文字で表記し、本発明における類縁体をそれぞれｔ，ｃ，ａ，ｇのように小文字で表記する。
【００５４】
【表１】
実験例２：酵素耐性の測定
天然型及び非天然型の下記のオリゴヌクレオチドについて、オリゴヌクレオチドを３’側から分解するエキソヌクレアーゼに対する耐性を調べた。
【００５６】
１５分間３７℃に保ったオリゴヌクレオチドのバッファー溶液（１０μＭ，４００μｌ）に、蛇毒ホスホジエステラーゼのバッファー溶液（０．００３Ｕ／ｍｌ，４００μｌ）を混合した。オリゴマーの分解による紫外部吸収（２６０ｎｍ）の増加をＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−２１００ＰＣを用い、３７℃で経時的に測定した。用いたバッファーの組成はＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．６）０．１Ｍ，ＮａＣｌ ０．１Ｍ，ＭｇＣｌ2 １４ｍＭであり、測定前に十分に脱気した。
【００５７】
測定に用いたオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
天然鎖 ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
Ｘ２ ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’
【００５８】
半減期（ｔ1/2）の測定
測定開始時（ｔ＝０）及び紫外部吸収（２６０ｎｍ）の増加が認められなくなった時点での紫外部吸収値の平均値を示す時間を半減期（ｔ1/2）とした。結果は次の通りである。
オリゴヌクレオチド ｔ 1/2 （秒）
天然鎖 ３５０
Ｘ２ １３９０
【００５９】
また、紫外部吸収の経時変化を示すチャートを図１（天然鎖）及び図２（Ｘ２）に示した。天然鎖は酵素反応開始後、約３０分で紫外部吸収値が一定となり、Ｘ２では約９０分で一定となった。
【００６０】
【配列表】
出願人の氏名：今西武
発明の名称：新規ヌクレオチド類縁体
整理番号：
出願番号：
出願日：平成９年１１月１７日
優先権番号：特願平８−３０６５８５号
優先日：平成８年１１月１８日
配列の数：１０
【００６１】
配列番号：１
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６２】
配列番号：２
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６３】
配列番号：３
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’
【００６４】
配列番号：４
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’
【００６５】
配列番号：５
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’
【００６６】
配列番号：６
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’
【００６７】
配列番号：７
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’
【００６８】
配列番号：８
配列の長さ：１２
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’
【００６９】
配列番号：９
配列の長さ：１３
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
【００７０】
配列番号：１０
配列の長さ：１３
配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列：
５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’
【図面の簡単な説明】
【図１】 天然型のオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎｍ）の経時変化を示すチャートである。
【図２】 本発明のオリゴヌクレオチド（Ｘ２）をエキソヌクレアーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎｍ）の経時的変化を示すチャートである。
Claims (3)
- 一般式：
- 上記オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが合計２〜５０個のヌクレオチド単位からなることを特徴とする請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオチド類縁体。
- 一般式：
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